INFECTIONS PNEUMOCOQUE ET STAPHYLOCOCCUS THMATIQUE AUREUS TAPER

Lantibiogramme de Staphylococcus aureus

Claire Daurela,*, Roland Leclercqa

RSUM
St h l Staphylococcus aureus a dvelopp d l diffrents diff t types t de d rsistance i t aux antistati t phylococciques. Plus de 80 % des souches produisent une pnicillinase. Loxacilline reste active contre ces souches, mais des staphylocoques hospitaliers et plus rcemment communautaires ont dvelopp une rsistance croise entre loxacilline et les autres bta-lactamines par production dune protine liant les pnicillines (PLP) de faible affinit, la PLP2a. Cette dernire rsistance est plus facilement dcele par le test de la cfoxitine. Trois enzymes sont responsables de linactivation des aminosides, chacune confrant un spectre spcifique de rsistance. Les glycopeptides, vancomycine et teicoplanine, sont des alternatives loxacilline en cas de rsistance ou dintolrance. Des souches de sensibilit diminue aux glycopeptides sont rapportes. Leur dtection est difficile. La rsistance aux macrolides est surtout lie la production de mthylase qui modifie le ribosome, cible de ces antibiotiques. Deux phnotypes, inductible et constitutif, sont distingus par la mthode de diffusion en glose. La rsistance aux quinolones est lie des mutations de la cible de ces antibiotiques, les topo-isomrases. De nouveaux antistaphylococciques ont t rcemment commercialiss, le linzolide, la daptomycine et la tigcycline. Des rsistances, encore rares, sont dj rapportes. Les phnotypes associs de rsistance se voient surtout chez les S. aureus rsistants la mticilline (SARM). Actuellement, la rsistance la mticilline est associe dans environ 90 % des cas de SARM hospitaliers la rsistance aux fluoroquinolones et au phnotype de rsistance aux aminosides kanamycine-tobramycine. En revanche, les SARM communautaires ne sont rsistants, outre la mticilline, qu la kanamycine, lacide fusidique et souvent aux ttracyclines. Rsistance aux antibiotiques staphylocoque lecture interprtative diffusion en glose automate SARM.

SUMMARY
Antibiogram of Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus has acquired different types of resistance to antistaphylococcal agents. More than 80% of isolates produce a penicillinase. Oxacillin remains active against those isolates. However, hospital-associated staphylococci and, more recently, community-associated staphylococci have developed cross resistance between oxacillin and other beta-lactams by production of a penicillin-binding protein with low affinity for beta-lactams, PBP2a. This resistance is more readily detected by the cefoxitin test. Three enzymes are responsible for aminosides inactivation, each conferring a specific resistance spectrum. Glycopeptides, vancomycin and teicoplanin, are alternatives to oxacillin in case of resistance or intolerance. Strains with decreased susceptibility to glycopeptides that are difficult to detect are reported. Macrolide resistance is most often due to methylase production responsible for modification of the ribosomal site of these antibiotics. Two phenotypes, inducible and constitutive, can be distinguished by the diskdiffusion method. Quinolone resistance is related to mutations in topo-isomerases, the target of these antibiotics. New antistaphylococcal agents were recently commercialized, linezolid, daptomycin and tigecycline. Resistance to these drugs are already reported but still rare. Resistances are mostly combined in methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Currently, methicillin resistance is associated in approximately 90% of cases of hospital-associated MRSA to resistance to fluoroquinolone and to the phenotype of aminoglycoside resistance, Kanamycin-Tobramycin. By contrast, communityassociated MRSA, are only resistant to kanamycin, fusidic acid and often tetracyclines, in addition to methicillin. Antibiotic resistance staphylococcus interpretive reading agar diffusion automat RSA.

1. Introduction
Lhomme est le rservoir naturel de Staphylococcus aureus. Un pourcentage lev de la population humaine est porteur de S. aureus en permanence ou par intermittence au niveau de certains sites anatomiques (fosses nasales, gorge). partir de ces sites de portage, cette espce va coloniser les zones humides (aisselles) et dautres sites comme les mains. S. aureus peut se retrouver aussi sur

a Laboratoire de microbiologie Centre hospitalier universitaire de Caen 14033 Caen cedex

* Correspondance daurel-c@chu-caen.fr article reu le 13 octobre, accept le 24 octobre 2008 2008 Elsevier Masson SAS Tous droits rservs.

la peau ou au niveau des muqueuses danimaux domestiques. Cette bactrie peut survivre longtemps dans le milieu extrieur. S. aureus est responsable de nombreuses manifestations pathologiques, suppuratives et ncrotiques : suppurations localises, septicmies et endocardites, ainsi que des toxi-infections alimentaires.
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Tableau I CMI modale des principaux antistaphylococciques pour les souches de S. aureus sensibles.
Antibiotique Oxacilline Kanamycine Tobramycine Amikacine Gentamicine Ntilmicine Erythromycine Clindamycine Pristinamycine Ttracycline Rifampicine Vancomycine Teicoplanine Ofloxacine Lvofloxacine Ciprofloxacine Cotrimoxazole Acide fusidique Fosfomycine Linzolide Daptomycine 0,25 0,5-2 0,12-0,5 0,5-2 0,12-0,25 0,12-0,25 0,12-0,25 0,12-0,25 0,12-0,5 0,2-1 0,002 0,5-2 0,5-2 0,12-0,5 0,12 0,12-0,5 0,06-0,12 0,03-0,12 2-16 1-2 0,25 CMI modale (mg/L)

picine, lacide fusidique et la fosfomycine. Ces trois dernires molcules sont donnes en association du fait des frquences leves de mutations. Plus rcemment, de nouveaux antibiotiques sont venus renforcer larsenal thrapeutique : une oxazolidinone, le linzolide, un lipopeptide, la daptomycine et une glycylcycline, la tigcycline. Les conditions techniques gnrales pour les mthodes de dilution et de diffusion en milieu glos sont rfrences dans les recommandations du Comit de lantibiogramme de la Socit franaise de microbiologie [1].

3. Les bta-lactamines
Les bta-lactamines ont pour cibles diffrentes enzymes ( protines liant les pnicillines ou PLP) impliques dans la formation du peptidoglycane. La fixation des btalactamines ces cibles entrane labsence de polymrisation du peptidoglycane et secondairement la synthse par la bactrie dautolysines conduisant sa mort. Les bta-lactamines sont donc bactricides. La sensibilit des souches de S. aureus sauvages aux btalactamines varie selon la molcule. Actuellement, 80 % 95 % des souches de S. aureus produisent une pnicillinase qui inactive la pnicilline G et lampicilline, rendant leurs indications obsoltes dans le cadre dune infection S. aureus. Cependant, ces deux bta-lactamines sont trs actives sur les souches non productrices de pnicillinase [concentrations minimales inhibitrices (CMI) modales respectivement gales 0,03 mg/L et 0,06 mg/L]. Loxacilline et la cloxacilline (qui ont remplac la mticilline) sont peu sensibles laction des pnicillinases acquises, avec des CMI gnralement gales 0,25 mg/L. Les cphalosporines ne sont pas plus actives, celles de 3e gnration sont nettement moins actives (par exemple la CMI du cfotaxime, gale 2 mg/L). Limipnme a une activit comparable celle de loxacilline. retenir r Loxacilline et la cloxacilline restent les bta-lactamines de rfrence pour S. aureus en labsence de rsistance acquise. r Mcanismes de rsistance Deux mcanismes principaux de rsistance sont dcrits, la production de pnicillinase et la modification de la cible des bta-lactamines.

2. Les antistaphylococciques
Des antistaphylococciques existent dans toutes les familles dantibiotiques (hormis les polymyxines et les imidazols) (tableau I). Les antistaphylococciques les plus utiliss appartiennent aux familles suivantes : les bta-lactamines (loxacilline du groupe des pnicillines M), les glycopeptides (vancomycine ou teicoplanine) en cas de rsistance ou dintolrance cette premire classe, les aminosides (gentamicine), qui permettent dobtenir une bactricidie rapide en association lune des deux classes prcdentes, et les fluoroquinolones. Dautres antibiotiques sont galement utiliss : les streptogramines (pristinamycine), les macrolides, la clindamycine, le cotrimoxazole, la rifam-

Figure 1 Aspect de la bordure de la zone dinhibition autour dune disque de pnicilline G avec les aspects typiques de zone fantme pour une souche de S. aureus non productrice de pnicillinase (A) et un aspect darrt net de croissance avec grosses colonies pour une souche productrice de pnicillinase (B)

3.1. Rsistance la pnicilline par production de pnicillinase

Lexpression de la pnicillinase plasmidique est inductible par les bta-lactamines et se traduit par une large dispersion des CMI de la pnicilline G et de lamoxicilline. Linterprtation de lantibiogramme peut ainsi tre difficile pour des CMI limites. Par la mthode de diffusion en glose, la dtection de cette rsistance se fait en utilisant un disque de pnicilline G charg 6 g [1]. - Les souches sensibles la pnicilline G ont un diamtre largement > 29 mm, et la zone dinhibition prsente une bordure floue faites de colonies samenuisant et devenant transparentes, ralisant une zone fantme (gure 1A).

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- Les souches rsistantes la pnicilline G ont un diamtre variable (souvent < 25 mm). La zone fantme est remplace par des colonies opaques de grande taille, ralisant une bordure nette avec parfois des colonies squatters occupant la zone dinhibition (gure 1B). Cet aspect est caractristique de la prsence dune pnicillinase sans quaucun test additionnel ne soit ncessaire. La prsence de pnicillinase pourrait tre vrifie par un test la nitrocfine (mthode enzymatique) en prenant les colonies induites par une pnicilline (colonies en bordure de disque). Les automates testent des concentrations critiques de pnicilline G. Certains incluent un test pnicillinase. Cependant, il existe des faux-ngatifs (particulirement pour les staphylocoques coagulase ngative) et il est ncessaire de contrler les rsultats ngatifs par un test la nitrocfine. Le comit europen de lEUCAST (rule 8,2 ; http://www. escmid.org/sites/index_f.aspx?par=2.4) considre que dans les pays forte prvalence de S. aureus producteurs de pnicillinase, il est possible de rapporter toutes les souches comme rsistantes la pnicilline G, lampicilline et lamoxicilline du fait de la difficult de dtection et du risque de faux ngatifs. Interprtation de lantibiogramme et rponse au clinicien Si une rsistance la pnicilline G est dtecte, les btalactamines suivantes seront inactives : pnicilline G, ampicilline, amoxicilline, ticarcilline, pipracilline. En revanche, lassociation des inhibiteurs de pnicillinase (acide clavulanique, sulbactam, tazobactam) restaure une sensibilit pour ces antibiotiques. Les cphalosporines et limipnme ne sont pas hydrolyses par la pnicillinase. retenir r La plupart des souches de S. aureus produisent une pnicillinase. r Tester la pnicilline G par la mthode des disques permet de dtecter la rsistance par pnicillinase. r Les souches productrices de pnicillinase restent sensibles lassociation amoxicilline-acide clavulanique et aux cphalosporines (en labsence de mticillino-rsistance).

dans ce cas seule une fraction de la population bactrienne va exprimer la rsistance. Le niveau dhtrognit varie. Certaines souches sont trs htrognes avec seulement 1/106 bactries exprimant la rsistance. Cette rsistance est donc trs difficile dtecter alors que ces souches doivent imprativement tre considres comme rsistantes. Lexpression htrogne de la rsistance est aujourdhui majoritaire chez les souches de S. aureus rsistantes la mticilline (SARM). Le diagnostic de certitude de la mticillino-rsistance repose sur la dtection du gne mecA. Malheureusement, ce test ne peut tre effectu pour linstant facilement en routine. Lexpression dune PLP2a peut aussi tre recherche laide de tests au latex commercialiss. Selon les recommandations du CA-SFM, la dtection de la rsistance ncessite lemploi de conditions particulires. Il faut modifier les conditions du test en utilisant un fort inoculum et un milieu Mueller-Hinton hypersal incub 37 C (ou un milieu Mueller-Hinton incub 30 C). On peut aussi tester dans les conditions standardises de la mthode des disques des bta-lactamines (cphamycines) pour lesquelles lexpression de la rsistance est plus franche, la cfoxitine ou le moxalactam. En pratique, la simplicit et la meilleure sensibilit du test de la cfoxitine le font recommander [1, 2]. Les critres dinterprtation (disque 30 g) sont : 27 mm, sensible loxacilline ; < 25 mm, rsistant loxacilline. Un diamtre infrieur 25 mm est bien corrl avec la prsence du gne mecA. Pour des diamtres de 25 ou 26 mm, le rsultat est incertain. Il est alors ncessaire de rechercher la PLP2a par un test au latex (dans les conditions indiques par le fournisseur) aprs induction (autour du disque de cfoxitine ou de moxalactam) ou le gne mecA par PCR. Certains automates proposent le test automatis de la cfoxitine en sus du test de loxacilline. Interprtation de lantibiogramme et rponse au clinicien Du fait du mcanisme de modification de cible, la rsistance est croise entre les diffrentes bta-lactamines : il sagit dune rsistance la famille entire. Cependant, des cphalosporines en dveloppement, ceftobiprole et ceftaroline, conservent une certaine activit in vitro contre les SARM. La dmonstration clinique reste faire. Il faut rappeler aussi que le cfotaxime peut tre utilis en association avec la fosfomycine pour les mningites postchirurgicales SARM sensible la fosfomycine. retenir r Le test de la cfoxitine permet de dtecter de faon fiable et spcifique la rsistance la mticilline chez S. aureus. r La rsistance la mticilline est croise entre toutes les bta-lactamines actuellement commercialises.

3.2. Mticillino-rsistance par modication de cible

Cette rsistance est due chez S. aureus et chez les staphylocoques coagulase ngative la production dune PLP additionnelle, la PLP2a, qui se surajoute aux PLP normales de S. aureus. En prsence de bta-lactamines (pnicillines, cphalosporines, carbapnmes), les PLP sont inhibes, sauf la PLP2a. Cette protine est code par le gne dexpression inductible mecA. Ce gne est port par un lment gntique mobile particulier, une cassette chromosomique appele SCCmec insre dans un locus spcifique. Lexpression de la rsistance est variable en fonction des souches. Elle peut tre homogne et dans ce cas, pour la souche considre, la totalit de la population exprime la rsistance la mticilline. Elle peut tre htrogne, et

3.3. Rsistance borderline

Les souches borderline BORSA (borderline oxacillin resistant S. aureus) montrent une activit diminue de loxacilline (ou une rsistance de bas niveau) non due la prsence du gne mecA. Elles ont une CMI de loxacilline
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gale 2 mg/L (sensible mais limite). Cette diminution de sensibilit est lie lhyperproduction de la pnicillinase touchant loxacilline, sans que lon puisse la classer rsistante [3]. Des CMI borderline de loxacilline se voient aussi en cas de modification des PLP prsentes normalement chez S. aureus (surtout la PLP4). Ces souches sont alors appeles MODSA [3]. Ces rsistances sont difficiles dtecter avec le disque doxacilline et les disques de cfoxitine ou de moxalactam. La signification clinique de cette diminution de sensibilit nest pas connue.

4. Les aminosides
Les aminosides inhibent la synthse protique en se fixant sur la sous-unit 30S du ribosome bactrien. Ils exercent une activit bactricide rapide qui justifie leur association aux antibiotiques inhibiteurs de la synthse de la paroi (oxacilline et vancomycine) pour le traitement des infections graves. La rsistance acquise des staphylocoques aux aminosides est surtout due la production denzymes inactivatrices. Les enzymes sont divises en trois classes selon la raction catalyse : r aminoside N-actyltransfrase (AAC) : actylation dun groupement -NH2 ; r aminoside O-phosphotransfrase (APH) : phosphorylation dun groupement -OH ; r aminoside nuclotidyltransfrase (ANT) : nuclotidylation dun groupement -OH. Chacune de ces classes peut tre divise en sous-classes en fonction de la position du carbone qui porte le groupement amin ou hydroxyle modifi (chiffre arabe). Certaines enzymes dune mme sous-classe peuvent diffrer par leur profil de substrats, ce qui se traduit par plusieurs formes isozymiques (chiffre romain). Chaque enzyme va modifier un certain nombre daminosides diffrents, ce qui va se traduire par un phnotype de rsistance spcifique de lenzyme. Chez les staphylocoques, trois enzymes sont connues [4] : r lAPH(3)-III confre une rsistance haut niveau la kanamycine et la nomycine (phnotype K) (tableau II). Cette enzyme phosphoryle lentement lamikacine, qui conserve une activit bactriostatique mais perd son activit bactricide et la synergie avec loxacilline et la vancomycine ; r lANT(4)(4)-I confre une rsistance haut niveau la kanamycine et la tobramycine (phnotype KT) (tableau II).

Lamikacine est galement substrat pour cette enzyme avec les mmes consquences que pour lenzyme prcdente. Certaines souches produisant niveau modr cette enzyme peuvent apparatre rsistantes seulement la tobramycine. Les CMI de la kanamycine sont en fait augmentes, mais insuffisamment pour catgoriser la souche comme rsistante. Il faut considrer ces souches comme ayant un phnotype KT ; r lAPH(2)-AAC(6) : cette enzyme qui possde deux fonctions confre une rsistance haut niveau la kanamycine, la tobramycine et la gentamicine (phnotype KTG) (tableau II). Lactivit enzymatique modifie fortement la kanamycine, la gentamicine, la tobramycine et modrment la ntilmicine et lamikacine ( noter que la streptomycine nest pas affecte par cette enzyme). L encore, ces deux dernires molcules restent bactriostatiques mais leur activit bactricide et la synergie avec les inhibiteurs de synthse de la paroi sont supprimes. En pratique, aucun des aminosides usuels nest utilisable. Dtection et lecture interprtative En pratique, il suffit de tester les aminosides qui sont les meilleurs substrats pour les enzymes inactivatrices, la kanamycine, la tobramycine et la gentamicine. Il nest pas utile de tester lamikacine et la ntilmicine qui risquent dinduire des rponses faussement sensibles. En cas de rsistance la kanamycine, lamikacine est aussi considre comme inactive du fait de la perte des synergies. En cas de rsistance la gentamicine, lamikacine et la ntilmicine sont inactives. La rsistance la tobramycine rpond pour elle-mme. retenir r Trois enzymes sont responsables des trois seuls phnotypes de rsistance connus (K, KT et KTG). r Le test de la kanamycine, de la tobramycine et de la gentamicine est suffisant. r La rponse pour lamikacine se dduit du test de la kanamycine et celle pour la ntilmicine du test de la gentamicine.

5. Les glycopeptides
Deux glycopeptides sont commercialiss, la vancomycine et la teicoplanine. Ils agissent sur la synthse du peptidoglycane. Ils utilisent une caractristique des

Tableau II Enzymes inactivatrices des aminosides et phnotypes de rsistance.

Phnotype 1 Kanamycine Acronyme du phnotype K Enzyme Aminoside phosphotransfrase 3 type III [APH(3)-III] Aminoside nuclotidyltransfrase 4 4 type I [ANT(4)-(4)-I] Aminoside actyltransfrase 6phosphotransfrase 2 [AAC(6)-APH(2)] Consquences sur la synergie avec les bta-lactamines ou les glycopeptides Pas de synergie avec kanamycine et amikacine Pas de synergie avec kanamycine, tobramycine et amikacine Pas de synergie avec kanamycine, gentamicine, ntilmicine, tobramycine, amikacine

Kanamycine-tobramycine Kanamycine-tobramycinegentamicine

KT

KTG

1 Seuls les antibiotiques fortement inactivs sont indiqus.

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prcurseurs du peptidoglycane qui est de comporter un acyl-D-alanyl-D-alanine leur extrmit. Les glycopeptides se lient aux D-Ala-D-Ala terminaux des prcurseurs la surface de la bactrie avec une haute affinit, bloquant ainsi laddition des prcurseurs la chane du peptidoglycane naissant et prvenant les tapes ultrieures de polymrisation. Ces molcules sont lentement bactricides. La dcouverte de souches de sensibilit diminue a t lorigine de controverses toujours actuelles sur leur dfinition et les mthodes de dtection.

la vancomycine vanA ont t rapportes aux tats-Unis. Lopron vanA port par des plasmides provient de souches dentrocoques rsistantes aux glycopeptides. Jusqu maintenant, les VRSA nont pas t isols en Europe.

5.2. Dtection
La dtection des souches qui ne prsentent quun niveau modr de rsistance aux glycopeptides est importante. En effet, lutilisation de la vancomycine ou de la teicoplanine dans les cas dinfections dues aux souches catgorises intermdiaires (ou plus forte raison rsistantes) au glycopeptide utilis conduit frquemment des checs. Un certain nombre de difficults sont inhrentes ltude de lactivit in vitro des glycopeptides [6]. r La mthode de diffusion en glose convient mal pour les glycopeptides : ces grosses molcules diffusent mdiocrement dans la glose. r Les mthodes rapides automatises ne conviennent pas car lexpression de la rsistance ncessite un temps prolong dincubation. r Leffet inoculum important pour la teicoplanine peut amener surestimer les rsistances. Les difficults du test des glycopeptides contre les staphylocoques ont conduit une dmarche prsente dans les recommandations du CA-SFM. Une diminution de sensibilit aux glycopeptides peut tre suspecte lorsque lon utilise les mthodes de routine en prtant attention certains critres dalerte ou par un criblage spcifique. Une fois la diminution de sensibilit suspecte, la catgorisation clinique (S/I/R) des souches se fait par dtermination des CMI des glycopeptides dans les conditions standardises. Parfois, certains tests peuvent tre ncessaires en complment. Un arbre dcisionnel est prsent gure 2.

5.1. Mcanismes et dnitions de la rsistance

Diffrents termes et acronymes, VISA, GISA, htro-VISA, ont t utiliss pour dfinir les souches de S. aureus de sensibilit diminue aux glycopeptides et plus rcemment VRSA pour les souches rsistantes.

5.1.1. Souches de sensibilit diminue aux glycopeptides

Ces souches ont une paroi paissie rsultant dune rorganisation complexe du mtabolisme du peptidoglycane lie probablement des mutations dans de multiples gnes. Ces rorganisations pourraient empcher laccs de la vancomycine sa cible. Une autre hypothse non exclusive serait lhyperproduction de prcurseurs du peptidoglycane agissant comme autant de leurres pour les glycopeptides [5]. Les souches de sensibilit diminue aux glycopeptides sont isoles des frquences faibles dans le monde entier et se recrutent essentiellement parmi les SARM. VISA et GISA Les termes de VISA (vancomycin intermediate S. aureus) et de GISA (glycopeptide intermediate S. aureus) regroupent des souches intermdiaires (CMI = 8 mg/L) ou rsistantes (CMI > 8 mg/L) la teicoplanine et sensibles (CMI 4 mg/L) ou intermdiaires (CMI = 8 mg/L) la vancomycine. Le terme de GISA est prfrable car il englobe lensemble des souches de sensibilit diminue lun ou lautre des glycopeptides. Htro-VISA Ces souches de S. aureus, initialement isoles au Japon, sont sensibles la vancomycine (CMI 2-4 mg/L) mais prsentent des sous-populations intermdiaires la vancomycine (CMI 6-8 mg/L). Les sous-populations sont prsentes des frquences faibles, de lordre de 10-5 10-7, et ne peuvent tre mises en vidence lantibiogramme standard. Ces souches sont pour leur grande majorit intermdiaires la teicoplanine (CMI 8 mg/L), voire rsistantes. La dfinition des souches htro-VISA souffre de labsence dune technique gntique servant de rfrence. De plus, leur signification clinique est discute. Cependant, beaucoup considrent que les souches htro-VISA constituent le rservoir des souches GISA, lensemble ne constituant quun continuum de souches de diverses sensibilits aux glycopeptides.

5.2.1. Test des glycopeptides

Malgr ses performances mdiocres, la mthode de diffusion reste utilise pour tester les glycopeptides. Aprs une incubation qui doit tre de 24 h pleines, un certain nombre de critres doivent alerter sur la possibilit dune sensibilit diminue aux glycopeptides : r un diamtre < 17 mm pour la vancomycine ou la teicoplanine ; r un diamtre dinhibition de la teicoplanine infrieur ou gal dau moins 3 mm celui de la vancomycine ; r la prsence de colonies dans la zone dinhibition dun glycopeptide. Avec les automates, un rsultat intermdiaire ou rsistant pour la vancomycine ou la teicoplanine doit faire confirmer le rsultat. Les mthodes de routine pouvant tre en dfaut pour la dtection des GISA et ne dtectant pas les htro-VISA, certaines quipes utilisent une des mthodes suivantes de criblage. r Le CA-SFM recommande lutilisation dune glose de Mueller-Hinton supplmente par 5 mg/L de teicoplanine, ensemence avec 10 L dune suspension de turbidit McFarland 2, incube 35 C-37 C pendant 24 et 48 h ; le test est positif en cas de prsence dau moins 4 colonies. Cette mthode a lavantage dtre trs sensible, la teicoplanine tant le meilleur marqueur de la rsistance, mais elle manque de spcificit.
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5.1.2. VRSA
Plus rcemment, de rares souches de S. aureus rsistantes la vancomycine et la teicoplanine (CMI de la vancomycine > 16 mg/L) ayant acquis lopron de rsistance

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Figure 2 Arbre dcisionnel pour linterprtation de la sensibilit de S. aureus aux glycopeptides.

Tester vancomycine (V) et ticoplanine (T) (diffusion ou automate)

V et T sensible

V et/ou T intermdiaire Diamtre dinhibition T < ou = 3 mm diamtre V ou rsistant (automates) (diffusion : diamtre < 17 mm)

Colonies dans le diamtre dinhibition du disque

Rponse : V et T sensible Attention : risque de faux sensible dterminer CMI en cas dinfection grave

Dterminer les CMI V et T

CMI V et T < ou = 4 mg/L Rponse V et T sensible

CMI V < ou 4 mg/L et T > 4 mg/L Rponse T intermdiaire ou rsistant V sensible mais htroVISA Probable (voir mthode de confirmation du texte)

CMI V = 8 mg/L et T > 4 mg/L Rponse V intermdiaire et T intermdiaire ou rsistant (trs rare)

CMI V et T > 4 mg/L (V et T rsistant)

Pas de cas en Europe

Contacter Centre de rfrence

r Par la mthode E-test : il faut ensemencer par couvillonnage une glose cur-cerveau avec 200 L dune suspension lourde (turbidit McFarland 2). La lecture est faite 24 h et confirme 48 h. Si les concentrations inhibitrices de la vancomycine et de la teicoplanine sont suprieures ou gales 8 mg/L (ne pas convertir un rsultat de 6 mg/L en 8 mg/L) ou bien si la concentration inhibitrice de la teicoplanine seule est suprieure ou gale 12 mg/L, la souche est vraisemblablement de sensibilit diminue aux glycopeptides. Attention, ce test est un test de criblage qui ne permet pas de dterminer la CMI : celle-ci doit tre ralise dans les conditions standardises. Dautres critres incitent galement vrifier demble la sensibilit aux glycopeptides, au moins dans les infections svres. Ainsi, une attention est requise envers les souches de SARM rsistantes la gentamicine et la rifampicine. Cest en effet ce groupe de souches quappartiennent la plupart des VISA/GISA isols en France.

Figure 3 Analyse de population. Un inoculum lourd est tal sur des gloses nutritives (milieu cur-cervelle) contenant des concentrations croissantes de vancomycine (1 12 mg/L).

5.2.2. Confirmation de la rsistance et catgorisation des souches

Mesure des CMI La mesure de la CMI seffectue par une mthode de rfrence ou par la technique E-test en glose MuellerHinton avec une suspension de turbidit quivalente McFarland 0,5. Les lectures doivent tre effectues aprs 24 h pleines dincubation et les rponses rendues selon les critres de catgorisation clinique. Cas des htro-VISA Ces souches apparaissent sensibles la vancomycine et lhtro-rsistance la vancomycine ne peut pas tre mise en vidence par dtermination de la CMI, par dfinition, puisque linoculum bactrien test est denviron
Les survivants poussent aprs 24-48 h dincubation et sont numrs et rapports linoculum. VSSA : S. aureus sensible la vancomycine ; hVISA : S. aureus htro-rsistant la vancomycine ; VISA : S. aureus intermdiaire la vancomycine ; VRSA : S. aureus rsistant la vancomycine.

104 bactries et que la frquence de la sous-population intermdiaire la vancomycine est infrieure ce seuil. Il faut suspecter un htro-VISA devant : - une CMI de la vancomycine gale 4 mg/L avec la mthode E-test ; - une rponse intermdiaire (CMI = 8 mg/L) pour la teicoplanine avec sensibilit la vancomycine (CMI = 2 ou 4 mg/L) avec la mthode E-test ; - une positivit un des tests de criblage.

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La technique de rfrence pour identifier un htro-VISA est lanalyse de population. Cette technique consiste taler diffrentes dilutions dun inoculum fort de la souche sur des milieux gloss contenant des concentrations croissantes de vancomycine. Les colonies ayant pouss sur ces milieux sont comptes aprs 48 h dincubation et lon calcule le pourcentage de bactries qui poussent aux diffrentes concentrations. Un rsultat typique est prsent gure 3. Comme cette technique est difficilement ralisable en pratique, certains se contentent des mthodes de criblage utilisant la mthode E-test ou le milieu Mueller-Hinton avec 5 mg/L de teicoplanine en remplacement, mais avec une spcificit et une sensibilit qui se situent un peu au del de 80 % [7]. Ces mthodes peuvent tre utilises en routine demble ou en seconde intention. Rponse au clinicien Pour les souches htro-VISA, lattention du clinicien doit tre attire sur la sensibilit diminue la vancomycine, qui ninterdit pas son usage mais incite une surveillance troite du traitement. retenir r Les mthodes de routine peuvent tre prises en dfaut pour dtecter les rsistances mais peuvent alerter sur une possible diminution de la sensibilit aux glycopeptides. Celle-ci doit tre confirme par la mesure des CMI qui est la mthode de rfrence. r Une CMI de la vancomycine gale 4 mg/L ou une rponse intermdiaire pour la teicoplanine avec sensibilit la vancomycine doit faire suspecter un htroVISA. La mthode de confirmation de rfrence est lanalyse de population.

6.1. Mcanismes de rsistance

6.1.1. Mthylation ribosomale (phnotype MLSB)
Ce mcanisme de rsistance est le plus frquent [8]. Il est li la modification du ribosome due la mthylation de ladnine 2058 de lARN ribosomal 23S. Ce groupement mthyle empche alors toute fixation de lantibiotique sur sa cible. Cette base tant un site de fixation commun aux macrolides, lincosamides et streptogramines B, la rsistance affectera ces trois groupes. Les gnes codant une mthylase sont nomms erm (erythromycin ribosome methylase). Chez S. aureus, les deux principaux gnes identifis sont erm(A) et erm(C). Lexpression des gnes erm peut tre inductible ou constitutive. Dans le premier cas, la mthylase nest synthtise quen prsence dun inducteur. Seuls les macrolides 14 et 15 atomes sont inducteurs et sont inactifs. En revanche, les macrolides 16 atomes, les lincosamides et les streptogramines ne sont pas des inducteurs et restent donc actifs. Ce mcanisme de rsistance peut tre identifi par diffusion en milieu glos. En effet, lorsquun disque drythromycine (inducteur) est plac ct dun disque de clindamycine, de lincomycine, de spiramycine ou de josamycine (non inducteurs), un aplatissement de la zone dinhibition autour du disque contenant lantibiotique non inducteur est observ en regard du disque drythromycine, formant une zone en forme de D (gure 4). Lorsque lexpression des gnes erm est constitutive, la mthylase est synthtise en permanence. Les macrolides, lincosamides et streptogramines B ne sont donc pas actifs. Cependant, la synergie entre les facteurs A et B des streptogramines est conserve, expliquant lactivit de la pristinamycine. Les CMI des souches dexpression constitutive ne sont augmentes que dune dilution au maximum par rapport celles des souches sensibles. En revanche, lactivit bactricide prcoce est supprime.

6. Les macrolides-lincosamidesstreptogramines
Les macrolides, lincosamides et streptogramines (MLS) appartiennent au mme groupe du fait dun mode daction proche (inhibition de la synthse protique par fixation sur lARN 23S de la sous-unit 50S du ribosome bactrien) et dune rsistance frquemment croise entre ces antibiotiques. Cependant, ces antibiotiques sont considrer classe par classe. Les macrolides prsentent une structure chimique commune constitue dun macrocycle avec des fonctions lactones comprenant un ensemble de 14 (rythromycine, clarithromycine, roxithromycine), 15 (azithromycine) ou 16 atomes (josamycine, spiramycine). Les lincosamides sont composs de la lincomycine et de la clindamycine. Les streptogramines sont une association des deux composs, le compos A (pristinamycine IA ou dalfopristine) et le compos B (pristinamycine IIA ou quinupristine). Leur place dans larsenal thrapeutique antistaphylococcique est dautant plus importante quils sont une alternative en cas dallergie aux pnicillines. Contrairement aux streptogramines, les macrolides et les lincosamides ne sont pas bactricides pour S. aureus.

Figure 4 Phnotype de rsistance lrythromycine (E), la lincomycine (L).

A : souche de S. aureus sensible ; B : souche de S. aureus MLSB inductible (zone en forme de D) ; C : souche de S. aureus MLSB constitutive ; D : rsistance par efflux.

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6.1.2. Efflux (phnotype MSB)

Cest le deuxime mcanisme de rsistance aux macrolides le plus important chez S. aureus. La prsence dune pompe ATP-dpendante code par le gne plasmidique msrA va confrer une rsistance par efflux aux macrolides 14 et 15 atomes ainsi quaux streptogramines B (sans consquence sur lactivit de la pristinamycine). La rsistance isole lrythromycine et labsence de zone en forme de D entre un disque drythromycine et un disque de lincomycine permettent de reconnatre ce phnotype (gure 4).

pour observer les interactions ; il peut tre ncessaire de rapprocher davantage les disques.

6.2.1. Rsistance isole lrythromycine

Sil sagit dun phnotype MLSB inductible (zone en forme de D), des mutants constitutifs peuvent tre slectionns en prsence de macrolide ou de lincosamide non inducteur partir de souches inductibles la frquence de 10-7. Des cas cliniques dchec par mutation ont t rapports. Bien que son importance ne soit pas connue, ce risque devrait tre signal au clinicien. Les macrolides 16 atomes, les lincosamides et la streptogramine B sont actifs mais risquent de slectionner des mutants rsistants. Sil sagit dun phnotype defflux, il ny a pas lieu de rinterprter la sensibilit aux macrolides 16 atomes, aux lincosamides et aux streptogramines. Les mthodes automatises en milieu liquide ne permettent pas encore de distinguer ce phnotype du prcdent.

6.1.3. Inactivation des lincosamides (phnotype L)

Ce phnotype est d lacquisition du gne lnu(A). La production dune enzyme inactivant les lincosamides se traduit par une diminution franche de lactivit de la lincomycine, alors que la diminution de lactivit de la clindamycine reste modre (tableau III).

6.1.4. Phnotype LSA

Le mcanisme de ce phnotype nest pas compltement lucid. Les souches rsistantes aux lincosamides et aux streptogramines A possdent parfois les gnes defflux du facteur A vga(A) et vga(Ag) (tableau III). Les lincosamides (lincomycine et clindamycine) sont souvent catgoriss intermdiaires. En revanche, la CMI de la streptogramine A est leve. Lactivit de lassociation streptogramine A et streptogramine B est diminue avec une augmentation modre des CMI (catgorisation sensible ou intermdiaire).

6.2.2. Rsistance lrythromycine et la lincomycine (phnotype MLSB constitutif)

Seule la pristinamycine est active mais la modification de lactivit bactricide fait discuter son utilisation. Lors dune infection svre comme par exemple une infection osseuse, la prudence simpose dans lutilisation de cette molcule et il faut sen rfrer aux recommandations de bonne pratique. Les mthodes automatises dtectent bien ce phnotype.

6.1.5. Rsistance la pristinamycine (phnotype SAB)

La rsistance isole la pristinamycine peut se rencontrer. Elle est due lacquisition de gnes confrant la rsistance au facteur A (gnes vat codant des actylases ou vga codant une protine de pompe efflux) associs ou non des gnes confrant la rsistance au facteur B (gnes vgb codant des lyases). La rsistance la pristinamycine est souvent associe la rsistance MLSB constitutive (tableau III).

6.2.3. Rsistance isole la lincomycine

Il semble ncessaire de modifier le rsultat sensible en intermdiaire pour la clindamycine. Cette rsistance naffecte pas les autres antibiotiques du groupe MLS.

7. Les quinolones
Les quinolones ont pour cible des enzymes essentielles la survie bactrienne, les topoisomrases de type II incluant la gyrase (compose de deux sous units, GyrA et GyrB) et la topoisomrase IV (compose de deux sous units, ParC et ParE) [9]. Ces enzymes sont responsables du surenroulement de la molcule dADN (gyrase), ncessaire son stockage sous forme compacte ou, inversement, au dsenchevtrement soprant lors de la traduction en ARNm

6.2. Dtection et lecture interprtative

Le test de lrythromycine, de la lincomycine et de la pristinamycine permet de reconnatre les phnotypes et dinterprter les rsultats. La distance entre les disques drythromycine et de lincomycine, habituellement gale 24 mm de bord bord, est gnralement suffisante

Tableau III Principaux phnotypes de rsistance aux MLS chez les staphylocoques.
Mcanisme Classe de gnes Phnotype Phnotype de rsistance 14-, 15-M Mthylation ribosomale erm(A), erm(C) MLSB inductible MLSB constitutif Efflux Modification enzymatique Efflux ? Modification enzymatique des facteurs A ou B +/efflux du facteur A
a b c

16-M S
a

L S
a

S S Sb S S S/I R

R R R S S S

R S S S S

R S R I S ou Id
c

msr(A) lnu(A) vga(A), vga(Av), lsa(B), dterminants inconnus vat(A), vat(B), vat(C), vga(A), vga(Av), vga(B), vgb(A), vgb(B) en diverses combinaisons

MSB L LSA S ou LSd

Risque de slection de mutant rsistant. Activit bactricide rduite. Rsistance la lincomycine et sensibilit la clindamycine (interprter I). d Possibilit de rsistance la lincomycine et la clindamycine en cas de prsence des gnes vga(A) ou vga(Av).

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(topoisomrase IV). La liaison des quinolones leurs cibles entrane larrt de la rplication et de la transcription de lADN bactrien. Les fluoroquinolones sont rapidement bactricides. S. aureus est naturellement rsistant aux quinolones de premire gnration (acide nalidixique, acide oxolinique et flumquine), mais sensible aux fluoroquinolones systmiques (ciprofloxacine, lvofloxacine, moxifloxacine, ofloxacine et pfloxacine) ou urinaire (norfloxacine).

Il existe deux mcanismes de rsistance cet antibiotique chez S. aureus : mutation dans le gne fusA codant le facteur dlongation G ou diminution de la permabilit. Les mutants pour le premier type de rsistance sont obtenus une frquence leve, de lordre de 10-6 10-8.

8.3. Rifampicine
La rifampicine inhibe lARN polymrase, bloquant ainsi la transcription. Elle est bactricide. Des mutations au sein du gne rpoB codant la chane bta de lARN polymrase sont responsables du phnotype de rsistance cet antibiotique. La plupart des souches prsentent un haut niveau de rsistance (CMI > 32 mg/L), dautres sont catgorises intermdiaires (CMI = 1 mg/L). Ces deux types prsentent des mutations diffrentes.

7.1. Mcanismes de rsistance

Modication de cible Le principal mcanisme de rsistance est d lapparition de mutations ponctuelles dans la ou les cibles des quinolones (gyrase et topoisomrase IV) [9]. Ces mutations sigent le plus souvent dans une courte rgion conserve appele QRDR (quinolone resistance determining region). Les quinolones narrivent alors plus se fixer leurs cibles. Chez S. aureus, une premire mutation sur une cible (en gnral ParC) va confrer un niveau de rsistance de bas niveau. Dans un deuxime temps, une deuxime mutation sur la deuxime cible (ParC, ParE ou GyrA) va confrer une rsistance de haut niveau. Les souches de haut niveau auront alors une rsistance croise la pfloxacine, la ciprofloxacine, la lvofloxacine et la moxifloxacine. Efux Des pompes vont diminuer la concentration intracytoplasmique de certaines quinolones spcifiques : la ciprofloxacine et la norfloxacine. La surexpression dune pompe inductible de la famille major facilitator superfamily entrane la rsistance qui est alors associe la rsistance au chloramphnicol. Lefflux peut sassocier au mcanisme prcdent.

8.4. Oxazolidinones
Le linzolide est le seul reprsentant de cette famille. Cest un inhibiteur de la synthse protique. Il interagit au niveau de la sous-unit 50S du ribosome et bloque une tape prcoce de la synthse protique. Cest un antibiotique bactriostatique trs actif sur S. aureus, incluant les SARM [10]. La dtection de la rsistance seffectue selon les mthodes standardises. Parfois, les mthodes de diffusion peuvent surestimer la rsistance. Les rsultats intermdiaires ou rsistants doivent tre vrifis par la dtermination de la CMI (mthode de rfrence ou E-test). Il existe de rares souches de S. aureus rsistantes au linzolide.

8.5. Lipopeptide
La daptomycine est le seul reprsentant de cette famille. Le mcanisme daction de cet antibiotique nest pas encore compltement lucid. Son insertion dans la membrane cytoplasmique (mcanisme calcium dpendant) cre une dpolarisation de la membrane et une fuite dions potassium. La bactrie arrte alors toute synthse dADN, dARN et de protines. Cest un antibiotique bactricide. Cependant, des mutants rsistants sont isols in vivo. Les CMI de la daptomycine augmentent paralllement celles de la vancomycine [11]. En effet, lpaississement de la paroi observ chez les VISA gnerait laccs de la daptomycine la membrane cytoplasmique.

7.2. Dtection et lecture interprtative

Il suffit de tester une fluoroquinolone, de prfrence parmi les moins actives (pfloxacine, ofloxacine ou norfloxacine). La rponse vaut pour lensemble de la classe.

8. Les autres antibiotiques

8.1. Sulfamides et trimthoprime
Les acides foliques sont impliqus dans la synthse des acides nucliques. En raison de leur activit anti-folique, les sulfamides et le trimthoprime interfrent avec la synthse des acides nucliques et des protines. Lassociation de ces deux molcules est synergique. Cette synergie est maintenue en cas de rsistance isole aux sulfamides, mais pas en cas de rsistance isole au trimthoprime. Chez S. aureus, la rsistance aux sulfamides est frquente (30 50 % des souches de S. aureus sensibles la mticilline et 80 95 % des SARM), souvent par modification de la cible. La rsistance au trimthoprime est elle aussi due une modification de la cible.

8.6. Glycylcycline
La tigcycline est le seul reprsentant de cette sous-classe drive des ttracyclines. Cet antibiotique spectre large est actif contre les souches de staphylocoques hbergeant les classiques mcanismes de rsistance aux ttracyclines par protection du ribosome ou efflux actif. Les souches de staphylocoques rsistantes sont exceptionnelles [12].

9. Les phnotypes associs de rsistance

Les phnotypes associs de rsistance se voient surtout chez les SARM. La rsistance la mticilline chez S. aureus est longtemps reste strictement hospitalire, rsultant de la diffusion mondiale de 5 principaux clones. Pour ces clones, il existe une rsistance associe de multiples antibiotiques (fluoroquinolones, macrolides, aminosides).
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8.2. Acide fusidique

Lacide fusidique, reprsentant unique de sa famille, inhibe la synthse protique en interfrant avec une GTPase (facteur dlongation G (EF-G)), empchant la progression de la chane polypeptidique au niveau du ribosome.

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Les combinaisons de rsistance ont beaucoup vari dans le pass. Actuellement, la rsistance la mticilline est associe dans environ 90 % des cas la rsistance

Figure 5 Antibiogramme par diffusion dun SARM communautaire.

aux fluoroquinolones et au phnotype de rsistance aux aminosides KT. La rsistance MLS B constitutive est prsente chez plus de 50 % des souches. La frquence de la rsistance la gentamicine, la rifampicine, la fosfomycine ou lacide fusidique est proche de 10 % [13]. Par ailleurs, depuis quelques annes, on observe lapparition de souches communautaires de SARM [CA-MRSA (community-acquired MRSA)]. Elles sont rares en France bien quen frquence croissante. Ces staphylocoques sont surtout isols chez lenfant ou bien au sein de certaines collectivits (quipes de sport collectif, prisonniers). Dans presque tous les cas, ils possdent les gnes codant la leucocidine de Panton Valentine qui leur confre un pouvoir pathogne particulier. Ces souches sont responsables dinfections svres de la peau et des tissus mous. Les SARM communautaires sont rsistants, outre la mticilline, la kanamycine, lacide fusidique (intermdiaire) et souvent aux ttracyclines (gure 5) [14]. Ce profil typique doit faire suspecter lorigine communautaire du staphylocoque tudi.

10. Conclusion
Rsistance la mticilline (FOX, cfoxitine), la kanamycine (K), lacide fusidique (FA) et sensibilit aux fluoroquinolones (PEF, pfloxacine), la tobramycine (TM) et la gentamicine (GM). S : streptomycine ; MOX : moxalactam ; C : chloramphnicol ; N : nomycine ; TMP : trimthoprime ; SXT : cotrimoxazole ; TEC : teicoplanine ; RA : rifampicine ; FOS : fosfomycine ; VA : vancomycine.

Lantibiogramme de S. aureus prsente quelques difficults maintenant bien connues pour la dtection des rsistances. Linterprtation est facilite par lexistence de rgles interprtatives. Malgr cela, certains antibiotiques comme les glycopeptides ncessitent une attention particulire car certaines souches de S. aureus de sensibilit diminue sont difficiles dtecter.

Rfrences
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