Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique Universit Mentouri Constantine Facult des Sciences

de la Nature et de la Vie Dpartement de Biochimie - Microbiologie

N dordre N de srie

Thse de Doctorat
Prsente pour lobtention du diplme de Doctorat en sciences Option : Biochimie
Par : KEBIECHE Mohamed

Thme Activit biochimique des extraits flavonodiques de la plante Ranunculus repens L : effet sur le diabte exprimental et lhpatotoxicit induite par lEpirubicine

Soutenu le :22/11/2009

Devant le jury :
Prsident Rapporteur : Mme BENLATRECHE C. : Mme MERAIHI Z. Prof. Universit Mentouri-Constantine Prof. Universit Mentouri-Constantine Prof. Universit de P. Verlaine- Metz, France Prof. Universit MIRA, Bejaia Prof. Universit de Jijel

Examinateurs : Mr SOULIMANI R. Mr MADANI K. Mr LAGHOUCHI S.

Liste des abrviations ALAT

ASAT A CCl4 CAT DTNB DNID DID DPPH EB EPI ED Fl O FADH GPx GR GSH GSSG GLP-1 HNE HO H2O2 IP L MDA Mole NADH NADPH NBT NO NOS OH O2 ONOO PCG QR RRL ROS ROO RPE SOD SIDA TBARS TBA TCA TEP TNB UI U Alanine amino transfrase Aspartate amino transfrase Absorbance Ttrachlorure de carbone Catalase 5-5-dithiobis2-nitrobenzoque Diabte non insulinodpendant Diabte insulinodpendant 2, 2-diphnylpicrylhydrasyl Extrait butanolique Epirubicine Eau distille Flavonod radical Flavine Adnosine Dinuclotide, forme rduite Glutathion peroxydase Glutathion rductase Glutathion Glutathion oxyd Glucagon like peptide-1 4-hydroxynonenal Hme oxygnase Peroxyde dhydrogne (eau oxygne) Intrapritonal Litre Malondialdhyde Mole/L Nicotinamide Adnine Dinuclotide Nicotinamide Adnine Dinuclotide Phosphate Nitro blue Tetrazolium Nitric oxide NOsynthase Le radical hydroxyl Anion superoxyde Peroxynitrite Pourcentage de la chute de la glycmie Querctine Ranunculus repens L Reactive oxygen species Radical peroxyl Rsonance para-lectrique Superoxyde dismutase Syndrome dimmunodficience acquise Thiobarbituric acid reactive substances Thiobarbituric acid Acide trichloroactique Ttratoxypropane Thionitrobenzoque Unit internationale Microunit

Sommaire
Page Introduction gnrale.............................................1

Partie 1 : Effet des extraits de flavonodes de Ranunculus repens L (RRL) et de la querctine sur le diabte
Introduction.. ...3 1. Le diabte.....5
1.1. Dfinitions et gnralits....... ..5 1.2. Le pancras et linsulinoscrtion..6 1.3. La pancratotoxicit lalloxane.....11 1.4. De lhyperglycmie chronique aux complications organiques....11 1.5. Le diabte et le stress oxydatif.........12 1.6. Les antidiabtiques : de lefficacit la toxicit..12 1.7. Plantes antidiabtiques.13

2. Les flavonodes-gnralits.....15
2.1. Dfinitions et historique ....15

2.2. Les composs phnoliques...15 2.2.1 Biosynthse des composs phnoliques.....17 2.2.2. Structure et classification...19 2.3. Pharmacologie des flavonodes...20 2.3.1. Biodisponibilit..20 2.3.2. Absorption intestinale et mtabolisme...20 2.4. Proprits pharmacologiques des flavonodes.....21 2.4.1. Proprits anti-inflammatoire et immunologique..21 2.4.2. Proprits antivirales et antibiotiques....22 2.4.3. Proprits antinoplasiques....23 2.4.4. Proprits antioxydantes des flavonodes..23 2.4.5. Proprits pro-oxydantes des flavonodes24 2.5. Distribution de flavonodes25 2.6. La plante Ranunculus repens L......26

2.5.1. Systmatique de la plante..26 2.5.2. Biologie de Ranunculus repens L.26 2.5.3. Ethnopharmacologie de Ranunculus repens L.27

3. Matriel et mthodes danalyse.....28

3.1 Prparation des extraits phnoliques....28 3.1.1. Extraction des flavonodes ..... ..28 3.1.2. Dosage des polyphnols.....29 3.1.3. Dosage des flavanoides......29 3.1.4. Evaluation du pouvoir oxydant des flavonodes....31 3.2. Exprimentation animale..32 3.2.1. Animaux et conditions dhbergement .. 32 3.2.2. La recherche de toxicit des flavanoids de RRL .... 32 3.2.3. Test de tolrance au glucose..... 32 3.2.4. Evaluation de leffet des flavanoids sur le stockage de glycogne hpatique et linsulinoscrtion...33 3.2.5. Evaluation de lactivit antidiabtique des composs phnoliques...37 3.2.6. Effet prventif des extraits de flavonodes de RRL et de la querctine sur le diabte induit par lalloxane..38 3.2.7. Recherche des mcanismes de prvention des extraits butanolique de RRL et de la querctine...39 3.2.8. Evaluation statistique.....42

3.3. Rsultats et interprtation.. ..43 3.3.1. Extraction et dosages des composs phnoliques..43 3.3.2. Evaluation du pouvoir antiradicalaire. ......44 3.3.3. Effet des flavonodes sur la tolrance au glucose......45 3.3.4. Evaluation du stockage de glycogne hpatique et la glycosylation de glucose in vitro.................................................................................................................................46 3.3.5. Effet antidiabtique des flavonodes en aigu et en subchronique chez les rats diabtiques......51 3.3. 6. Effet prventif des flavonodes contre le diabte induit lalloxane...54

3.4. Discussion ..59 3.4.1. Les flavonodes de Ranunculus repens L..59 3.4.2. Etude de lactivit des flavonodes et leur mcanisme daction....61

3.4.3. Activit antidiabtique des flavonodes.....63 3.4.4. Effet protecteur des flavonodes et mcanismes daction contre le diabte induit par lalloxane...........64 3.4.5. Effet de lalloxane et les flavonodes du RRL sur les cellules du pancras : mcanisme daction.......66

Conclusion.......68 Rfrences bibliographiques..... 69

Partie 2 : Effet des extraits de flavonodes de RRL et de la querctine sur lhpatotoxicit induite par lEpirubicine Introduction.81
Le stress oxydant....83

1. Dfinitions........83 2. Les espces ractives de loxygne et leur origine..84

2.1. Les radicaux libres oxygns ..84 2.2.3. Rle pathologique des espces actives de loxygne.. ...94 2.2.4. Les systmes scavenger des radicaux libres..99 Les systmes endognes enzymatiques.......99 Les systmes endognes non enzymatiques.....103

2.2. Les systmes exognes antioxydants...104

3. Etude exprimentale de leffet hpatoprotecteur des flavonodes....111 3.1. Matriel et mthodes.................................................................................112

3.1.1. Induction de lhpatotoxicit par lEpirubicine.112 3.1.2. Le srum et le test de la fonction hpatique ....112 3.1.3. Prparation des fractions de cytosol et de la matrice mitochondriale...112 La prparation de cytosol des hpatocytes....112 La prparation de la matrice mitochondriale.....113

3.1.4. Evaluation biochimique du statut oxydatif dans le cytosol et les mitochondries....113

3.2. Rsultats et interprtation ....115

3.2.1. Effet de lpirubicine sur la fonction hpatique et laction hpatoprotecteur des flavonodes....115 3.2.2. Evaluation in vivo de la peroxydation lipidique dans le cytosol et la mitochondrie.115 3.2.3. Evaluation des systmes antioxydants dans le cytosol hpatique....117 3.2.4. Evaluation de lactivit enzymatique CAT et SOD dans les mitochondries.......117

3.3. Discussion.......118 Conclusion.121 Conclusion gnrale......122 Rfrences bibliographiques.124

Annexes

Introduction gnrale
Le diabte est une maladie mtabolique caractrise par un dsordre au niveau de la rgulation du mtabolisme des glucides entranant une hyperglycmie. A l'origine, le terme "diabte" dsignait diverses maladies caractrises par une limination importante durines, une dshydratation et une soif intense [Calop et al., 2008]. Cette pathologie se distinguait par la saveur sucre des urines et fut nomme diabte sucr [Rodier, 2001 ; Sharma, 2008]. Elle est rpandue dans le monde o on dnombre 5 7% de la population mondiale [Weaber, 2007 ; Sharma et al., 2008 ; Singh P. and Kakkar P., 2009 ; Zhou et al., 2009]. Selon lOMS [Guermaz, 2008], lAlgrie en compte 5 millions tout diabte confondu. Le diabte sucr est un groupe de maladies mtaboliques caractrises par une hyperglycmie chronique rsultante dun dfaut de la scrtion de linsuline et/ou de laction de cette hormone [Rodier, 2001 ; Sharma et al., 2008]. Le diabte type 1, insulinodpendant (DID), est actuellement matris surtout aprs la synthse de linsuline recombinante [Johnson, 1983]. Pour le diabte type 2 (DNID), le champ de recherche est encore ouvert. Au niveau des socits industrielles, les recherches et les tentatives en pharmacothrapie ont permis dtablir linsulinothrapie pour lutter contre le diabte juvnile et le contrle du rgime alimentaire associ la prise de molcules antidiabtiques (sulphonylurs, biguanide, methformine, ) pour le traitement et la lutte contre le DNID [Marles, 1994 ; Dey lucey et al., 2002]. Dans certaines socits traditionnelles non industrialises (Chine, certains pays africains et latino-amricains), la prise en charge mdicamenteuse de pathologies dites chroniques (tel le diabte) est en grande partie assure par lutilisation de plantes mdicinales et alimentaires [Sharma et al, 2008 ; Guermaz, 2008 ; Singh, 2009 ; Zhou et al., 2009 ]. En effet, la vie humaine sur trre est troitement lie lexploitation des plantes. Ces dernires ont la capacit de produire des substances naturelles trs diversifies. A ct des mtabolites primaires, elles accumulent frquemment des mtabolites dits secondaires qui reprsentent une source importante de molcules utilisable par lhomme en particulier dans le domaine pharmacologique [Marouf et Jol, 2007]. De nos jours, plus de 3000 flavonodes sont identifis et se trouvent localiser particulirement dans les pigments floraux ou dans les feuilles [Marfak, 2003]. Les flavonodes sont reconnus essentiellement pour leur action antioxydante [Bruneton, 1999],

modulatrice de lactivit

de certaines enzymes, vasculoprotectrice [Vitor et al., 2004]

[Ghedira, 2005], anti-inflammatoire [Chen et al.,2008] et antidiabtique [Marfak, 2003]. Lexistence dune pharmacope traditionnelle antidiabtique destine au traitement de la pathologie diabtique svit et son existence est confirme par les praticiens et les mdecins qui la pratiquent [Sharma et al, 2008 ; Singh, 2009]. Il parat difficile voire impossible de rpertorier la totalit des plantes actives et efficaces sur ce genre de pathologie. Aussi, dans notre travail, nous nous sommes limits ltude de la plante Ranunculus repens L trs utilise de faon traditionnelle (ses jeunes pousses de feuilles en dcoction et en infusion) dans le traitement du diabte sucr dans la rgion de Jijel (ville de lEst algrien). Ses effets avrs sur le diabte, nous ont donc pousss dmontrer exprimentalement, le ou les principes actifs et den comprendre les mcanismes daction. Par ailleurs, selon la documentation consulte [Coles, 1977 ; Lovett-Doust et al., 1990 ; Khan et al., 2006], cette plante na pas t tudie tant sur le plan phytochimique que pharmacologique. Notre stratgie exprimentale comporte donc les axes suivants : Un

fractionnement des flavonodes

par entranement

avec diffrents solvants

organiques Un modle de rat diabtique est conu pour tester lefficacit des extraits de la plante et tudier galement leurs mcanismes daction in vitro et in vivo. Pour cette tude la querctine est utilise comme tmoin positif, connue pour ses proprits antiradicalaires [Boots, 2008 ; Coskun, 2005] et antioxydantes [Boots, 2008 ; Erlund , 2004].

Une tude parallle est entreprise pour valuer la toxicit hpatique mdicamenteuse
cause par lEpirubicine (antibiotique anticancreux). Les activits antihpatotoxiques, hpatoprotectrices et antioxydantes des extraits de flavonodes sont compares leffet de la querctine. Le travail est divis en 2 sections : une section comportant les deux premiers points et une autre pour la dernire tude.

Introduction

Le diabte est une maladie mtabolique grave menaant, dune manire croissante, la sant publique dans le monde. Elle touche environ 4% de la population mondiale et on s'attend une augmentation de 5,4% en 2025 [Al-Achi, 2005]. Les patients atteints de diabte ont le stress oxydatif lev et une altration des systmes de dfense anti-oxydant, qui semblent contribuer l'initiation et la progression des complications du diabte induit [Kim et al., 2006]. Les systmes de dfenses antioxydants existant dans lorganisme sont susceptibles de moduler le niveau du stress oxydatif intracellulaire. En effet, la superoxyde dismutase, la catalase, la glutathion peroxydase (enzymes antioxydantes), peuvent catalyser la dismutation des radicaux libres ou leur neutralisation [Rudge et al., 2007]. Le diabte entrane de graves dsquilibres mtaboliques, des changements dans de nombreux tissus en particulier le pancras [McCord et al., 1971] o Ihara et al., 1999, ont not une augmentation des marqueurs du stress oxydatif dans les lots pancratiques de rats diabtiques. Le malondialdehyde reflte le degr de peroxydation lipidique, laugmentation de sa production joue un rle important dans le contrle de la progression du diabte [Ilhan et al., 2001].

Malgr lutilisation des hypoglycmiants comme drogues antidiabtiques, le diabte et ses complications constituent une grande problmatique dans la prise en charge thrapeutique des diabtiques et la russite du traitement serait dun intrt grandiose, malgr lavance de nouvelles molcules thrapeutiques. Les mdicaments modernes, y compris l'insuline et les hypoglycmiants oraux (les biguanides, les sulfonylures), leur administration rgulire engendre deffets indsirables [Nissen and Wolski, 2007]. Rcemment, les diabtologues sont arrivs lvidence dun complment thrapeutique constitu par les extraits de plantes est ncessaire pour optimiser le traitement du diabte [Bagchi et al., 1997 ; Kim et al., 2002 ; Jin et al., 2008 ]. Les plantes sont reconnues comme une merveilleuse source de mdicaments. Actuellement 1200 espces de plantes sont utilises comme mdicaments dans la thrapeutique traditionnelle du diabte [Marles and Farnsworth, 1995]. Cependant pour la plupart d'entre elles les preuves scientifiques ne sont pas encore lucides.

Les antioxydants jouent un rle majeur dans la protection contre les dommages oxydatifs molculaire [Evans, 2007]. En plus du stress oxydatif, laction de linsuline est galement

perturbe chez les diabtiques, ce qui entrane une augmentation de la production hpatique de glucose. Ainsi, l'effet des composs phytochimiques sur les tissus tel que le foie, qui rgule le mtabolisme du glucose, est un domaine intressant explorer. En effet, les flavonodes sont longuement reconnus pour avoir un effet anti-inflammatoire, antioxydant, antiallergique, antithrombotique, antiviral et anticancrinogne [Carroll et al., 1998]. Cependant peu dinformations sont disponibles sur leur potentiel rguler et contrler le glucose sanguin chez lhomme.

Lobjectif de la prsente tude est la validation de leffet antidiabtique de la plante Ranunculus repens L (poudre de feuilles sches), reconnue par la tradimdecine dans le traitement du diabte ainsi que le potentiel antioxydant en utilisant des outils biochimiques. Dans ce contexte, une tude sera entreprise pour comprendre les mcanismes molculaires daction des fractions riches en flavonodes de la plante. Un autre objectif fix galement par cette investigation est ltude de la variation du status redox des cellules pancratiques sous leffet du diabte. Le test de tolrance au glucose en utilisant les diffrents extraits de flavonodes, glycogne hpatique, la scrtion d'insuline, test de glycosylation in vitro, activit des enzymes antioxydantes, glutathion et peroxydation lipidique ont t analyss chez le diabte induit par lalloxane afin d'valuer leffet des flavonodes sur certains paramtres molculaires et

biochimiques des cellules pancratiques.

1. Le diabte
1.1. Dfinitions et gnralits

Le diabte est une maladie frquente, connue depuis fort longtemps, trs rpandue en ce dbut de XXIme sicle. Cest une pathologie chronique, caractrise par une hyperglycmie. Lorsque la glycmie dans le sang, mesure jeun, devient suprieure 1,26 g par litre, la personne est considre comme diabtique. Cette maladie est incurable, mais peut nanmoins tre traite efficacement [Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004]. Le diabte est un dsordre du mtabolisme lipidique, glucidique et protique attribu la production diminue de l'insuline ou une rsistance anormale cette hormone qui entrane une hausse du taux de glucose. On peut distinguer plusieurs types de diabte :

Le diabte insulinodpendant (DID) : Concerne le plus souvent les enfants, mais il

peut survenir tout ge. Les cellules qui scrtent l'insuline sont dtruites jusqu' 90% de leur quantit normale (causes auto-immunes ou idiopathiques. Il est li un dficit en insuline [ Raccah, 2004 ; Calop et al., 2008 ].

Diabte non insulinodpendant (DNID) : Ce type de diabte dbute gnralement

aprs l'ge de 40 ans et reprsente 90% de l'ensemble des cas mondiaux [Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004]. Il rsulte de l'incapacit de l'organisme ragir correctement l'action de l'insuline. Linsuline est soit basse ou soit leve (insulinorsistance prdominante ou insulinopnie prdominante) [Calop et al., 2008 ; Raccah, 2004].

En l'absence de traitement, le diabte se reconnat par une lvation chronique de la glycmie. Celle-ci s'accompagne parfois par les symptmes suivants : polydipsie, polyurie, asthnie, polyphagie, amaigrissement ou obsit, et des troubles de la conscience aboutissant un coma mortel [Sharma et al., 1993 ; Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004 : Calop et al., 2008 ]. Le diabte aboutit des complications comme les maladies cardio-vasculaires et rnales. Ces complications peuvent tre retardes, diminues ou empches en maintenant une glycmie prs de la normale (0.7 - 0.8 g/l) [Raccah, 2004].

Les maladies coronariennes sont prsentes chez 8 20 % des diabtiques au-del de 45 ans et cette frquence augmente avec l'ge [Raccah, 2004]. Le diabte est la cause principale de nouveau cas de ccit chez des adultes diabtiques entre 30 et 75 ans. Les diabtiques au-del de 65 ans sont deux fois plus souvent hospitaliss pour des problmes lis au fonctionnement des reins que les personnes non atteintes [Sharma et al., 1993 ; Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004]. Les diabtiques de type 2, prcisment, sans aucun pass coronaire ont un risque dinfarctus myocardique aussi lev que celui des tmoins non diabtiques [Sharma et al., 1993 ; Buysschaert et al., 1998].

1. 2. Le pancras et linsulino-scrtion Bien que les apports de glucose soient trs variables dans le temps, la glycmie reste toujours comprise entre 0.7 et 0.8 g/l [Raccah, 2004]. Cette rgulation est assure par les scrtions endocrines du pancras qui pntrent dans le flot sanguin par la veine msentrique [Buysschaert et al., 1998]. Le pancras est une glande double, la fois exocrine et endocrine, situe dans une anse du duodnum. La glande endocrine est reprsente par de petits lots cellulaires dissmins dans le parenchyme exocrine, les lots de Langerhans, dont le diamtre varie de 100 300 mm et dont le total ne reprsente gure que 1% environ de la glande, soit un poids total de 1 2 g ). (figure 1).

Figure 1 : Les systmes endocriniens du pancras [Nelson et Cox, 2004 ]

Les scrtions de linsuline rejoingnent la circulation sanguine via le foie. Le pancras scrte plusieures hormones (Nelson et Cox, 2004) :

1/ L'insuline : hormone peptidique synthtise dans les glandulaires des lots de langerhans ou cellules Bta. Lincapacit de ces cellules produire suffisamment linsuline, entrane un diabte. Cette fragilit intervienne dans les mcanismes qui conduisent la destruction de la cellule bta, sous leffet dagents diabtognes, comme lAlloxane [Malaisse et al., 1982 ; Oberley, 1988]. Laction de linsuline est reprsente sur la figure suivante (figure2):

Figure 2 : Mcanisme biochimique de laction de linsuline [Oberley, 1988].

Au niveau des cellules cibles, cette hormone facilite la pntration du glucose dans les cellules en augmentant la permabilit de leur membrane via des rcepteurs au glucose exemple GLUT 4 [Malaisse et al., 1982 ; Oberley, 1988 ]. Au niveau du foie, elle stimule la glycognogense. La capacit, plus ou moins grande, de linsuline favoriser lutilisation du glucose par les tissus priphriques dfinit le degr de sensibilit linsuline dune personne. Chez les humains obses et/ou diabtiques, cette action de linsuline est fortement rduite et cette perturbation est due un dfaut au niveau du transport du glucose [Buysschaert et al., 1999 ;

Raccah, 2004 ; Weaber, 2007 ]. Les mcanismes par lesquels linsuline stimule ce processus dans les cellules musculaires et adipeuses soient indiqus dans la figure 3. Comme nous lavons mentionn ci-dessus, linsuline stimule l'enrichissement de la membrane plasmique en transporteurs GLUT 4, o des vsicules contenant les transporteurs fusionnent avec la membrane [Wang et al., 1997]. Une autre hormone d'origine intestinale, le GLP-1, est galement capable d'augmenter le nombre de rcepteurs GLUT4 et GLUT1 sur les adipocytes in vitro [Wang et al., 1997].

Figure 3 : Stimulation de lenrichissement de la membrane plasmique en GLUT4 par linsuline [Kahn, 1992].

Linsulino-rsistance est une rponse biologique in vivo l'insuline explique par une
scrtion rduite ou par son action dfectueuse. Elle est caractristique du diabte non insulino-dpendant et concerne la majorit des tissus cibles comme le foie qui va augmenter sa production en glucose, les muscles squelettiques et le tissu adipeux. Les mcanismes responsables peuvent se situer diffrents niveaux du mtabolisme insulinique, y compris au

niveau du rcepteur l'insuline des cellules cibles [Buysschaert et al., 1999 ; Raccah, 2004 ] (figure 4).

Figure 4 : Les mcanismes de l'insulino-rsistance [Kahn, 1992 ] (1) signalisation dficiente, (2) translocation affaiblie, (3) fusion choue,(4) fusion partielle et exposition au milieu extracellulaire inadquate, or (5) rduction de lactivation des transporteurs de glucose.

2/ Le glucagon : hormone peptidique synthtise par les cellules , qui est une hormone hyperglycmiante. C'est un facteur antagoniste de l'insuline. Cette hormone agit en stimulant la glycognolyse hpatique. 3/ La somatostatine : hormone peptidique synthtise par les cellules dont le rle est hyperglycmiant. Chez les mammifres, l'organisme contrle l'quilibre entre la consommation cellulaire du glucose et sa production endogne hpatique et les apports exognes. Les facteurs hormonaux

comme l'insuline et le glucagon, des neurotransmetteurs et autres molcules participent la rgulation du mtabolisme glucidique afin de maintenir l'homostasie (figure 5). Certains des signaux hormonaux favorisant la production d'insuline ont t tudis dans le but de corriger le DNID tel que le glucagon intestinal (GLP-1) [Nauck, 1998]. Les rgulations des scrtions endocrines pancratiques font donc intervenir de nombreuses molcules d'origines diverses: des hormones, mais aussi des neurotransmetteurs et des produits de la digestion.

Figure 5 : Rgulation des scrtions endocrines pancratiques [Nauck, 1998].

1.3. La pancratotoxicit lalloxane

LAlloxane est un compos organique bas sur un squelette de lhtrocyclique de la pyrimidine (figure 6). Ce compos a une haute affinit pour leau existant sous forme monohydrate. Les donnes caractrisant l'Alloxane dans les conditions standards sont les suivantes : Nom chimique : 2, 4, 5,6(1H, 3H)-pyrimidine ttraone monohydrate. Structure chimique : C4H2N2O4 Masse molculaire : 160,09 g/mol. Point fondant : 253C.

Figure 6. Structure chimique de l'Alloxane. LAlloxane est un agent oxydant fort excentre une activit cytotoxique sur les cellules par le produit de sa rduction, lacide diallurique [Grankvist et al., 1981]. Il tablit un cycle doxydorduction avec formation de radicaux superoxydes, associ linternalisation de fortes doses de calcium dans le cytosol provoquant anisi la destruction rapide des cellules [Ammon et al., 1983 ; Lenzen et al., 1996 ]. Cet effet dltre est inhrent la vulnrabilit de ces cellules au stress oxydatif en raison dune part, de leur pauvret en cu++/zn++ super oxyde dismutase, en catalase et en glutathion peroxydase, dautre part au faible contenu en glutathion rduit [Grankvist et al., 1981]. cette fragilit intervient dans les mcanismes qui conduisent la destruction des cellules sous leffet dagents diabtognes comme lAlloxane [Grankvist et al., 1981; Ammon et al., 1983 ; Lenzen et al., 1996].

1. 4. Hyperglycmie chronique et complications organiques

Lhyperglycmie chronique est associe des complications organiques spcifiques touchant particulirement les yeux, les nerfs, les reins, le coeur et les vaisseaux [Raccah, 2004], qui provoquent un risque de mortalit trs lev. A titre dexemple la mortalit cardiovasculaire en France chez les personnes atteintes dun diabte de type 2 est approximativement le double de celle des sujets non diabtique [Drouin et al., 1999 ; [Buysschaert et al., 1999].

1. 5. Le diabte et le stress oxydatif

Les complications du diabte sont fortement lies certain nombre de facteurs. A cot de lhyperglycmie chronique et la glycation non enzymatique des protines, un facteur trs important impliqu dans la gense de ces complications est le stress oxydatif [Guerci et al., 2001 ;Punitha et al ., 2005]. En effet, le mtabolisme cellulaire normal de loxygne produit de manire continue de faibles quantits despces oxygnes actives dont font partie les
. . radicaux libres (O2 , OH ,, le peroxyde dhydrogne et loxygne singulet). Le patient

diabtique prsente une surproduction des ROS dune part et dautre part, une diminution des antioxydants, ce qui gnre un tat de stress oxydatif lorigine des micro et des macro angiopathies [Pincemail et al., 1999 ; Huang et al., 2004 ].

1. 6. Les antidiabtiques : de lefficacit la toxicit

Gnralement, tous ces agents antidiabtiques causent diffrents effets secondaires qui varient selon la classe et la gnration du mdicament. Prcisment, les sulfamides, insulinoscrtagogues, provoquent un tat d'hypoglycmie. Cet effet est considr comme principal cot de l'hyponatrmie, l'hpatite, les atteintes hmatologiques, l'ventuelle raction dermatologique ainsi qu'un gain de poids d l'hyperinsulinmie [Marles and Farnsworth, 1994 ; Marles and Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002]. Suite leurs effets secondaires nfastes, certains Biguanides, inhibiteurs de la noglucognse et labsorption intestinale du glucose, sont limins du march. La metformine, le biguanide le plus commercialis dans le monde, n'est plus disponible quaux USA car il provoque une acidose lactique, une fatigue, des nauses et une toxicit rnale [Dey lucey et al., 2002]. L'acarbose (C25H43NO18), un mdicament de la classe des inhibiteurs des alpha-glucosidases prsente divers effets secondaires, comme les gaz, le ballonnement et la diarrhe [Marles and Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002].

1. 7. Plantes antidiabtiques

Pour pallier aux effets secondaires des traitements antidiabtiques, les recherches scientifiques portent sur 1123 plantes utilises traditionnellement contre le diabte [Raccah, 2004]. La minorit tudie concerne les plantes suivantes : Momordica charantia,

Catharanthus roseus, Trigonella foenum-greacum, Allium cepa, Allium sativum, et autres [AlAchi, 2005].

Les guanidines furent extraits la premire fois partir de Galega officinalis, qui constituent une source naturelle pour la semi-synthse des Biguanides les moins toxiques que les guanidines [Dey lucey et al., 2002]. Dautres composs vgtaux montrent une activit biologique (voir tableau1).

Tableau 1. Composs vgtaux vertus antidiabtiques.

Compos
Polypeptide P

Nature chimique
Polypeptide

Source
Momordica charantia

Mcanisme daction possible

Insulinomimtique administr par voie sous cutane chez des diabtiques de type1 [Marles and Farnsworth, 1995]. * Mcanisme daction exacte reste inconnu. Des tudes ont rapport que: * Le jus de M. charantia peut amliorer la tolrance au glucose chez les diabtiques de type 2 [Welihinda et al., 1986]. * Lextrait aqueux de M. charantia diminue la glycmie post prandial avec une rduction du taux de lhmoglobine glycosyle [Srivastava et al., 1993]. * Il augmente lutilisation hpatique du glucose et inhibe la noglucogense, il rprime linsulinorsistance en augmentant le taux des transporteurs membranaires de glucose [Al-Achi, 2005] Les extraits bruts ont montr les effets suivants : * Diminution de la glycmie post prandial. * Diminution du taux de glucagon, somatostatine, insuline, cholestrol total et des triglycrides * Augmentation du taux dHDLCholestrol [ Ribes et al., 1984]. * Resensibilisation des cellules laction de linsuline [ Al-Achi, 2005] Ces deux composs semblent agir par comptition avec linsuline sur son rcepteur [Marles and Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002 ; Al-Achi, 2005]. * La plante provoque une augmentation du nombre des transporteurs de glucose * Stimulation de la synthse de linsuline [Al-Achi, 2005].

Charantine

Htroside stroidique

Momordica charantia [Dey lucey et al., 2002] Momordica foetida [Marles and

Farnsworth, 1995 ]

Trigonelline

Alcaloide

Trigonella foenumgreacum [ Marles and

Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et

al., 2002]

Allyl propyl disulfide Diallyl disulfide oxide

Allium cepa Drivs de la cystine Allium sativum

Ginsenosides

Htroside stroidique

Panax ginseng

2. Les flavonodes-gnralits 2.1. Dfinitions et historique

Le nom flavonode est driv du mot Flavus en latin, qui signifie jaune. Lintrt nutritionnel pour les flavonodes date de la dcouverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi en 1938 [Szent-Grgyi, 1938 ; Bruneton, 1993]. Le scorbut exprimental cde lingestion de jus dagrumes mais rsiste la seule administration dacide ascorbique. Plus pratiquement, les symptmes hmorragiques du scorbut lis la fragilit des vaisseaux sont guris par des extraits de Paprika et du jus de citron alors que lacide ascorbique seul est inefficace [Szent-Grgyi, 1938]. Les analyses chimiques ont montr que la fraction active tait de nature flavonodique [Bruneton, 1993]. Cette action des flavonodes sur la permabilit vasculaire a t appele proprit vitaminique P (P tant la premire lettre du mot permabilit). Cette notion de vitamine P nexiste plus lheure actuelle puisquelle ne correspond pas la dfinition classique des vitamines ; par contre, les flavonodes sont considrs comme des micronutriments importants puisqu.ils peuvent jouer des rles antioxydants [Alan et Miller, 1996] ou possder des proprits biologiques diverses qui seront dveloppes dans ce chapitre.

2.2. Les composs flavonodiques

Ce sont des composs phnoliques des vgtaux constituent un groupe dune extrme diversit. Plusieurs milliers de molcules ont t identifies ce jour [Alan et Miller, 1996 ; Rajnerayanama et al., 2001]. Ce sont des pigments quasi universels des vgtaux presque toujours hydrosolubles. Ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles assurant ainsi la protection des tissus contre les agressions des ultraviolets [Bruneton, 1993 ; Rajnerayanama et al., 2001].

Les flavonodes sont des drivs du noyau FLAVONE ou 2-PHENYL CHROMONE (figure 7) portant des fonctions phnols libres, thers ou glycosides. Le noyau FLAVONE est lui mme un driv du noyau FLAVANE de base [Bruneton, 1993], (figure 8).

Figure 7 : Structure du FLAVONE [Bruneton, 1993 ; Elicoh-Middleton, 2000].

Figure 8 : Structrue du FLAVANE [Bruneton, 1993 ; Elicoh-Middleton, 2000].

Les flavonodes sont donc des polyphnols complexes dont la structure est constitue de deux noyaux aromatiques (noyaux A et B) et dun htrocycle oxygn, cycle C [Bruneton, 1993 ; Elicoh-Middleton, 2000].

2.2.1. Biosynthse des composs phnoliques

Les flavonodes sont synthtiss au niveau du chloroplaste et participent la phase lumineuse de la photosynthse comme transporteurs dlectrons. Certains quittent le chloroplaste et saccumulent dans les vacuoles [Elicoh-Middleton, 2000]. Les composs de dpart de la biosynthse des flavonoides sont le malonyl CoA et les drivs CoA de lacide cinnamique, le cinnamoyl CoA [Gerhard, 1993]. Ces composs sont forms suite deux voies complmentaires, voie actate malonate et voie shikimate [Hollman et al.,

1999 ; Elicoh-Middleton, 2000]. La voie shikimate conduit la synthse de lacide cinnamique et donc au cycle B et la chane en C3 qui formera le cycle oxygn C de la structure de base des flavonodes. Les prcurseurs de cette voie sont lrythrose 4-phosphate de la voie des pentoses et le PEP rsultant de la glycolyse [Marfak, 2003]. La voie actate malonate constitue la voie de synthse du noyau A. Ce systme aromatique est form par condensation rpte dunits dactate [Gerhard, 1993]. Ces deux voies sont alors condenses pour engendrer un prcurseur commun la 4, 2,4,6 ttrahydroxychalcone avec la catalyse de la chalcone synthase [Elicoh-Middleton, 2000]. Ce pigment jaune est mtabolis en diffrentes classes des flavonoides sous laction denzymes spcifiques (figure 9). Des ractions post-biosynthtiques sont enfin effectues pour donner la structure finale aux flavonoides telles que la glycosylation, lacylationformes natives sur lesquelles se trouvent in vivo [Marfak, 2003]. Il existe cependant des flavonoides non glycosyls comme la querctine [Bruneton, 1993 ; Remesy et al., 1996 ; Elicoh-Middleton, 2000 ;].

Figure 9 : Voie de biosynthse des flavonodes [Gerhard, 1993].

2.2.2. Structure et classification.

Les flavonodes se rpartissent en quinze familles de composs, dont les plus importantes sont les suivantes : flavones, flavonols, flavanones, flavanonols, isoflavones, isoflavanones, chalcones, aurones et anthocyanes [Harborne et Williama, 2000 ; Kuresh et al., 2002]. Les composs de chaque sous classe se distingue par le nombre, la position et la nature des substituants sur les deux cycles aromatiques A et B et le cycle intermdiaire [Julies et Christin, 2002]. Les flavonodes se rencontrent la fois sous forme libre ou sous forme dhtrosides qui rsultent de la combinaison du groupe rducteur dun ose avec une substance non glucidique : laglycone ou la gnine, avec limination deau. La partie osidique peut tre mono-, di- ou trisaccharidique. La partie glycarique est forme soit dhexoses ( D-glucose , D-galactose , Dallose ) ou de pentoses ( D-apiose , L-arabinose , L-ramnose ) ou avec des acides ( Dglucuronique , D-galacturonique ). La partie osidique peut tre linaire ou ramifie [Gerhard, 1993]. La liaison GENINE-OSE existe entre un hydroxyle phnolique ou dun hydroxyle de lhtrocycle oxygn et un OH ou un -CH de la fonction hmiactalique du ou des ose(s). On obtient alors des O-HETEROSIDES ou des C-HETEROSIDES (figure 10), [Milane, 2004].

Figure 10 : Structure chimique deux flavonodes : a : la rutine ; b : la saponarine

- Il existe diffrentes gnines :

Figure 11 : Exemple de deux structures de flavonodes : a : flavone ; b : isoflavone.

2.3. Pharmacocintique des flavonodes

2.3.1. Biodisponibilit

Les tudes de Vanessa et al. (2003) montrent que cette biodisponibilit dpend de trois facteurs essentiels : La capacit de transport travers la bordure en brosse des anthrocytes, lintensit de la scrtion intestinale des flavonodes conjugus vers la lumire intestinale et vers le sang et de la capacit de la scrtion biliaire. Les flavonodes prsentent une faible biodisponibilit avec une limination lente qui diffre dun flavonode lautre. En prenant comme exemple, la querctine, le principal flavonode consomm par lhomme dans ses aliments (persil, oignon, myrtilles, cerises) [Remesy et al., 1996], aprs 174 min, un temps de demi-vie dabsorption de 52 min, de distribution de 228 min et dlimination de 1008 min [Elicoh-Middeleton et al., 2000]. In vitro, le pouvoir antioxydant de nombreux flavonodes est suprieur celui de la vitamine C et de la vitamine E [Elicoh-Middeleton et al., 2000].

2.3.2. Absorption intestinale et mtabolisme

Les flavonodes sont prsents dans notre alimentation sous plusieurs formes. Cette particularit va leur confrer des mtabolismes diffrents. Les formes libres (aglycones) peuvent tre directement absorbes au niveau de lintestin grle [Hollman et al., 1997 ; Hollman and Katan, 1998] tandis que les formes glycosyles doivent tre hydrolyses, sous linfluence des glycosidases, par la flore intestinale au niveau du clon avant dtre absorbes [Manach et al.,

1995 ; Manach et al., 2004]. Cependant les formes libres issues de cette hydrolyse peuvent galement tre dgrades par la microflore en acide phnolique, lui mme absorb ou limin via les fces [Williams et al., 2004].

Les principaux sites de mtabolisme sont la flore intestinale et le foie [Haslam, 1998]. Les mtabolites, glucuro- et sulfoconjugus des flavonodes absorbs sont limins principalement par la bile, lexcrtion urinaire ne reprsentant que 3 6 % de llimination totale [Haslam, 1998]). En effet, les flavonodes sont transforms, dans lenthrocyte, en flavonodes conjugus par mthylation, sulfatation, glucuronidation [Crespy et al., 2004]. Une partie de ces flavonodes est dverse dans le sang tandis quune autre est destine vers la lumire intestinale ce qui constitue lun des mcanismes de contrle de labsorption intestinale de ces substances phnoliques [Gee et al., 2000 ; Crespy et al., 2004].

Dans le sang, les flavonodes ne sont pas prsents sous leur forme native car ils ont t transforms, cause de leur transformation au niveau du foie et de la cellule intestinale. La fraction des flavonodes conjugus destine finalement vers les tissus pourrait avoir un effet biologique potentiel ou serait limine dans les urines. Cependant, dautres flavonodes conjugus pourraient tre dverss dans lintestin via la bile et y tre hydrolyss par les enzymes de la flore intestinale librant ainsi de nouveaux aglycones en constituant probablement un recyclage entrohpatique des flavonodes qui permet le maintien dune concentration non ngligeable dans le sang [Manach et al., 1995 ; Rechner et al., 2000].

2.4. Proprits pharmacologique des flavonodes

2.4.1. Proprits anti-inflammatoires et immunologiques

De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonodes possdent des proprits antiinflammatoires et quils sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire [Da Silva et al., 1994 ; Galati et al., 1994 ; Middleton, 1996]. Les flavonodes sont de puissants inhibiteurs de la prolifration des lymphocytes B et T [Mookerjee et al., 1986 ; Namgoong et al., 1994 ]. Leur effet sur les lymphocytes B ou T peut tre variable: en effet, les flavones (apignine, lutoline et 7,3,4 hydroxyflavone) et les flavonols (kaempfrol, querctine et myrictine) inhibent la prolifration des lymphocytes T alors que la myrictine

est active sur les lymphocytes B [ Mookerjee et al., 1986 ]. Leffet antiprolifratif des flavonodes pourraient sexpliquer par leur capacit inhiber lactivit de certaines protines kinases (protine Kinase C ou protine tyrosine kinase) [Mookerjee et al., 1986 ; Namgoong et al., 1994 ]. Par ailleurs, les flavonodes sont susceptibles de diminuer la libration dhistamine des basophiles et des mastocytes [Middleton and Drzewiecki, 1984]. La querctine a un effet anti inflammatoire en inhibant les enzymes de synthse [la cyclooxygnase (pour les postaglandines) et la li-oxygnase (pour les leucotrines) des principaux mdiateurs de linflammation [Middleton and Drzewiecki, 1984].

2.4.2. Proprits antivirales et antibiotiques

La stratgie de recherche dun compos antiviral consiste mesurer la rduction de linfection virale de cellules en culture. Une substance peut agir diffrents niveaux du cycle viral [Milane, 2004]: - au niveau de la pntration du virus dans la cellule hte, - au niveau de la rplication du virus et la synthse des protines virales, - au niveau de lassemblage et de la sortie du virus hors de la cellule hte. Les flavonodes sont capables dagir au niveau de la synthse des protines virales permettant ainsi une bonne protection des souris vis--vis dune infection virale la suite dune administration journalire de 3-O-mthylquerctine raison de 20 mg/kg pendant 9 jours [Vrijsen et al., 1987]. Dautres chercheurs [Muecsi and Pragai, 1985] ont galement montr une corrlation entre leffet inhibiteur de certains flavonodes sur divers virus de lherps et leur capacit augmenter les taux intracellulaires en AMPc dans des cellules infectes. Les travaux de Spedding et al. (1989) ont mis en vidence un impact des flavonodes sur le rtrovirus HIV responsable du syndrome dimmunodficience acquise (SIDA). Ils ont dmontr que les flavonodes sont de bons inhibiteurs de la reverse transcriptase. Cependant, leur impact semble plus fort sur lADN et lARN polymrase de la cellule hte que sur la reverse transcriptase virale [Ono et al., 1990a ; Ono et al., 1990b]. Certains travaux de recherche [Mahmood et al., 1993] ont montr que les flavonodes pouvaient avoir une action plus slective en interagissant avec une glycoprotine de surface du virus HIV (la gpl20), en empchant ainsi la liaison du virus la cellule hte. Enfin, les flavonodes seraient susceptibles dinhiber lintgrase rtrovirale du virus HIV-1 qui assure lintgration du gnome viral celui de la cellule hte [Mahmood et al., 1993 ; Fesen et al., 1994].

Des tudes [Ohemeng et al., 1993 ; Sato et al., 1995] ont apport lvidence de leffet bactricide de diffrentes flavanones sur lADN gyrase dune bactrie staphylococcus aureus. Le mcanisme des effets antimicrobiens des polyphnols est sans doute trs complexe. Parmi les hypothses avances, il faut citer: Linhibition des enzymes extracellulaires microbiennes ; la squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation de mtaux tels que le fer ; linhibition du mtabolisme microbien [Mila and Scalbert, 1994].

2.4.3. Proprits antinoplasiques

Des tudes ralises chez la souris ont mis en vidences les effets protecteurs des flavonodes vis--vis des promoteurs de tumeurs [Kato et al., 1983]. La querctine, par exemple, est lun de ces phnoliques capables de diminuer, chez le rat, lincidence des tumeurs mammaires induites par le DMBA (7,12 dimthylbenz(a)anthracne) ou la NMU (Nnitrosomthylure) [Verma et al., 1988]. Les flavonodes peuvent galement interfrer avec le mtabolisme des xnobiotiques notamment en stimulant les systmes de dtoxification [Wattenberg Lee, 1983 ; Bu-Abbas et al., 1995]. En donnant des rats ou des souris une alimentation contenant de la flavone ou de la querctine, des chercheurs [Nijhoff et al., 1995] ont observer des effets chimioprventifs divers niveaux en particulier au niveau du foie par une stimulation de la glutathion-Stransfrase. Enfin, les flavonodes peuvent inhiber les enzymes intervenant dans lactivation des procarcinognes en intermdiaires mutagnes et carcinognes [Obermeier et al., 1995 ; Lasker et al., 1984].

2.4.4. Proprits antioxydantes des flavonodes

Les polyphnols et surtout les flavonoides sont des antioxydants puissants susceptibles dinhiber la formation des radicaux libres et de sopposer loxydation des macromolcules [Van Acker et al., 1995]. En effet, les flavonodes sont des pigeurs efficaces des radicaux libres les plus prooxydants, particulirement impliqus dans la peroxydation lipidique, puisquils la prviennent comme l-tocophrol. Ils formeraient des espces radicalaires intermdiaires peu ractives [ Laughton et al., 1989 ; Puppo,1992 ]. De plus, ils ont une activit chlatrice des mtaux tels que cuivre et fer qui, ltat libre, peuvent tre lorigine de la production de radicaux libres par les ractions de Fenton et dHaber-Weiss [Puppo,

1992 ; Van Acker et al., 1995]. Les flavonodes sont de puissants inhibiteurs de loxydation des LDL [Laughton et al., 1989 ; De Whalley et al., 1990 ].

2.4.5. Proprits prooxydantes des flavonoides

Les flavonoides sont connus pour avoir des proprits antioxydantes mais ils sont sucseptibles davoir un effet prooxydant [Kessler et al., 2002]. En effet, plusieurs dentre eux ont t dcrits comme responsables dauto-oxydation et de la gnration de radicaux oxygns actifs, comme le peroxyde dhydrogne [Laughton et al., 1989 ; Yen et al.,1997]. Lactivit prooxydante de ces substances est le rsultat de leur capacit rduire les mtaux comme le Fe
+3 +2

pour donner Fe

lequel ragira avec O2 ou H2O2 avec gnration dinitiateurs de

loxydation [Kessler et al., 2002] . En dfinitive, certains flavonodes pourraient acclrer la survenue de latteinte oxydative de lADN, des protines et des glucides in vitro [Yen et al., 1997 ; Kessler et al., 2002]. Cependant, le potentiel pro-oxydant de ces composs ne doit pas tre nglig dans le mcanisme daction des flavonodes.

2.5. Distribution des flavonodes

Les flavonodes se rpartissent dans les organes ariens jeunes (jeunes feuilles, boutons floraux) o ils sont localiss dans les tissus superficiels (assise palissadique), et parfois dans les racines [Milane, 2004]. Au niveau cellulaire, les flavonodes de type htrosides, sont dissous dans le suc vacuolaire ou localiss dans les chloroplastes et les membranes des vgtaux [Bruneton, 1993]. Chez les angiospermes la diversit structurale des flavonodes est maximale avec une trentaine de flavonodes identifis chez les Astraces [Bruneton, 1993 ; Milane, 2004]. En dfinitive, les flavonodes possdent une large rpartition dans le monde vgtal. Le tableau 2 illustre la rpartition des 4-oxo-flavonodes dans quelques fruits et lgumes.

Tableau 2 : Teneur en flavonodes dans quelques fruits et lgumes [Remesy et al., 1996].

Fruits et lgumes Pamplemousse Orange Persil Laitue Oignon Endives Myrtilles cultives Chou fris Ciboulette Chou fris (serr) Poireau Cleri Cerises aigres Cassis Haricots verts Choux de Bruxelles Raisins Abricots Mres Brocolis Pommes Groseilles Framboises Prunes Cerises douces

mg/kg poids 2700/6000 1700/2800 500 320 300 290 165 150 110 105 100 100 100 80 70 65 50/100 55 50 35 30 30 30 30 12 Hesprtine Naringnine Apignine Querctine

Aglycones

Querctine + Kaempfrol Kaempfrol Querctine Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Apignine + Lutoline Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol Querctine + Kaempfrol

2.6. La plante Ranunculus repens L (RRL) 2.6.1. Systmatique de la plante

La plante RRL est une espce vivace herbace, gnralement duveteuse longs stolons rampants, les feuilles triangulaires ont trois dents, celui du milieu tant ptiol. Les fleurs ont cinq ptales jaunes, cinq spales dresss et beaucoup dtamines. Le rceptacle porte de nombreux carpelles qui, maturit, donnent des aknes bec grle [Gerard and Camille, 2003], (Figure 12). Systmatique [Gerard and Camille, 2003 ; Pierre, 2003]: v Phylum: Dictotyldone. v Famille : Ranunculaceae. v Ordre : Ranale ou polycarpique. v Genre: Ranunculus. v Espce: Ranunculus repens L. v Nom Arabe: Mergheris (El-houdane). v Nom commun : Ranunculus rampante.

2.6.2. Biologie de Ranunculus repens L La Ranunculus repens L est une herbe rampante avec des racines fibreuse, elle est commune dans les pturages, champs et dans les zones humides aux climats temprs. Elle produit de nouvelles plantes ou clones qui se dveloppe travers les stolons qui poussent dans les aisselles des feuilles (Figure 12). Au printemps des stolons latraux sont produits dans les feuilles et la production de stolons continue jusqu la fin de lt. Une deux stolons par plante sont communes mais il y a des plantes qui peuvent avoir jusqu cinq ainsi que des branches secondaires [Holm et al., 1997]. En automne, quand les rameaux sont tablis le stolon devient ple et meurt laissant des rosettes physiologiquement indpendantes se dvelopper et deviennent des fleurs. La saison prochaine pendant que la plante originale plit et meurt, la nouvelle plante peut persister durant lhiver comme une petite rosette. Le court caudex stocke les matires nutritives qui permettent lacclration de la croissance en printemps (entre Avril et Juin) [Holm et al., 1997 ; Sarukhan, 1976]. Une enqute a rvle que chaque fleur produisait une vingtaine de graines. En gnral, la saison de fleurs est entre

Avril Juillet [Alex, 2001]. Cette floraison est suivie de fruits en deux semaines. La Ranunculus repens est rsistante la gele et survit la scheresse modre [Holm et al., 1997].

Figure 12: La plante Ranunculus repens L dans son milieu systmatique (Chekfa, Jijel, Est Algrie).

1.6.3. Ethnopharmacologie de la Ranunculus repens L

Ranunculus repens L est une plante appartient la famille Ranunculaceae, communment appele EL-Faiha (Berbre). Dans la mdecine traditionnelle, les feuilles sches sont utilise sous forme dinfusion pour traiter le diabte sucr et la jaunisse en petite Kabylie (Est dAlgrie). Selon les rsultats dune tude non publies, cette plante parait riche en composs polyphnoliques et contient une teneur importante en flavonodes. La consultation de la littrature scientifique ne montre aucune recherche phytopharmacologique sur cette plante [Holm et al., 1997 ; Sarukhan, 1976 ; Alex, 2001].

3. Matriel et mthodes

3.1 Prparation des extraits phnoliques

Les jeunes pousses de feuilles de Ranunculus repens L ont t rcoltes au mois d avril 2004 dans la rgion de Chekfa (Wilaya de Jijel, Est Algrie) au cours de la priode de floraison. Aprs leur identification par le Laboratoire de phytopharmacologie, Universit de Jijel, les chantillons de feuilles sont nettoys puis mis scher temprature ambiante dans un endroit ar lombre pour mieux conserver les molcules sensibles la chaleurs et la lumire. Le broyat va constituer la matire sche qui va servir lextraction des flavonodes.

3.1.1. Extraction des flavonodes

Lextraction des flavonodes est ralise selon la mthode de Markham (1982), avec modification inspire selon la mthode de Bruneton (1993). Elle est base sur le degr de solubilit des flavonodes dans les solvants organiques (Figure 13). Cette mthode comprend deux grandes tapes : la premire phase dextraction se fait avec le mthanol pour solubiliser les flavonodes et la deuxime est ralise avec lther dithylique ( extraction des gnines libres) et lactate dthyle (extraction des monoglycosides) et le n-butanol( pour solubiliser les di et les triglycosides).

Lextraction des flavonodes est effectue partir de la matire sche finement broye par du mthanol 85% (10% W/v). Le macrt est filtr sur Bchner sous pression rduite puis soumis une vaporation basse pression 35C (Rota Vapor, Bchi 461, Germany). La phase aqueuse ainsi obtenue est conserve 48 heures 40C pour acclrer la diffusion des molcules dans les solvants puis filtre. Le filtrat est dbarrass des cires, des lipides et de la chlorophylle par trois lavages successifs avec lther de ptrole (v/v) pour donner une phase aqueuse. Afin de sparer les flavonodes en fractions aglycones, monoglycosides et di et triglycosides, la phase aqueuse est mlange avec lther dithylique (v/v) pour obtenir une phase organique contenant les flavonodes aglycones et les aglycones mthoxyls. La phase aqueuse restante subit son tour trois extractions avec lactate dthyle afin de rcuprer dans la phase organique certains flavonodes aglycones mais surtout les monoglycosides. La

phase aqueuse restante est mlange avec le n-butanol pour rcuprer notamment les flavonodes di et triglycosides. La phase aqueuse finale contient surtout les flavonodes glycosyls plus polaires. Les quatre fractions rcoltes sont concentres par vaporation basse pression 35C puis lyophilises pendant 24 heures (ALPHA 1-2 LD, Fisher Bioblock). La lyophilisation permet dobtenir un produit facilement soluble dans leau et qui, aprs addition deau, prsente les mmes caractristiques que le produit dorigine. Chaque Lyophilisat est pes pour calculer le rendement de lextraction, exprim en gramme de lyophilisat par 100 g de matire sche.

3.1.2. Dosage des polyphnols

Lvaluation des polyphnols totaux est ralise selon la mthode du bleu de Prusse de Price et Butler, 1977 [Butler, 1989], modifie par Graham (1992) pour donner une meilleur stabilit de la couleur. La diffrence entre la mthode originale et la mthode modifie rside dans lutilisation du FeCl3 la place du FeNH4 (SO4)2 comme second ractif. Une prise dessai de 0.1 ml de mthanol (contenant 0.02 mg de lextrait n-butanolique, 0.02 mg de lextrait dactate dthyle, 0.06 mg de lextrait dther thylique ou 0.04 mg de lextrait aqueux) est mlange avec 3 ml deau distille. 15 min aprs laddition successive de 1 ml de K3Fe (CN)
6

0.016 M et de 1 ml de FeCl3 (0.02 M dans HCl 0.1 N), 5 ml de

stabilisant (mlange deau bi distille, de lacide phosphorique 85 % et de la gomme arabique 1% (dans les proportions 3 :1 :1 v/v/v) sont ajouts et labsorbance est lue 700 nm (Shimadzu UV 1601, Japan). Une gamme talon est tablie sparment avec lacide gallique (25-200 g/ml) (figure 1, Annexe 1) pour calculer la concentration des polyphnols dans chaque extrait. Les rsultats du dosage sont exprims en mg dquivalent dacide gallique par gramme de lyophilisat

Matire sche
Broyage - Extraction (mthanol 85%, 1 : 10 w/v) - Conservation 4C/72 - Filtration (mousseline)

Filtrat

Sdiment
- Extraction (mthanol 85%, 2 fois, v /v) - Filtration (mousseline)

Filtrat

Sdiment
- Extraction (mthanol 50%, 2 fois) - Filtration (mousseline)

Filtrat Filtrat combin

- Filtration (papier filtre) - Evaporation basse pression 35C Phase aqueuse - Conservation 4C /48 h - Filtration (papier filtre)

Sdiment

Sdiment

Filtrat
Lavage avec lther de de ptrole Lavage avec lther deptrole Lavage avec lther deptrole Lavage avec lther ptrole Phase aqueuse Extraction (ther di-thyl, 3 fois, v/v)

Phase organique (cires, lipides, chlorophylle)

Phase organique

Phase aqueuse
Extraction (actate dthyle, 3 fois, v/:v) Phase aqueuse

Phase organique

Extraction (butanol, 3 fois, v/v) Phase organique Phase aqueuse

Evaporation basse pression 35C - Lyophilisation Extrait dther dithyl (Flavonoides aglycones) Extrait dactate dthyle (Flavonoides mono glycosides) Extrait n-butanol (Flavonoides di et triglycosides) Extrait aqueux (Falvonodes trs polaires)

Figure 13 : Protocole de fractionnement des flavonodes de RRL

3.1.3 Dosage des flavonodes

Lvaluation quantitative des flavonodes dans les diffrentes fractions est ralise selon la mthode du trichlorure daluminium [Bahorun et al., 1996]. Brivement, les chantillons sont prpars par la dissolution des lyophilisats obtenus lors de lextraction dans le mthanol : extrait dther dithylique 0.14 mg/ml ; extrait dactate dthyle 0.06 mg /ml ; extrait de nbutanol 0.02 mg/ml ; extrait aqueux 0.2 mg/ml. A 1 ml de chaque chantillon est ajout 1ml de LAlCl3 2% dans le mthanol. Dix minutes aprs le dbut de la raction, labsorbance est lue 430 nm. Une gamme talon est tablie sparment avec la querctine (1-25 g/ml) (figure 2, Aannexe 1) pour calculer la concentration des flavonodes dans chaque extrait. Les rsultats du dosage sont exprims en milligramme dquivalent de querctine par gramme de lyophilisat.

3.1.4. Evaluation du pouvoir oxydant des flavonoides

La capacit antiradicalaire des flavonodes di et triglycosydes (EB) est value in vitro par la mthode de DPPH (2, 2 - Diphenyl-1-picrylhydrazyl) rapport par Wahllandir et al. (1979). Brivement, 15l de diffrentes concentrations de flavonodes 0.1, 0.2 et 0.4 mg/ml, (0.158, 0.079 et 0.039 mg dquivalent en querctine (en considrant leur pourcentage dans le (lyophilisat), sont ajouts 1.5 ml de DPPH dans une solution thanol (100M). Un tube standard est prpar avec la vitamine C (0.158 mg/ml). Labsorbance est lue chaque 30 s durant 5 min 515 nm. Leffet boueur des flavonodes est exprim en pourcentage de DPPH rduit en partant du 100% du tmoin (DPPH seul) selon la relation suivante:

% de rduction = [AT - AE/AT].100

AT: Absorbance du tmoin aprs 5min. AE: Absorbance de l'essai aprs 5 min.

3.2. Exprimentation animale

3.2.1. Animaux et conditions dhbergement

Les animaux dexprience sont des rats males de varit Wistar (Institut Pasteur, Alger) pesant entre 220-250 g. Tous les animaux de statut sanitaire EOPS (Exempts dorganismes pathognes spcifiques). Ds leur rception, les rats sont placs alatoirement en groupe de 6 dans des cages standard pour une priode dacclimatation (2 semaines) avant dtre utiliss dans les diffrentes expriences. Pendant cette priode les animaux ont un accs libre la nourriture et leau (croquettes provenant de la socit de production des aliments danimaux, Bouzarat, Alger ) et sont maintenus dans une animalerie temprature constante (22 2) C soumis un cycle de lumire/obscurit de 12/12h. La phase obscure de ce cycle commence 12h et les diffrentes expriences ont toujours lieu de 13h 18h en raison de lactivit nocturne de lanimal (phase active).

3.2.2. Recherche de la toxicit des flavonodes de RRL La DL50 des extraits flavonodiques de Ranunuculus repens L nest pas connue dans la littrature consulte ainsi la recherche dune ventuelle toxicit de la plante est ncessaire. Pour ce faire, lextrait butanolique de RRL aux doses de : 25, 250, 500, 1000, 2000 mg/kg dans une solution physiologique (Na Cl 0.9%) sont administrs par voie orale aux cinq groupes de rats et la solution physiologique au sixime groupe servant de contrle. Les rats sont mis lobservation continue durant 72h concernant les symptmes de toxicit, le changement de comportement et la mortalit [Litchfield and Wilcoxon, 1949].

3.2.3. Test de tolrance au glucose

Le pouvoir hypoglycmiant est mesur afin de dterminer la dose la plus efficace des diffrents extraits flavonodiques de RRL (extrait dther dithylique, extrait dactate dthyle, extrait n-butanolique). Les trois extraits sont mis en suspension dans une solution de srum physiologique (Na Cl 0.9%) puis administrs des rats par voie orale (100 mg de lyophilisat/ kg) une heure avant le gavage gastrique dune solution de glucose la dose de 4 g/kg. Les animaux tmoins sont rpartis en groupe tmoin recevant une solution

physiologique, un groupe hyperglycmique recevant une solution de glucose (4 g/ kg) et un troisime groupe standard recevant la glibenclamide (mdicament hypoglycmiant) la dose de 2.5 mg/kg [Silva et al., 2002] une heure avant ladministration du glucose par voie orale. Lvolution de la glycmie est suivie avant et chaque demi heure sur une dure de 2 heures de traitement. Le dosage de glucose srique est ralis par une mthode colorimtrique utilisant des Kits (Biomrieux, France) sur un automate multiparamtrique (TECHNICON, Germany). Le pourcentage de la chute de la glycmie (PCG), est utilis comme index de lactivit hypoglycmique des flavonodes [Puri, 2001].

3.2.4. Evaluation de leffet des flavonodes sur le stockage de glycogne hpatique et linsulinoscrtion

3.2.4.1. Evaluation du stockage de glycogne hpatique

Lvaluation

du taux de la teneur hpatique en glycogne chez les

rats hyper

glycmiques est ralis selon le protocole suivant : 2 groupes de rats sont prpars : le premier sert de contrle, reoit une solution de glucose la dose de 4g/kg dans une solution physiologique par voie orale ; le second constitue le lot trait par les flavonodes la dose de 100 mg/kg, par voie orale, aprs une heure dadministration du glucose 4g/kg dans une solution physiologique. 3 heures leffet des flavonodes, Les rats sont sacrifis par dislocation cervicale et subissent une dissection abdominale. Les foies sont prlevs et fixs dans le Bouin (formol/ acide picrique/ acide actique). Lvaluation de glycogne est ralise par deux mthodes diffrentes, une mthode colorimtrique et une mthode histochimique [Dedier, 1994] :

Mthode colorimtrique

5 grammes de foie frais sont coups en petits morceaux et bouillis ensuite dans 50 ml deau distille pendant 2 minutes. Les fragments de foie sont goutts laide dune passoire et broys avec le mortier. 25 ml deau distille sont jouts au broyat et la suspension obtenue est bouillie pendant 5 minutes. Le bouillonnt est filtr sous vide sur Bchner puis le filtrat est rcupr avec 3 gouttes dHCl (pour prcipiter les protines) et est filtr nouveau. Le filtrat est trait par 4 fois son volume dalcool 95% puis filtr sous vide et le filtrat final est repris avec 2 ml deau distille (figure 14).

Pour doser le glycogne, 3 ml deau distille et une goutte de Lugol sont ajouts 1 ml dextrait de glycogne obtenu et la densit optique de la coloration brun acajou est lue 470 nm [Dedier, 1994]. La concentration de glycogne est dduite partir dune gamme talon tablie avec du glycogne pure comme standard figure 1, (Annexe1,).

Mthode Histochimique

- Prparation des blocs: Aprs fixation dans le Bouin (on ralise une dissection de labdomen afin dextraire le foie. Le foie est bien lav et puis conserv dans un fixateur [solution du Bouin (formol / acide picrique / acide actique)]. Les fragments des foies sont dshydrats par submersion dans des bains dthanol des concentrations allant en ordre croissant : 60 %, 70% ,80%, et 100%. Aprs dshydratation par lthanol, les chantillons subissent deux bains de xylne et deux autres de paraffine fondue. Le xylne occupe la place de leau et donc facilite la pntration de la paraffine puisque cette dernire est hydrophobe. La dure de chaque bain est de 24 heures. Les chantillons des foies sont placs dans des moules (barres de Leucart) et recouverts de paraffine fondue. Aprs refroidissement, les blocs sont prts la coupe.

- Ralisation des coupes et coloration : les blocs sont placs dans le microtome afin de raliser des coupes de 3m dpaisseur. A laide dune pince trs fine, les coupes sont places sur des lames couvertes de glatine qui sont ensuite dparaffines par chauffage ltuve pendant une heure. Pour mettre en vidence les hpatocytes, les coupes sont dabord rhydrates par submersion successivement dans les bains suivants : 2 bains de tolune (30 min), 5 bains dthanol des concentrations dcroissantes : 100%, 90%, 80%,70%, 60% (5 min chacun). Aprs rinage dans de leau distille, les coupes rhydrates sont places dans un bain dhmatoxyline (8 min) pour colorer les noyaux, lexcs de colorant est enlev par lacide chlorhydrique. Elles sont mises ensuite dans un bain dosine (8 min) pour colorer le cytoplasme, lexcs de colorant est enlev par lthanol. Pour mettre en vidence les granules de glycogne hpatique, les lames ayant subi la coloration de base, sont submerges dans un bain de Lugol (leau iod) pendant 15 min puis dans un bain dthanol pour liminer lexcs du ractif. Les lames ainsi colores sont couvertes de lamelles et prtent lobservation microscopique (objectif x 100).

Pour viter les interfrences de couleurs, une deuxime coloration de base est faite ensuite par le bleu de mthylne qui remplace lhmatoxyline et losine dont le but est damliorer lobservation des coupes et les granules de glycognes.

3.2.4.2. Evaluation de leffet des flavonodes sur linsulinoscrtion

Pour valuer leffet de lextrait butanolique sur la scrtion insulinique, un groupe de rats normoglycmique est trait par une monoprise de flavonodes (EB) la dose de 100 mg/kg. Deux autres groupes tmoin et standard reoivent respectivement de la solution physiologique et de glibenclamide (2,5 mg/kg). Linsulinmie est mesure avant gavage et aprs 60 et 90 min par une mthode immuno-enzymatique de type ELISA [Monti et al., 1995], (AxSYM Insulin reagent pack, Abbott Laboratory, USA). Ce dosage est effectu sur le srum, aprs centrifugation en vitant lhmolyse qui gne le dosage immuno-enzymatique et dans les plus brefs dlais afin dviter la destruction de lhormone par les insulinases plasmatiques.

3.2.4.3. Effet des flavonodes sur la complexation du glucose in vitro : Test de glycosylation

Le but de ce test est destimer la capacit des flavonodes complexer le glucose libre in vitro, donc dmontrer leur rle de glucophage. Bien que les conditions in vivo et in vitro soient diffrentes, ce test pourra nous renseigner sur un des mcanismes hypoglycmiants les flavonodes. Pour cela, 10 l dune solution glucose (0. 61g/l) est mlang avec 10 l de chaque extrait flavonodique (Aglycones, monoglycosides, di et triglycosides) diffrente concentration : 1 mg, 2mg et 4 mg/ml. Le tmoin est constitu par 10l deau distille. Le mlange ainsi obtenu est incub 37C pendant 15 min. Le dosage de glucose non li aux extraits flavonoiques est mesur selon la mthode de Bertrand prcdemment dcrite.

Sacrifice des animaux

Peser et couper 5 g de foie frais Bouillir dans 50 ml d'eau distille Broyage

Ajouter 25 ml d'eau distille Bouillir 5 mn

Filtration sous vide

Filtrat

Rcupration avec 3 gouttes d'HCl Filtration sous vide Filtrat

Rcupration avec 4 fois son volume d'alcool

Filtrat Liquide hpatique contenant le glycogne

Filtration sous vide

Reprendre avec 2 ml d'eau distille

Figure 14 : Protocole d'extraction du glycogne hpatique

3.2.5. Evaluation de lactivit antidiabtique des composs phnoliques

3.2.5.1 Induction de diabte exprimental

Pour valuer lactivit antidiabtique des flavonodes, un modle de rat diabtique induit par lalloxane est ralis. Linjection de lalloxane par voie intra pritonale (125 mg/Kg de poids) dclenche un diabte chez le rat [Diatewa et al., 2004], sachant que lalloxane monohydrate est indicteur de diabte qui provoque une ncrose slective sur les cellules bta du pancras donnant ainsi une dficience insulinique chronique [Dhanabal et al., 2007]. Lalloxane monohydrate (Pharmacia, St.Quentin en Yvelines, France), reconstitu juste avant ladministration dans une solution physiologique (Na Cl 0.9%) pour constituer la concentration dcrite prcdemment pour tre inject au rat une semaine aprs linjection, une valuation de glucose sanguin est effectue et les rats dont le glucose sanguin est suprieur 2 g/l sont considrs diabtiques et rpartis alatoirement en groupe de 5.

3.2.5.2. Effet aigu de lextrait butanolique sur les rats diabtiques

Le test de tolrance au glucose montre une meilleure amlioration de la tolrance des animaux au glucose avec lextrait n-butanolique, (EB) (di et triglycosides) Afin dvaluer leffet antidiabtique de lextrait n-butanolique, 5 groupes de 5 rats sont utiliss: le groupe 1, contrle diabtique recevant 1 ml dune solution physiologique (Na Cl 0.9%) par voie orale ; les groupes 2, 3 et 4 reoivent respectivement lextrait EB de la RRL par voie orale en une seule dose de 200, 400 mg/kg et 600 mg/kg dans une solution physiologique ; le groupe 5, contrle standard, reoit la Glibenglamide la dose de 2,5mg/kg, p.o. La glycmie des animaux est mesure avant gavage et 30, 60, 90 et 120 min aprs le traitement.

3.2.5.3. Effet subchronique de lextrait butanolique (EB) sur les rats diabtiques

Pour valuer leffet antidiabtique de lextrait butanolique sur les rats diabtique durant 28 jours, trois groupes de rats sont utiliss cet effet. Un groupe diabtique et un groupe standard reoivent par gavage respectivement une dose quotidienne de 200 mg/kg de flavonodes et de 2,5 mg/kg de glibenclamide ; un groupe tmoin diabtique reoit une solution physiologique (Na Cl 0.9%). La glycmie des animaux est mesure J+7, J+14, J+21 et J+28.

3.2.5.4. Le prlvement du sang

2 ml de sang sur EDTA 8,5 % sont prlevs au besoin laide dune pipette pasteur travers le sinus rtro-orbital au niveau de lil des rats. Le sang rcupr est immdiatement centrifug 4000 t/min pendant 10 minutes 10C centrifugeuse (Bioblock Sscientifc Centrifugeuse 55702), pour lanalyse des paramtres biochimiques.

3.2.6. Effet prventif des extraits de flavonodes et de la querctine sur le diabte induit par lalloxane

Lactivit antioxydante des flavonodes est tudie in vivo 5 heures aprs linjection de lalloxane. Deux groupes prtraits par les flavonodes ou la querctine sont compars un groupe tmoin. Aprs le traitement, les rats sont sacrifis par dislocation cervicale et les pancras sont prlevs. Le 1 er groupe reoit, par voie orale, deux doses de 200 mg de lyophilisat /kg (0.794 mg quivalent de querctine) avant et aprs deux heures de linjection de lalloxane, le second est trait par la querctine pure la mme dose (tmoin positif) en fin le 3eme groupe (tmoin ngatif) a reu la solution physiologique en plus de linjection de lalloxane.

La glycmie et linsulinmie sont mesures avant et aprs dix jours de traitement (injection de lalloxane et/ou de flavonodes).

3.2.7. Recherche des mcanismes de prvention des extraits butanoliques de RRL

3.2.7.1. Peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique dans le pancras est value par le dosage de malondialdhyde (MDA) selon la mthode dOhkawa et al. (1979)]. Le MDA est lun des produits terminaux de la dcomposition des acides gras polyinsaturs (PUFA) sous leffet des radicaux libres librs au cours du stress. En milieu acide et chaud (pH 2 3, 100 C) une molcule de MDA est condense avec deux molcules de thiobarbiturique (TBA) pour former un complexe color en ainsi (figure 15) : rose (lecture 530 nm). Le principe de cette mthode est rsum

Figue 15; Principe du dosage du malondialdhyde

Pour le dosage du MDA, 1 g de pancras est additionn 3 ml de solution de KCl (1,15 M) puis broyage par un homogniseur de Dounce (Kontes, Glass companyan ISO-9001 steered firm, New Jersey USA). 0,5 ml de lhomognat 0,5 ml dacide trichloractique 20 % et 1 ml dacide thiobarbiturique (TBA) 0,67 % sont additionns. Le mlange est chauff 100 C pendant 15 minutes, refroidi puis additionn de 4 ml de n-butanol. Aprs centrifugation de 15 minutes 3000 tours/minute, labsorbance est dtermine sur le surnageant au spectrophotomtre (LKB II) 532 nm.

La concentration de MDA est dduite partir dune gamme talon tablie dans les mmes conditions avec 1, 1, 3,3 ttratoxypropane qui donne le MDA aprs son hydrolyse en solution figure 4, (Annexe1). Les rsultats du dosage sont exprims en nmol/gramme de pancras.

3.2.7.2. Dosage de glutathion pancratique (GSH)

Le dosage du GSH est bas sur la mthode colorimtrique dEllman (1959). Le principe est bas sur la raction doxydation du GSH par lacide 5, 5- Dithiobis 2-nitrobenzoque (DTNB) librant ainsi lacide thionitrobenzoque (TNB) absorbant 412 nm, selon la raction suivante (figure 16) : NO2 COOH NO2 COOH SH COOH

DTNB

S S

+ GSH S

5 COOH

NO2 TNB absorbant

G
Acide glutathionyl-dithio-nitrobenzoque NO2

Figure 16 : Principe de dosage du glutathion

Pour ce dosage, un gramme de pancras (frais ou congel) est homognis dans trois volumes de TCA 5 % laide dun broyeur de Dounce puis centrifug 2000 rpm. 50 l de surnageant sont dilus dans 10 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 8). 3 ml du mlange de dilution, 20 l de DTNB (0,01 M) sont additionns.

Labsorbance est lue 412 nm contre un blanc prpar dans les mmes conditions avec le TCA 5 %. Les concentrations sont exprimes en nmol/gramme de foie. Elles sont dduites

partir dune gamme talon tablie dans les mmes conditions avec le glutathion figure 4, (Annexe 1).

3.2.7.3. Evaluation de lactivit enzymatique de la catalase (CAT)

Lactivit enzymatique de CAT est dtermine par la mthode de Clairborne (1985). Le principe est bas sur la disparition de lH2O2 en prsence de la source enzymatique 25 C selon la raction suivante :

Catalase 2 H2O2 2 H2O + O2

Avant lvaluation de lactivit enzymatique de CAT, une fraction enzymatique est prpare selon la mthode dIqbal et al. (2003) comme suit : 2 g de pancras sont coups et homogniss dans 3 volumes de tampon phosphate (0.1M, pH 7.4) contenant du KCl (1.17%) par un homognisateur de Dounce. Lhomognat est centrifug 2000 rpm durant 15 min 4 C. Le surnageant obtenu est centrifug 9600 rpm durant 30 minutes 4 C (Centrifugeuse SIGMA 6k15) et le surnageant final reprsente la source utilise pour lvaluation de lactivit des enzymes (catalase et superoxyde dismutase). Pour cela, un mlange est constitu de 1 ml de tampon phosphate (KH2PO4, 0.1 M, pH 7.2), 0.975 ml de H2O2 frachement prpar (0.091 M) et de 0.025 ml de la source denzyme (le cytosol). Labsorbance est lue 560nm chaque minute pendant 2 minutes et lactivit enzymatique est calcule en terme dunit internationale par minute et par gramme de protine (UI / min/g de protine), selon la formule :

UI/g= (2.3033/T) (logA 1/A2) /g de protine.

A1 : Absorbance la premire minute. A2 : Absorbance la deuxime minute. T : Intervalle de temps en minute.

La concentration cytosolique des protines est value par la mthode de Lowry (1951), dans les mmes conditions, une gamme talon est tablie en utilisant le srum albumine bovine (BSA) avec le ractif phnolique de Folin, figure 6 (annexe1). Labsorbance est lue 750 nm.

3.2.7.4. Evaluation de lactivit enzymatique du superoxyde dismutase (SOD) Lvaluation de la SOD est ralise sur le cytosol par la mthode de Beauchamp et Fridovich (1971). Un mlange est constitu de 2 ml du milieu ractif (Cyanide de Sodium 10
2 -4 -

M, solution de NBT(nitroblue de tetrazolium) 1.76x 10 M, EDTA 66 mmol, Methionine

-2

10 M, Riboflavine 2 mol, pH 7.8) et 5L de cytosol. Ce mlange est expos la lumire dune lampe de 15 Watt pendant 10 min pour induire la photoraction de La riboflavine et de lO2. La rduction de NBT par les anions superoxydes en formazan est suivie par le spectrophotomtre 560 nm. Lactivit enzymatique est calcule en termes dUI/mg de protines.

3.2.8. Evaluation statistique

Les rsultats sont donns sous forme de moyennes et cart-types. Lvaluation statistique est effectue en utilisant le test t de Student. La valeur trouve par le calcul du t peut affirmer que les populations sont diffrentes avec un risque derreur p tel que : p > 0,05 = la diffrence nest pas significative ns ; 0,05 > p > 0,01 = la diffrence est significative* ; 0,05 > p > 0,001 = la diffrence est hautement significative**; p < 0,001 = la diffrence est trs hautement significative***.

Le calcul statistique est realis par Statview 4.5 statistical package (Abacus Conceps, Int).

3.3. Rsultats et interprtation

3.3.1. Extraction et dosage des composs phnoliques

Lextraction des flavonodes par la mthode daffrontement par les solvants organiques partir de la poudre des jeunes pousses de feuilles de la plante RRL, montre que lextrait aqueux reprsente le rendement le plus lev (20%) suivi de lextrait butanolique (18%) puis de lextrait dactate dthyle (6%). Le rendement le plus faible (1%) est obtenu par lextrait dther thylique (Tableau. 3).

Tableau 3 ; Evaluation quantitative des polyphnols totaux et des flavondes des extraits de Ranunculus repens L.
Extrait Rendement moyen (%) Polyphnols (mg quivalent dacide gallique/g de lyophilisat Flavonodes (mg quivalent de querctine/g de Lyophilisat)

Ether dithylique Actate dthyle Butanol Eau

1 6 18 20

60 270 516 150

50 160 397 25

Le dosage des polyphnols totaux par la mthode modifie de bleu de Prusse montre, en plus de sa sensibilit, une reproductivit puisque labsorbance est troitement corrle la concentration de lacide gallique utilis dans la gamme talon, r = 0.96 (figure 4, annexe1).

Les rsultats de dosage de polyphnols rvlent que les extraits butanolique/actate dthyle continnent respectivement 516 mg et 270 mg dquivalent dacide gallique/g de lyophilisat. Les extraits aqueux/ dther dithylique en contiennent moins avec des concentrations successives de 150 et 60 mg /g (Tableau 4). Lvaluation quantitative des flavonodes (la querctine sert de standard) montre une corrlation positive entre la variation de ce flavonode (1 25 g/ml) et labsorbance avec un coefficient de corrlation r = 0.96 (figure 5, Annexe 1).

Les teneurs en flavonodes varient dans les mmes proportions que celle des polyphnols: lextrait butanolique est plus riche en flavonodes (397 mg/g) suivi de lextrait dactate dthyle (160 mg/g). Les extraits dther dithylique et aqueux ont une teneur moindre (50 mg/g et 25 mg/g respectivement, ( Tableau 3).

2.2. Evaluation du pouvoir antiradicalaire des flavonodes

Lactivit antiradicalaire in vitro des flavonodes est value par la diminution du taux de DPPH dos aprs laddition des flavonodes diffrentes concentrations (figure 17).

1 0,9 Absorbance du DPPH 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 Temps X30S 8 9 10
Tmoin+ ED Tmoin+ Vit.C(0,4mg/ml) Tmoin+ flav.(0,4mg/ml) Tmoin+ flav.(0.2mg/ml) Tmoin+ flav.(0.1mg/ml)

Figure 17: Pouvoir antiradicalaire des flavonodes (moyenne de 3 essais).

La lecture de cette figure, montre que leffet antiradicalaire des extraits de flavonodes est dose dpendant. Le pouvoir antioxydant des flavonodes vis vis du DPPH, le plus lev (78, 24 %) est observ avec une dose de 0.4 mg /ml; pouvoir quivalent celui quexerce la vitamine C (78 ,51%) la mme concentration.

3.3.3. Effet des flavonodes sur la tolrance au glucose

Les rsultats de lvaluation de la tolrance au glucose chez les animaux hyperglycmiques traits par les diffrents flavonodes sont rassembls dans le tableau 1 (annexe2) et illustrs dans la figure 18.
1,8 1,6 1,4 Glycm ie [g/l] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 30 60 Temps (min) 90 120 Tmoin normal Tmoin Hyp. Trait Agly. Trait Mono. Trait di. et tri. Standard Gli

Figure 18 : Evolution de la tolrance au glucose chez les rats hyperglycmiques traits par les diffrents types de flavonodes.

Nous constatons un effet bnfique des flavonodes et de la glibenclamide lorsque les rats sont prtraits par ces substances : lhyperglycmie est tardive chez cette catgorie de rats prtraits par rapport aux rats non traits (90 min contre 60 min respectivement). Cet effet est hautement significatif (p < 0.001) pour tous les rats traits par les flavonodes par rapport au groupe tmoin (traitement avec leau physiologique 9 de Nacl). Par ailleurs, on assiste une rduction de la glycmie aprs 120 min du gavage relativement au tmoin. En effet, les monoglycosides et les di et triglycosides ont rduit la glycmie 0.46 0.02 g/l et 0.40 0.02 g/l, respectivement dune manire significative) en comparaison avec les tmoins normaux. Un effet quivalent est observ avec le glibenclamide (0.37 0.02 g/l). Le glucose sest probablement fix sur les fonctions OH des flavonodes pour rduire la teneur en glycmie.

3.3.4. Evaluation du stockage de glycogne hpatique et la glycosylation de glucose in vitro 3.3.4.1. Effet des flavonodes sur le stockage de glycogne hpatique

Mthode biochimique

Leffet des flavonodes sur le stockage de glycogne hpatique est reprsent dans le tableau 4. Tableau 4 : Variation de la quantit du glycogne hpatique stock en fonction de la dose des flavonodes.

Rats
Groupe Tmoin + sol. phys Groupe Aglycones Groupe Monoglycosides Groupe di et triglycosides Groupe standard glibenclamide

Glycogne (mg /ml)

2.72 0.134 4.43 0.503 ** 4.63 0.107 *** 6.60 0.715 *** 5.45 0. 436 ***

Chaque valeur correspond la moyenne Ecart type. ( test de Student: ** p < 0.01, *** p < 0.001 , groupes compars au tmoin )

Lanalyse du tableau 4 montre que la dose de 100 mg /kg provoque une augmentation trs hautement significative de la quantit du glycogne hpatique stock sous l'effet des glycosides : 4.63 0.503 mg/ml ; 6.60 0.415 mg /ml respectivement pour les mono et di et triglycosides. Un effet est observ avec les aglycones (4.43 0.503 mg /ml contre 2.72 0.134 mg /ml pour le groupe tmoin). Par ailleurs, lanalyse de ces rsultats montre un effet des flavonoides quivalent celui de la glibenclamide prise comme standard (5.45 0. 436 mg/ml).

Photo 1 : Tissu hpatique du rat tmoin [Coloration par l'hmatoxyline +osine + Lugol. (X100s. Le cytoplasme des hpatocytes renferme des granules de glycognes colors en brain acajou qui se rpartissent dune manire non homogne et moins dense tmoignant dune faible teneur de glycogne hpatique.

Photo 2 : Tissu hpatique du rat trait par 100mg/kg des di et triglycosides[Coloration par l'hmatoxyline + osine + Lugol .(X100)]. Le brin acajou qui colore le glycogne hpatocytaire se montre plus dense et se rpartit dune manire homogne dans tout le cytoplasme

Mthode histochimique

Le tissu hpatique est form de lobules de forme polydrique, au centre des lobules se trouvent la veine centrolobulaire. Les hpatocytes ont une forme polygonale, chaque hpatocyte contient un noyau arrondi, le cytoplasme renferme un rticulum endoplasmique trs abondant et des granules de glycogne. Chez le tmoin (photo 1), nous observons un cytoplasme hpatocytaire qui renferme des granules de glycogne de couleur brun-acajou. Ces granules ne sont pas rparties de faon homogne dans tout le cytoplasme. Par contre, le traitement par les di et triglycosides montre un tissu hpatique (photo2) o le glycogne se rpartit sous forme dagrgats de faon plus abondante et diffuse dans tout le cytoplasme lexception des espaces prinuclaires par rapport au tmoin. Nous notons les mmes observations chez le tissu du groupe de rats traits par les aglycones et les monoglycosides (photo 2). La deuxime coloration ralise avec le bleu de mthylne (photo 3) montre des cellules et des granules de glycogne plus claires par rapport celle ralise avec lhmatoxyline et losine (photo 4). Les granules de glycogne hpatique sont trs denses dans le foie des rats prtraits par les Flavonodes di et triglycosides que celui prlev sur des rats non traits par ces flavonodes (comparez les photo3 et 4).

Photo 3 : Tissu hpatique du rat tmoin [Coloration par le bleu de mthylne + Lugol (X100)]. Les granules de glycogne hpatique sont moins abondantes et de densit trs faible tmoignant dune pauvret apparente du foie en glycogne.

Photo 4 : Tissu hpatique du rat trait par 100mg/kg des di et triglycosides[Coloration par le bleu de mthylne + Lugol (X100)]. Cette coloration ralise avec le bleu de mthylne plus le Lugol est plus dense et se rpartissant dune manire abondante dans tout le cytoplasme.

3.3.4.2. Effet des flavonodes sur linsulinoscrtion chez les rats

Les rsultats de leffet des flavonodes sur la scrtion insulinique sont regroups dans le tableau 2 (annexe2) et illustrs par la figure 19.
2,5 Insulinmie [U/ml] 2 1,5 1 0,5 0 0 60 temps (min) 120
ns ns * * * * * * * * *

* * *

N.Control 200mg standard

Figure 19 : Variation de linsulinmie chez les rats normoglycmiques traits par les flavonodes ( groupes traits compars au groupe tmoin).

Nous constatons quil y a une variation positive de linsulinmie dans le sang des rats traits. En effet, les valeurs de linsulinmie obtenues sont significativement leves tant pour les animaux traits par les flavonodes que par la glibenclamide par rapport celles obtenues sur le sang des rats non traits (p< 0.001). Il faut noter galement que cette hyperinsulinmie reste significativement leve durant un temps de 120 min au moins.

3.3.4.3. Effet de glycosylation des flavonodes

Les rsultats de leffet des flavonodes sur la complexation du glucose in vitro sont rassembls dans le tableau 5.

Tableau 5 : Variation du pourcentage de rduction du glucose dans les tubes la dose initiale de 0.61 g/l additionns de flavonodes.

Flavonodes

[Glucose] (g /l)

Pourcentage de rduction du glucose dans les tubes

Aglycones 1 mg /ml 2 mg /ml 4 mg /ml Monoglycosides 1 mg /ml 2 mg /ml 4 mg /ml Di et triglycosides 1 mg /ml 2 mg /ml 4 mg /ml 0.19 0.11 0.09 68.85 % 81.96 % 85.20 % 0.23 0.21 0.20 62.29 % 65.57 % 67.21 % 0.33 0.25 0.23 45.90 % 59.01 % 62.29 %

% de rduction de glucose = (Tube T Tube E / T) X 100 Tel que : T, tube tmoin ; E, tube chantillon

Il y a une chute importante de la concentration initiale de glucose dans les tubes contenants les flavonodes par rapport au tube tmoin. En effet, le pourcentage de rduction de glucose peut atteindre une valeur de 85% dans le cas des di et triglycosides la dose de 4mg/ml.

3.3.5. Effet antidiabtique des flavonodes en aigu et en subchronique chez les rats diabtiques

3.3.5.1. Variation de la glycmie chez les rats diabtiques traits en aigu (monoprise)

Les rsultats de leffet antidiabtique de lextrait butanolique de RRL sur les rats diabtiques traits en monoprise la dose de 200, 400 et 600mg/kg sont rassembls dans le tableau 3 (annexe2) et illustrs par la figure 20. Nous avons constat quil ya eu une diminution significative importante de la glycmie au cours des 120 minutes pour tous les groupes ayant reu un traitement par les flavonodes diffrentes doses. En effet, partir de

30 minutes, la diffrence du taux de la glycmie des groupes diabtiques traits est dj significative (p<0.05, p< 0.001) par rapport la glycmie initiale des diabtiques tmoins non traits. Cette chute de glycmie continue dans le temps et dune manire diffrentielle en fonction des doses de flavonodes administres pour atteindre la limite de 1.90 0.175 g/l pour la dose de 600 mg/kg, 2.25 0.12 g/l pour la dose de 400 mg/kg et 2.75 0.128 g /l pour la dose de 200 mg/kg. Toutes ces valeurs sont trs hautement significatives par rapport la glycmie initiale du mme groupe ou du groupe tmoin. Il faut noter que la glycmie la plus rduite (1.90 0.175 g/l pour la dose de 600 mg/kg) aprs 120 min du traitement na aucune diffrence significative avec celle obtenue avec la glibenclamide dans la mme dure (1.75 0.153 g/l), (figure 21).

4 3,5 3 Glycmie [g/l] 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0min control 200mg/kg 400mg/kg 600mg/lg Standard

30min

60min Temps (min)

90min

120min

Figure 20 : Effet temps de lextrait butanolique diffrentes doses sur la glycmie chez les rats diabtiques ( Les valeurs donnes sont en Moyenne ecart type).

4,5 4 3,5 Glycmie [g/l] 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Tmoin DT200 DT400 DT600 GT.Gly. Doses des flavonodes[mg/kg] * * * * * *

* * *

* * *

Figure 21 : Effet dose de lextrait butanolique sur la glycmie chez les rats diabtiques durant 120 min suivant le traitement et comparaison avec le groupe tmoin NaCl 0.9%. Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. test de Student: *** p < 0.001 ; groupes compars au groupe tmoin .

3.3.5.2. La variation de la glycmie chez les rats diabtiques traits en subchronique.

Les rsultats de leffet antidiabtique de lextrait butanolique de RRL sur les rats diabtiques durant 28 jours la dose quotidienne de 200 mg/kg sont regroups dans le tableau 4 (annexe2) et illustrs par la figure 22.

3,5 3 Glycmie [g/l] 2,5 2 1,5 1 0,5 0 J+7 J+14 J+21 J+28 Temps (jours)
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

Gr.diabtique Gr.Tr.par EB Gr.Tr.par Gliben.

Figure 22: Variation de la glycmie dans le cas dun traitement de 28jours par lEB et le standard, chez les rats diabtiques. Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. Test de
Student: ** p < 0.01; ***P<0.001 : groupes compars au groupe tmoin Na Cl 0.9%. .

Nous constatons quil y a une rduction trs significative et /ou hautement significative de la glycmie (p < 0.01 et p < 0.001) chez les rats diabtiques sur les quatre semaines de traitement par lextrait. Ces taux glycmiques ne prsentent aucune diffrence significative avec ceux obtenus avec le groupe standard. Nanmoins, la glycmie de base nest pas atteinte dans les deux traitements.

3.3. 6. Effet prventif des flavonodes contre le diabte induit lalloxane

Les rsultats de leffet prventif et protecteur des flavonodes sont rassembls dans le tableau 6. Nous avons constat des diffrences significatives (p<0.01), tant au niveau de linsulinmie quau niveau de la glycmie aprs 10 jours du prtraitement des animaux alloxaniss par les composs phnoliques. En effet, linsulinmie est reste autour de sa valeur initiale chez les des groupes prtraits par lextrait de flavonodes ou par la querctine (0.238 0.052 et 0.218
0.018 U/ml) par contre celle des tmoins non protgs (0.108 0.015 U/ml) a diminue significativement aprs 10 jours de linjection de lalloxane (p< 0.01) par rapport sa valeur

initiale ( J0) (0.228 0.041 U/ml) dans le mme groupe danimaux. Pour la glycmie, une stabilit est constate au niveau du taux sanguin de glucose au dixime jour aprs le

prtraitement par les flavonodes chez les groupes protgs par les flavonodes (1.02 0.09 et
0.95 0.12 g/l) par rapport sa valeur initiale (J0). Par contre une hyperglycmie significative (p< 0.001) est obtenue chez les rats non protgs contre lalloxane (2.42 0.15 g/l) par rapport

la glycmie initiale du mme groupe (0 .94 0.12 g/l).

Tableau 6 : Variation de la glycmie et linsulinmie chez les rats prtraits ou non par les flavonodes.

Groupes et traitement des rats

Tmoin+alloxane + sol. Physio. Trait + alloxane + flavonodes Trait + alloxane + querctine

Insulinmie [U/ml] J0
0.228 0.041

Glycmie [g/l] J0
++

J0 + 10
0.108 0.015

J0 + 10
2.42 0.15
+++

0 .94 0.12

0.242 0.035

0.238 0.052**

0. 92 0.11

1.02 0.09***

0.231 0.022

0.218 0.018**

0.79 0.09

0.95 0.12***

Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. test de Student: ** p < 0.01, *** p < 0.001 : groupse compars au groupe tmoin Alloxane + Na Cl 0.9% ; ++ p < 0.01,+++ p < 0.001 : groupes compars lui mme J0 (avant linjection de lalloxane).

3.3.6.1. Recherche des mcanismes de prvention contre le diabte induit par lalloxane

3.3.6.1.1. Effet des flavonodes sur la peroxydation lipidique

La figure 23 illustre leffet des flavonodes sur la variation du MDA cytosolique dans les cellules pancratiques chez les rats alloxaniss prtraits ou non par les composs phnoliques.

2,5 [ nm ol/g de pancras] 2 1,5 1 0,5 0

* * *

Tmoin normal Tmoin+ allox. Prtrait allox.+ flav. Prtrait allox.+ QR

ns ns

MDA
Figure 23 : Effet des flavonodes sur la production du MDA dans les cellules pacratique Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. test de Student: *** p < 0.001 : groupes compars au groupe tmoin Na Cl 0.9%.

Nous avons constat une lvation trs hautement significative (p < 0.001) du MDA chez les rats recevant lalloxane et non traits (2.132 0.102 nmol) par rapport au groupe tmoin normal (0.621 0.064 nmol). Par ailleurs, aucune variation significative du MDA nest constate chez les rats recevant lalloxane et prtraits par lextrait de flavonodes et la querctine ( leurs valeurs respectives 0.721 0.078 nmol et 0.694 0.099 nmol nont aucune diffrence significative avec celle obtenue avec le tmoin normal). Ce rsultat explique probablement la protection des animaux par les flavonodes contre le stress oxydatif.

3.3.6.1.2. Effet des flavonodes sur le niveau cytosolique de GSH dans le pancras

La figure 24 illustre leffet des flavonodes sur la variation de GSH cytosolique dans les cellules pancratique chez les rats recevant de lalloxane prtraits ou non par les composs phnoliques.

0,7
ns

Tmoin normal
ns

0,6 [mmol/g de pancras] 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 GSH

* * *

Tmoin+ allox. Prtrait allox.+ flav. Prtrait allox.+ QR

Figure 24. : Effet des flavonodes sur le niveau cytosolique de GSH dans le pancras
Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. test de Student: *** p < 0.001 Groupes compars au groupe tmoin Na Cl 0.9%.

Nous avons remarqu une lvation trs hautement significative (p < 0.001) de GSH chez les rats recevant lalloxane et non traits (0.152 0.023 mmol) par rapport au groupe tmoin normal (0.49 0.057 mmol). Par contre, aucune variation significative de GSH nest constate chez les rats recevant lalloxane et prtraits par lextrait de flavonodes et la querctine car leurs valeurs respectives 0,501 0,092 mmol et 0,484 0,031mmol nont aucune diffrence significative avec celle du tmoin normal.

3.3.6.1.3. Effet des flavonodes sur la catalase et super oxyde dismutase

Les rsultats de leffet des flavonodes sur les deux enzymes sont reports dans le tableau 7.

Tableau 7 : Effet des flavonodes sur lactivit des enzymes antioxydants, CAT et SOD chez les rats recevant lalloxane et traits ou non par les flavonodes.

Traitement des animaux Tmoin phy Tmoin allox. + sol.phy Prtrait allox. + Flav. Prtrait allox. + QE normal+sol.

Protine mg/ml

Activit de CAT [UI/mg Pr ] 0.582 0.093 0.294 0.042 ** 0.492 0.031 ns 0. 543 0.076 ns

Activit de SOD [UI/mg Pr ] 17.42 2.13 6.23 0.78*** 14.98 1.79 ns 18.15 3.21 ns

4.21 0.030 3.52 0.045* 4.85 0.06 ns 5.12 0.09 ns

Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. Test de Student : ns, ** p < 0.01, *** p < 0.001, * p < 0.05 : groupes compars au groupe tmoin normal+ Na Cl.

Lactivit de la CAT et la SOD dans lhomognat de pancras a significativement diminu (p < 0.01, p < 0.001) chez les rats recevant lalloxane seul (0.294 0.042 UI) par rapport celle mesure chez les tmoins qui ne reoivent que la solution physiologique (0.582 0.093 UI). Lactivit enzymatique de ce systme antioxydant est conserve son niveau normal chez les rats prtraits par lextrait de flavonodes et de la querctine, ses valeurs respectives de 0.4920.031 UI et 0. 543 0.076 UI nont aucune diffrence significative par rapport celle obtenue avec les rats tmoins (tableau 7). Lactivit de la CAT et la SOD est exprime par mg de protines. Une courbe dtalonnage des protines est labore cet effet (figure 6, annexe1).

3.4. Discussion

Le diabte sucr est une maladie mtabolique chronique qui touche 5 7% de la population mondiale [Singh P. and Kakkar P., 2009 ; Zhou et al., 2009]. Cette maladie est classe en deux types (DID et DNID) selon ltiologie individuelle de chaque patient. 95% des diabtiques sont diagnostiqus avec le type 2 [Attele et al., 2002]. La cause principale du diabte type 2 est la rsistance linsuline et/ou la dficience des rcepteurs pour cette hormone qui peut causer une hyperglycmie [Laakso, 2001]. Par consquent, la stratgie cl dans le traitement de patients atteints de diabte de type 2 est le maintien dune normoglycmie. Les agents oraux antidiabtiques courants, reprsents par les insulinoscrteurs, les sensibilisants de linsuline et les inhibiteurs de la glucosidase, ont une action modeste avec une efficacit limite [Yu et al., 2000]. Par exemple plusieurs tudes ont indiqu que la metformine avait peu ou pas deffet sur lutilisation priphrique de glucose stimule par linsuline chez les sujets obses diabtiques [Inzucchi et al., 1998 ; Yu et al., 2000] et non diabtiques [Fendri et al., 1993]. En outre, les mdicaments anti-diabtiques ont gnralement des effets secondaires, une diminution de l'efficacit au fil du temps, une inefficacit contre les complications diabtiques long terme et un faible rapport cot-efficacit [Grover et al., 2002]. En consquence, la dcouverte et le dveloppement de nouveaux mdicaments antidiabtiques est encore plus quindispensable. La mdecine populaire pratique par lhomme travers le monde est base essentiellement sur lutilisation des plantes comme sources de substances naturelles actives. Parmi ces substances, les composs phnoliques et notamment les flavonodes qui occupent une place importante dans le traitement de nombreuses pathologies entre autres le diabte sucr, la jaunisse, le systme vasculaire. En se basant sur les enqutes thnobotaniques au niveau locale (petite Kabylie, Algrie), il sest avr que la plante RRL est bien utilise par les populations campagnardes pour traiter le diabte.

3.4.1. Les flavonodes de Ranunculus repens L

Du fait que la plante RRL est largement utilise localement par la tradimdecine, nous sommes tents de raliser une sparation des flavonodes et afin dobtenir une bonne sparation de ses principes actifs responsables sur son activit antidiabtique validant ainsi utilit, la mthode dextraction adopte est base sur la solubilit diffrentielle des flavonodes dans les solvants organiques. Dans la prsente tude, un rendement lev (20%) est obtenu avec lextrait aqueux de RRL contenant les composs phnoliques les plus hydrosolubles. Le rendement de lextrait butanolique, renfermant surtout les di et triglycosides, est relativement lev (18%). Par contre, le rendement de lextrait dactate dthyle renfermant certains aglycones et les monoglycosides, est trois fois plus faibles que celui de lextrait butanolique (6%) et lextrait dther thylique, riche en aglycones, donne un rendement encore trs faible (1%). Sachant que le nombre de lavages effectu dans le protocole dextraction pourrait conduire des pertes substantielles des aglycones do les inconvenients de la mthode daffrontement par les solvants.

La mthode modifie du bleu de Prusse de Graham (1992), sest avre efficace pour le dosage des polyphnols totaux dans les diffrents extraits. Cette mthode a t choisie car elle satisfait aux critres de reproductibilit et de faisabilit. Lvaluation quantitative de ces composs phnoliques montre que la quantit des polyphnols (51,6%) dans lextrait butanolique est importante en comparaison avec les autres extraits, lextrait dther thylique en est pauvre (6%).

Il est intressant de dterminer la quantit de flavonodes dans les extraits de RRL afin de mieux les caractriser. Le dosage des flavonodes par la mthode de trichlorure daluminium montre une intensit leve de labsorbance des complexes forms entre les flavonodes et LAlCl3. En effet, la dtermination de la quantit des flavonodes dans les extraits de RRL montre lextrait dther thylique faible avec un rendement de 60 mg/ g de lyophilisat, par contre les extraits dactate dthyle et de butanol en continnent plus avec des rendements respectifs de 160 mg/g et 397 mg/g de lyophilisat. Comme pour les polyphnols lextrait butanolique est le riche en flavonodes.

Lanalyse par HPLC (rsultats non publis) qui montre que cet extrait contient surtout des rutinosides (38%), de la querctine (18%), du kaempfrol (12%) sous forme aglycone ou glycoside.

3.4.2. Etude de lactivit des flavonodes et leur mcanisme daction

Ltude prliminaire de cette activit concerne priori, lactivit antihyperglycmiante des flavonodes le cas dune hyperglycmie exprimentale afin dvaluer la porte de la tolrance au glucose par les tissus priphriques des animaux traits par les diffrents extraits de flavonodes et fortiori, la recherche de mcanismes de cette activit moyennant des mthodes biochimiques.

3.4. 2.1. Etude de lactivit antihyperglycmiante

Les rsultats de cette tude montrent que tous les extraits de flavonodes utiliss sont dune activit antihyperglycmiante. La meilleure activit est obtenue avec les formes glycosyles donnant un effet comparable celle de lhypoglycmiant oral, la glibenclamide. En effet, partir de 30 min aprs le gavage, les diffrents flavonodes et la glibenclamide ont frein laugmentation de la glycmie en lempchant ainsi datteindre le pic glycmique obtenu avec le tmoin hyperglycmique 90 min du gavage et en le dplaant dans le temps 60 min. Plus encore, ces substances actives ont provoqu une hypoglycmie plus ou moins importante partir de 90 min de ladministration telle que la bien montre la courbe de leffet temps des flavonodes sur la glycmie des animaux traits.

Ces rsultats montrent lvidence une utilisation trs active de glucose par les tissus priphriques, explique par une lvation de la tolrance au glucose au niveau de ces tissus quand les animaux sont traits par les composs phnoliques. Laugmentation de la tolrance des tissus au glucose est mentionn dans des rapports de plusieurs travaux sur les extrais flavonodiques de diffrentes plantes telles que Biophytum sensitivum et Gongronema latifolium [McCord et al., 1971 ; Lenzen et al., 1996].

3.4.2.2. La recherche des mcanismes possibles daction

De par une augmentation significative de linsulinmie chez les rats normaux traits par les flavonodes, la prsente tude met en vidence de leffet tropique des extraits de flavonodes et de la querctine vis--vis de linsulinoscrtion. Autrement dit, les cellules sont stimules par ces substances bioactives et ont augment la scrtion de linsuline durant la premire et la deuxime heure des traitements des rats. Cette lhyperinsulinmie est suggre tre lorigine de lhypoglycmie constate 90 min du gavage, cest pourquoi il est prpondrant dadministrer une dose flavonodique plus rduite pour viter la chute de glucose sanguin au de de la normoglycmie. Cet effet tropique des composs phnoliques sur linsulinoscrtion a t apport par les travaux de Puri [Puri, 2001] et de Venkateswaran et al. [Venkateswaran et Pari, 2002]. Dans ce contexte, un certain nombre d'autres plantes se sont avres pourvues de l'activit antihyperglycemique avec un effet stimulant sur la rgulation et la libration de linsuline [Esmaeili and Yazdanparas, 2004 ; Sharma et al., 2006].

Daprs la littrature consulte, la plante Ranunculus repens L na pas eu lattention des chercheurs dans leurs investigations tant sur le plan biochimique que pharmacologique. Cependant, les rsultats de la prsente tude sont en accord avec les travaux de Cunha et al. (2008), de Dhanabal et al. (2007), de Adeneye et al. (2007) et de Puri (2001) sur les flavonodes des extraits alcooliques respectivement de la plante Leandra lacunosa, Nymphaea stellataqui, Musanga cecropioide et de Biophytum sensitivum, o il a t prouv lactivit antihyperglycmique de ces extraits chez les rats.

Dans la prsente tude, llvation de la tolrance des tissus au glucose provoque par les flavonodes, pourrait expliquer llvation significative de la teneur hpatique en glycogne chez les animaux prtraits par les flavonodes par rapport aux tmoins. En effet, ce stockage massif de glycogne dans le foie peut se produire suite une internalisation intense de glucose dans les hpatocytes. Le passage du glucose du sang vers les tissus priphriques, en loccurrence les tissus hpatiques, est susceptible dtre facilit par diffrents effets des substances phnoliques et/ou insuliniques, nous pouvons citer parmi dautres : une activation de la glycognogense [Subash-Babu et al., 2008], une activation du transporteur de glucose (GluT) et une potentialisation de leffet insulinique [Wang et al., 1997].

Laugmentation de la teneur hpatique et musculaire en glycogne a t constate galement chez le diabte induit par la streptozotocine chez les souris aprs leur traitement par des extraits riches en flavonodes [Sharma et al., 2008]. Sachant que la glycognognse hpatique ou musculaire est corrle lactivit de linsuline qui rgule le dpt glycognique par la stimulation de la glycogne synthase et linhibition de glycogne phosphorylase [Pari et Saravanan, 2007 ; Subash-Babu et al., 2008].

Par ailleurs, le test positif de complexation de glucose ou la glycosylation des flavonodes peut nous renseigner sur la possibilit dattribuer le rle de glucophage ces substances, c'est--dire la capacit de fixer le glucose, et intgrer ainsi cet effet parmi les actions possibles des composs phnoliques sur la glycmie des animaux traits. Il faut noter dans ce contexte que les flavonodes ont naturellement tendance lier des oses pour donner les flavonodes glycosides [Bruneton, 1993], ce qui justifie raisonnablement la possibilit de leur glycation dans les solutions glucoses.

3.4.3. Activit antidiabtique des flavonodes

Une normalisation durable de la gycmie diminue le risque de dvelopper des micro-maladies vasculaires et de rduire les complications de cette maladie. Les thrapies conventionnelles du diabte ont de nombreuses lacunes, par exemple les effets secondaires comme le stress oxydatif [Guerci et al., 2001 ; Huang et al., 2004 ; Punitha et al ., 2005]et lintolrance linsuline [Raccah, 2004]. Il a t montr que des extraits de plantes ont les mmes efficacits que les mdicaments antidiabtiques et sans effets secondaires [Kim et al., 2006].

Dans la prsente tude, lextrait butanolique aprs son administration la dose de 200mg/kg aux animaux diabtiques (en monodose ou en doses rptes sur une dure de 28 jours), a provoqu un effet hypoglycmiant significatif (p < 0.01) de 33 %. Le mme effet a t dmontr par dautres auteurs avec le traitement des rats diabtiques par des extraits alcooliques dautres plantes (Musanga cecropioides, Berberis aristata) [Adeneye et al., 2008 ; Singh et Kakkar, 2009] avec le traitement des rats alloxaniss avec une dose de 250 mg/kg dextraits mthanoliques de 16% et de 50% de rduction de glycmie. Cunha et al. (2008) ont eu une corrlation positive de la chute de la glycmie linsulinoscrtion.

Dautres auteurs [Esmaeili and Yazdanparas, 2004 ; Sharma et al., 2006 ; Sharma et al., 2008 ; Shipra et al., 2009 ] ont dmontr que les extraits flavonoque des plantes Eugenia jambolana, Cassia auriculata L et Teucrium polium stimulent et rgnrent les cellules du pancras.

3.4.4. Effet protecteur des flavonodes et mcanismes daction contre le diabte induit par lalloxane

Le diabte induit lalloxane est un modle bien connu du diabte exprimental [Dhanabal et al., 2007]. Nous avons constat une hyperglycmie aprs dix jours de ladministration de lalloxane monohydrate aux animaux, dune chute significative de linsulinmie. Ce compos peut causer une ncrose svre des cellules pancratiques. Cet effet est expliqu par le fait que lalloxane est pourvu dun pouvoir producteur du peroxyde dhydrogne et dautres radicaux libres qui sont lorigine de cette ncrose cellulaire des cellules [Lenzen and Munday, 1991]. La sensibilit de ces cellules au stress oxydatif est attribue galement un taux faible en antioxydants du pancras par apport aux autres tissus [Lenzen et al., 1996]. Cet effet prooxydant de lalloxane produit une hyperglycmie suite la chute de linsulminoscrtion et aggrave le statut redox par lautooxydation du glucose [Sakurai et Tsuchiya, 1988 ; Abir et al., 2005].

Les rats prtraits par les flavonodes ont t protgs contre leffet dltre et diabtogne de lalloxane ainsi aucune variation significative nest constate tant pour la glycmie que pour linsulinmie aprs dix jours du traitement alloxanique associ aux flavonodes. Ces rsultats sont en accords avec des travaux sur des extraits de flavonodes ou des formes pures dans le cas de diabte induit lalloxane [Abir et al., 2005] ou la streptozotocine [Coskun et al., 2005].

3.4.4.1. Action des flavonodes sur la peroxydation des lipides

Lvaluation de la peroxydation lipidique produite dans les cellules pancratiques a montr la gnration dun taux significativement lev de MDA cytosolique dans le pancras, chez les rats alloxaniss et non protgs par les flavonodes, par rapport aux animaux prtraits par ces composs phnoliques. Par ailleurs une telle hyperperoxydation pourrait tre le rsultat dune modification importante du statut redox cellulaire dans le pancras en faveur des prooxydants,

car lalloxane sest avr gnrateur de radicaux libres qui, par leur pouvoir oxydant, sont lorigine de loxydation de lADN, de lipides et de carbohydrates aboutissant ainsi la mort des cellules et linstallation du diabte [Quinlan et Gutteridge, 1988 ; Huk et al., 1998]. Par contre les extraits de flavonodes de RRL et de la quectine se sont avrs des composs chmoprotecteurs cellulaires pourvus dun pouvoir antiperoxydant jouant un effet cran contre leffet dltre des radicaux libres, ce qui explique le maintien de MDA son niveau cytosolique normal dans le pancras des les rats traits par lalloxane en association avec ces composs phnoliques.

3.4.4.2. Effet des flavonodes sur la dpltion du GSH et les enzymes antioxydantes

Les rsultats de la prsente tude ont montr un dsquilibre dans le statut redox cytosolique en faveur des prooxydants mettant les cellules pancratique dans un tat de stress oxydatif. En effet la teneur du pancras en glutathion, dj nativement faible par rapport aux autres organes [Lenzen et al., 1996], a subi une baisse significative juste aprs cinq heures des traitements chez les rats alloxaniss et non protgs par les flavonodes.

Parmi les systmes antioxydants enzymatiques cellulaires figurent en premire ligne la SOD et la CAT. Lanion superoxyde, premire espce toxique forme partir de loxygne, est limin et maintenu un niveau de concentration assez bas par la SOD qui catalyse sa desmutation en H2O2. Ce dernier est transform en H2O et O2 par la CAT. Lvaluation biochimique de lactivit des systmes enzymatiques antioxydants (la catalase et la superoxyde desmutase) a mis en vidence une rduction significative de lactivit cytosolique de ces enzymes dans le pancras des mmes animaux. Au mme moment, le prtraitement des rats administrs dalloxane par les flavonodes a pu maintenir les systmes de dfense cellulaire antioxydants (GSH, CAT et SOD) leur niveau cellulaire normal pour empcher ainsi la perte de lquilibre redox prooxydants / antioxydants constate avec les animaux non protgs par les flavonodes.

La cellule dispose pour sa protection au GSH porteur dune fonction thiol qui constitue un systme antioxydant de la premire dfense en se liant par sa fonction SH aux mtabolites toxiques [Morin et al., 2001]. Il joue son rle antioxydant galement en synergie avec les

enzymes antioxydantes telles la glutathion peroxydase, la catalase et la superoxyde desmutase [Morin et al., 2001]. Lors du traitement des animaux par lalloxane, les taux de GSH sont nettement diminues suite leur action de neutralisation des radicaux libres gnrs par lalloxane [Huk et al., 1998] ce phnomne aussi provoque sa dpltion et facilite la peroxydation des lipides et loxydation des groupements thiols des protines [Lopez-Lazaro et al., 2000 ; Vessal et al., 1992]. Cependant, le prtraitement des animaux par les flavonodes a empch la diminution de GSH observe chez les rats recevant le diabtogne seul en maintenant le niveau cellulaire normal de ce tripeptide. Autrement dit, les extraits de flavonodes et la querctine ont un effet scavenger, c'est--dire au lieu que les radicaux libres produits par lalloxane [Quinlan et Gutteridge, 1988 ; Huk et al., 1998] se neutralisent par le GSH ils vont plutot tre capts par les composs phnoliques en maintenant ainsi le taux normal de glutathion des cellules pancratiques.

Des tudes scientifiques [Hii et Howell, 1984 ; Nuraliev et Avezov, 1992 ; Wolff, 1993 ; Coskun et al., 2005 ] ont dmontr leffet protecteur des flavonodes (extraits bruts ou molcules purifies) vis-avis du diabte provoqu par la streptozotocine ou lalloxane. Ces travaux ont montr lvidence de leffet chemoprotecteur et antiradicalaire des flavonodes contre la peroxydation lipidique, et donc de la formation du [El-Missiry et al., 2000 ].

3.4.5. Effet de lalloxane et les flavonodes de RRL sur les cellules du pancras : Mcanisme daction

Certes, la toxicit de lalloxane a t tudie par plusieurs auteurs, nanmoins le mcanisme de son effet prooxydant sur le statut redox cellulaire reste fractionn. Ce produit diabtogne induit des dommages pancratiques notamment au niveau des cellules via les radicaux libres produits lors de sa mtabolisation [Ammon et al., 1983 ; Lenzen et al., 1996 ]. Ces derniers sont neutraliss par le GSH, systme de premire dfense antiradicalaire, ce qui provoque une dpltion accrue de sa teneur intracellulaire (notre tude ; Singh et Kakkar, 2009) .

Les espces ractives de loxygne sont susceptibles dpuiser lactivit des systmes enzymatiques antioxydants de la cellule (SOD, CAT), aboutissant finalement un dsquilibre du systme redox cellulaire au profit des prooxydants. Cet tat de stress oxydatif favorise les ractions en cascade des radicaux libres avec les molcules biologiques. Une lipoperoxydation (au niveau des biomembranes cellulaires) est amorce et provoque ainsi

augmentation du niveau intracellulaire du MDA. Loxydation des acides gras insaturs des phospholipides membranaires est susceptible de dformer la structure des membranes et provoquer en consquence sa permabilit et la mort cellulaire [Lopez-Lazaro et al., 2000 ; Servais, 2004 ; Dhanabal et al., 2007].

Le constat tir de lobservation des rsultats de la prsente tude est que les flavonodes de RRL administrs en association avec lalloxane la dose de 200mg/kg, ont maintenu lquilibre de la balance antioxydant / prooxydant des cellules pancratiques. Cet quilibre est maintenu sous leffet de laction antioxydante des composs phnoliques contre les ROS gnrs par lalloxane, pouvoir antiradicalaire dj dmontr au dbut de ces travaux in vitro avec le DPPH. Les systmes enzymatiques de dfense antioxydants (SOD, CAT) ne sont pas donc altrs et le taux cellulaire du GSH est conserv sous leffet chmoprotecteur des flavonodes, puisque la variation du MDA cellulaire reste normale tmoignant de labsence dune lipoperoxydation sensible et dune intgrit cellulaire. Cet effet est confirm par une absence de ncrose des cellules du pancras des animaux prtraits par les flavonodes.

Conclusion
Dans cette prsente tude, la mthode daffrontement par les solvants applique dans lextraction des polyphnols indique une richesse de la plante RRL en composs phnoliques, avec une teneur importante en flavonodes. Ces substances sont dotes dun pouvoir antiradicalaire trs lev compar celui de la vitamine C.

Lvaluation de leffet antihyperglycmique des extraits de flavonodes chez les rats a mis en vidence une tolrance leve des tissus au glucose, ce qui attribue une action insulinomimique ces substances qui stimulent la noglycognse favorisant ainsi le stockage du glucose. Par ailleurs, il a t observ que les flavonodes de la plante RRL stimulent la scrtion de linsuline qui internalise le glucose dans le foieet qui le transforme en glycogne.

Les rsultats obtenus de ltude de lactivit prventive des extraits flavonodiques comme la querctine possdent galement un pouvoir chmoprotecteur de ces composs contre leffet dltre et diabtogne de lalloxane qui se manifeste par le maintien de lquilibre redox des cellules pancratiques malgr leffet prooxydant et cytotoxique de lalloxane.

Nanmoins, la purification et lidentification des flavonodes ayant une activit antidiabtique et antioxydante restent fortement recommande pour approfondire non seulement les connaissances sur les diffrents flavondes pourvus de cette activit mais aussi pour cerner dune manire plus fine les diffrentes actions possibles de ces composs et leur synergie. La culture des cellules de Langerhans reste un moyen indispensable qui permet une tude cytotoxique plus spcifique dune part et une valuation biochimique et pharmacologique de lactivit antidiabtogne et antioxydante des flavonodes sur un seul type cellulaire dautre part.

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Introduction
Les espces ractives de loxygne (ROS) sont des radicaux libres rsultant du mtabolisme de l'oxygne. Chez lhomme, les principaux ROS, l'anion superoxyde (O2 -), le peroxyde d'hydrogne (H2O2) et le radical hydroxyle (OH), le monoxyde nitrique (NO), sont constamment gnrs l'intrieur de cellules suite lexposition aux xnobiotiques dans notre environnement ambiant et / ou un certain nombre de mtabolites endognes

impliquant des enzymes d'oxydo-rduction et de la chane respiratoire lors de transfert d'lectrons [Borg and Reeber, 2008]. Dans les conditions biologiques normales, il existe un quilibre entre les taux intracellulaires des ROS et les systmes antioxydants endognes comme la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT, la glutathion peroxydase (GPx) et le glutathion (GSH). Il est connu que l'exposition des organismes des facteurs exognes et endognes pourvus dun pouvoir prooxydant pouvant produire un dsquilibre redox intracellulaire au profit dune vaste gamme de ROS [Halliwell and Gutteridge, 2007]. Ensuite, ces ROS sont susceptibles doxyder les molcules environnantes en milieu biologique (les acides nucliques, les lipides, les glucides, les protines) [Farber, 1994] en provoquant des lsions cellulaires se terminant par la ncrose ou lapoptose [Halliwell and Gutteridge, 2007]. Cette oxydation de diverses biomolcules est galement un facteur tiologique essentiel impliqu dans de nombreuses pathologies chroniques telles que le cancer, le diabte, l'athrosclrose, la cirrhose, la maladie d'Alzheimer .., [Pong, 2003].

Ces perturbations se rprcutent sur le foie o Il a t montr par des tudes pidmiologiques, que la prvalence de la toxicomanie et les substances toxiques, pharmacologiques ou non, susceptibles dinduire diverses hpatopathologies est en progression rapide dans les pays en dveloppement [Bissel et al., 2001].

Toute mdication nest pas saine entrane des effets secondaires surtout les radicaux libres quil faut attnuer par un apport nutritionnel adquat. Malgr un grand nombre d'tudes ayant t faites dans ce contexte, la comprhension des mcanismes de linduction des lsions hpatiques est encore insuffisante et na pas convaincu les laboratoires pharmaceutiques d'arrter et de supprimer les mdicaments les plus toxiques. Par ailleurs, il est reconnu que l'intervention de la nutrition peut augmenter l'apport de phyto-antioxydants pouvant rduire la menace des radicaux libres [Arora et al., 2003].

Les flavonodes prsents dans les plantes possdent un fort effet antioxydant [Pannala et al., 1997]. Ils ont galement un pouvoir chmoprotecteur contre plusieurs maladies [Halliwell et Gutteridge, 2007 ; Borg et Reeber, 2008].

Les mdicaments anticancreux comme la daunorubicine, la doxorubicine et l'pirubicine (EPI) ont des effets cardiotoxiques [Nielsen et al., 1990 ; Allen, 1992 ; Goebel, 1993 ; Mazu et al., 1995]. Les mcanismes biochimiques impliqus dans la cardiotoxicit ne sont pas clairement lucids, mais il a t suggr que l'pirubicine est susceptible dinduire une cardiotoxicit en produisant des ROS au cours de son mtabolisme [Germain et al., 2003]. Par contre, selon la littrature lhpatotoxicit induite par l'EPI, sest avre moins documente et notre prsente tude sinscrit dans la mise en vidence, priori, des aspects biochimiques et toxicologiques de lhpatotoxicit induite par lEPI au niveau cytosolique et mitochondriale et fortiori, une valuation de leffet chmoprotecteur de ces mmes compartimentations cellulaires suite de ladministration des extraits de flavonodes de la RRL et de la querctine en association avec cet anticancreux chez les rats.

Le stress oxydant
1. Dfinition Pour dfinir le stress oxydant, il faut dabord dfinir ce que sont les radicaux libres. Un radical libre est une espce chimique possdant un lectron clibataire qui lui confre une ractivit vis--vis dautres molcules. Celle-ci est variable selon la nature du radical. En biologie, les radicaux libres sont forms le plus souvent par gain dlectron partir de lO2. Les espces ractives de loxygne (ROS) regroupent lensemble des drivs radicalaires de loxygne (O2 , OH, NO , ROO (ROOH, H2O2, O2), [Milane, 2004]. Il est important dvoquer alors le paradoxe de lO2 : il est indispensable au fonctionnement cellulaire mais est aussi la source des ROS qui peuvent provoquer des dommages aux macromolcules biologiques (ADN, protines, phospholipides membranaires), [Droge, 2002]. Les ROS sont impliqus dans la prolifration cellulaire, la mort cellulaire programme en agissant comme second messager [Thannickal et Fanburg, 2000 ; Droge, 2002 ].
1

.-

), mais galement les composs non radicalaires

Dans lensemble de nos tissus sains, les dfenses antioxydantes sont capables de faire face et dtruire les radicaux produits en excs [Pincemail et al., 1999]. Dans ce cas, on dit que la balance antioxydants / proxydants est en quilibre [Pincemail et al., 2000]. Mais dans certaines situations, en raison dune surproduction radicalaire (tabac, alcool, pollution et certaines pathologies comme le diabte, le cancer, le SIDA, linflammation, pathologies cardiovasculaires ) ou dune diminution des capacits antioxydantes (insuffisance dapports des micronutriments antioxydants, inactivation enzymatiques) un dsquilibre entre production de radicaux libres et le systme de dfense est lorigine dun tat redox altr de la cellule appel stress oxydatif [Pincemail et al., 1999 ; Pincemail et al., 2000].

2. Les espces ractives de loxygne et leur origine

2.1. Les radicaux libres oxygns Dans les molcules, les atomes sont assembls par des liaisons covalentes tablies par mise en commun dlectrons de spins opposs. Tout apport dnergie suffisant est susceptible

dentraner la rupture de ces liaisons pour donner des entits chimiques qui possdent un lectron non appari, dit clibataire , sur une orbitale externe. Ces entits chimiques sont appeles radicaux libres. Parmi les espces radicalaires, les plus intressantes se trouvent les formes actives de loxygne [Curtin et al., 2002 ; Milane, 2004 ; Haton, 2005]. La ractivit particulire de loxygne est due la structure biradicalaire de la molcule O2. En effet, si loxygne molculaire est trs stable vis- -vis des substances lectrons apparis, la molcule ragit nergtiquement avec les radicaux libres [Milane, 2004]. Ces derniers sont des espces chimiques prsentant un ou plusieurs lectrons clibataires (le radical hydroxyle
.

OH, lanion superoxyde O2 , loxyde nitrique NO ...)]. Ils sont produits naturellement dans

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lorganisme (radicaux primaires) [Milane, 2004 ; Borg and Reeber, 2008 ; Haton, 2005] : - au niveau de la respiration mitochondriale lorsque loxygne chappe la rduction complte en H2O ; - au niveau de certains organites cellulaires tels que les peroxysomes ; - par diverses oxydases cellulaires ; - au cours de la phagocytose.

Ces radicaux libres primaires sont capables dextraire un lectron des molcules voisines pour complter la vacance de leur orbital en produisant de ce fait dautres radicaux libres dit secondaires, donc sont les sous produits des ractions doxydation et de rduction [Borg and Reeber, 2008]. D'autres espces drives de l'oxygne dites espces actives de l'oxygne, comme l'oxygne singulet
1

O2, le peroxyde d'hydrogne (H2O2) ou le nitroperoxyde

(ONOOH), ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi ractives et peuvent tre des prcurseurs de radicaux [Yoshikawa et al., 2000 ]. L'ensemble des radicaux libres et de leurs prcurseurs est souvent appel espces ractives de l'oxygne (ROS) [Fulbert and Cals, 1992 ; Crompton, 1999 ; Yoshikawa et al., 2000].

La ractivit de ces espces nest pas uniforme pour tous radicaux de loxygne et elle est trs variable selon la nature du radical [Milane, 2004]. Chez les tres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2) comme le monoxyde d'azote (NO) ne sont pas trs ractifs, mais constituent des prcurseurs d'autres espces plus ractives [Borg and Reeber, 2008]. La faible ractivit de ces deux radicaux permet d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme

mdiateurs rgulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation capillaire, la prolifration ou le message de neurones [Borg and Reeber, 2008 ; Milane, 2004]. En revanche, des radicaux comme les radicaux peroxyles (ROO) ou surtout le radical hydroxyle (HO) sont extrmement ractifs avec la plupart des molcules des tissus vivants [Favier, 2003] . Ces radicaux libres de l'oxygne ou de l'azote, pourtant ractifs et toxiques, sont produits par divers mcanismes physiologiques afin de dtruire les bactries des cellules phagocytaires (macrophages, polynuclaires) ou pour rguler des fonctions cellulaires ltales telle la mort cellulaire programme ou apoptose [Favier, 2003 ; Dalton et al., 2002].

Les principaux radicaux libres oxygns sont les suivants [ Milane, 2004 ; Haton, 2005 ; Borg et Reeber, 2008 ] :

- lanion superoxyde : la molcule doxygne, mise en prsence dune quantit dnergie suffisante, peut acqurir un lectron supplmentaire et former ainsi lanion superoxyde :

O2 + e
un rducteur

O2 -

Cet anion intervient comme facteur oxydant dans de nombreuses ractions, cest galement - le radical hydroxyle : OH, Il est trs ractif vis--vis des structures organiques et joue un rle initiateur dans lauto-oxydation lipidique, il est dune trs faible distance de diffusion. - le radical peroxyde : ROO , intermdiaire ractif avec les lipides - loxygne singulet : O2, forme excite de loxygne molculaire, est souvent assimil un radical libre en raison de sa forte ractivit, ragit avec les macromolcules biologiques (ADN, Protines, lipoprotines).
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Par ailleurs les radicaux libres ont un pouvoir antioxydant diffrent dun radical un autre ; aussi ils sont prsents par ordre croissant de leur pouvoir oxydant dans le tableau 1.

Tableau 1 : Principaux radicaux libres et comparaison de leur pouvoir oxydant [Crompton, 1999 ; Haton, 2005].

Radicaux libres (nomenclature) Radical hydroxyle Radical alkoxyle Radical hydroperoxyde Radical peroxyde Radical oxyde nitrique Radical alkoxyle Peroxyde dhydrogne* Peroxynitrite Anion superoxyde

Structure chimique

OH RO HOO ROO NO RO H2O2 ONOO O2

-

* Espce active de l'oxygne, non radicalaire

Lorigine endogne des ROS

Selon certains auteurs [Dalton et al., 2002 ; Fulbert and Cals, 1992 ; Yoshikawa et al., 2000 ; Tillement, 2001] les radicaux libres peuvent avoir plusieurs origines. Ils sont issus du mtabolisme physiologique mais ils peuvent aussi tre, produits lors de dviations du mtabolisme cellulaire. En effet, la respiration oxydative est la principale source dnergie pour les cellules arobies. Lactylcoenzyme A issue des mtabolismes glucidique, protidique et lipidique entre dans le cycle de KREBS pour loxydation complte du reste actyle en CO2 + H2O. Les lectrons transports via la chane respiratoire, sous forme de coenzymes rduites (FADH2, NADH, NADPH) vont transfrer leur pouvoir rducteur sur les systmes transporteurs dlectrons de la chane respiratoire et permettre aussi la synthse dATP. Ce transfert dlectron est sold par la synthse de leau partir de loxygne dans ltape ultime de la chane respiratoire mitochondriale :

O2 + 4H+ + 4 e-

2 H2O

La rduction de l'oxygne en eau ncessite l'apport de 4 lectrons qui peuvent s'additionner un par un, successivement sur O2, en conduisant aux intermdiaires respectifs O2 , H2O2 et OH selon la raction suivante [Gards et al., 2003] :

Cependant, une rduction incomplte de lO2 peut apparatre pour 1 2% de loxygne molculaire conduisant alors la formation de radicaux libres oxygns : loxygne singulet
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O2 et surtout lanion O 2 - [Milane, 2004 ; Haton, 2005 ; Borg et Reeber, 2008]. Si ce

dernier est libr dans un milieu dpourvu de protons, il peut exercer ses effets dltres, telles les doubles couches phospholipidiques des membranes cellulaires dont la structure a tendance augmenter la dure de vie des radicaux libres [Milane, 2004 ; Favier, 2004]. Si cet anion est libr dans un milieu proton, il subit une dismutation, que ce soit spontanment ou en prsence dune dismutase, phnomne au cours duquel lanion O2 oxygne :
-

dismute en eau

O2 + e -

O2 -

SOD 2 O 2 - + 2 H+ H2O2 + O2

Il faut noter que la formation initiale de lanion superoxyde est lorigine du phnomne radicalaire car en donnant le peroxyde dhydrogne par dismutation ce dernier peut alors se transformer en radical hydroxyle OH par la raction de Fenton:

H2O 2 + Fe2+

OH + OH + Fe3+

Le peroxyde dhydrogne est susceptible de ragir avec le radical superoxyde en donnant galement le radical hydroxyle selon la raction de Habber-Weiss :

H2O 2 +

O2 -

OH + OH + O 2

La vitesse de la raction de dismutation de lO2

est maximale pH = 4,8, mais est trs lente

pH = 7 , cest pourquoi la cellule a besoin dune superoxyde dismutase pour acclrer cette raction en multipliant sa vitesse par 1010 au pH physiologique [Milane, 2004].
-4

Dune manire gnrale, la dure de vie des radicaux libres est trs courte (10 s) et aussi instable. Ils sont trs ractifs car ils cherchent un lectron afin de r-apparier leur lectron clibataire. Ceci peut se faire au cot de la cration dun nouveau radical libre et alors une propagation en chane sinstalle. Ce processus intracellulaire est limit par la compartimentation cellulaire et peut sarrter selon [Tillement, 2001 ; Milane, 2004 ; Borg et Reeber, 2008] par :

- La recombinaison des radicaux libres entre eux :

R1 + R2

R1- R2

Ceci est possible sil sagit de chanes organiques contenant uniquement des liaisons satures [Borg et Reeber, 2008].

Quand lorganisme subit une attaque bactrienne, la raction du systme immunitaire est de facto par une inflammation accompagne de cellules phagocytaires actives qui librent des enzymes, des mdiateurs chimiques tels que lhistamine et la srotonine, et lanion superoxyde accompagn dautres drivs oxygns comme lacide hypochloreux (HClO ) et les radicaux OH , H2O2 et O2. [Tillement, 2001 ; Milane, 2004].
1

En effet, la phagocytose des germes bactriens saccompagne, dune production massive danions superoxydes par le mtabolisme leucocytaire : cest ce quon appelle la flambe respiratoire (Respiratory burst). Une NADPH oxydase, active par la protine kinase C et lacide arachidonique libr par la phospholipase A2 (PLA2) intervient et permet la synthse

de O2

au prix dune forte consommation dO2 [Henderson et al., 1989 ; Hill et al.,

1989 ; Rahman et al., 1996 ; Milane, 2004 ].

NADPH +H+ + 2 O 2

2 O2 -

NADP+ + 2 H+

Les anions superoxydes produits subissent une dismutation soit spontan soit enzymatique[ Hill et al., 1989 ; Rahman et al., 1996].

Au cours de la phagocytose et la formation de phagosome, ce dernier renferme une enzyme sappele la myloperoxydase, catalyse en prsence de H2O2 et dions Cl la formation de drivs halogns toxiques :
-

H 2O2 + Cl -

ClO- + H2O

Lhypochlorite en captant un proton peut ragir son tour avec les fonctions amines ou lion ammonium pour donner des chloramines :

HClO + RNH2 HClO + NH3

RNHCl + H2O NH 2Cl + H2O

En prsence de H2O2 lacide hypochloreux peut donner loxygne singulet

HClO + H2O2
1

HCl + H2O + 1O2

Lors de la phagocytose, il y a donc formation dun taux lev de radicaux libres oxygns (OH, H2O2, O2 et O2, et des chloramines vertu bactricide [Servais, 2004 ; Favier, 2004] agissant contre les infections microbiennes en lysant les agents microbiens phagocyts. Dans le cas dune granulomatose septique ou une inhibition de la myloperoxydase par une corticothrapie, lorganisme devient alors fragile et trs sensible aux agressions microbiennes [Milane, 2004] do les bienfaits des chloramines.

Par ailleurs, la biosynthse des prostaglandines est amorce priori par la libration de lacide arachidonique des phospholipides membranaires par laction hydrolytique de PLA2.

Deux enzymes, la lipooxygnase et la cyclooxygnase, lies aux membranes plasmiques et microsomales, transforment lacide arachidonique libr en drivs (le thromboxane, les prostaglandines ou les leucotrines), aprs action de la lipooxygnase, la transformation dun hydroperoxyde, lacide hydroperoxyeicosattranoque (HPETE) en acide hydroxyeicosattranoque (HETE) saccompagne de la libration du radical hydroxyle OH [Hill et al., 1989 ; Harrison, 2002 ; Milan, 2004]].

De manire gnrale, toute raction biochimique faisant intervenir de loxygne molculaire est susceptible dtre lorigine dune production de radicaux libres oxygns. La xanthinedshydrognase est une enzyme ubiquitaire implique dans le catabolisme de lATP. Au cours des phnomnes dischmie-reperfusion, cette enzyme est modifie en xanthineoxydase qui gnre du superoxyde en prsence doxygne et de xanthine ou dhypoxanthine :

Xanthine + 2O2 + H2O2

Acide urique +2 O2 - + 2 H+

Ainsi, cette voie de production de drivs ractifs de loxygne participe probablement au stress oxydatif chez tout patient prsentant une pathologie ischmique, comme linfarctus ou les tats de choc, les bas dbits rgionaux svres, les microthromboses [Le Bot et al., 1988] Par ailleurs, beaucoup de cellules sont capables de produire du monoxyde dazote NO partir darginine et doxygne, dans une raction catalyse par la NO-synthase (NOS). Cette production est physiologique et joue par exemple un rle majeur dans le tonus vasculaire [Servais, 2004]:

NOS L-Argnine + O2 + NADPH L-Citruline + NO + NADP

Une seconde forme de NO-synthase existe : sous laction des cytokines et des endotoxines libres lors dun sepsis, cette forme est inductible et produit de grandes quantits de NO. forte concentration, le NO devient dltre pour les cellules, notamment en ragissant avec un radical superoxyde O2

pour former un puissant oxydant : le peroxynitrite ONOO . En

outre, le peroxynitrite peut secondairement se dcomposer en dautres oxydants (NO2, OH, etc.) [Hill et al., 1989 ; Haton, 2005].

Le rticulum cytoplasmique renferme des enzymes qui catalysent des ractions pour dtoxifier les drogues liposolubles et dautres produits mtaboliques toxiques. La plus connue de ces enzymes est le cytochrome P450 qui oxyde les acides gras insaturs et les xnobiotiques et produit ainsi les ROS, qui semblent rguler les fonctions du rticulum comme par exemple la scrtion des protines [Schisler and Singh, 1989 ; Milan, 2004].

Dans le peroxysome galement, il y a une production intense de H2O2 suite la prsence de nombreuses enzymes qui gnrent le peroxyde pour tre utilis substrat par la catalase peroxysomiale afin de raliser des ractions de peroxydation avec dautres substrats. Ces ractions sont importantes dans le processus de dtoxification prsent dans le foie et le rein [Schisler and Singh, 1989]. Lorigine exogne des ROS

Lorganisme humain est soumis lagression de diffrents agents capables de donner naissance des radicaux libres. Les rayonnements UV induisent la synthse de radicaux libres du type O2 , OH,

.-

O2 et de molcules gnratrices de radicaux libres tel que H2O2, par

lintermdiaire dagents photosensibilisants [Sinha et al., 1989]. Par ailleurs les radiations ionisantes provoquent galement la gnration de radicaux libres drivs de loxygne [Sinha et al., 1989 ; Milane, 2004 ]. Lingestion dalcool est suivie de la formation de radicaux libres selon divers mcanismes. La xanthine oxydase et laldhyde oxydase peuvent oxyder le principal mtabolite de lthanol, lactaldhyde, avec production dO2

.-

[Albano et al., 1994 ; Albano et al., 1999 ]. Selon ces

mmes auteurs, lthanol stimule galement la production danion superoxyde par induction de la synthse des NADPH oxydase, NADPH cytochrome rductase et du cytochrome P 450. Enfin, selon Schisler et Singh (1989), lalcool diminue lactivit des enzymes de protection (SOD-GSH-Px). De mme, les concentrations sriques en slnium et vitamine E sont abaisses chez les alcooliques et corrles avec une atteinte hpatique plus ou moins svre. Des toxiques tels que loxyde dazote (NO) et le dioxyde dazote (NO2), prsents dans notre environnement (suies, goudron, tabac, polluants industriels), participent la gense de

radicaux libres : ils sont responsables dune auto-oxydation des acides gras polyinsaturs des alvoles pulmonaires selon 2 ractions : Raction rversible :

NO2 + CH3CH = CHCH3

Raction irreversible:

NO2 CH3 CH - C HCH3 ;

NO2 + - CH2 -CH =CH -

HNO2 + - C H -CH =CH-

NO et NO2 peuvent aussi ragir avec le peroxyde dhydrogne produit par les macrophages au niveau des alvoles pulmonaires et donner naissance des radicaux OH [Servais, 2004]. La fume de cigarette joue un rle majeur dans la formation de ces espces radicalaires : elle contient NO et NO2, renferme de fortes concentrations en composs insaturs et stimule, par son action irritante, les macrophages des alvoles pulmonaires [Servais, 2004]. Dautres toxiques agissent par transfert dlectrons, comme le ttrachlorure de carbone (CCl4) dont la toxicit sexerce par lintermdiaire des radicaux CCl3 et mis en vidence dans des hpatocytes de rat par rsonance paramagntique lectronique (RPE). La rduction de CCl4 en CCl 3 seffectue, soit sous laction du cytochrome P450 hpatique CCl4 + e Cl + CC l 3, soit en prsence de fer ferreux CCl4 + Fe le CCl

+
2

+ Fe

+
3

+ CC l 3 [Milane, 2004]. Par ailleurs

est capable dinduire lauto-oxydation des acides gras polyinsaturs et une

production importante des hydroperoxydes lipidiques [Knecht et Mason, 1988]. Par ailleurs, des antibiotiques anticancreux, tels que les anthracyclines, sont galement capables de gnrer des radicaux libres. La formation despces radicalaires serait responsable de leur mode daction anticancreux et de leur toxicit en agissant selon un mcanisme de transfert dlectron [Pein et al., 1995 ; Sinha et al., 1989]. Des travaux raliss sur des cultures de cellules tumorales mammaires, ladriamycine est bioactive en radical semiquinone de ladriamycine (SQ) par rduction enzymatique (cytochrome P450), ce radical peut ragir avec loxygne pour former lanion superoxyde [Sinha et al., 1989]. Pour une autre anthracycline, la daunorubicine, la rduction en radical libre (DSO) se ralise alors que la molcule est dj intercale dans l.ADN [Sinha et al., 1989]. Enfin, sur des cultures de cardiomyocytes, lpirubicine, un autre driv des anthracyclines, savre inducteur dune toxicit avre modifiant les proprits physicochimiques des membranes cellulaires par la gnration des radicaux libres [Pein et al., 1995].

Etape 1 : Initiation

Le radical form (R) subit un rarrangement interne, d une tautomrie lie au dplacement de la double liaison la plus proche de llectron clibataire, et existe donc sous 2 formes en quilibre.

Etape 2 : Adition de loxygne

En prsence doxygne, il se forme un radical peroxyde (ROO).

Etape 3 : Propagation et amplification

Figure 1 : Le mcanisme de la peroxydation lipidique

2.2.3. Rle pathologique des espces actives de loxygne

Plusieurs tudes [Halliwell et Cross, 1994 ; Cadet et al., 2002 ; Favier, 2003 ; Halliwelle et Gutteridge, 2007] ont bien montr le rle des radicaux libres et des espces oxygnes ractives dans la gense de nombreuses maladies. En effet, La production excessive de radicaux libres provoque des lsions directes de molcules biologiques (oxydation de l'ADN, des protines, des lipides, des glucides), mais aussi des lsions secondaires dues au caractre cytotoxique et mutagne des mtabolites librs notamment lors de l'oxydation des lipides [Favier, 2003]. L'organisme peut aussi ragir contre ces composs anormaux par production d'anticorps, qui malheureusement peuvent aussi tre des auto-anticorps crant une troisime vague d'attaque chimique [Favier, 2003 ; Halliwelle et Gutteridge, 2007]. Toutes ces cascades vont avoir des rpercussions sur les biomolcules. v Les lipides : Les lipides, en particulier les acides gras polyinsaturs, sont la cible privilgie de l'attaque par le radical hydroxyle capable d'arracher un hydrogne sur les carbones situs entre deux doubles liaisons, pour former un radical dine conjugu, oxyd en radical peroxyle. Cette raction appele peroxydation lipidique forme une raction en chane car le radical peroxyle form se transforme en peroxyde au contact d'un autre acide gras qui forme un nouveau radical dine conjugu. Les hydroperoxydes peuvent subir plusieurs modes d'volution : tre rduits et neutraliss par la glutathion peroxydase ou continuer s'oxyder et se fragmenter en aldhydes acides et en alcanes (thane, thylne, pentane) qui, de par leur volatilit, sont limins par voie pulmonaire. Le radical peroxyle, aprs volution en un peroxyde cyclique et coupure de la molcule, peut librer diffrentes aldhydes toxiques dont le malonaldialdhyde ou l'hydroxynonenal. La transmission en chane de la raction de peroxydation lipidique est stoppe par la vitamine E intercale dans la bicouche lipidique des membranes. On peut dtailler le mcanisme de cette peroxydation en trois tapes conscutives, figure 1, [Gards et al., 2003]. Le radical peroxyde (ROO) qui dstabilise une deuxime molcule dAGPI et conduit un hydroperoxyde lipidique (ROOH) et un nouveau radical (R ). Cette auto-oxydation se propage et samplifie dun acide gras lautre. Les implications chimiques et les diffrents produits engendrs par ce mcanisme sont rsums dans la figure 2.

Figure 2 : Ractions en chane de la peroxydation lipidique et ses produits terminaux [Favier, 2003].

La peroxydation lipidique provoque une augmentation croissante de la permabilit des membranes cellulaires induisant une altration irrversible des proprits fonctionnelles de la cellule, pouvant aller jusqu la lyse complte. La raction en chane prolonge les effets intramembranaires des radicaux libres, mme si lagression radicalaire sestompe [Milane, 2004]. La peroxydation lipidique aboutit la formation de nombreux drivs toxiques : les

hydroperoxydes et leurs drivs [Halliwelle et Gutteridge, 2007]. Les hydroperoxydes lipidiques sont relativement stables; en prsence de fer, ils sont transforms en radicaux alkoxyles (RO). Parmi leurs drivs, le MDA (malondialdhyde) a une demi-vie plus longue que celle des radicaux libres et diffuse facilement et peut donc tre considr un marqueur de la peroxydation lipidique et peut galement former des liaisons avec les bases de lADN et devenir un mutagne [Milane, 2004 ; Favier, 2003].

Par ailleurs, les ROS sattaquentont aux lipoprotines circulantes aboutissant la formation de LDL oxydes qui, captes par des macrophages, formeront le dpt lipidique de la plaque d'athrome des maladies cardiovasculaires [Favier, 2003]. v LADN : Bien que l'ADN soit la mmoire de toute la composition biochimique des tres vivants, il s'agit d'une molcule trs sensible l'attaque par les radicaux de l'oxygne. Au minimum, cinq classes principales de dommages oxydatifs mdis par OH peuvent tre gnres, parmi elles, les bases oxydes, les sites abasiques, des adduits intra-catnaires, des cassures de brins et des pontages ADN-protines [Von Sonntag, 1987 ; Favier, 2003].

Par exemple, dans le cas de l'ADN, le radical hydroxyle ragit avec les bases en s'additionnant sur les doubles liaisons (voir figure 3).

Figure 3 : Illustration dun mode daction des radicaux hydroxyles (addition sur les doubles liaisons) avec une base de lADN, la guanine [Singal et al., 1988].

Deux radicaux libres sont forms : R1 (centr sur l'atome de carbone 5) et R2 (centr sur l'atome d'azote 7). Ce dernier (R2) donne naissance la 8-oxoguanine, un des principaux marqueurs du stress oxydant dans l'ADN [Singal et al., 1988]. Des dommages indirects peuvent rsulter galement de l'attaque des lipides dont la peroxydation gnre des aldhydes mutagnes, formant des adduits sur les bases de l'ADN de type MDA-guanine ou thnodrivs [Favier, 2003]. v Les protines] : Les protines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent une fonction thiol (SH) [Favier, 2003 ]. Comme les protines de transport qui deviennent inactives suite leur oxydation [Avissar et al., 1989 ; Favier, 2003 ]. Les protines peuvent alors soit subir des rticulations par formation notamment de ponts bi-tyrosine dtectables par leur fluorescence, soit subir des coupures en cas d'agression forte, soit des modifications de certains acides amins en cas d'agressions modres [Halliwell and Gutteridge, 2007]. Les protines modifies par oxydation perdent leurs proprits biologiques (enzyme, anti-enzyme, transporteurs, rcepteurs...) et deviennent beaucoup plus sensibles l'action des protases et notamment du protasome [Favier, 2003 ].

Figure 4 : Nature de quelques modifications des chanes latrales dacides amins des
protines aprs attaque radicalaire [Favier, 2003].

Figure 5 : Caractristiques morphologiques de lapoptose et de la ncrose.

[ Duvall et Wyllie, 1986]

Les protines oxydes deviennent allors trs hydrophobes (pertes des groupes ionisables et/ ou extriorisation de zones hydrophobes centrales). Elles vont alors former des amas anormaux dans ou autour des cellules et sassocient aux lipides pour former des dpts de lipofuschines caractristiques des tissus des sujets gs [Avissar et al., 1989 ; Favier, 2003 ]. Les radicaux libres sont galement responsables dune fragmentation des macromolcules (collagne, protoglycannes, acide hyaluronique), qui forment de dimres ou dagrgats protiniques dans les membranes cytoplasmiques. Les acides amins, les plus sensibles leur action, sont le tryptophane, la tyrosine, la phnylalanine, la mthionine, la cystine (figure 4).

Les consquences biologiques du stress oxydant seront extrmement variables selon la dose et le type cellulaire. De lgers stress augmenteront la prolifration cellulaire et l'expression de protines d'adhsion, des stress moyens faciliteront l'apoptose, alors que des stress importants provoquent une ncrose et des stress violents dsorganiseront la membrane cellulaire, entranant des lyses immdiates [Duvall, 1986] (figure 5). De nombreuses autres anomalies biologiques sont induites par le stress oxydant : mutation, carcinogense, malformation des foetus, dpt de protines anormales, fibrose, formation d'auto-anticorps, dpt de lipides oxyds, immunossupression [Favier, 2003 ; Halliwell et Gutteridge, 2007]

2.2.4. Les systmes scavenger des radicaux libres

Les systmes antioxydants entranant le pigeage des radicaux libres sont enzymatiques et non enzymatiques [Germain et al., 2003 ; Le Bot et al., 1988 ; Gards et al., 2003 ; Avissar et al., 1989].

Les systmes endognes enzymatiques

La superoxyde dismutase ou EC 1.15.1.1. (SOD)

Cette enzyme assure llimination de lanion superoxyde, premire espce toxique forme partir de loxygne. Elle assure, ainsi, la premire ligne de dfense contre le stress oxydant. Le mcanisme ractionnel est catalys par un mtal situ au cur de lenzyme dont la nature distinguera les superoxyde-dismutases (Mates et al., 1999 ; Milane, 2004]: - SOD manganse (Mn-SOD) : protge la mitochondrie.

- SOD cuivre zinc, protge le cytosol (cCu-ZnSOD) - La face externe de la membrane des cellules endothliales (ecCu-ZnSOD). - Le plasma sanguin (pCu-ZnSOD).

Pour leur effet antioxydant, les superoxyde-dismutases sont utilises en thrapeutique : dans les maladies inflammatoires chroniques, les anions superoxydes relargus par les phagocytes activs stimulent et amplifient la rponse inflammatoire. Ladministration de SOD peut prvenir les lsions tissulaires dues lanion superoxyde [Milane, 2004]. Les SOD semblent galement rduire ltendue de linfarctus du myocarde [Avissar et al., 1989 ; Milane, 2004].

Le systme glutathions peroxydases ou EC 1.11.1.9. (GSH-Px)

Ses enzymes sont slno-dpendantes contenant 4 atomes de slnium situs aux centres actifs de lenzyme sous forme de slnocystine [Milane, 2004]. Elles se trouvent dans le cytosol, la mitochondrie, le rticulum endoplasmique et le noyau. Un dficit en slnium entrane une chute de lactivit de lenzyme et une rpltion la restaure [Favier, 2003 ; Servais, 2004]. Ces enzymes sont, sans doute le principal systme de protection car elles dtruisent non seulement H2O2, mais aussi les peroxydes organiques toxiques forms par loxydation des acides gras ou du cholestrol [Favier, 2003].

L'activit de ces enzymes est trs dpendante de l'apport nutritionnel en slnium et ncessite la prsence de glutathion rduit (GSH) comme donneur dlectron. Le glutathion disulfite (GSSG) produit est nouveau rduit par la glutathion rductase qui utilise le NADPH comme donneur dlectron, cest pourquoi le rapport GSH/GSSG est un index de ltat doxydation dans la cellule [Mates et al., 1999 ; Servais, 2004]

Avissar et al. (1989), ont, partir de cultures cellulaires, individualis 2 formes de GSH-Px qui diffrent par leur structure, leur activit et leurs sites antigniques : - une forme localisation intracellulaire - une forme glycosyle riche en ponts disulfures, localisation extracellulaire. Les GSH-Px ont une action dtoxicante vis--vis de 2 substrats :

- le peroxyde dhydrogne :

- les hydroperoxydes (ROOH) drivs des lipides :

Lactivit de dtoxication des GSH-Px face aux hydroperoxydes ncessite une autre enzyme, la PLA2. Cette phospholipase libre les peroxydes dacides gras des membranes cellulaires en hydrolysant les fonctions esters des phospholipides membranaires. Les peroxydes librs dans le cytosol sont alors transforms par la GSH-Px tandis que la chane dacides gras manquante est resynthtise [Avissar et al., 1989 ; Milane, 2004].

La catalase ou EC 1.11.1.6. (CAT)

La catalase est une enzyme rpartie dans les tissus [Milane,2004 ; Borg et Reeber, 2008]. Elle catalyse la dcomposition de H2O2 selon la raction suivante :

2H2O 2

2 H2O + O2

Le H2O2 na pas de charge sa surface ce qui rend ce ROS trs lipophile et peu ractif en milieu aqueux. Le peroxyde dhydrogne peut nanmoins tre considr comme un driv ractif de loxygne potentiellement toxique car sa faible ractivit, associe sa capacit traverser les membranes biologiques, fait quil peut se retrouver une grande distance de son lieu de synthse [Marfak, 2003]. Il ragit avec tous les substrats organiques et pouvant se transformer en radical hydroxyle OH par la raction de Fenton ou par la raction de HabberWeiss [Avissar et al., 1989 ; Haton, 2005].

La CAT est localise principalement dans le peroxysome, mais elle se trouve aussi dans le cytoplasme. La GPx et la CAT permettent ainsi llimination de H2O2. Toute fois la CAT semble jouer un rle plus important en prsence de forte concentration de H2O2. Aussi elle empche le peroxyde dhydrogne de participer la raction de Fenton, alors que la GPx prend en charge le hydroperoxydes et H2O2 mme en faible quantit, pour lesquels elle est considre la source majeure de protection [Avissar et al., 1989 ; Milane,2004 ; Borg et Reeber, 2008].

Les thioredoxines peroxydases ou EC1.11.1.15. (Prx)

Ce sont des petites protines activit antioxydante, localises dans le cytosol, les mitochondries, les proxysomes, associs aux noyaux et aux membranes [Avissar et al., 1989]. Ces protines exercent leur rle antioxydant travers une activit peroxydase, o lH2O2, le peroxynitrite et de nombreux hydroperoxydes sont les substrats [Avissar et al., 1989].. Ils jouent un rle trs important dans la dtoxication vue leur quantit importante (0.1 0.8% de protines solubles cellulaires) et leur large distribution cellulaire [Favier, 2003 ; Milane, 2004].

Lhme oxygnase ou EC 1.14.93. (HO)

Le systme oxygnase permet la conversion

de lhme en monoxyde de carbone, en

biliverdine et en fer [Koolman et Rohm, 1999 ; Ryter et Tyrell, 2000]: Leffet protecteur de l HO contre le stress oxydant est indirect, puisquil est reli au fait que : - La biliverdine se transforme en bilirubine activit antioxydante [Ryter et Tyrell, 2000]. - Le fer produit par lactivit de l HO stimule la synthse de la ferritine, qui est aussi implique galement dans la rponse antioxydante [Milane, 2004]. . Les systmes endognes non enzymatiques Les protines de stress thermique : Ces protines interviennent

dans la rparation des dommages oxydatifs induits au niveau des protines par un stress oxydant [Milane, 2004]. Les antioxydants non enzymatiques : Parmi ces antioxydants se

trouvent les thiols (SH) dont certains sont synthtiss in vivo, comme le glutathion (GSH) [Favier, 2003]. Le glutathion est un tripeptide (-Glu-Cys-Gly) dont la concentration intracellulaire est importante puisqu'elle est de l'ordre de 10-4 10 -3 mol.L-1[Halliwell and Gutteridge, 1999]. La fonction thiol confre au glutathion un rle d'antioxydant, c'est--dire de rducteur, qu'il exerce vis--vis de nombreuses espces oxydes, en particulier vis--vis de l'eau oxygne et des radicaux hydroxyles :

H2O2 + 2 GSH

2 H2O + GSSG

GSH + OH

GS + H2O

Toutefois, le rle protecteur de GSH semble provenir de sa capacit ragir avec les radicaux centrs sur le carbone R [Favier, 2003 ; Gards et al., 2003] :

GSH + R

GS + RH

En effet dans ce cas, un phnomne de rparation des radicaux R en RH se produit, par opposition l'oxydation possible des radicaux R par O2, donnant naissance des radicaux peroxyles RO2 [ Gards et al., 2003 ].

Cependant, les radicaux thiyles GS forms lors des ractions sus-cites, sont loin d'tre euxmmes inoffensifs car leurs ractions ultrieures peuvent gnrer de nouveaux radicaux libres susceptibles d'initier leur tour des dommages molculaires [Gards et al., 2003]. Par consquent, l'effet protecteur des thiols reste relativement limite. La rgnration de la fonction thiol SH semble se faire, in vivo, l'aide d'autres rducteurs tels que l'ascorbate (Vit. C) [Milane, 2004 ; Gards et al., 2003] et le systme glutathions peroxydase [Milane, 2004].

2.2. Les systmes exognes antioxydants

Toute substance capable de capter llectron clibataire dun radical libre sans donner elle mme un produit radicalaire est dfinie comme un pigeur de radicaux libres [Schisler and Singh, 1989 ; Tillement, 2001] . Ces pigeurs se caractrisent par leur affinit leve pour les radicaux libres et leur spcificit pour certains dentre eux. Les antioxydants d'origine alimentaire, comme l'ascorbate, les tocophrols, les carotnodes et les polyphnols prsents dans certains fruits et lgumes (persil, oignon, myrtilles, cerises), exercent des effets

protecteurs importants in vivo [Van Acker et al., 1996 ; Gards et al., 2003 ; Halliwell and Gutteridge, 2007]. Les oligolments (Se, Zn, Cu, Mn, ) sont des cofacteurs indispensables pour les enzymes antioxydantes [Favier, 2003 ; Milane, 2004]. La vitamine C : La molcule d'acide ascorbique (figure 6) et sa forme dprotone, l'ascorbate (prsent majoritairement pH physiologique), est agent rducteur [Favier, 2003]. L'ascorbate est un trs bon capteur de radicaux libres oxygns puisqu'il ragit non seulement avec les radicaux hydroxyles OH mais aussi avec lanion superoxyde O2 et les radicaux peroxyles RO 2 . En ragissant avec ces divers oxyradicaux, l'ascorbate (AscH ) est oxyd en radical ascorbyle (Asc ) qui est relativement inerte vis--vis des matriaux biologiques. Par consquent, l'oppos du radical thiyle GS susceptible dinitier de nombreuses ractions secondaires, le radical ascorbyle Asc ne dveloppe pas de ractions ultrieures dommageables [Gards et al., 2003].
. .-

sec

Figure 6 : Structure dorigine alimentaire de quelques antioxydants : -tocophrol, acide ascorbique, -carotne, acide cafique et querctine [Gardse et al., 2003].

Une proprit importante de l'ascorbate est la rparation possible de deux autres antioxydants, le glutathion et l'-tocophrol (-TH) partir de leurs formes radicalaires. L'ascorbate est recycl, tout au moins en partie, par dismutation du radical ascorbyle [Halliwell and Gutteridge, 2007]:

AscH + GS

Asc + GSH

AscH + -T

Asc + -TH

Les Tocophrols : Ils existent plusieurs variantes de tocophrols naturels (d-, d, d- et d-- tocophrols), le d--tocophrol (vitamine E) est celui qui est le plus efficace in vivo. C'est un antioxydant liposoluble, en raison de sa longue chane aliphatique comportant 16 atomes de carbone (figure 6). Le d--tocophrol est donc localis parmi les chanes d'acides gras des phospholipides constituant les membranes et les lipoprotines [Milane, 2004 ; Servais, 2004]. Le rle essentiel de la vitamine E est de capter les radicaux peroxyles lipidiques RO2 qui propagent les chanes de peroxydation [Gards et al. 2003] . La partie active de la molcule tant la fonction phnol rductrice (-TH), celle-ci perd facilement un atome d'hydrogne et se transforme en radical -tocophryle, -T , tandis que le radical peroxyle est rduit en une molcule d'hydroperoxyde [Gards et al. 2003]:

RO2 + -TH

RO2H + -T

L'-tocophrol capte galement les radicaux superoxydes (sous leur forme protone HO2 ),

les radicaux hydroxyles OH, ainsi que l'oxygne singulet 1O2 (espce ractive de l'oxygne, non radicalaire). Le recyclage de la vitamine E est assur par des systmes rducteurs dont le plus important est l'ascorbate (raction ci-dessus), d'antioxydant plusieurs reprises [Servais, 2004]. lui permettant de jouer son rle

Figure 7 : Pigeage des ROS (R ) par les flavonodes [Van Acker, 1996].

Les carotnodes : ils sont trs nombreux et reprsentent la principale source

1

alimentaire de rtinol. En plus de leur activit de provitamine A, les carotnodes ont un rle spcifique de capteur doxygne singulet O2, ce qui leur permet d'exercer une protection vis-vis des dommages induits par les rayons ultraviolets de la lumire solaire [Gardse et al., 2003; Milane, 2004]. Daprs Burton et Ingold (1984), leffet antioxydant du -carotne serait d une interaction entre le radical et le systme de doubles liaisons conjugues de la chane insature du pigeur qui serait stabilis par rsonance. Les flavonodes : Tous les flavonodes sont capables de piger les radicaux libres gnrs en permanence par notre organisme ou forms en rponse des agressions de notre environnement (cigarette, polluant, infections ingrs avec nos aliments, ces composs renforcent nos dfenses naturelles en protgeant les constituants cellulaires (lipides et macromolcules) contre le stress oxydant [Bors et al., 1997]. Ils sont de bons capteurs de

. . radicaux hydroxyles OH, lanion superoxyde O2 et peroxyles RO 2 [Gards et al ;, 2003 ;

Milane, 2004]. Ils sont donc susceptibles d'inhiber les chanes de peroxydation lipidique. La querctine, flavonode non glycosyl, est la plus antioxydante [Milane, 2004]. Le pigeage des radicaux libre se fait selon la raction [Cao et al., 1997 ; Marfak, 2003] :
. .

Flavonode (OH) + R

flavonode (O ) + RH

O R reprsente lanion superoxyde, le peroxyle, l alkoxyle et l hydroxyle. Le radical flavonoxy (FL-O ) peut ragir avec un autre radical pour former une structure

quinone stable (figure 7) et un anion superoxyde avec loxygne.

Cette raction est responsable dun effet prooxydant indsirable des flavonodes. Nous constatons que la capacit des flavonodes dagir comme antioxydants dpend non seulement du potentiel redox du couple Fl-O / FL-OH mais aussi de la ractivit du radical flavonoxy [Marfak, 2003].

Figure 8 : Flavonodes et leurs sites proposs pour la chlation des ions mtalliques (Men+) [Milane, 2004 ].

Figure 9 : Elments essentiels pour l'activit antioxydante des flavonodes [Van Acker, 1996].

Par ailleurs, les flavonodes sont considrs comme de bons chlateurs des ions mtalliques. Des tudes menes par Van Acker et al. [Van Acker, 1996], montrent laptitude des flavonodes chlater les minraux. La querctine est la plus active des flavonodes tudis dans ce travail. On peut rsumer les sites essentiels pour la chlation des ions mtalliques dans la figure 8 : (i) un noyau catchol sur le cycle B, (ii) les groupes 3-hydroxyle et 4-oxo du cycle C, et (iii) les groupes 4-oxo et 5-hydroxyle entre les cycles A et C.

En fin, selon la communaut scientifique, la capacit des flavonodes piger les radicaux libres, est en relation avec ceux qui combinent les trois critres suivants:

1. La structure ortho-dihydroxy sur le cycle B (groupement catchol) qui confre la stabilit au radical flavonoxy et participe la dlocalisation des lectrons. 2. La double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo. 3. La prsence du groupe 3-OH en combinaison avec la double liaison C2-C3. A titre dexemple, la querctine satisfait tous ces critres et par consquent, elle est le compos le plus actif de la famille des flavonodes (figure 9).

3. Etude exprimentale de leffet hpatoprotecteur des flavonodes contre le stress oxydatif induit par lEpirubicine (EPI) dans lhpatocyte et la mitochondrie

La prise de mdicaments anticancreux provoque des intoxications hpatiques. Des tudes pidmiologiques ont dmontr que les maladies hpatiques causes par les substances toxiques et pharmacologiques en particulier par les substances anticancreuses [Bissel et al., 2001]. Des travaux de recherche ont montr que les drivs des anthracyclines tels que lEpirubicine, daunorubicine et doxorubicine engendrent un effet toxique sur le foie et le cur [Le Bot et al., 1988 ; Mazu et al., 1995 ; Nielsen et al., 1990 ; Goebel, 1993]. Chez lhomme le risque de la cardiotoxicit augmente exponentiellement au-del de la dose cumulative [Allen, 1992].

Cependant, les mcanismes impliqus, dans lhpatotoxicit et la cardiotoxicit [Le Bot et al ;, 1988 ; Germain et al., 2003] par lpirubicine ne sont pas clairement identifis. Dautres travaux scientifiques suggrent que la toxicit cause par ces anticancreux ou leurs

mtabolites est mdie par la production des radicaux libres.[Le Bot et al ;, 1988 ; Germain et al., 2003].

Dans cette deuxime partie de notre travail exprimental, nous allons investir dabord le degr de toxicit produit par lEPI au niveau du foie car selon la littrature consulte [Nielsen et al., 1990 ; Goebel, 1993 ; Mazu et al., 1995 ; Germain et al., 2003], nous estimons quelle na pas t tudie sur le plan cellulaire que subcellulaire. En plus de cette tude nous allons examiner le statut antitoxique des flavonodes de RRL et de la querctine contre la toxicit provoque par lEPI. Lutilisation de ces composs

phnoliques est motive par les rsultats de la premire partie de la prsente tude montre la possibilit dattribuer le statut dantioxydant et cytoprotecteur ces substances naturelles dans le cas du diabte induit par lalloxane.

3.1. Materiel et mthodes

3.1.1. Induction de lhpatotoxicit par lEpirubicine

Avant dinduire lhpatotoxicit, lEPI, lextrait de flavonodes (EB) et la querctine sont reconstitus dans une solution saline (0.9%) juste avant les traitements. Les animaux sont rpartis comme suit : Groupe1, tmoin normal reoit deux fois l ml de la solution saline, la premire par gavage avant 24 heures et la seconde par voie pritonale ; Groupe 2, trait par lEPI, reoit par gavage 1 ml la solution saline deux fois galement, la premire par gavage avant 24 h et la seconde juste aprs ladministration par voie intra pritonale dune dose monoprise de 1 ml EPI 9 mg/kg [Dobbs et al., 2003]; Group 3, prventif, reoit deux fois 1 ml de lextrait de flavonodes par gavage la dose de 100ml/kg, la premire avant 24 h et la seconde aprs ladministration dune monoprise de 1ml dEP par voie intra pritonale la dose de 9mg/kg ; Groupe 4, reoit la querctine la dose de 33mg/kg, de la mme manire que lextrait de flavonodes. 3.1.2. Le srum et le test de la fonction hpatique Aprs les diffrents traitements, les rats sont dcapits par dislocation cervicale aprs un jen de 24 heure afin de collecter le sang dans des tubes non hparins puis centrifuger 3000 rpm 4 C pendant 10 min pour rcuprer le srum ( Sigma 1-15K, Bioblock scientific). Les activits enzymatiques de lASAT et de LALAT, biomarqueurs de la fonction hpatique, sont dtermines par colorimtrie selon la mthode de Reitman et al. (1957) en utilisant des Kits du commerce (Biomrieux, France), sur un automate multiparamtrique (TECHNICON, Germany). 3.1.3. Prparation des fractions de cytosol et de la matrice mitochondriale Prparation de cytosol des hpatocytes

La fraction cytosolique est extraite selon la mthode dcrite par Sanmugapriya et Venkataman (2005). Ars le sacrifice des rats, les foies sont immdiatement prlevs par dissection et perfuss avec une solution saline froide (0.86%) afin de drainer tout le sang restant dans le foie. En suite les tissus hpatiques sont coups en petits morceaux, pess et homogniss (homognisation avec 3 volumes de tampon phosphate 0.1 M; pH 7.4 contenant KCl 1.17%).

Le surnageant est centrifug 10000 rpm pendant 45 min 4C et le surnageant obtenu est utilis comme source de CAT et de SOD. Le dosage des protines dans les fractions cytosoliques est ralis par la mthode de Lowry (1951). Prparation de la matrice mitochondriale

La matrice mitochondriale est prpare selon la mthode dcrite par Rustin et al. (1994) avec quelques modifications. Les morceaux de foie sont mis dans un tampon glac disolation des mitochondries (10 mM tris-HCl, pH 7.4, 250 mM Sucrose, 0.5 mM EDTA et 0.5% bovin serum albumin). Aprs homognisation des fragments, lhomognat obtenu est centrifug 10000 rpm pendant 10 min 4C. Les pellets de mitochondries sont lavs deux fois avec le tampon disolation puis re-suspendus dans la mme solution tampon. La matrice mitochondriale est extraite par conglation et dconglation suivi immdiatement par homognisation rpte des prparations fraches de mitochondriales afin dclater les

mitochondries. Aprs centrifugation 10000 rpm pendant 10 min, le surnageant obtenu est considr la source de CAT, Mn-SOD et MDA. Le dosage des protines dans les fractions mitochondriales est ralis par la mthode de Lowry (1951).

3.4. Evaluation biochimique du statut oxydatif dans le cytosol et les mitochondries Le MDA est valu par le mthode de Ohckawa et al. (1979) ; le dosage de GSH par la mthode dEllman (1951) ; les activits de la CAT par la mthode de Clairborne (1985) ; et de la SOD la mthode dcrite par Beauchamp et Fridovich (1971). Lactivit enzymatique spcifique est calcule en termes dUI/mg de protines.

Figure 10. Effet de lEPI et les flavonodes sur la fonction hpatique et sa libration des transaminases ASAT et ALAT. Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. ** P< 0.01, groupes
compars au groupe tmoin.

***

Figure 11. Effet des flavonodes sur la teneur en MDA cytosolique et mitochondriale des hpatocytes sous leffet dun stress oxydatif induit par lEPI chez les rats. Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. *** P< 0.001 groupes compars au tmoin.

3.2. Rsultats et interprtation

3.2.1. Effet de lpirubicine sur la fonction hpatique et laction hpatoprotecteur des flavonodes Leffet de lpirubicine sur les fonctions hpatiques avec ou sans lextrait de flavonodes est illustr par la figure la figure 10. Sur cette figure on constate une lvation significative (p< 0.05, p 0.01) du niveau srique de TGO chez les rats traits par lEPI (69.510.53 UI/ml) contrte (37 5.35 UI/ml) pour le groupe tmoin. Ladministration des extraits flavonodiques tamporise, leffet du mdicament anticancreux et normalise la valeur de cette enzyme (38 4.08 IU/ml) contre (37 5.35 UI/ml) contre le tmoin. Les mmes remarques pour les variations de la TGP : avec puribicine 50.25 9.42 UI/ml contre EPI et flkavonodes : 22.75 5.85 IU/ml. Les flavonodes de la RRL prservent le foie contre la toxicit provoque par l EPI, mdicament anticancreux 3.2.2. Evaluation in vivo de la peroxydation lipidique dans le cytosol et la mitochondrie Leffet de lEPI sur le mtabolisme des lipides (cytosol et mitochondrie) est illustr par la figure 11. La lipoperoxydation est matrialise par une audmentation du MDA : 0.644 0.035 nmol /g (cytosol) et 0.530 0.059 nmol/g (mitochondrie) compar au groupe tmoin respectif : (0.151 0.011 nmol/g) ; (0.089 0.014 nmol/g). Le prtraitement par les flavonodes diminue loxydation des lipides chez les rats et normalise la valeur du MDA : 0.206 0.026 nmol/g (cytosol) ; 0.069 0.013 nmol/g (mitochondrie) compar au groupe tmoin respectif : (0.151 0.011 nmol/g) ; (0.089 0.014 nmol/g).

Conclusion : Comme pour les transaminases hpatiques, les flavonodes attnuent le stress oxydatif des lipides induit par lEPI.

Tableau 2. Effet prventif des flavonodes sur le systme antioxydant des hpatocytes sous leffet dun stress oxydant induit par lEPI chez les rats. Paramtres Gr. de Rats
Control Solu. Saline Epi. 9mg/kg Epi. 9mg/kg+ BE 100mg/kg Epi. 9mg/kg+QE 0.33mg/kg

Protines [mg/ml]
5,93 0.53 4.2 0.25* 6.42 0.55 ns

CAT [UI/mg Pr.]

0,615 0.08 0,334 0.07*** 0.53 0.05 ns

CU/ZN SOD [UI/mg Pr]

15,32 2.13 06,007 0.76** 12 0.731ns

GSH [mM/g liver]

2,74 0.21 0,53 .06*** 2.46 0.18 ns

6,02 0.78 ns

0,51 0.09 ns

12,26 1.42 ns

2,63 0.32 ns

Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. Comparaisons faites entre les groupes traits et le groupe normal. * P< 0.05 reprsente une diffrence significative; ** P< 0.01 reprsente une diffrence hautement significative ; *** P < 0.001 reprsente une diffrence trs hautement significative.

Tableau 3. Effet prventif des flavonodes sur la dfense enzymatique antioxydant, CAT et Mn-SOD, dans les mitochondries des hpatocytes, sous leffet dun stress oxydant induit par lEPI chez les rats. Paramtres Gr, et Traitements

Pr. [mg/ml]
0. 291 0.05 0. 088 0.02 *

CAT [UI/mg Pr.]

6. 264 1.428 01.099 0.20 **

SOD [UI/mg Pr.]

190. 56 16.72 6.23 2.69 ***

Control, phys. Saline

Epi.9mg/kg

Epi. 9mg/kg+BE100mg/kg

0. 261 0.04 ns

04.98 0.93 ns

174. 25 28.30 ns

Epi.9mg/kg+QE0.33mg/kg

0. 242 0.03 ns

05. 82 1. 27 ns

2 05.44 1.27 ns

Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. Comparaisons faites entre les groupes traits et le groupe normal. * P< 0.05 reprsente une diffrence significative; ** P< 0.01 reprsente une diffrence hautement significative ; *** P < 0.001 reprsente une diffrence trs hautement significative.

3.2.3. Evaluation des systmes antioxydant dans le cytosol hpatique La lecture du tableau 2 montre que ladministration de lEPI provoque une diminution significative (p<0.001, p<0.01) des niveaux de GSH, CAT and Cu/Zn-SOD chez les rats traits avec lEPI compars au groupe normal. Par ailleurs, le prtraitement des animaux par lextrait de flavonodes (100 mg/kg) et la querctine (33 mg/kg) associs avec lEPI, a normalis la teneur cellulaire en ces facteurs antioxydants dans lhpatocyte.

3.2.4. Evaluation de lactivit enzymatique CAT et SOD dans les mitochondries

Comme dans le cytosol les les teneurs mitochondriales des enzymes antioxydant, CAT et MnSOD sont significativement rduites (p<0.01, p<0.001) chez les rats traits par LEPI seul compars au groupe normal (tableau 3), le traitement des animaux par lextrait de flavonodes et la querctine qui a maintenu le niveau mitochondrial normal de ces enzymes. Les activits enzymatiques sont normalises lorsque les animaux subissent un prtraitement par les extraits flavonodes en particulier lextrait acqueux.

3.3. Discussion Lpirubicine est un anticancreux driv de la doxorubicine. Cet analogue des antracyclines est lun des mdicaments les plus utiliss en clinique thrapeutique cause de son efficacit thrapeutique et sa faible cardiotoxicit [Li et al., 2005]. Il est mtabolis dans le foie chez les animaux et lhomme pour donner des mtabolites tels que lpirubicinol, EPI glucoronide [Weenen et al., 1984]. La doxorubicine et lpirubicine sont considrs les plus toxiques des anthracyclines dans les hpatocytes [Weenen, 1984 ; Le Bot et al., 1988 ]. Malgr cette toxicit, lEPI continue tre utilis en Europe comme agent anticancreux [Andersson et al ;, 1999]. Par ailleurs, il a t clairement dmontr que la culture des myocardiocytes en prsence dEPI, manque de viabilit cellulaire suite des perturbations des membranes cellulaires sous leffet de la gnration des radicaux libres oxygns [Germain et al., 2003]. Les travaux de Ganziani (1983), le Bot et al. (1988) et Twelves et al. (1992) ont clairement dmontr une corrlation entre lEPI et lactivit des transaminases sriques chez les patients cancreux ayant reu ce mdicament.

Cependant, leffet de lEPI sur le statut redox hpatocytaire nest pas suffisamment investi par les chercheurs et selon la littrature consulte, les donnes biochimiques concernant lhpato toxicit induite par lEPI in vivo restent fractionnes et confuses. Nous avons donc investi les marqueurs du stress oxydatif gnr par lEPI dans le cytosol et les mitochondries de lhpatocyte. Cette prsente tude se veut dtudier galement leffet antioxydant et hpatoprotecteur des flavonodes extraits de RRL et de la querctine contre lhpatotoxicit induite par lEPI.

Pour valuer la toxicit engendre par lEPI, le mdicament est administr en monodose de 9 mg/kg par voie intra pritonale [Dobbs et al., 2003] pour assurer une toxicit aigue [Twelves et al., 1992]. Effectivement, aprs 24 heures de traitement, nous avons constat une augmentation de 187 % (ASAT) et de 271% (ALAT). Cette lvation significative de lactivit des transaminases sriques expliquent une ncrose hpatocytaire svre [Ganzina, 1983 ; Dobbs et al., 2003]. Par contre ladministration prventive des flavonodes la dose de 100 mg/kg en association avec lEPI a attnu leffet provoqu par le mdicament seul et normalise leurs activits comme dans le cas dun traitement prventif par la querctine (33 mg/kg). Leffet prventif

est observ dans le cas dune hpatotoxicit induite par le CCl4 [Ashork et al., 2002 ; Sanmugapriya and Venkataraman, 2006] ou le cyclophosphamide et la vinblastine [Lahouel et al., 2004 ; Kaur et al.,2006]. Le modle de la toxicit hpatique induite par lEPI nest pas bien connu chez les animaux dexprimentation, pour cette raison nous avons compar nos rsultats leffet provoqu par dautres mdicaments chimiothrapeutiques et substances hpatotoxiques.

Dans cette prsente tude, les rsultats ont montr clairement une lvation significative du MDA cytosolique et mitochondrial, lorsque les animaux sont traits avec lEPI, traduisant une augmentation de la lipoperoxydation et par consquent des dommages tissulaires par la formation excessive des radicaux libres [Sanmugapriya and Venkataraman, 2006]. Ce constat est susceptible dexpliquer la fuite des transaminases hpatiques et leur passage dans le sang. Par contre, ladministration prventive de lextrait de flavonodes et de la querctine associs avec lEPI, maintiennent lquilibre du systme redox intrahpatocytaire. Ces rsultats sont en accord avec ceux obtenus dans ltude de lactivit antioxydante des flavonodes extraits de la Propolis dans le cas de lhpatotoxicit induite par le cyclophosphamide et la vinblastine [Lahouel et al., 2004].

Le glutathion rduit (GSH), antioxydant non enzymatique, constitue la premire ligne de dfense antiradicalaire [Raja et al., 2007]. La dpltion du GSH hpatique est souvent associe lhpatotoxicit mdicamenteuse [Hewawasam et al., 2003 ; Raja et al., 2007] comme le cyclophosphamide et la vinblastine [Lahouel et al., 2004]. Dans cette prsente tude, les rsultats ont rvl une dpltion significative du GSH hpatique chez les animaux traits lEPI. Par contre, la teneur hpatocytaire de ce tripeptide est maintenue son niveau cellulaire normal quand les rats sont traits par lEPI associ aux flavonodes. Cet effet dmontre le pouvoir chmoprotecteur antiradicalaire des polyphnols en gnral. Ces molcules sont donc capables dempcher la chute du GSH et stimulent sa rgnration partir de GSSG [Martin, 2003] suite la neutralisation des ROS par les flavonodes. Comme nous lavons au dbut de ltude, les flavonodes sont des puissants scavengers de DPPH dune manire concentration-dpendante (page 44).

Les ROS, par une vie trs courte et une ractivit leve, sont analyss indirectement par lvaluation des enzymes antioxydantes : la SOD et la CAT. La SOD dismute les anions O2 en H2O2 et O2, La CAT dcompose H2O2 en O2 et H2O. Ces ractions constituent un ensemble soutenu contre les ROS [Venukumar et Latha, 2002 ; Halliwell et Gutteridge, 2007]. La rduction de lactivit de la SOD et la CAT est observe non seulement dans le cytosol mais galement dans les substructures cellulaires, les mitochondries chez les animaux traits avec de lEPI (mdicament anticancreux) o nous avons observ une chute importante pour la Mn-SOD. Ce rsultat peut expliquer une production intensive de lanion suproxyde suite au traitement des animaux par le mdicament. Par contre, le prtraitement des animaux par les extraits de flavonodes attnue complettement ces effets puisque les taux du SOD et de CAT revinnent la normale. Ces rsultats expliquent la proprit antioxydante des flavonodes dmontrs dans plusieurs travaux [Favier, 2003 ; Marfak, 2003; Servais, 2004 ; Milane, 2004 ; Halliwell et Gutteridge, 2007].

Conclusion
Dans la prsente tude, lvidence de lhpatotoxicit sous leffet de lEPI est confirme. Cet anticancreux est susceptible de causer un dommage profond suite la production intensive de radicaux libres provoquant un dsquilibre dans le statut redox cellulaire au profit des prooxydants. En effet, il a t constat que le systme de dfense antioxydant a diminu significativement tant dans le cytosol que dans les mitochondries, organelles principales de la production des anions suroxydes (par la chane respiratoire en dtress), laissant la place aux prooxydants responsables de la lipoproxydation et la destruction des structures membranaires. Les cellules hpatiques une fois lses et leurs membranes perfores librent des enzymes transaminasiques (ASAT et ALAT) dans le sang. Lextrait flavonodique et la querctine (un flavonode non glycosyl de rfrence) jouent un rle chmoprotecteur vis--vis du stress oxydatif produit dans le cytosol et les mitochondries de lhpatocyte, lors de ladministration de LEPI aux animaux de laboratoire. Par leur pouvoir scanvenger contre les espces ractives de loxygne, ils possdent une activit antioxydante. Il ressort clairement de notre tude que les extraits de flavonodes de la plante Ranunculus repens L et de la querctine sont des substances intressantes riche en thrapeutique, par leur pouvoir antioxydant et chmoprotecteur dans le foie. Cependant, une investigation plus approfondie est ncessaire pour lucider certaines zones dombres et en expliquer les mcanismes. Malgr la faisabilit de lutilisation dun extrait flavonodique de la RRL en conformit avec la pratique thrapeutique quant lutilisation de cette plante par les populations en compagne de la rgion de Jijel (Algrie), il est bien recommand de mener une tude phytochimique visant lidentification et la purification des principes actifs de cet extrait. Par ailleurs, le fait que le statut redox mitochondrial est perturb par lEPI, il serait intressant dtudier leffet de ce dernier sur le fonctionnement mitochondrial et lventualit dune action proapoptotique des anthracyclines (comme lEPI).

Conclusion gnrale

Dans ce travail, lextraction des polyphnols montre une richesse de la plante Ranunculus repens L en polyphnols avec un taux trs lev des flavonodes. Ces composs phnoliques savrent dun pouvoir antiradicalaire important compars la vitamine C.

Dans la premire partie de ce travail, les rsultats obtenus montrent une importante activit antihyperglycmique des flavonodes de la plante RRL. Cet effet se traduit par une internalisation de glucose sanguin dans les tissus priphriques, comme le foie et son stockage substantiel sous forme de glycogne hpatique et galement par une activation de

linsulinoscrtion chez les animaux de laboratoire. Ladministration de ces composs phnoliques un modle de rat diabtique induit par lalloxane montre un effet antidiabtique dans le temps soutenant ainsi lutilisation de cette plante en tradimdecine contre le diabte.

Dans ce travail, le traitement des rats alloxaniss par lextrait butanolique de flavonodes et de la querctine permet la mise en vidence dun effet chmoprotecteur et prventif de ces substances contre linduction alloxanique du diabte. Dans ce contexte, les rsultats de la recherche de mcanismes daction de ces composs montrent une activit antioxydante permettant la neutralisation des radicaux libres oxygns gnrs par lalloxane au niveau des cellules pancratiques. Effectivement le statut redox cellulaire est maintenu son quilibre en normalisant le taux des systmes antioxydant des cellules pancratiques (SOD, CAT, GSH) chez les rats alloxaniss traits par les flavonodes ce qui empche une lipoperoxydation excessive et protge ainsi la mort des cellules et linstallation du diabte.

Dans la deuxime partie de notre travail, ltude de leffet chmoprotecteur et prventif des flavonodes contre le dsquilibre du statut redox cellulaire a t tendue une hpatotoxicit induite par lpirubicine, mdicament anticancreux. Aprs la mise en vidence de la toxicit cytosolique et mitochondriale de cette anthracycline exprime par un dysfonctionnement hpatique (libration dans le sang des transaminases hpatiques) et un stress oxydant, cette tude a permis de montrer encore une fois le potentiel antioxydant de ces substances. Le dsquilibre de la balance prooxydants / antioxydants au profit des ROS tant dans le cytosol que dans les mitochondries et le dysfonctionnement hpatique (fuite des transaminases), obtenus aprs ladministration de lpirubicine aux animaux de laboratoire, est normalis par

un prtraitement des rats avec les flavonodes de la plante RRL et de la querctine pure. Cet effet est exprim encore une fois par la normalisation des paramtres antioxydants tels que les enzymes antioxydantes (SOD et CAT) ou le GSH dans le cytosol et les mitochondries. Cet quilibre redox constat dans les deux compartimentations, prvient une peroxydation pathologiquece dans le foie qui reste fonctionnel suite une normalisation des transaminases chez les animaux traits avec lEPI.

Il ressort clairement de ce travail quen plus de leur activit antihyperglycmique et antidiabtique, les extraits de flavonodes de la plante Ranunculus repens L (compar la querctine) sont pourvus dun pouvoir antiradicalaire et antioxydant pouvant jouer un rle chmoprotecteur et prventif contre la pancratotoxicit et lhpatotoxicit induite respectivement par lalloxane et lpirubicine.

Bibliographie partie 2

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Annexe 1

0,6 0,5 Densit optique 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 Glycogne [mg/ml] y = 0,1206x - 0,0104 R = 0,97

Figure 1. Courbe dtalonnage de glycogne avec le ractif de Lugol (Moyenne de 3 essais).

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

y = 0,8393x - 0,0029 R = 0,98

Densit optique

0,2

0,4 MDA [nmol/ml]

0,6

0,8

Figure 2. Courbe dtalonnage du MDA avec le ractif TBA (Moyenne de 3 essais).

1,2 1 Densit optique 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

y = 0,1343x + 0,0414 R = 0,96

GSH [nmol/ml]

Figure 3 : Courbe talon du GSH avec le ractif de DTNB, (Moyenne de trois essais).

0,9 0,8 0,7 Densit optique 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 Acide gallique (g/ml)
Figure 4 : Courbe talon du dosage des polyphnols (acide gallique comme standard), (Moyenne de 3 essais).

y = 0,0039x + 0,0021 R = 0,96

1,2 1

Densit optique

0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 25 30 y = 0,0394x + 0,0778 R = 0,96

Querctine (g/ml)

Figure 5 : Courbe talon du dosage des flavonodes (querctine avec le ractif de LAlCl3 Moyenne de 3 essais).

0,3 0,25 Densit optique 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 SAB [mg/ml] y = 0,404x + 0,0043 R = 0,97

Figure 6 : Courbe talon du dosage des protines (srum albumine bovine comme standard avec le ractif de Folin, moyenne de trois essais).

Annexe 2
Tableau 1 : Variation de la tolrance au glucose en fonction du temps aprs le traitement des rats par les diffrents types de flavonodes. Temps
0 min 30 min 60 min 90 min 120 min

Rats traits
Tmoin normal Sol. Physiolog. 0.76 0.08 0.75 0.08 1.13 0.08 1.05 0.11 ns 1.00 0.08 ns 0.95 006 * 0.91 0.09 ns 0.81 0.02 1.44 0.05 0.85 0.05 1.65 0.12 0.82 0.03 1.07 0.06

Tmoin hyperglycmique 0.86 0. O6 Groupe trait Aglycones Groupe trait Monoglycoside Groupe trait di et triglycoside Groupe trait Glibenclamide 0.71 0.05ns 0.80 0.04ns 0.83 0.10ns 0.74 0.09ns

1.20 0.04 ** 0.92 0.03*** 0.55 0.02 *** 1.17 0.04 ** 0.65 0.12*** 0.46 0.02 *** 1.12 0.15 * 0.55 0.12*** 0.40 0.02 *** 1.01 0.12** 0.48 .01*** 0.37 0.02 ***

Chaque valeur correspond la moyenne Ecart type., test de Student : ns p > 0.05 , * p < 0.05 , ** p < 0.01 , *** p < 0.001, groupes compars au tmoin hyperglycmique.

Tableau 2 : Variation de linsulinmie chez les rats normoglycmiques traits par les flavonodes. Temps aprs le traitement Traitement des animaux t = 0 min t = 60 min Insulinmie (U/ml)
0,1960.022

t = 120min

Groupe Tmoin normal, Solution physiologique

0,2280.04

0,2450.085

Groupe trait 200mg/kg de falavonodes

0,1650.053 ns

0,8310.061***

1,0310.089***

Groupe standard, 2.5 de mg/kg de Glibencl de glibenclamide

0,2150.094 ns

1,6920.106***

1,9520.122***

Les valeurs sont donnes en Moyenne Ecart type, n=5. ; *** P< 0.001, les groupes traits sont compars avec le groupe tmoin normal.

Tableau 3. Variation de la glycmie en fonction du temps et de la dose chez les rats diabtiques traits en aigu par lextrait butanolique. La glycmie (g/l) Temps (min)
0 30 60 90 120
Tmoin diabtique Diabtique trait + EB 200 mg/kg Diabtique trait + EB 400 mg/kg Diabtique trait + EB 600 mg/kg Diabtique standard + Gliben. 2.5 mg/kg

3.50 0.098 3.45 0.112 3.42 0.121 3.48 0.084 3.52 0.072

3.45 0.183ns 3.21 0.102* 3.10 0.126** 2.80 0.159*** 2.75 0.128***

3.30 0.097ns 3.12 0.063* 2.78 0.196*** 2.65 0.16*** 2.25 0.12***

3.35 0.154ns 2.90 0.160*** 2.68 0.207*** 2.40 0.152*** 1.90 0.175***

3.51 0.138ns 2.65 0.150*** 2.12 0.135*** 2.00 0.116*** 1.75 0.153***

Les valeurs sont donnes en Moyenne Ecart type, n=5. *P<0.05; **P< 0.01;***P< 0.001, groupes compars aux tmoins diabtiques.

Tableau 4 : Variation de la glycmie dans le temps ( J+28), chez les rats diabtiques traits par lextrait butanolique et le standard.

Temps Rats
Gr.diabtique Gr.Tr.par EB

J+7
2,61 0,13 1,72 0,09**

J+14
2,85 0,17 1,54 0,1***

J+21
2,43 0,11 1,62 0,12***

J+28
2,21 0,16 1,49 0,07**

1,65 0,08** 1,45 0,11*** 1,61 0,09*** 1,53 0,12** Gr.Tr.par Gliben. Les valeurs sont donnes en moyenne Ecart type. ( test de Student: ** p< 0.01, *** p < 0.001 ) * : groupes compars au groupe tmoin diabtique.

Abstract
In the present study, the antihyperglycemic, anti-diabetic and antioxidant effects of the n-Butanol extract (BE) obtained from air part of Ranunculus repens L plant and quercetin were investigated in normal glucose-fed hyperglycemia, in alloxan induced diabetes and in epirubicin (EPI) toxicity of the rats. The results of this study show antihyperglycemic and antidiabetic activity of the phenolic compounds. And to elucidate a possible mechanism of action of this plant extract, the glycogen liver rate, insulin secretion and the in vitro chelating effect of glucose by plant compounds were also investigated. The flavonoids reduced significantly blood glucose in a dose-dependant manner (200,400,600 mg/kg) in both hyperglycemic and diabetic rats after oral administration as oral hypoglycemic drug, glibenclamide (2.5 mg/kg). We show that flavonoids extracts was able significantly to complex the glucose in vitro, induce insulin secretion of beta cells and to active glycogenesis in liver as shown by the abundance of glycogen granulation in liver histochemical preparation after administration of flavonoids extract. In addition these flavonoids extract and quercetin possess a chemoprotector power against malondialdehyde formation (MDA, lipid peroxidation product) and reduction of antioxidant systems such SOD, CAT and GSH in alloxaninduced diabetic rats. The equilibrium disorder of redox status after alloxan administration is reestablished by flavonoids pretreatment of alloxanised rats. The flavonoids markedly inhibited lipid peroxidation process in pancreatic cells and the proportioning of cytosolic SOD, CAT and GSH showed a significant elevation to establish equilibrium of redox status and consequently protect beta cells and prevent diabetes. The anticancer therapy with EPI produces acute hepatotoxicity by generation of free radicals. However, the oxidative status of the liver cells and mitochondria has been investigated in EPI toxicity of the rats. In this present study, we investigated in first the prooxidant effect of EPI and its implication on both hepatic cells and mitochondria function. EPI injection in rats at dose of 9 mg/kg induced hepatic dysfunction revealed by a significant increase in serum of glutamate oxaloacetate transaminases and glutamate pyruvate transaminases. Oxidative stress in liver cells and mitochondria was provoked by EPI since a statistically significant reduction of CAT, SOD and GSH levels, and significant increase of MDA level, indicator of lipid peroxidation which could perforate the biologic

membranes, were observed. In second, the protective effect of quercetin (33 mg/kg) and flavonoids extract of RRL (100 mg/kg) against oxidative stress induced by EPI was also investigated. Indeed, the pretreatment of rats with flavonoids protected liver cells and mitochondria from oxidative stress permitting, on one hand, the prevention of hepatic dysfunction on maintaining the normal level of serum transaminases following inhibition of their hepatic leakage by preventing lipid peroxidation Thus, the prevention of the cellular membranes perforation, and in the other hand maintaining also antioxidant defense system in mitochondria and cytosol of hepatocytes. Taken together, this data reveal that flavonoids extract of Ranunculus repens L extract and quercetin possess an interesting virtue to be antihyperglycemic and antidiabetic with positive action on liver glycogenesis and insulin secretion. These phenolic compounds have also antiradical and antioxidant power that confers them chemoprotection role against oxidative stress generated in pancreas cells and liver respectively by alloxan and epirubicin.

Key words: flavonoids extract; Ranunculus repens L; alloxane; antidiabetic effect; pirubicin; Hepatotoxicity; Oxidative stress; Quercetin; Hepatoprotective effect.

Nom : KEBIECHE Prnom : Mohamed Doctorat en sciences : option biochimie Thme: Activit biochimique des extraits flavonodiques de la plante Ranunculus repens L : Effet sur le diabte exprimental et lhpatotoxicit induite par lpirubicine Rsum
Leffet antidiabtique et antioxydant des extraits de flavonodes de Ranunculus repens L et de la querctine sont tudis dans le cas du diabte induit par lalloxane et lhpatotoxicit provoque par lEPI chez les rats Wistar Albinos. Ces composs phnoliques se sont montrs antihyperglycmiques et antidiabtiques. Ils ont galement une capacit antidiabtogne dans le cas du diabte induit par lalloxane qui dsquilibre le statut redox des cellules pancratiques au profit du stress oxydatif. Lactivit de ces flavonodes se traduit par un effet significativement positif sur linternalisation cellulaire du glucose par les tissus priphriques et le stockage de glycogne hpatique, un effet insulinoscrtoire sur les cellules et une action antioxydante et chmoprotectrice des cellules pancratiques intoxiques par lalloxane chez le rat. Cet effet prventif des composs phnoliques sur les cellules est exprim par la rduction de la lipoperoxydation avec un taux normal du MDA et la normalisation du niveau cytosolique des systmes antioxydants (SOD, CAT et GSH) ce qui maintient, par consquent, un statut redox cellulaire en quilibre aprs ladministration de lalloxane. Par ailleurs, la thrapie anticancreuse avec lEPI induit une hpatotoxicit nfaste sur les cellules hpatiques et la fonction des mitochondries. Linjection de lEPI chez le rat, la dose de 9 mg / kg, induit un dysfonctionnement hpatique se rvlant par une augmentation significative des taux sriques de ASAT et ALAT. LEPI provoque un stress oxydatif dans le cytosol et les mitochondries des hpatocytes en rduisant significativement la CAT, la SOD et GSH et en augmentant galement le niveau du MDA dans les deux compartimentations cellulaires, rsultat dune peroxydation excessive qui provoque la lyse et la libration des transaminases hpatiques et leur augmentation significative dans le sang. Or le prtraitement des rats avec les flavonodes protge les cellules du foie et les mitochondries de lattaque des ROS gnrs par lEPI permettant ainsi, d'une part la prvention des rats dun dysfonctionnement hpatique et dautre part le maintien dun statut redox quilibr tant dans le cytosol que dans les mitochondries des hpatocytes. Ils savrent, en fin de cette tude, que les flavonodes extraits de RRL ou sous forme pure sont dots dune activit antihyperglycmique et antidiabtique avec une action positive sur la glycognse hpatique et linsulinoscrtion. Ces composs phnoliques sont pourvus galement dun pouvoir antiradicalaire et antioxydant qui leur confre un rle chmoprotecteur contre le stress oxydatif gnr dans le foie et le pancras respectivement par lEPI et lalloxane.

Mots cls: Alloxane, diabte, flavonodes, Ranunculus repens L ; effet antidiabtique ; pirubicine; hpatotoxicit; stress oxydant; querctine; chmoprotecteur.

Encadreur : MERAIHI Z. Prof. Soutenue LUMC, le 22/11/2009.