ANALYSE

MICROBIOLOGIQUE
DE L’EAU
 INTRODUCTION
Les eaux sont divisées principalement en deux catégories:
. Les eaux destinées à la consommation humaine (boisson,
préparation d’aliments…)
. Les eaux de baignade
Les origines des eaux sont diverses:
. Eaux souterraines
. Eaux de surface
Par conséquence, la flore microbienne qui y est présente
est très variée.
La présence de micro-organismes pathogènes dans les eaux
provoquent de sérieux problèmes de santé pour l’homme
(déséquilibres intestinaux, maladies cutanées, respiratoires,…).
 De ce fait, les eaux font l’objet de contrôles bactériologiques
périodiques, entrant dans le cadre d’une politique de prévention
et de surveillance des maladies à transmission hydrique.
On estime actuellement qu’il existe dans les pays en voie de
développement environ 500 millions de personnes qui souffrent
chaque année de maladies transmises par des microorganismes
pathogènes présents dans les eaux.
 ECHANTILLONNAGE

Un examen bactériologique ne peut être valablement
interprété que s’il est effectué sur un échantillon correctement
prélevé (respectant les règles d’asepsie, homogène et
représentatif), selon un mode opératoire précis évitant toute
contamination accidentelle.
Correctement transporté au laboratoire et analysé sans délai
ou après une courte durée de conservation dans des conditions
satisfaisantes.
Matériels
• Récipients
De préférence des flacons en verre de 500 ml borosilicatés
Flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant.
Ces deux dispositifs doivent être stérilisés au préalable à l’autoclave.
materiel :
• - Désinfectant (éthanol).
• - Désinfectant pour les mains + papier essuie-mains.
• - Chalumeau à gaz avec recharges.
• - Briquet.
• - Marqueurs, stylos, étiquettes.
• - Clés à molette.
• - Glacière avec blocs réfrigérants.
• - Thermomètre.
• - Porte flacon lesté (perche).
• - Flacons stériles avec thiosulfate de sodium.
Appareillage
Canne de prélèvement :
Constituée de :
• Segments métalliques : d’environ 50 cm
s’ajustant les uns au bout des autres.
• Une pince de laboratoire : soudée au
dernier segment permettant le maintient du
flacon de prélèvement.

Plongeur :
Il s’agit d’un appareil auquel est fixé le
flacon de prélèvement et qui permet
d’entrainer celui-ci au dessus de la surface
de l’eau, suspendu à une corde, cet appareil
peut être descendu au fond d’un puits (du
bord de la margelle), dans un cours d’eau
(d’un pont) en profondeur dans un lac (d’un
bateau).
 Prélèvement de l’eau de robinet

. Enlever les brises-jets et tuyaux de caoutchouc adaptés au robinet choisi,

débarrasser le calcaire qui s’est déposé;
· Se laver très soigneusement les mains et avant-bras, les rincer à l’alcool,
laisser sécher;
· Flamber le robinet pendant au moins 1 minute;
· Ouvrir le robinet et laisser couler 3 à 5 minutes avant de faire le
prélèvement;
· Travailler devant une flamme;
· Flamber rapidement le bord du goulot, remplir presque entièrement le
flacon, flamber à nouveau rapidement le bord du goulot et remettre le
bouchon.
 Prélèvement dans un puits à l’aide d’un plongeur
· Utiliser un plongeur stérile enveloppé de son papier protecteur et d’une corde,
de longueur adaptée à la profondeur du puits;
· Poser le plongeur sur le sol;
· Enlever le coton obturant le goulot, soulever l’appareil, le dégager totalement
du papier protecteur et le descendre lentement dans le puits, en évitant de
toucher les parois de celui-ci;
· Prélever à 0.5 mètres de la surface;
· Lorsque le flacon est plein, remonté l’appareil, dégager le flacon en le prenant
par la base du goulot;
· Vider un peu d’eau;
· Flamber le bord du goulot et l’obturer avec le bouchon dégagé de son paquet;

•Ce même procédé est utilisé pour le prélèvement des eaux de rivière, de lac,
de citerne ou de réservoir.
•Il est possible d’utiliser des appareils spéciaux ne s’ouvrant qu’une fois la
profondeur désirée atteinte et qui autorisent une meilleure précision.
 TRANSPORT

L’échantillon est transporté au laboratoire et analysé sans

délai ou après une courte durée de conservation dans des
conditions satisfaisantes.
 Les différentes eaux et les micro-organismes recherchés
Les eaux Eau du Eaux de Eau de Eaux à usage Eau de Eau de
robinet puits/baches piscine pharmaceutique/ source mer
(T) forages/sondes cosmétique minérale
Les germes (NT)
Coliformes totaux

Coliformes fécaux

Streptocoques fécaux

Germes anaérobies sulfito-

réducteurs
Salmonella

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Germes aérobies (tester la qualité

mésophiles totaux marchande du
produit)
Vibrio cholerae
Critères microbiologiques d’une eau potable
Exemple: Qualité requise pour les eaux de baignade (eaux de mer)
Paramètres Unités Valeurs guides Valeurs limites
microbiologiques

Coliformes totaux /100 mL 500 10000

Coliformes fécaux /100 mL 100 2000

Streptocoques fécaux /100 mL 100 -

Salmonelles /1 mL - 0
Vibrion cholérique /450 mL - 0

Les concentrations ≤ aux valeurs guides: eau de bonne qualité.

Les concentrations comprises entre les valeurs guides et les valeurs limites:
eau de qualité acceptable.
Les concentrations ˃ aux valeurs limites: eau de mauvaise qualité.
Pour les Salmonelles et le vibrion cholérique, le seuil est de zéro ie qu’aucun
germe n’est toléré dans le volume d’eau à analyser.
En milieu solide En milieu liquide

Méthode par incorporation Méthode de

détermination du
Méthode par étalement
nombre le plus probable
Méthode par filtration (NPP)
 Technique de dénombrement en milieu liquide

Principe général
Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions
sont incorporées dans un milieu liquide conçu pour permettre la
croissance d’un micro-organisme ou de groupe de
microorganismes. la croissance se traduit par l’apparition d’un
trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible
( virage d’un indicateur de pH coloré).
 Mode opératoire

• On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser

(par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de
culture liquide par dilution.
• On notera le nombre de tubes inoculés présentant une
culture positive.
• Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de
tubes positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur
statistiquement la plus probable et son intervalle de
confiance).
Recherche et numérotation par filtration
 Principe
La filtration sur membrane
consiste à faire passer un certain
volume d’échantillon au travers une
membrane filtrante (type membrane
millipore quadrillée de 47 nm de
diamètre et d’une porosité de 0,45
µm) sur laquelle sont retenus les
micro-organismes recherchés. Le
filtre est ensuite posé sur la surface
d’un milieu gélosé spécifique du
germe à rechercher, face portant les
germes vers le haut. Après
incubation, on compte les colonies
formées à la surface du filtre.
 Technique
• Stériliser la plaque
poreuse et l’entonnoir de
l’appareil (les flamber
avec le bec Bunsen);
• Mettre en marche la
pompe à vide et ouvrir le
robinet du support puis
refroidir le dispositif avec
l’eau à analyser;
• Fermer par la suite le robinet du support;
• Déposer le filtre stérile avec une pince stérile sur la plaque poreuse;
• Placer l’entonnoir au dessus du filtre;
• Verser l’eau à analyser, après l’avoir agiter, dans l’entonnoir (la quantité
d’eau est variable selon le type d’analyse à effectuer);
• Ouvrir le robinet du support pour laisser l’eau s’écouler lentement sous
l’action du vide.
Evaluation du nombre de bactéries par mL

Nombre de colonies compté

dilution de l’échantillon
n
N = —————— x d
V
UFC.cm-3

Volume de l’inoculum cm3

 Dénombrement des micro-organismes revivifiables

Définition
On entend par microorganismes : bactéries, levures, moisissures
 Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques
de l’eau.
 Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes
issus de l’homme et des animaux à sang chaud.
Le dénombrement s’effectue après ensemencement en masse
en milieu PCA (Plat Count Agar) ou TGEA (Tryptone Glucose
Extract Agar).
 Recherche et dénombrement des coliformes
totaux et fécaux
Définitions
Les coliformes totaux : bacilles aérobie et anaérobie facultatifs,
capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de
fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h
à une température de 35- 37°C.
Ils se répartissent en fait en deux catégories :
Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli,
Citrobacter, Klebsiella, serratia.
 Les germes provenant d’autre sources environnementales
(aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium,
Amnigenus et klebsiella terrigena.
Le milieu TTC tergitol est un milieu sélectif, utilisé pour la
recherche et le dénombrement des coliformes.
Intérêts
la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à
37°C: intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection
d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une
contamination fécale sure.

coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe

l’existence quasi certaine d’une contamination fécale récente.

La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli

ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants,
Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore
intestinale de l’homme et des animaux.
 Recherche et dénombrement des
streptocoques fécaux ou entérocoque
Définition
bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des
chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant l’antigène
D, cultivant en anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables
d’hydrolyser l’esculine en présence de bile.

Le milieu Slanetz et Bartley est utilisé pour la recherche et le

dénombrement des streptocoques.
les colonies representatives apparaissent roses à marrons.
Intérêts

 les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les
eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une
contamination fécale de l’eau plus ancienne.

 La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est

également plus importante, probablement du fait de leur
mode groupement en chainettes, et est comparable à celle
des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux
entérocoques de mieux représenter la contamination virale
d’une eau.

 Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des
contaminations fécales. On retrouve par exemple
Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement,
sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.
 Recherche et dénombrement des spores de
clostridium sulfito-réducteurs
Les Spores : formes de résistance de micro-organismes. Elles
se développent en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en
gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant
le sulfite de sodium.
Forme végétative: bacilles Gram positif.
Intérêts
 Ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale.
Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les
matières fécales, est un germe assez ubiquiste.

 L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la

propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement
résistant aux traitements de désinfection.

 Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs

de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en
particulier de Cryptosporidium.
 Méthode de recherche et Dénombrement des germes
témoignant d’une pollution fécale

analyse technique Volume de Milieu utilisé T° confirmation

l’échantillon d’incubation

µ-organisme Incorporation 1 ml Gélose 37° Colonies blanches

revivifiables en milieu à l’extrait ou 20° C
liquide de levure
Coliformes filtration 100 ml Gélose lactosée 37° C Colonies typiques
totaux au TTC oranges
Coliformes filtration 100 ml Gélose lactosée 44° C Colonies typiques
fécaux au TTC oranges
Streptocoque filtration 100 ml Gélose Slanetz 37° C Colonies typiques
Du Gr D et bartley roses à marrons
Clostridium Incorporation 20 ml Gélose 37 ° C Colomies typiques
sulfito- en milieu Viande - foie noires
réducteurs solide
Colonies de Coliformes sur TTC tergitol Colonies de Streptocoques sur
Slanetz et Bartley
Recherche des bactéries pathogènes
 Recherche de salmonella

Définition
 Des bacille Gram négatifs
 Se multipliant 37°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen,
formant de petites colonies, lisses à contours réguliers,
pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir.
Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les
typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non
typhoidiques.
Méthode de recherche

Pré-enrichissement

Enrichissement primaire

Enrichissement secondaire
Lecture et interprétation

 Repérer les colonies caractéristiques.

 Faire une identification biochimique basée essentiellement sur
ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC,…
 Si nécessaire faire une identification antigénique basée
essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de
groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de
référence.
 Recherche de vibrion cholérique

Définition
 Bacille Gram négatif droits ou incurvés,
 Très mobiles,
 Oxydase (+),
 Aéro-anaéribies facultatifs,
 Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S,
 Hautement pathogènes.
Isolées sur milieu G.N.A.B, les colonies apparaissent grisâtres
et transparentes.
Méthode de recherche
 Recherche de Staphylocoques
à coagulase positive
Définition
. Cocci à Gram (+)
. Isolées ou en grappes de raisin,
. Catalase (+) et coagulase (+)
. Se multipliant en 24 à 48 h à 37 °C sur un milieu
sélectif Chapman au mannitol.
L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus.
Elle est pathogène et très redoutée.
Méthode de recherche
 Recherche de Pseudomonas aéruginosa

Définition
. Un bacille Gram négatif,
. Oxydase (+),
. Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide.

Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie

hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.
Méthode de recherche
Lecture et interprétation
Après la période d’incubation spécifiée :
•les colonies pigmentées en bleu vert donc productrices de pyocyanine sont considérées
d’emblée comme des colonies de Pseudomonas aeruginosa :
Compter le nombre de colonies.
•Les colonies qui présentent une fluorescence sous UV, nécessitent une confirmation
biochimique basée essentiellement sur un repiquage sur bouillon à l’acétamide qui sera incubé
à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures.
Après incubation, la production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, est révélée avec
une à deux gouttes du réactif de Nessler. Une décoloration du jaune au rouge brique, est en
faveur de Pseudomonas aeruginosa :
Compter le nombre de colonies.
•Les colonies présentant une pigmentation brun rougeâtre sans fluorescence, nécessitent
également une confirmation biochimique basée d’abord sur le test à l’oxydase :
•Les colonies oxydase positives seront ensuite repiquées d’une part, sur bouillon à l’acétamide
qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures et d’autre part, sur milieu King B.
Après incubation :
•La production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, révélée avec une à deux gouttes
du réactif de Nessler : décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas
aeruginosa :
Compter le nombre de colonies.
•L’apparition d’une fluorescence sur milieu King B exposé aux UV (360 nm) est en faveur de
Pseudomonas aeruginosa :
À compter.