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NF T72-281

NOVEMBRE 2014

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Normes en ligne

Pour : PIERRE LABAT

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le : 27/01/2015 à 11:20
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FA178120 ISSN 0335-3931

NF T 72-281
8 Novembre 2014

Indice de classement : T 72-281

ICS : 11.080.20

Procédés de désinfection des surfaces


par voie aérienne — Détermination de l'activité
bactéricide, fongicide, levuricide, mycobactéricide,
tuberculocide sporicide et virucide incluant
les bactériophages
E : Methods of airborne disinfection of surfaces — Determination of bactericidal, fungicidal,
yeasticidal, mycobactericidal, tuberculicidal sporicidal and virucidal activity,
including bacteriophages
D : Verfahren zur Desinfektion von Oberflächen auf dem Luftwege — Bestimmung
der bakteriziden, fungiziden, levuroziden, mykobakteriziden, tuberkuloziden sporiziden
und viruziden Aktivität, einschließlich Bakteriophagen

Norme française homologuée


par décision du Directeur Général d'AFNOR.
Remplace la norme homologuée NF T 72-281, de mai 2009.

Correspondance À la date de publication du présent document, il n'existe pas de travaux de normalisation


internationaux ou européens traitant du même sujet.

Résumé Le présent document décrit une méthode destinée à déterminer l’activité désinfectante des
procédés de désinfection des surfaces par voie aérienne utilisés dans les secteurs de la santé
humaine, vétérinaire, agro-alimentaire, industriel et collectivité par des procédés physiques
et/ou chimiques.
Cette méthode permet de rechercher, dans les conditions voisines de la pratique, l’activité
désinfectante de procédés utilisés pour la désinfection des surfaces par voie aérienne, soit non
dirigés (assimilés à une mise en oeuvre automatique ou semi-automatique hors présence
humaine), soit dirigés (assimilés à des procédés manuels en présence de l’opérateur).

Descripteurs Thésaurus International Technique : DESINFECTANT, DESINFECTION,


DECONTAMINATION, MILIEU, EFFICACITE, BACTERICIDE, FONGICIDE, SPORICIDE,
ESSAI, ACTIVITE ANTIBACTERIENNE, DENOMBREMENT, MICROORGANISME, MILIEU
DE CULTURE, TEMOIN, APPAREILLAGE, MODE OPERATOIRE, PROCES-VERBAL
D'ESSAI.

Modifications Par rapport au document remplacé, révision et mise à jour complètes du document.
Par ailleurs, les modifications suivantes majeures ont été apportées : inclusion de l’activité
virucide, mycobactéricide ajout de substances interférentes et de conditions obligatoires
complémentaires, modification des prescriptions pour la contamination artificielle des supports
et pour l’étalement de l’inoculum sur le support (5.5.1.2.1), ajout d’un tableau récapitulatif des
conditions de test et objectifs selon le secteur d’application (Annexe D), ajout d’une annexe
informative sur les procédés à base de rayonnements ultra-violets (Annexe E), ajout d’une
annexe informative pour l’évaluation de l’activité mycobactéricide (Annexe F).

Corrections

Éditée et diffusée par l’Association Française de Normalisation (AFNOR) — 11, rue Francis de Pressensé — 93571 La Plaine Saint-Denis Cedex
Tél. : + 33 (0)1 41 62 80 00 — Fax : + 33 (0)1 49 17 90 00 — www.afnor.org

© AFNOR — Tous droits réservés Version de 2014-11-F


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NF T 72-281 —2—

La norme

La norme est destinée à servir de base dans les relations entre partenaires économiques, scientifiques,
techniques et sociaux.

La norme par nature est d’application volontaire. Référencée dans un contrat, elle s’impose aux parties.
Une réglementation peut rendre d’application obligatoire tout ou partie d’une norme.

La norme est un document élaboré par consensus au sein d’un organisme de normalisation par
sollicitation des représentants de toutes les parties intéressées. Son adoption est précédée d’une enquête
publique.

La norme fait l’objet d’un examen régulier pour évaluer sa pertinence dans le temps.

Toute norme est réputée en vigueur à partir de la date présente sur la première page.

Pour comprendre les normes

L’attention du lecteur est attirée sur les points suivants :

Seules les formes verbales doit et doivent sont utilisées pour exprimer une ou des exigences qui doivent être
respectées pour se conformer au présent document. Ces exigences peuvent se trouver dans le corps de la
norme ou en annexe qualifiée de «normative». Pour les méthodes d’essai, l’utilisation de l’infinitif correspond
à une exigence.

Les expressions telles que, il convient et il est recommandé sont utilisées pour exprimer une possibilité
préférée mais non exigée pour se conformer au présent document. Les formes verbales peut et peuvent
sont utilisées pour exprimer une suggestion ou un conseil utiles mais non obligatoires, ou une autorisation.

En outre, le présent document peut fournir des renseignements supplémentaires destinés à faciliter la
compréhension ou l'utilisation de certains éléments ou à en clarifier l'application, sans énoncer d'exigence
à respecter. Ces éléments sont présentés sous forme de notes ou d'annexes informatives.

Commission de normalisation

Une commission de normalisation réunit, dans un domaine d’activité donné, les expertises nécessaires
à l’élaboration des normes françaises et des positions françaises sur les projets de norme européenne ou
internationale. Elle peut également préparer des normes expérimentales et des fascicules de documentation.

Si vous souhaitez commenter ce texte, faire des propositions d’évolution ou participer à sa révision,
adressez-vous à «norminfo@afnor.org».

La composition de la commission de normalisation qui a élaboré le présent document est donnée ci-après.
Lorsqu’un expert représente un organisme différent de son organisme d’appartenance, cette information
apparaît sous la forme : organisme d’appartenance (organisme représenté).
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—3— NF T 72-281

Antiseptiques et désinfectants chimiques AFNOR T72Q

Composition de la commission de normalisation


Président : M STROHL
Secrétariat : M THOMASSIN – AFNOR

M ARNOULD LCB — LABORATOIRE DE CHIMIE ET DE BIOLOGIE


MME ATTIG ANSES
M BARON SF2H — SOC FSE D HYGIENE HOSPITALIERE
MME BAUDOUX CONFORMAT
MME BENOLIEL SCIENTIS
MME CARRE IRM — INSTITUT RECH MICROBIOLOGIQUE SARL
M CHAPELLE FRANKLAB
M CHIRON UFR SCIENCES PHARMACEUTIQUES
MME CORRE KEYBIO
M CORTEZ ANSM
M DARBORD ASSISTANCE PUBLIQUE HOPITAUX DE PARIS / AGEPS
M DELHOMME AIRINSPACE
MME DESMURS BIOXAL
M DESPINS BIOQUELL SAS
M DESTREZ ETHICON SAS (GLOSTER EUROPE)
M DUMAS CONFORMAT
MME DURAND LABORATOIRES ANIOS
MME FERREIRA-THERET SCIENTIS
M GHISLAIN ANSM
MME HADDIOUI FONDEREPHAR
M HAUTION DEVEA SAS
M HUGUET ACTION PIN
MME KHALED PSA — PRODUITS SANITAIRES AERONEFS
MME KIANPOUR LNE
MME LE DREAU LCB — LABORATOIRE DE CHIMIE ET DE BIOLOGIE
MME LUCAS AFISE
M MARIS ANSES
MME MOROT-BIZOT APEX BIOSOLUTIONS
MME PALMA BIOXAL
M PETER GLOSTER EUROPE
MME PLUCHART LABORATOIRES ANIOS
M RAT FACULTE DE PHARMACIE ET DE BIOLOGIE
MME ROQUES FONDEREPHAR
M ROULEAU AIREL
MME SCLIFFET LNE
DR SESQUES HYPRED SAS
M STROHL IRM — INSTITUT RECH MICROBIOLOGIQUE SARL
M TAILLIEZ ACM PHARMA
MLLE TCHIR CONFORMAT
MME TEULIER HYPRED SAS
MME THERY KEYBIO
MMME TRENY-JUHEN GOJO FRANCE
MME VAN DE VELDE CHRISTEYNS NV
M YEZLI BIOQUELL SAS
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Sommaire
Page

Avant-propos ...................................................................................................................................................... 6

Introduction ........................................................................................................................................................ 7

1 Domaine d'application ...................................................................................................................... 7

2 Références normatives .................................................................................................................... 7

3 Termes et définitions ........................................................................................................................ 8

4 Prescriptions ..................................................................................................................................... 9

5 Méthode d'essai ................................................................................................................................ 9


5.1 Principe ............................................................................................................................................... 9
5.1.1 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel ............................................................. 9
5.1.2 Essai proprement dit ......................................................................................................................... 10
5.2 Matériel et réactifs ............................................................................................................................. 10
5.2.1 Micro-organismes d’essai ................................................................................................................. 10
5.2.2 Milieux de culture et réactifs .............................................................................................................. 11
5.2.3 Supports des germes utilisés ............................................................................................................ 18
5.3 Appareillage et verrerie ..................................................................................................................... 19
5.3.1 Généralités ........................................................................................................................................ 19
5.3.2 Équipement habituel pour laboratoire de microbiologie et en particulier .......................................... 19
5.4 Préparation et dénombrement des suspensions d’essai .................................................................. 21
5.4.1 Préparation des suspensions d’essai
(bactéries, levures, moisissures, spores et mycobactéries) .............................................................. 21
5.4.2 Préparation des suspensions dans les substances interférentes ..................................................... 21
5.4.3 Dénombrement des suspensions préparées dans la substance interférente ................................... 24
5.4.4 Préparation et dénombrement des suspensions virales .................................................................. 25
5.4.5 Préparation et dénombrement des suspensions de tests
(suspensions bactériennes hôtes et bactériophages) ....................................................................... 27
5.5 Mode opératoire pour évaluer l’activité du procédé .......................................................................... 30
5.5.1 Mode opératoire pour évaluer l’activité du procédé selon les conditions d’usage transmises
par le fabricant (bactéries, levures, moisissures, spores, virus,
bactériophages et mycobactéries) .................................................................................................... 30
5.5.2 Essais de virucidie ............................................................................................................................ 37
5.5.3 Mode opératoire pour évaluer l’activité mycobactéricide du procédé : description dans l’Annexe F
(voir F.3) ............................................................................................................................................ 40
5.6 Données expérimentales et calculs (bactéries, levures, moisissures, spores bactériennes
et bactériophages et mycobactéries) ................................................................................................ 40
5.6.1 Généralités ........................................................................................................................................ 40
5.6.2 Dénombrement des colonies et limites à respecter .......................................................................... 40
5.6.3 Détermination du nombre de germes N dans les suspensions microbiennes,
de bactériophages et de phages (5.4) .............................................................................................. 40
5.6.4 Détermination du nombre de germes T sur les supports-témoins (5.5.1.2) ...................................... 41
5.6.5 Détermination des valeurs obtenues dans l’essai préliminaire (5.5.1.3) ........................................... 41
5.6.6 Détermination du nombre de germes et de plages sur les supports-essais après contact
et du taux de réduction logarithmique d (5.5.1.4.3) ........................................................................... 41
5.7 Interprétation des résultats ................................................................................................................ 43
5.8 Rapport d’essai ................................................................................................................................. 44
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—5— NF T 72-281

Sommaire
Page

Annexe A (normative) Préparation des suspensions stocks de spores de Bacillus subtilis .................. 46
A.1 Matériel et réactifs : ceux définis en 5.2 et les suivants ..................................................................... 46
A.1.1 Bouillon (TGB) ................................................................................................................................... 46
A.1.2 Gélose (MYA) .................................................................................................................................... 46

Annexe B (normative) Distances appareil de désinfection – porte-germes à mettre en œuvre .............. 47

Annexe C (normative) Schémas d’essais ..................................................................................................... 48

Annexe D (normative) Tableau récapitulatif des conditions de test et objectifs en fonction


des revendications d’activité ...................................................................................................... 52
Annexe E (informative) Méthodologie spécifique liée à l'évaluation de l'efficacité antimicrobienne
des procédés de désinfection par rayonnement Ultra-violet non-dirigés .............................. 54
E.1 Généralités ........................................................................................................................................ 54
E.2 Méthode d'évaluation ......................................................................................................................... 54
E.3 Interprétation des résultats ................................................................................................................ 55

Annexe F (normative) Mode opératoire pour l’évaluation de l’activité mycobactéricide ........................ 56


F.1 Matériels et réactifs ............................................................................................................................ 56
F.1.1 Micro-organismes d’essai .................................................................................................................. 56
F.1.2 Milieux de culture et réactifs .............................................................................................................. 56
F.1.3 Appareil .............................................................................................................................................. 56
F.2 Préparation et dénombrement de la suspension mycobactérienne d'essai en présence
de substances interférentes ............................................................................................................... 56
F.2.1 Suspension mycobactérienne d'essai ................................................................................................ 56
F.2.2 Dénombrement et incubation de la suspension d’essai en présence de matières interférentes ....... 58
F.3 Mode opératoire pour évaluer l’activité mycobactéricide du procédé ................................................ 58
F.3.1 Témoins de survie des germes sur support ....................................................................................... 58
F.3.2 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel ............................................................ 59
F.3.3 Essai proprement dit .......................................................................................................................... 60
F.4 Calculs et interprétation des résultats ................................................................................................ 60
F.4.1 Calculs : voir Article 6 du présent document ..................................................................................... 60
F.4.2 Interprétation des résultats ................................................................................................................ 60

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 61
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NF T 72-281 —6—

Avant-propos

Le présent document décrit une méthode générale destinée :


— à vérifier dans des conditions standardisées voisines de la pratique, que les procédés proposés pour la
désinfection des surfaces par voie aérienne atteignent l’objectif pour lequel ils ont été conçus ;
— à comparer dans des conditions reproductibles les divers procédés entre eux ;
— à fournir un schéma expérimental dans des limites précisées lorsque les conditions pratiques s‘éloignent de
celles qui sont données dans le texte ci-dessous.
Le présent document prend en compte la désinfection des surfaces non poreuses mais pas celle de l’air ;
Le présent document s’applique à des procédés utilisant des principes actifs ou agents physiques dont la mise en
œuvre peut être automatique, semi-automatique ou manuelle.
Le présent document propose deux approches d’évaluation des performances en fonction du mode d’application
des procédés. On distingue :
— les procédés non dirigés dont l’objectif est la désinfection des surfaces de l’ensemble de l’espace à traiter.
Ils sont souvent assimilés à une mise en œuvre automatique ou semi-automatique hors présence humaine.
Dans ce cas, le document propose une position d’échantillons unique représentative de la diversité
d’orientation et d’emplacement des surfaces en conditions réelles et permettant une comparaison simple et
objective des procédés. L’inoculum microbien est positionné à une distance définie de l’appareil de
désinfection et orienté dans la direction opposée. Des orientations, et emplacements additionnels sont
possibles en fonction de l’utilisation prévue du procédé. Les procédés à base de rayonnements ultra-violets
font l’objet d’une annexe spécifique (Annexe E) ; En raison du manque d’expérience avec ces procédés,
l’annexe E est informative. Elle attire l’attention des utilisateurs et évaluateurs sur l’influence de la distance,
de l’exposition à la source UV, et, en cas d’exposition indirecte, sur les propriétés des parois faisant face
à l’échantillon ;
— les procédés dirigés mis en œuvre par application sur des surfaces faisant face au système de diffusion
(souvent assimilés à des procédés manuels en présence de l’opérateur). Dans ce cas, l’inoculum est placé
face au système de diffusion.
Il appartient au fabricant :
— de préciser les limites d’utilisation et précautions d’utilisation du procédé ;
— de s’assurer que les conditions d’essais du document sont représentatives du ou des usages préconisés.
Il recouvre les secteurs d’application 1) santé humaine, 2) vétérinaire, 3) agro-alimentaire, industriel et
collectivités. Les conditions de tests et objectifs d’efficacité sont adaptés à chacun des domaines ci-dessus.
Les essais décrits dans le présent document sont basés sur la mesure, dans les conditions précisées, de la
réduction logarithmique de bactéries, de levures, de moisissures, de spores bactériennes, de bactériophages ou
de virus de différentes espèces et de mycobactéries. L‘éventail des micro-organismes choisi pouvant se révéler
trop restreint pour certaines applications, il pourra être complété par d’autres souches en s’appuyant sur le
schéma expérimental décrit dans le présent document, en faisant varier les conditions selon les besoins de la
(ou des) application(s) pratique(s) envisagée(s).
Le présent document a pour but de reproduire les conditions pratiques de la désinfection par voie aérienne ;
des conditions obligatoires sont définies selon les modalités définies ci-après. Pour certains paramètres tels que
les dimensions de la salle de test, le taux d’humidité et la température, des conditions obligatoires dites
« complémentaires » devront être réalisées si l’usage prévu se situe préférentiellement en dehors des conditions
obligatoires de base. Des conditions additionnelles sont également proposées.
Le rapport de test précisera et récapitulera les conditions dans lesquelles sont réalisés les essais.
Le document permet de qualifier le procédé c’est-à-dire l’ensemble des composants et consommables nécessaire
à sa mise en œuvre. À titre d’exemple pour les procédés chimiques le couple matériel-produit reste indissociable.
Les procédés sont généralement mis en œuvre après procédure de nettoyage et sont alors testés, selon les
secteurs d’application, en conditions de propreté ou de saleté de bas niveau. Pour certaines applications
spécifiques, et en fonction des recommandations du fabricant des méthodes d’évaluation en présence d’autres
substances interférentes sont également possibles en conditions additionnelles.
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—7— NF T 72-281

Introduction
Le présent document a pour objet de décrire une méthode de détermination de l’activité désinfectante des
procédés de désinfection des surfaces par voie aérienne dans des conditions expérimentales précises.
Les procédés concernés incluent ceux mettant en jeu des désinfectants chimiques sous formes dispersés ou
vapeur et ceux mettant en jeu des agents physiques, tels que les UV. (Annexe E, informative).
Le présent document ne prend pas en compte les procédés dont le mode d’action est basé sur le trempage et/ou
sur le contact associé ou non à une action mécanique par essuyage. Les effets ci-dessus se traduisent par un
déplacement de tout ou partie des micro-organismes, en dehors de la surface du support tel que défini dans le
document sans que ces derniers soient inactivés. En conséquence, pour les procédés qui en conditions réelles
d’utilisation associent une action mécanique à l’action désinfectante, seule l’action désinfectante sera évaluée.
Le présent document comprend des conditions, obligatoires, des conditions obligatoires complémentaires et des
conditions additionnelles (voir 5.5.1.1) adaptées aux divers domaines. Les conditions obligatoires
complémentaires permettent des évaluations en dehors des fourchettes obligatoires de volumes, température et
humidité; les conditions additionnelles autorisent l'utilisation de micro-organismes ou souches pertinentes, en
alternative à ceux décrits dans les conditions obligatoires, dans le cas d'essais en grand volume (voir NOTE du
paragraphe 5.5.1.1 d)). L'équivalence avec les souches obligatoires qu'elles remplacent, devra toutefois être
préalablement établie.
Le lait écrémé ajouté aux suspensions microbiennes joue, à la fois, le rôle de substance protectrice et interférente.
Le document permet pour les germes fragiles au séchage, et pour ces derniers uniquement (parmi les germes
obligatoires actuels, seul P. aeruginosa est concerné) une possibilité d’augmentation de la concentration de
matière protectrice afin de limiter la perte au séchage (voir 3.6, 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.1 a), 5.2.2.4.1.2 b),
5.2.2.4.1.3 a), 5.4.2.1 et Annexe D).

1 Domaine d'application
La méthode décrite est destinée à déterminer l’activité désinfectante des procédés utilisés dans les secteurs 1)
de la santé humaine, 2) vétérinaire, 3) agro-alimentaire, industriel et collectivité par des procédés physiques
et/ou chimiques.
Les procédés concernés ont pour objectifs la désinfection des surfaces de l’ensemble de l’espace y compris les
surfaces externes des équipements contenus dans ces locaux. Le traitement de l’air et les produits ou procédés
spécifiquement destinés à la désinfection des dispositifs médicaux sont exclus du domaine d’application de
ce document.

2 Références normatives

Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent document et
sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).

NF EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d'essai utilisés


pour la détermination de l'activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et
virucide (bactériophages inclus) (indice de classement : T 72-145)

NF EN 13610, Désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de l'activité virucide
contre les bactériophages des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de l'agro-alimentaire et
dans l'industrie — Méthode d'essai et exigences (phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-183)

NF EN 14476, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de


l'activité virucide dans le domaine médical — Méthode d'essai et prescriptions (phase 2, étape 1) (indice de
classement : T 72-185)
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NF T 72-281 —8—

NF EN 14675, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de


l'activité virucide des antiseptiques et des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine vétérinaire —
Méthodes d'essai et prescriptions (phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-184)

NF EN 14885, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Application des Normes européennes sur les
antiseptiques et désinfectants chimiques (indice de classement : T 72-900)

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans la norme NF EN 14885 ainsi que
les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
procédé physique
procédé utilisant un agent physique par exemple UV (Annexe E, informative). Le procédé comprend la source
émettrice et le système de génération et de diffusion. Les procédés à base de vapeur et les radiations ionisantes
ne sont pas prises en compte dans le cadre de ce document

3.2
procédé chimique
procédé dont le principe actif est un agent chimique diffusé sous forme gazeuse, liquide ou solide. Le procédé
comprend le produit chimique et le système de diffusion associé qui ne peuvent être évalués séparément
Le procédé comprend de manière indissociable le produit chimique et le système de diffusion.

3.3
procédés de désinfection non dirigés
procédé destiné à la désinfection de toutes les surfaces incluses dans un volume donné, quelle que soient leurs
orientations. Les procédés concernés ont pour objectif la désinfection des surfaces de l’ensemble de l’espace.
Ce type de procédé est généralement mis en œuvre hors présence humaine dans la zone traitée

3.4
procédés de désinfection dirigés
procédés destinés à la désinfection de surfaces directement exposées au système de diffusion ou à la source.
Ces procédés sont manœuvrés par un opérateur qui est présent dans la salle pendant le cycle
Sont distingués les procédés :
— sans pression (petits pulvérisateurs type « spray » par exemple) ;
— avec pression (appareils plus volumineux à lance et compresseur ou « aérosols »)

3.5
activité désinfectante d’un procédé de désinfection par voie aérienne
activité d’un procédé capable de réduire, par destruction le nombre de micro-organismes dénombrables dans les
conditions du document et issus de souches déterminées appartenant à au moins un des sept groupes de
micro-organismes suivants : bactéries, spores bactériennes, levures, moisissures, virus humains, bactériophages,
et mycobactéries, dans des conditions définies et après dépôt sur un support de référence non poreux
Dans le cas où le procédé n’a été testé ou ne répond aux critères du document que sur une partie des espèces
préconisées, il conviendra de préciser les activités parmi la liste ci-après : activité bactéricide, activité sporicide,
activité fongicide, activité levuricide, activité virucide, activité virucide contre les bactériophages,
activité tuberculocide et activité mycobactéricide.

3.6
germe fragile au séchage
selon les critères spécifiques du présent document, lorsque la perte au séchage est supérieure à 1,5 log à l’issue
de la phase de séchage, hors période exposition
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—9— NF T 72-281

4 Prescriptions
Les taux de réduction recherchés sont exprimés en logarithmes décimaux et dépendent du domaine d’application.
Ils sont repris dans les tableaux de l’Annexe D et résumés ci-dessous :
— activité bactéricide : réduction supérieure ou égale à 5 sur les supports-essais comparativement
aux supports-témoins non exposés au procédé, pour les cinq souches bactériennes mises en œuvre
(voir 5.2.1.1 — 5.2.1.2 — 5.2.1.3 — 5.2.1.4) ;
— activité sporicide : réduction supérieure ou égale à 3 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour la souche de bactérie sporulée mise en œuvre (voir 5.2.1.5) ;
— activité fongicide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour les deux souches fongiques (levure et moisissure) mises
en œuvre (voir. 5.2.1.6 – 5.2.1.7) ;
— activité levuricide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour la souche de levure mise en œuvre (voir 5.2.1.6) ;
— activité virucide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement
aux supports-témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) virale(s) mise(s) en œuvre
(voir 5.2.1.8 — 5.2.1.9 — 5.2.1.10) ;
— activité virucide contre les bactériophages : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais
comparativement aux supports-témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) de
bactériophages(s) mise(s) en œuvre (voir 5.2.1.11 — 5.2.1.12) ;
— activité mycobactéricide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports- témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) mycobactérienne(s) mise(s) en œuvre
(voir 5.2.1.13 et 5.2.1.14).
Ces activités peuvent être déterminées indépendamment.
Ces sept activités doivent être déterminées dans des conditions expérimentales de référence définies en 5.5.
Le cas échéant, une activité bactéricide, sporicide, fongicide, levuricide, virucide (virus humains)
bactériophagicide et mycobactéricide spécifique additionnelle peut être déterminée dans d’autres conditions de
durée de contact, nature des supports, micro-organismes, volume du local d’essais, hygrométrie, température,
conformément au 5.5 en vue de tenir compte des conditions qui correspondent à l’usage spécifique auquel les
procédés sont destinés.
Ces conditions additionnelles doivent être décrites, résumées et rapportées dans le rapport d’essai.

5 Méthode d'essai

5.1 Principe
5.1.1 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel
L‘essai préliminaire est effectué dans le but de révéler une éventuelle activité résiduelle due aux résidus de
désinfectant transportés par les supports, vers les milieux de subculture (en gélose et sur les membranes) et de
trouver une méthode pour l’éliminer. Ainsi, lors de l’essai proprement dit, une activité bactéricide, fongicide,
levuricide, sporicide, virucide y compris contre les bactériophages et mycobactéricide véritable est déterminée et
non un simple effet inhibiteur résiduel.
Exposition de supports non contaminés, au gaz ou au dispersat.
Récupération dans 100 mL (20 mL pour la virucidie) de liquide stérile et recherche de l’effet bactériostatique
(ou fongistatique ou d’inhibition de la germination des spores ou de réduction de sensibilité des cellules) dû au
désinfectant fixé sur les supports, qui pourrait avoir une action inhibitrice en milieu gélosé et sur les membranes
filtrantes ou une diminution du titre viral résiduel.
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5.1.2 Essai proprement dit


À partir des suspensions de micro-organismes, dépôt de 50 L sur un support inerte préparé comme indiqué
en 5.2.3.
Étaler et sécher l’inoculum comme indiqué en 5.5.1.2.1, puis maintenir l’ensemble dans des conditions définies
en contact avec le produit diffusé par le procédé testé.
Récupérer des bactéries, des mycobactéries, des levures, des moisissures, des spores ou des virus ou des
bactériophages par grattage, agiter et traiter par ultrasons éventuellement, à partir des supports, dans le liquide
de récupération :
— concernant les bactéries, mycobactéries, levures, moisissures et spores, dilution et inclusion en gélose d’une
partie du liquide de récupération. Incubation et dénombrement des colonies développées. Filtration sur
membrane du liquide de récupération restant et rinçages afin d’éliminer au maximum le désinfectant.
Transfert de la membrane sur un milieu gélosé. Inclusion du support en milieu gélosé. Incubation et
dénombrement des colonies obtenues ;
— concernant les virus, dilution d’une fraction du liquide de récupération et mise en présence de cellules
réceptrices. Incubation et détermination du titre viral.

5.2 Matériel et réactifs


5.2.1 Micro-organismes d’essai
En fonction de l’activité recherchée et du domaine d’application (voir l'Annexe D) tout ou partie des souches
suivantes doivent être utilisées.
On peut se les procurer auprès de centres de collection. Il s’agit de :
a) Pour l’activité bactéricide :
- 5.2.1.1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 = CIP 103-467 ;
- 5.2.1.2 Staphylococcus aureus ATCC 6538 = CIP 4 .83 ;
- 5.2.1.3 Enterococcus hirae ATCC 10541 = CIP 5855 ;
- 5.2.1.4 Escherichia coli ATCC 10536 = CIP 54127.
b) Pour l’activité sporicide :
- 5.2.1.5 Bacillus subtilis spores ATCC 6633 = CIP 52 62.
c) Pour l’activité fongicide :
- 5.2.1.6 Candida albicans ATCC 10231 = IP 4872 ;
- 5.2.1.7 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 = IP 1431-83.
d) Pour l’activité levuricide :
- 5.2.1.6 Candida albicans ATCC 10231 = IP 4872.
e) Pour l’activité virucide :
- 5.2.1.8 Bovine enterovirus Type 1 (Enteric Cytopathogenic Bovine Orphan Virus — ECBO) ATCC VR-248.
ECBO cultivé sur lignée cellulaire BT cell (ATCC CRL-1390) ou autres lignées à sensibilité appropriée ;
- 5.2.1.9 Murine Norovirus souche S99, Friedrich Loefler Institut, Berlin. MNV cultivé sur cellules RAW 264.7
(ATCC TIB-71) ;
- 5.2.1.10 Adenovirus type 5, souche adenoide, ATCC VR-5. Adenovirus cultivé sur cellules HeLa ou autres
lignées à sensibilité appropriée.
f) Pour l’activité virucide vis-à-vis des bactériophages :
- 5.2.1.11 Bactériophage de Lactococcus lactis sous espèce lactis P001 (DSM 4262) ;
- 5.2.1.12 Bactériophage de Lactococcus lactis sous espèce lactis P008 (DSM 10567) ;
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La multiplication de ces deux phages doit être obtenue à partir de la souche hôte suivante : Lactococcus lactis
sous-espèce lactis F7/2 (DSM 4366).
g) Pour l’activité mycobactéricide et/ou tuberculocide :
- 5.2.1.13 Mycobacterium avium ATCC 15769 ;
- 5.2.1.14 Mycobacterium terrae ATCC 15755.
Si des micro-organismes d’essai additionnels sont utilisés, ils doivent être incubés dans des conditions de
croissance optimale (température, temps, atmosphère, milieu) qui seront mentionnées dans le rapport d’essai.
Si les micro-organismes d’essai additionnels choisis ne correspondent pas aux espèces spécifiées,
leurs aptitudes à fournir les inoculums nécessaires doivent être vérifiées. Si ces micro-organismes d’essai
additionnels ne sont pas répertoriés par un centre de collection, il est indispensable d’établir leurs caractéristiques
d’identification. De plus, ils doivent être référencés et conservés par le laboratoire d’essais ou le centre de
collection national pendant cinq ans.

5.2.2 Milieux de culture et réactifs

5.2.2.1 Milieux de culture pour bactéries, levures, moisissures, spores bactériennes et mycobactéries

5.2.2.1.1 Généralités
Toutes les masses de substances chimiques indiquées dans ce document correspondent aux sels anhydres.
Les formes hydratées peuvent être employées mais les masses requises doivent être ajustées pour tenir compte
des différences de masse moléculaire.
Les réactifs doivent être de qualité analytique et/ou satisfaire aux besoins microbiologiques. Ils doivent être
exempts de substances toxiques ou inhibitrices pour les micro-organismes d’essai.

5.2.2.1.2 Eau
L’eau doit être fraîchement distillée sur verre et non déminéralisée.
Stériliser par autoclavage (5.3.2.1 a)).
NOTE 1 L’eau distillée stérile est nécessaire pour la préparation des suspensions de tests. En revanche, il n’est pas
toujours nécessaire de stériliser l’eau utilisée, par exemple, pour la préparation des milieux de culture qui sont ensuite
stérilisés.

NOTE 2 En l’absence d’eau distillée de qualité appropriée, il est possible d’utiliser de l’eau pour préparations injectables.

5.2.2.1.3 Gélose de dénombrement bactéries (tryptone soja agar : TSA)


Pour réaliser les dénombrements des bactéries cultivables (5.2.1.1 à 5.2.1.4).
Tryptone, digestion pancréatique de caséine .................................. 15,0 g
Peptone de soja, digestion papaïque de farine de soja ..................... 5,0 g
NaCl ................................................................................................... 5,0 g
Gélose .............................................................................................. 15,0 g
Eau qsp ....................................................................................... 1 000 mL
Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,2  0,2 pour une mesure
à 20 °C.
Ajouter un neutralisant du désinfectant si nécessaire dans le milieu (le mentionner dans le PV).

5.2.2.1.4 Gélose pour entretien des souches 5.2.1.1 à 5.2.1.4 voir 5.2.2.1.3 sans neutralisant
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5.2.2.1.5 Diluant des suspensions microbiennes


5.2.2.1.5.1 Bactéries, levures, moisissures et spores
Solution de tryptone-chlorure de sodium, composée de :
Tryptone, digestion pancréatique de caséine .................................... 1,0 g
Chlorure de sodium (NaCl) ................................................................ 8,5 g
Eau (5.2.2.2) qsp ......................................................................... 1 000 mL
Stériliser dans l’autoclave [5.3.2.1a)]. Après stérilisation, le pH du diluant doit être équivalent à 7,0  0,2, pour une
mesure à (20  1) °C.
Le diluant ne doit pas entraîner d’interférences entre les micro-organismes d’essais et le produit
désinfectant testé.

5.2.2.1.5.2 Mycobactéries : Solution de tryptone-chlorure de sodium, (voir 5.2.2.1.5.1.) ou eau distillée


(voir 5.2.2.1.2)
Le diluant ne doit pas entrainer d’interférences entre les micro-organismes d’essais et le produit
désinfectant testé.

5.2.2.1.6 Gélose à l’extrait de malt (GEM)


Pour les dénombrements de cellules cultivables de levures et moisissures (5.2.1.6 et 5.2.1.7).
Extrait de malt (qualité technique) ................................................... 30,0 g
Gélose .............................................................................................. 15,0 g
Eau qsp ....................................................................................... 1 000 mL
L'extrait de malt doit être de qualité alimentaire (par exemple, poudre Cristomalt, commercialisée par Difal)
ou de qualité équivalente, non hautement purifié et ne contenant pas uniquement du maltose (par exemple,
l'extrait de malt commercialisé par OXOID). 1)
Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 5,6  0,2 pour une mesure
à 20 °C.
Ajouter un neutralisant du désinfectant si nécessaire dans le milieu (le mentionner dans le rapport d’essai).

5.2.2.1.7 Milieu pour l’entretien des souches 5.2.1.6 et 5.2.1.7 : voir 5.2.2.1.6 sans neutralisant

5.2.2.1.8 Liquide de récupération des germes et de rinçage des membranes


Composition :
Tryptone, digestat pancréatique de caséine ..................................... 1,0 g
Chlorure de sodium ........................................................................... 8,5 g
Polysorbate 80 .................................................................................. 5,0 g
Eau qsp ...................................................................................... 1 000 mL

Préparation :
Dissoudre le chlorure de sodium et la Tryptone dans l’eau. Ajouter éventuellement un neutralisant spécifique du
désinfectant à l’étude.
Préparer le diluant en grands volumes puis répartir en récipients adaptés. Stériliser à l’autoclave.

1) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
saurait constituer un engagement d’AFNOR à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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5.2.2.1.9 Lait écrémé reconstitué


Utiliser du lait en poudre écrémé, garanti sans antibiotique et sans additif, reconstitué à raison de 100 g pour 1 L
d’eau distillée.
Stériliser pendant 30 min à (105  3) °C ou 5 min à (121  3) °C ou stériliser par filtration sur membrane
de 0,22 L.

5.2.2.1.10 Gélose pour dénombrement des Mycobactéries cultivables (souches 5.2.1.13 et 5.2.1.14)
Voir Annexe F (F.1.2.1).

5.2.2.1.11 Milieu pour les spores (souche 5.2.1.5)


Gélose glucosée à l’extrait de levure.
Pour le dénombrement des spores de Bacillus subtilis viables :
Aminoacides, sans vitamines, obtenus par hydrolyse acide de la caséine ............ 1,0 g
Amidon soluble ........................................................................................................ 1,0 g
Glucose.................................................................................................................... 2,5 g
Extrait de levure ....................................................................................................... 5,0 g
Fe SO4 ..................................................................................................................... 0,1 g
Mn SO4, H2O ..................................................................................................... 0,0001 g
Gélose.................................................................................................................... 15,0 g
Eau qsp............................................................................................................. 1 000 mL
Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 6,8  0,2 pour une mesure
à 20 °C.
D’autres milieux peuvent être utilisés pour les spores : voir Annexe A.

5.2.2.2 Milieux de culture et réactifs pour la préparation des virus (souches 5.2.1.8 à 5.2.1.10)

5.2.2.2.1 Milieux de croissance et de conservation


Il faut utiliser le milieu minimum essentiel (MEM) de Eagle ou un équivalent, supplémenté par une concentration
appropriée en sérum fœtal de veau inactivé et exempt de mycoplasme, et si nécessaire des antibiotiques et autres
facteurs de croissance (voir NF EN 14476 et NF EN 14675).

5.2.2.3 Milieux de culture et réactifs pour la préparation des bactériophages (souches 5.2.1.11 à 5.2.1.12)

5.2.2.3.1 Bouillon de culture M17


Pour l’entretien de la souche bactérienne hôte, la multiplication des bactériophages et la préparation du diluant
pour phages :
Peptone phytone (issue de farine de soja ...................................... 5,00 g ;
Peptone polypeptone (issue de caséine & tissu animal ................. 5,00 g ;
Extraits de bœuf en poudre ........................................................... 5,00 g ;
Extraits de levure ........................................................................... 2,50 g ;
D(+)-lactose ................................................................................... 5,00 g ;
Acide ascorbique ........................................................................... 0,50 g ;
-glycérophosphate de sodium .................................................... 19,00 g ;
Sulfate de magnésium, 7 H2O ....................................................... 0,25 g ;
Eau (voir 5.2.2.1.2) compléter à ................................................. 1 000 mL.
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Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,0  02 pour une mesure
à 20 °C.
Lorsque le bouillon M17 est le diluant utilisé pour préparer le neutralisant (voir NF EN 13610), il faut alors utiliser
le bouillon de culture M17 préparé à double concentration (c’est-à-dire qu’il convient de doubler la concentration
de tous les ingrédients qui sont ajoutés aux 1 000 mL d’eau).

5.2.2.3.2 Gélose M17 (gélose de fond)


Gélose de fond pour le dénombrement quantitatif des zones de lyse (plages) obtenues chacune à partir d’une
seule particule infectieuse de bactériophages, formées dans le tapis bactérien de la bactérie hôte.
Ajouter 15 g de gélose à 1 000 mL de bouillon de culture M17. Dissoudre la gélose en la portant à ébullition tout
en agitant en continu.
Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,0  0,2 pour une mesure
à 20 °C. Une fois la gélose refroidie à (47  1) °C, ajouter 10 mL de solution mère stérile de CaCl2 à 1 mol/L
(voir 5.2.2.3.6). Mélanger doucement et verser 15 mL à 18 mL de gélose dans des boîtes de Petri.

5.2.2.3.3 Gélose de recouvrement (gélose de surface, gélose molle)


Pour le dénombrement des bactériophages : dissoudre 6,5 g de gélose dans 1 000 mL de bouillon de culture M17
(porter à ébullition en agitant en continu). Répartir la gélose en surfusion dans des tubes à essai (2,5 mL à 3 mL
par tube).
Stériliser par autoclavage.

5.2.2.3.4 Diluant pour phages (à base de solution de Ringer diluée au ¼)


Pour préparer la série de dilutions destinées à déterminer le titre des suspensions de phages (dénombrement des
zones de lyse par les phages) :
— solution de Ringer diluée au ¼ :
- chlorure de sodium ............................................. 2,250 g ;
- chlorure de potassium ........................................ 0,105 g ;
- chlorure de calcium anhydre ................................ 0,06 g ;
- hydrogénocarbonate de sodium ......................... 0,050 g ;
- eau (voir 5.2.2.1.2) compléter à ....................... 1 000 mL.
Ajouter 10 mL de bouillon de culture M17 à 90 mL de solution de Ringer diluée au ¼.
Stériliser par autoclavage. Avant utilisation, ajouter 1 mL de solution mère de CaCl2 à 1 mol/L à 100 mL du bouillon
de dilution.
NOTE La solution de Ringer peut être préparée à partir de pastilles prêtes à l’emploi en suivant les recommandations
du fournisseur.

5.2.2.3.5 Tampon SM
Pour la remise en suspension et la conservation intacte des particules phagiques :
Tris/HCl ........................................................................................... 2,4 g ;
NaCl ................................................................................................ 5,8 g ;
MgSO4, 7 H2O ................................................................................. 2,5 g ;
eau (voir 5.2.2.1.2) compléter à ................................................ 1 000 mL.
Ajuster le pH du tampon à 7,4  0,1. Stériliser par autoclavage.
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5.2.2.3.6 Solutions mères de CaCl2 (1 mol/L et 0,05 mol/L)


Dissoudre dans de l’eau (voir 5.2.2.1.2) 110,99 g ou 5,55 g de CaCl2 anhydre et compléter à 1 000 mL pour
obtenir respectivement la solution mère à 1,0 mol/L ou 50 mmol/L. Stériliser par autoclavage.

5.2.2.3.7 Solution d’acide lactique (d’une fraction volumique de 10 %)


Pour l’acidification du lait à faible teneur en matière grasses en vue de préparer le petit-lait acide.
Diluer une solution mère d’acide lactique d’une fraction volumique de 90 % dans de l’eau (voir 5.2.2.1.2) afin
d’obtenir une solution de travail d’une fraction volumique de 10 %. Pour ce faire, ajouter 8 parties d’eau à 1 partie
de solution mère. Stériliser par autoclavage.

5.2.2.4 Substances interférentes

5.2.2.4.1 Généralités
Il faut choisir la ou les substance(s) interférente(s) selon le secteur d’application du procédé (voir l'Annexe D).
Il est toujours possible d’ajouter, du lait écrémé pour certains germes fragiles (par exemple Pseudomonas
aeruginosa) en plus des substances interférentes préconisées. La ou les substance(s) interférente(s) doivent) être
stérile(s) et préparée(s) 10 fois concentrées par rapport à la concentration finale dans l’essai.
Les méthodes de préparation et de stérilisation ainsi que la composition doivent être notées dans le rapport
d’essai.

5.2.2.4.1.1 Conditions pour désinfectants utilisés en médecine humaine


a) Conditions de propreté
Pour les activités bactéricides, mycobactéricides, fongicides, levuricides et sporicides, la condition de propreté est
représentée par l’utilisation du lait écrémé tel que décrit en 5.2.2.1.9 et dilué au 1/20ème qui limite la perte au
séchage pour les micro-organismes.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est
concerné), après mise en œuvre d’un premier test dans les conditions du document pour les bactéries et dont le
résultat sera obligatoirement présenté dans le rapport d’essai, deux adaptations méthodologiques sont proposées
pour la prise en compte de la perte au séchage :
— il est admis d’augmenter la quantité de matière protectrice jusqu’à 1/5ème de lait écrémé reconstitué afin de
limiter la perte au séchage (quantité de germes non viables) en dessous de 1,5 log. Le titre initial témoin
minimal ainsi que l’objectif de réduction logarithmique requis pour revendiquer la conformité restent identiques
à ceux des germes de la catégorie, respectivement 6 log et 5 log pour Pseudomonas aeruginosa ;
— il est admis d’augmenter l’inoculum initial jusqu’à 5.109 de façon à obtenir un titre de 6 log sur les supports
témoin après séchage.
Lors des essais les deux méthodes seront réalisées en parallèle. Dès lors qu’un des deux résultats est positif,
l’activité pourra être revendiquée. Les deux résultats devront cependant figurer sur le rapport.
NOTE Dans le cas des germes fragiles tels que définis en 3.6 et en cas d’augmentation de l’inoculum, une quantité
importante de germes morts s’ajoute à la matière protectrice ou interférente prévue par le document (selon les germes et
domaines d’application). Il a été observé qu'une quantité de germes morts importante, peut surprotéger le germe et
conduire à une surestimation de sa résistance qui peut également être observée en cas d’augmentation de la concentration
en lait écrémé.

Pour l’activité virucide, il convient d’utiliser l'albumine bovine (fraction V de Cohn) disponible dans le commerce et
la préparer comme suit :
— dissoudre 0,3 g d'albumine bovine dans 100 mL d'eau ;
— compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge ;
— stériliser par filtration sur membrane de 0,22  ;
— conserver au réfrigérateur durant un mois maximum ;
— la concentration finale en albumine bovine (SAB) dans l'essai est de 0,3 g/L.
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b) Conditions de saleté (sérum albumine bovine)


Sérum albumine bovine :
Il convient d’utiliser l'albumine bovine (fraction V de Cohn, adaptée aux besoins microbiologiques) disponible dans
le commerce et la préparer comme suit :
— dissoudre 3 g d'albumine bovine dans 100 mL d'eau ;
— compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge ;
— stériliser par filtration sur membrane de 0,22  ;
— la concentration finale en albumine bovine sérique (SAB) dans l’essai est de 3 g/L ;
— conserver au réfrigérateur pour une durée d’un mois.
Érythrocytes de mouton :
Il convient d’utiliser le sang de mouton défibriné stérile disponible dans le commerce.
— centrifuger les érythrocytes à partir d’au moins 8 mL de sang de mouton défibriné frais à 800 g
pendant 10 min ;
— après avoir éliminé le surnageant remise en suspension des érythrocytes dans le diluant (5.5.2.1.5) ;
— répéter ce mode opératoire au moins trois fois de façon à ce que le surnageant soit incolore.
Solution d’albumine bovine et d’érythrocytes de mouton :
— mettre en suspension 3 mL d'érythrocytes concentrés dans 97 mL de solution d'albumine bovine 3 % (m/v) ;
— la concentration finale de l'albumine bovine et des érythrocytes de mouton dans le mode opératoire d’essai est
respectivement de 3 g/L et 3 mL/L ;
— afin d'éviter une contamination, il convient de fractionner ce mélange en nombre d’aliquots nécessaires pour
une journée et de les conserver dans des récipients séparés au maximum 7 j entre 2 °C et 8 °C.
NOTE La préparation de la condition de saleté en présence de lait écrémé peut demander un protocole spécifique et un
ratio inoculum / substance interférente différent de 1/10ème afin d’éviter la formation d’agrégats d’hématies. Dans ce cas,
il convient de tenir compte du ratio du mélange dans les calculs.

5.2.2.4.1.2 Conditions pour désinfectants utilisés en domaine vétérinaire


a) Conditions de saleté de bas niveau (solution d’albumine bovine)
Dissoudre 3 g de fraction V d’albumine bovine dans 100 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL. Compléter
avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22  et conserver au
réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L.
b) Conditions de saleté de bas niveau en présence de lait écrémé : Pour les germes fragiles tels que définis
en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est concerné) voir conditions
en 5.2.2.4.1.1 a)
Dissoudre 6 g de fraction V d’albumine bovine dans 90 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL. Compléter
avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22  et conserver au
réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
Mélanger volume pour volume avec du lait écrémé reconstitué (5.2.2.1.9).
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L et le lait écrémé reconstitué est dilué
au 1/20ème.
c) Conditions de saleté de niveau élevé (mélange de solution d’albumine bovine et d’extrait de levure)
Dissoudre 50 g d’extrait de levure dans 150 mL de d’eau dans une fiole jaugée de 250 mL et laisser la mousse
retomber. Compléter avec de l’eau jusqu’au trait de jauge. Transférer dans un flacon propre et stériliser en
autoclave. Laisser refroidir à température ambiante. Prélever 25 mL de cette solution dans une fiole jaugée
de 50 mL puis ajouter 10 mL d’eau.
Dissoudre 5 g de fraction V d’albumine bovine dans la solution tout en agitant et laisser la mousse se réduire.
Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau puis stériliser par filtration sur membrane de 0,22 . Conserver au
réfrigérateur (2 °C à 8 °C) et utiliser durant le mois.
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— 17 — NF T 72-281

La concentration finale dans l’essai est de 10 g/L d’albumine bovine et 10 g/L d’extrait de levure.
NOTE La préparation de la condition de saleté de niveau élevé en présence de lait écrémé peut demander un protocole
spécifique et un ratio inoculum / substance interférente différent de 1/10ème pour des raisons de solubilité des ingrédients
et de la concentration élevée de la solution mère. Dans ce cas, il convient de tenir compte du ratio du mélange dans
les calculs.

5.2.2.4.1.3 Conditions pour désinfectants utilisés dans les domaines agroalimentaires, industriels, domestiques
et institutionnels
a) Conditions de propreté
Pour les activités bactéricides, mycobactéricides, fongicides, bactériophagicides, levuricides et sporicides, la
condition de propreté est représentée par l’utilisation du lait écrémé tel que décrit en 5.2.2.1.9 et dilué au 1/20ème
qui limite la perte au séchage pour les micro-organismes.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est
concerné) voir conditions en 5.2.2.4.1.1 a).
Pour l’activité virucide, il convient d’utiliser l'albumine bovine (fraction V de Cohn) disponible dans le commerce et
la préparer comme suit :
— dissoudre 0,3 g d'albumine bovine dans 100 mL d'eau (voir 5.2.2.1.2) ;
— stériliser par filtration sur membrane ;
— conserver au réfrigérateur durant un mois maximum ;
— la concentration finale en albumine bovine (SAB) dans l'essai est de 0,3 g/L.
Dissoudre 0,3 g de fraction V d’albumine bovine dans 100 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22 .
La concentration finale d’albumine bovine dans l’essai est de 0,3 g/L et concerne les virus.
b) Conditions de saleté
Dissoudre 3 g de fraction V d’albumine bovine dans 100mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22  et
conserver au réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L.
c) Conditions de saleté en présence de lait écrémé : Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les
germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est concerné) voir conditions en 5.2.2.4.1.1 a).
Dissoudre 6 g de fraction V d’albumine bovine dans 90 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22  et
conserver au réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
Mélanger volume pour volume avec du lait écrémé reconstitué (5.2.2.1.9).
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L et le lait écrémé reconstitué est dilué
au 1/20ème.

5.2.2.4.1.4 Substances interférentes spécifiques aux bactériophages


a) Solution de petit-lait
Pour les conditions d’essai, préparer de la manière suivante une solution de petit-lait acide à partir de lait écrémé
pasteurisé (1,5 % de teneur en matières grasses) :
— ajouter 0,3 mL d’une solution d’acide lactique d’une fraction volumique de 10 % (voir 5.2.2.3.7) à 10 mL de lait
écrémé, mélanger et maintenir l’échantillon à température ambiante pendant 30 min. Mélanger de temps en
temps pendant cette période de 30 min. Faire sédimenter ensuite les protéines de lait précipitées par
centrifugation à la vitesse maximale (4 000 g minimum) pendant 30 min. Stériliser le surnageant (petit-lait) par
filtration sur membrane (porosité de 0,45 m et le conserver entre 4 °C et 8 °C ;
— pour obtenir une solution de travail d’une fraction volumique égale à 10 %, requise comme substance
interférente obligatoire pour l’essai vis-à-vis des phages, diluer une partie de la solution de petit-lait acide avec
neuf parties d’eau. Conserver la solution de petit-lait d’une fraction volumique de 10 % entre 4 °C et 8 °C.
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Pour : PIERRE LABAT

NF T 72-281 — 18 —

Les solutions de petit-lait doivent être conservées entre 4 °C et 8 °C un mois au maximum. Pour des durées de
conservation plus longues, elles doivent être maintenues congelées à des températures comprises entre – 18 °C
et – 20 °C, ou plus basses.
Pour le mode opératoire d’essai, la concentration finale de la solution de petit-lait doit être égale à une fraction
volumique de 1,0 %.
b) Lait écrémé
Pour les conditions d’essai, préparer le lait écrémé reconstitué (1,5 % de teneur en matières grasses) de la
manière suivante :
— reconstituer le lait écrémé en poudre, garanti exempt d’antibiotiques ou d’additifs, à raison de 100 g/L d’eau
(voir 5.2.2.1.9) ;
— stériliser à la vapeur trois jours successifs (30 min chaque jour) à 100 °C et laisser à température ambiante
entre les traitements à la vapeur.
Ne pas laisser au réfrigérateur entre les traitements successifs à la vapeur.
Le lait écrémé non dilué est utilisé pour conserver la souche bactérienne hôte.
Il est également possible de stériliser à (115  3) °C pendant 15 min.
— Pour obtenir une solution de travail d’une fraction volumique égale à 10 %, requise comme substance
interférente facultative pour l’essai vis-à-vis des phages, diluer une partie de lait écrémé avec neuf parties
d’eau stérile (voir 5.2.2.1.2). Conserver le lait écrémé d’une fraction volumique de 10 % entre 4 °C et 8 °C.
Pour le mode opératoire d’essai, la concentration finale du lait écrémé doit être égale à une fraction volumique
de 1,0 %.

5.2.3 Supports des germes utilisés


N’utiliser pour chaque essai que des supports neufs.

5.2.3.1 Supports de référence


Disques en acier Inox 1.4301 (NF EN 10088-1) de 3 cm à 4 cm de diamètre, nuance 2B selon les exigences de
la NF EN 10088-2, finition bilatérale. 2) Il convient que les surfaces soient aussi planes que possible en utilisant
une jauge en acier inox de 1,2 mm ou de 1,5 mm et ne soient utilisées qu’une seule fois puis éliminées.
Avant utilisation placer les surfaces pendant 60 min dans un bécher (contenance minimale : 50 mL contenant au
moins 20 mL de DeconR à 5 % (v/v)). Rincer ensuite les supports sous un courant d’eau fraîchement distillée
pendant 10 s.
Pendant la phase de préparation des supports, ne laisser la surface sécher en aucune façon. Les supports doivent
uniquement être manipulés à l’aide de pinces. Rincer les supports à l’eau pendant encore 10 s afin de garantir
l’élimination complète de l’agent de surface. Afin d’assurer un débit d’eau satisfaisant, il est possible d’utiliser un
récipient sous pression délivrant le fluide stérile par un tuyau approprié et des raccords ou toute autre méthode
appropriée et de régler le débit afin de fournir environ 2 000 mL/min. Pour désinfecter, placer le disque propre
dans un bain contenant 70 % (v/v) d’isopropanol pendant 15 min. Retirer le support et le sécher par évaporation
sous un flux d’air laminaire.

5.2.3.2 Supports additionnels


Tout support peut être utilisé à condition qu’il soit non poreux et décrit en détail au procès-verbal d’essai.
Les supports doivent permettre d’y étaler un inoculum de 50 L sur une surface de l’ordre de 3 cm2 (2 cm de
diamètre). Vérifier la faisabilité de l’étalement sur ce support. Ils doivent ensuite pouvoir être introduits dans un
récipient de 150 mL à 500 mL puis dans les boites de Petri pour l’inclusion.
Le nettoyage et la stérilisation doivent être déterminés en fonction de la nature du support et précisés dans le
rapport d’essai.

2) Les disques en acier inox peuvent généralement être obtenus localement auprès d’entreprises fabricantes.
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— 19 — NF T 72-281

5.3 Appareillage et verrerie


5.3.1 Généralités
Stériliser toute la verrerie et tous les éléments de l’appareillage qui entrent en contact avec les milieux de culture
et les réactifs ou l’échantillon, à l’exception de ceux qui sont fournis stériles, par l’une des méthodes suivantes :
— par la chaleur humide à l’autoclave (5.3.2.1 a)) ;
— par la chaleur sèche, dans un four à air chaud (5.3.2.1 b)).

5.3.2 Équipement habituel pour laboratoire de microbiologie et en particulier

5.3.2.1 Appareils de stérilisation


a) Pour la stérilisation par chaleur humide, un autoclave pouvant être maintenu à (121  3) °C pendant
au moins 15 min.
b) Pour la stérilisation par chaleur sèche, un four à air chaud pouvant être maintenu à 180 °C  5 °C pendant au
moins 30 min, à (170  5) °C pendant au moins 1 h ou à (160  5) °C pendant au moins 2 h.

5.3.2.2 Bains d’eau


— Bain thermostaté contrôlé à (45  1) °C.

5.3.2.3 Incubateurs
— Incubateur bactériologique, ventilé ou non ventilé réglé à une température maximale de (37  1) °C pour le
séchage en moins de 2 h des supports contaminés.
— Incubateur pour l’activité bactéricide, pouvant être maintenu à (36  1) °C ou à (37  1) °C. Incubateur
(pour l’activité levuricide, fongicide sporicide, virucide et virucide envers les bactériophages), pouvant être
maintenu à (30  1) °C.
— Incubateur à CO2 (95 % air, 5 % CO2), capable d’être maintenu à (36  1) °C ou à (37  1) °C pour l’incubation
des cultures cellulaires et des virus.

5.3.2.4 pH-mètre, ayant une précision de  0,1 unité pH, à (20  1) °C


NOTE Pour mesurer le pH des milieux gélosés, il convient d’utiliser une électrode de pénétration ou une électrode
à embout plat.

5.3.2.5 Chronomètre

5.3.2.6 Agitateur électromécanique ou mécanique

5.3.2.7 Appareils de filtration sur membrane, construit dans un matériau compatible avec les substances
à filtrer.
L’appareil doit avoir un entonnoir d’un volume utile au moins égal à 50 mL. Il doit être adapté à une utilisation avec
des filtres de 47 mm à 50 mm de diamètre et de 0,45 m de porosité.
La source de vide utilisée doit assurer un débit de filtration régulier. Afin d’obtenir une répartition uniforme des
micro-organismes sur la membrane et d’éviter une filtration trop longue, le dispositif doit être réglé pour
filtrer 100 mL de liquide de rinçage en 20 s à 40 s.

5.3.2.8 Réfrigérateur pouvant être thermostaté entre 2 °C et 8 °C

5.3.2.9 Pipettes graduées d’une capacité nominale de 10 mL, 2 mL, 1 mL et 0,1 mL. Des pipettes
automatiques calibrées peuvent être utilisées.

5.3.2.10 Boîtes de Petri de 90 mm à 100 mm de diamètre et 55 mm pour les membranes

5.3.2.11 Billes de verre (diamètre : 3 mm à 4 mm)

5.3.2.12 Filtre en verre fritté : porosité comprise entre 40 m et 100 m (ISO 4793) = porosité 2
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5.3.2.13 Centrifugeuse capable d’une accélération de 2 000 g (4 000 g minimum dans le cas des
bactériophages)

5.3.2.14 Fiole de Roux à col droit

5.3.2.15 Balance analytique de portée adaptée

5.3.2.16 Spectrophotomètre équipé d’un monochromateur

5.3.2.17 Pompe à vide (débit max. 3,8 m3/h, vide final  75 mbar)

5.3.2.18 Membranes filtrantes stériles à bords hydrophobes de porosité 0,45 m (diamètre 47 mm à 50 mm)
en esters de cellulose ou toute autre matière adaptée au produit à l’essai.

5.3.2.19 Dispositif pour maintenir les supports à distance de la source

5.3.2.20 Microscope
— De préférence à contraste de phase (pour les essais de sporicidie) ;
— microscope inversé pour la lecture des essais de virucidie.

5.3.2.21 Pinces

5.3.2.22 Tubes à essai diamètre 18 mm ou 20 mm

5.3.2.23 Récipients : flacons ou fioles de capacité adéquate

5.3.2.24 Récipient coniques, large ouverture, 250 mL ou 500 mL

5.3.2.25 Flacons à bouchon vissé

5.3.2.26 Pipettes à embouts à usage unique, délivrant 0,05 mL = 50 l pour le dépôt de I’inoculum.

5.3.2.27 Vibreur ultrasonique de 35 kHz

5.3.2.28 Agitateur magnétique pour conserver les cellules en suspension avant inoculation

5.3.2.29 Boites de Petri, tubes à essais stériles, flacons de culture de capacité appropriée

5.3.2.30 Fiole jaugée calibrée à 20 °C

5.3.2.31 Plaques de micro-titration stériles 96 puits, plaques à six ou huit puits pour culture cellulaire et fioles
de culture cellulaire.

5.3.2.32 Une machine à glace ou de la glace du commerce pour refroidir le milieu de conservation cellulaire et
les mélanges réactionnels pendant l'essai

5.3.2.33 Bac pour bain de glace avec de la glace et de l'eau

5.3.2.34 Enceinte de sécurité biologique, classe II (pouvant également servir lors de l’étape de séchage
des inoculums)

5.3.2.35 Congélateur avec une température inférieure ou égale à – 70 °C

5.3.2.36 Dessiccateur avec manomètre de contrôle du vide ou l’utilisation de PSM ventilés comme alternative
pour l’opération de séchage des inoculums sur supports.

5.3.2.37 Homogénéisateur haute vitesse : voir Annexe F (F.1.3.1).


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— 21 — NF T 72-281

5.4 Préparation et dénombrement des suspensions d’essai


5.4.1 Préparation des suspensions d’essai (bactéries, levures, moisissures, spores et mycobactéries)
5.4.1.1 Conservation des micro-organismes d’essai et culture mères
Les micro-organismes d’essai et leurs cultures mères doivent être préparés et conservés conformément aux
prescriptions de la NF EN 12353.

5.4.1.2 Culture de travail des micro-organismes d’essai

5.4.1.2.1 Suspensions bactériennes et fongiques


a) Bactéries :
Afin de préparer la culture de travail de la souche d’essai, repiquer à partir de la culture stock sur gélose TSA et
incuber à (37  1) °C. Au bout de 18 h à 24 h, préparer un deuxième repiquage de la même manière à partir du
premier repiquage et incuber pendant 18 h à 24 h. Un troisième repiquage peut être réalisé de la même façon
à partir du deuxième.
NOTE 1 Le deuxième et/ou le troisième repiquage constituent la ou les cultures de travail.
S’il n’est pas possible de préparer un deuxième repiquage un jour particulier, il est admis d’utiliser un repiquage
de 48 h pour repiquage ultérieur, à condition que le repiquage ait été maintenu dans l‘incubateur pendant les 48 h.
Dans ce cas, préparer un autre repiquage de 24 h avant de faire l’essai. Ne pas effectuer un quatrième repiquage.
Dans le cas de souches additionnelles tout écart par rapport à cette méthode de culture des bactéries ou de
préparation des suspensions doit être noté, en indiquant les raisons, dans le rapport d’essai.
Incuber à (37  1) °C.

b) Moisissures et levures :
Afin de préparer la culture de travail de Candida albicans, repiquer à partir de la culture stock sur gélose GEM et
incuber à (30  1) °C. Au bout de 42 h à 48 h, préparer un deuxième repiquage de la même manière à partir du
premier repiquage et incuber pendant 42 h à 48 h. Un troisième repiquage peut être réalisé de la même façon à
partir du deuxième.
NOTE 2 Le deuxième et/ou le troisième repiquage constituent la ou les cultures de travail.
S’il n’est pas possible de préparer un deuxième repiquage un jour particulier, il est admis d’utiliser un repiquage
de 72 h pour repiquage ultérieur, à condition que le repiquage ait été maintenu dans l‘incubateur pendant les 72 h.
Dans ce cas, préparer un autre repiquage de 48 h avant de faire l’essai. Ne pas effectuer un quatrième repiquage.
Pour Aspergillus brasiliensis utiliser un repiquage sur GEM dans des boites de Roux et incuber à (30  1) °C de
sept à neuf jours.

5.4.1.2.2 Suspensions de spores


Les spores ne sont pas repiquées mais sont conservées sous forme de suspension stock (voir Annexe A).

5.4.1.2.3 Suspensions mycobactériennes


Pour la préparation de la culture de travail de Mycobacterium avium et Mycobacterium terrae : voir Annexe F
(F.2.1.2).

5.4.2 Préparation des suspensions dans les substances interférentes

5.4.2.1 Souches 5.2.1.1 à 5.2.1.4 (bactéries)


Prélever 10 mL de diluant (5.2.2.1.5) et les introduire dans une fiole de 100 mL avec 5 g de billes de verre.
Prélever à l’anse la culture de travail et transférer le prélèvement dans le diluant (5.2.2.1.5).
Il convient de mettre les cellules en suspension dans le diluant en immergeant l’anse et en la frottant contre la
paroi de la fiole pour en détacher les cellules. Agiter la fiole pendant 3 min à l’aide d’un agitateur mécanique.
Aspirer la suspension qui se trouve avec les billes de verre et la transférer dans un autre tube.
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Pour : PIERRE LABAT

NF T 72-281 — 22 —

Ajuster le nombre de cellules de la suspension à l’aide du diluant (5.2.2.1.5), en estimant le nombre d’unités au
moyen d’un spectrophotomètre ou par un moyen approprié.
Ajouter à cette suspension selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé afin
d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de cette
dernière au 1/10ème. Le titre final de bactéries doit être compris entre 5.107 et 2.109 UFC/mL.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est
concerné) deux adaptations méthodologiques sont proposées pour la prise en compte de la perte au séchage :
— il est admis d’augmenter la quantité de matière protectrice jusqu’à 1/5ème de lait écrémé reconstitué afin de
limiter la perte au séchage (quantité de germes non viables) en dessous de 1,5 log. Le titre initial témoin
minimal ainsi que l’objectif de réduction logarithmique requis pour revendiquer la conformité restent identiques
à ceux des germes de la catégorie, par exemple respectivement 6 log et 5 log respectivement pour
Pseudomonas aeruginosa ;
— il est admis d’augmenter l’inoculum initial jusqu’à 5.109 de façon à obtenir un titre de 6 log sur les supports
témoin aprés séchage.
Lors des essais les deux méthodes seront réalisées en parallèle. Dès lors qu’un des deux résultats est positif,
l’activité pourra être revendiquée. Les deux résultats devront cependant figurer sur le rapport.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors d’essais
préliminaires.
Conserver cette suspension dans le bain d’eau à (20  1) °C et l’utiliser dans les 2 h qui suivent sa préparation.

5.4.2.2 Souche 5.2.1.5 (spores bactériennes)


— Suspension stock de spores de la souche d’essai : la suspension stock de spores de Bacillus subtilis est
préparée au laboratoire d’essai, conformément à l’Annexe A.
— Suspension d’essai de spores : pour préparer la suspension d’essai de spores, diluer la suspension stock de
spores avec du diluant 5.2.2.1.5.
Ajouter à cette suspension selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé afin
d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de cette
dernière au 1/10ème. Le titre final de spores doit être compris entre 2.105 et 5.105 UFC/mL. Il appartient au
laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors d’essais préliminaires.
Maintenir la suspension d’essai dans le bain d’eau à (20  1) °C et l’utiliser dans les 2 h qui suivent.
L’examen au microscope sous un grossissement de 400 doit être effectué immédiatement après la préparation et
juste avant l’essai afin de mettre en évidence l’absence de cellules végétatives et de spores germinatives.
Si présence de spores germinatives  1 % la suspension doit être éliminée.

5.4.2.3 Souche 5.2.1.6 (Candida albicans)


Prélever 10 mL de diluant (5.2.2.1.5), et les introduire dans une fiole de 100 mL avec 10 g de billes de verre.
Prélever à l’anse la culture de travail et transférer le prélèvement dans le diluant. Il convient de mettre les cellules
en suspension dans le diluant en immergeant l’anse et en la frottant contre la paroi de la fiole pour en détacher
les cellules. Agiter la fiole pendant 3 min à l’aide d’un agitateur mécanique. Aspirer la suspension qui se trouve
avec les billes de verre et la transférer dans un autre tube. Ajuster le nombre de cellules de la suspension à l’aide
du diluant en estimant le nombre d’unités au moyen d’un spectrophotomètre ou par un moyen approprié.
Ajouter à cette suspension, selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé
afin d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de
cette dernière au 1/10ème. Le titre final de Candida albicans doit être compris entre 2.107 et 1.108 UFC/mL.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors d’essais
préliminaires.
Conserver cette suspension dans le bain d’eau à (20  1) °C et l’utiliser dans les 2 h qui suivent sa préparation.
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— 23 — NF T 72-281

5.4.2.4 Souche 5.2.1.7 (Aspergillus brasiliensis)


Mettre en suspension les cellules de la culture de travail dans 10 mL d’une solution stérile de polysorbate 80 %
à 0,05 % (m/V) dans de l’eau 5.2.2.1.5. À l’aide d’une spatule de verre stérile, détacher les conidies de la surface
de la culture. Transférer la suspension dans une fiole conique et agiter doucement pendant 1 min en présence de
billes de verre. Filtrer la suspension à travers un filtre fritté.
Procéder à un examen microscopique sous grossissement  400 immédiatement après la préparation pour
s'assurer :
1) de la présence d'une concentration élevée (au moins 75 % de spores échinulées) de spores matures
caractéristiques, c'est-à-dire des spores échinulées (par opposition aux spores lisses) [voir Figure 1 et Figure 2] ;
2) de l'absence de germination des spores (vérifier au moins 10 champs) ;
3) en cas de présence de germination des spores, rejeter la suspension ;
4) de l'absence de fragments mycéliens (vérifier au moins 10 champs).
En cas de présence de mycélium, procéder à une deuxième filtration frittée.
Si le mycélium est toujours présent, rejeter la suspension.

Figure 1 — Photo N° 1 Observation des Figure 2 — Photo N° 2 Observation des


conidiospores à l'aide d'un microscope optique : conidiospores à l'aide d'un microscope optique :
présence de spores lisses (a) et échinulées (b) concentration élevée en spores matures
(suspension inadéquate) caractéristiques avec un aspect échinulé
(suspension adéquate)
NOTE L'impossibilité d'obtenir 75 % de spores échinulées peut être due à la culture de l'Aspergillus brasiliensis ou au
milieu utilisé pour produire ces spores. En pareil cas, il est nécessaire d'utiliser une culture issue d'une autre collection de
cultures et/ou d'utiliser de la gélose à l'extrait de malt provenant d’un autre fournisseur.

Ajuster ensuite par ajout d’eau stérile (5.2.2.1.5) le nombre de spores dans la suspension en estimant le nombre
d’unités formant colonies par un moyen approprié.
Cette suspension d’essai ne doit pas être conservée plus de 2 j à une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
Mélanger la suspension d’essai immédiatement avant usage afin de remettre les spores en suspension.
Ajouter à cette suspension, selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé
afin d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de
cette dernière au 1/10ème. Le titre final d’Aspergillus brasiliensis doit être compris entre 5.106 et 1.107 UFC/mL.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors
d’essais préliminaires.

5.4.2.5 Souches 5.2.1.13 et 5.2.1.14 (Mycobacterium avium et Mycobacterium terrae)


Préparation de la suspension d’essai: voir F.2.1.3 de l’Annexe F.
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NF T 72-281 — 24 —

5.4.3 Dénombrement des suspensions préparées dans la substance interférente

5.4.3.1 Bactéries
Dénombrement des suspensions bactériennes d’essai :
Diluer les suspensions bactériennes ajustées (voir 5.4.2.1) jusqu’à 10-6, 10-7 et 10-8 dans le diluant 5.2.2.1.5.
Les dénombrements sont réalisés en parallèle par inclusion N1 et par filtration N2.
Inclusion : prélever en double un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution et inoculer par ensemencement en
profondeur N1. À l’aide d’une pipette, introduire chaque échantillon de 1,0 mL dans des boîtes de Petri distinctes
et ajouter 15 mL à 20 mL de gélose TSA en surfusion et refroidies à (45  1) °C pour les bactéries.
Filtration : prélever en double un échantillon N2 de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL dans un appareil distinct de filtration sur membrane (5.3.2.7). Filtrer immédiatement. Filtrer en faisant
passer du liquide de rinçage (5.2.2.1.8) de la même manière que lors de l’essai (5.5.1.4.3). Puis déposer chacune
des membranes sur la surface du milieu gélosé (5.2.2.1.3).
Pour les souches bactériennes, incuber les boîtes à (36  1) °C ou à (37  1) °C pendant 24 h. Écarter toutes les
boîtes sur lesquelles il n’est pas possible de compter les colonies, pour quelque raison que ce soit. Incuber les
boîtes 24 h de plus. Ne pas recompter les colonies sur les boîtes qui ne présentent plus de colonies bien
séparées. Les recompter sur les boîtes restantes.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.

5.4.3.2 Levures et moisissures


Dénombrement des suspensions fongiques d’essai ;
Diluer les suspensions fongiques ajustées (voir 5.4.2.3 et 5.4.2.4) jusqu’à 10-5, 10-6 et 10-7 dans le diluant 5.2.2.1.5.
Les dénombrements sont réalisés en parallèle par inclusion N1 et par filtration N2.
Inclusion : prélever en double un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution et inoculer par ensemencement en
profondeur N1. À l’aide d’une pipette, introduire chaque échantillon de 1,0 mL dans des boîtes de Petri distinctes
et ajouter 15 mL à 20 mL de gélose GEM en surfusion et refroidies à (45  1) °C pour les champignons.
Filtration : prélever en double un échantillon N2 de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL dans un appareil distinct de filtration sur membrane (5.3.2.7). Filtrer immédiatement. Filtrer en faisant
passer du liquide de rinçage (5.2.2.1.8) de la même manière que lors de l’essai (5.5.4.3). Puis déposer chacune
des membranes sur la surface du milieu gélosé (5.2.2.1.6).
Dans le cas d’Aspergillus brasiliensis, diviser l’échantillon en deux, trois ou quatre portions de taille
approximativement égale et transférer chaque portion dans un récipient distinct de filtration sur membrane
(5.3.2.7), ce qui revient, pour un échantillon en double, à inoculer quatre, six ou huit membranes.
NOTE La raison justifiant la division de l’échantillon est la limite supérieure du dénombrement (5.6.2).

Pour les souches fongiques, incuber les boîtes à (30  1) °C pendant 24 h (Candida albicans) et pendant 42 h
à 48 h (Aspergillus brasiliensis). Écarter toutes les boîtes sur lesquelles il n’est pas possible de compter les
colonies, pour quelque raison que ce soit. Compter les boîtes et déterminer le nombre de colonies formant unités.
Incuber les boîtes 24 h de plus. Ne pas recompter les colonies sur les boîtes qui ne présentent plus de colonies
bien séparées. Les recompter sur les boîtes restantes.
Pour Aspergillus brasiliensis, poursuivre l’incubation entre 20 h et 24 h de plus et, si nécessaire, encore 20 h
à 24 h, à condition que le nombre de colonies (petites colonies) augmente.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.
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— 25 — NF T 72-281

5.4.3.3 Spores
Pour le dénombrement de la suspension d’essai de spores, préparer des dilutions à 10-4 et 10-5 de la suspension
d’essai en utilisant le diluant (5.2.2.1.5).
Les dénombrements sont réalisés en parallèle par inclusion N1 et par filtration N2.
Inclusion : prélever en double un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL sur des boîtes de Petri distinctes et ajouter entre 12 mL et 15 mL de gélose glucosée à l’extrait de
levure GGL (5.2.2.1.10) en surfusion refroidie à (45  1) °C.
Filtration : prélever en double un échantillon N2 de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL dans un appareil distinct de filtration sur membrane (5.3.2.7). Filtrer immédiatement. Filtrer en faisant
passer du liquide de rinçage (5.2.2.1.8) de la même manière que lors de l’essai (5.5.4.3). Puis déposer chacune
des membranes sur la surface du milieu gélosé (5.2.2.1.11).
Incuber les boîtes de Petri à (30  1) °C pendant 3 j. Déterminer le plus grand nombre de colonies pour
chaque boîte. Calculer le nombre d’UFC/mL dans la suspension d’essai.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.

5.4.3.4 Mycobactéries
Pour le dénombrement de la suspension d’essai : voir F.2.2 de l’Annexe F.

5.4.4 Préparation et dénombrement des suspensions virales

5.4.4.1 Suspension stock de virus


Le virus doit être multiplié à large échelle pour obtenir une suspension virale ayant les mêmes caractéristiques
que la suspension virale de référence. Pour des raisons de sécurité, seulement 10 passages issus du virus original
sont autorisés.
Pour la multiplication et la préparation des suspensions virales voir 5.5.2.
La suspension virale est conservée en aliquots à – 70 °C ou préférentiellement à – 196 °C dans l’azote liquide.

5.4.4.2 Suspension virale d’essai


La suspension virale stock est multipliée au sein d’une lignée cellulaire appropriée et capable de produire une
haute concentration de particules virales. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (400 g pendant
15 min). Cette préparation est appelée « suspension virale d’essai ».
La suspension virale d’essai est utilisée sans dilution dans l’essai.
La suspension virale doit avoir un titre compris entre 1.107 et 1.109 UFP/mL, ou doit être suffisamment élevée
pour qu’à minima, une réduction de titre de 104 puisse être déterminée.
Dans certains cas exceptionnels, la suspension virale pourra être concentrée suivant des méthodes appropriées
(c’est-à-dire ultracentrifugation).
NOTE 1 Pour éviter la formation d’agrégats, la sonication pourra être nécessaire.

NOTE 2 Pour vérifier la qualité de la suspension virale, une évaluation des protéines (i.e. méthode de Lowry) pourra être
réalisée pour une meilleure reproductibilité.

NOTE 3 Le titre de la suspension viral doit tenir compte de la perte occasionnée par l’étape de séchage des supports
contaminés (5.5.1.2.1 et 5.5.2)
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NF T 72-281 — 26 —

5.4.4.3 Essai d’infectivité

5.4.4.3.1 Titrage par effet cytopathique (méthode de dilution limite)


5.4.4.3.1.1 Titrage du virus sur les cellules en suspension en plaques de microtitration
Diluer la suspension virale par des dilutions au 1/10ème sous un volume de 0,1 mL de suspension virale + un
volume approprié de milieu de culture (exemple : MEM + 2 % SFV). Les pointes de pipettes doivent être changées
après chaque étape de dilution.
Transférer 0,1 mL de chaque dilution dans six ou huit puits d'une plaque de microtitration, en commençant par la
dilution la plus élevée. Ajouter 0,1 mL de suspension de culture cellulaire à une densité permettant la formation
d'une monocouche ( 90 %) en au moins 2 j. Six ou huit puits servent de témoin cellulaire et ne reçoivent aucune
suspension virale.
L'effet cytopathique viral est lu à l'aide d'un microscope inversé une fois la durée d'incubation appropriée écoulée
(selon le type de virus).

5.4.4.3.1.2 Titrage du virus sur tapis monocellulaires pré-établis en plaques de microtitration


Transférer 0,1mL de chaque dilution dans six ou huit puits d’une plaque de microtitration contenant des cellules
confluentes ( 90 %) en monocouche sans aucun milieu. La dernière rangée de six ou huit puits reçoit 0,1 mL de
milieu de culture (MEM + 2 % SFV) et sert de témoin cellulaire.
Après 1 h d'incubation à 37 °C, 0,1 mL de milieu de culture cellulaire est ajouté à chaque puit et les plaques sont
mises à incuber à 37 °C pour une période appropriée. L’effet cytopathique viral est lu à l'aide d'un microscope
inversé.

5.4.4.3.1.3 Méthode des plages


Les puits des plaques en plastique (diamètre de surface de 30 mm à 35 mm) avec des cellules confluentes en
monocouche sont lavés une fois avec de la solution tamponnée au phosphate (PBS) et inoculés avec 0,2 mL de
dilutions en série du virus dans un milieu de culture (MEM 2 % SFV). Trois puits sont généralement utilisés
par dilution.
Après une période d'adsorption de 1 h à 37 °C, pendant laquelle l'humidité des cellules en monocouche est
maintenue en inclinant les boîtes toutes les 8 min à 10 min, l'inoculum est retiré et les cellules en monocouche
sont lavées une fois avec de la solution tamponnée au phosphate (PBS). Par la suite, les puits sont recouverts
avec 3 mL d'un mélange comportant 2 % d'agarose fondu ou autre milieu semi-solide approprié et du MEM
concentré deux fois avec 4 % SFV.
Les cultures sont incubées pendant 2 j à 3 j à 37 °C dans un incubateur à CO2 (voir 5.3.2.3).
Les plages de lyses peuvent être comptées après incorporation d'une deuxième couche (2 mL) ayant la même
composition que la première et contenant également 5 % d'une solution de rouge neutre (1/1 000e) et incubation
supplémentaire (dans l'obscurité) à 37 °C pendant 24 h à 48 h dans un incubateur à CO2 (voir 5.3.2.3).
Le comptage peut aussi être réalisé après addition de violet de méthyle. Les cellules en monocouche sont fixées
en ajoutant 2 mL d'acide trichloracétique (TCA) à 10 % sur la couche d'agar pendant 10 min à 15 min
à température ambiante. La couche d'agar est ensuite retirée et on ajoute 2 mL de violet de méthyle à 0,1 % dans
de l'éthanol à 20 %. Après 10 min à 15 min à température ambiante, les puits sont complètement lavés avec de
l'eau et les plages de lyse (taches blanches) sont comptées.
NOTE La détermination du ECP peut être utilisée comme alternative à la méthode des plages.
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— 27 — NF T 72-281

5.4.5 Préparation et dénombrement des suspensions de tests (suspensions bactériennes hôtes


et bactériophages)

5.4.5.1 Culture stock des bactéries hôtes


Inoculer le lait écrémé reconstitué avec une fraction volumique de 1 % d’une culture en milieu liquide ou avec une
anse de bactéries provenant d’une gélose M17 en pente ou en boîte, incuber 2 h à (30  1) °C et conserver cette
culture stock de la souche hôte dans le lait écrémé reconstitué au réfrigérateur réglé à une température comprise
entre 4 °C et 8 °C. Dans un intervalle de deux semaines, laisser ces cultures stock se développer pendant toute
une nuit à (30  1) °C et répéter la procédure afin d’obtenir une culture stock fraîche.
S’il est nécessaire de prolonger la conservation, congeler les cultures dans le lait écrémé à des températures
comprises entre – 18 °C et – 20 °C, ou plus basses.
Ou bien, utiliser des cultures lyophilisées.

5.4.5.2 Culture de travail des bactéries hôtes


Afin de préparer la culture de travail des bactéries hôtes, repiquer à partir de la culture stock dans le bouillon de
culture M17 (voir 5.2.2.3.1) et incuber à (30  1) °C. Utiliser une fraction volumique de 1 % d’inoculum provenant
d’une culture en milieu liquide ou une anse de bactéries provenant d’une gélose M17 en pente ou en boîte.
Après 16 h à 24 h, préparer un deuxième repiquage à partir du premier dans le bouillon de culture M17
(une fraction volumique de 1 % d’inoculum) et incuber pendant 16 h à 24 h à (30  1) °C.
À partir de ce deuxième repiquage, vous pouvez en effectuer un troisième de la même façon. Le deuxième et/ou
le troisième repiquage constituent la ou les cultures de travail.
S’il n’est pas possible de préparer le deuxième repiquage un jour particulier, il est admis de préparer ce deuxième
repiquage à partir d’un repiquage datant de 48 h, à condition de l’avoir conservé, après une incubation de 2 h
à (30  1) °C, dans un réfrigérateur réglé à une température entre 2 °C et 8 °C. Dans ce cas, avant de continuer,
il faut préparer un troisième repiquage qui sera incubé 16 h à 24 h. Ne pas procéder à un quatrième repiquage.

5.4.5.3 Suspension stock de bactériophages


Dans un tube à essai, ajouter 0,1 mL de lysat des phages de référence à 0,1 mL d’une culture de travail de
bactéries hôtes (culture de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17). Supplémenter l’échantillon avec
10 mmol/L de CaCl2 en ajoutant 0,05 mL de solution mère stérile de CaCl2 à 50 mmol/L (voir 5.2.2.3.6).
Agiter brièvement au Vortex et incuber 10 min à température ambiante (c’est-à-dire entre 20 °C et 21 °C) pour
permettre l’adsorption des phages sur les cellules bactériennes.
Ajouter dans le tube à essai 10 mL de bouillon de culture M17 (préchauffé à (30  1) °C), mélanger brièvement et
incuber à (30  1) °C (voir 5.3.2.3) jusqu’à apparition de la lyse cellulaire. La croissance des bactéries hôtes
(c’est-à-dire la turbidité) et la lyse cellulaire doivent être suivies.
À l’œil nu, ou, de préférence, en mesurant la densité optique de la culture avec un spectrophotomètre approprié
réglé sur une longueur d’onde définie (par exemple 620 nm).
Préparer de la même façon un tube à essai témoin, mais en remplaçant le lysat des phages par 0,1 mL de bouillon
de culture M17 (voir 5.2.2.3.1). Comparer la turbidité dans le tube à essai avec celle dans le tube témoin.
Après la lyse des bactéries hôtes dans le tube à essai contenant les phages, passer le surnageant contenant les
phages sur une membrane filtrante (porosité de 0,45 m).
Conserver les suspensions stock de phages entre 4 °C et 8 °C jusqu’à utilisation.
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Pour : PIERRE LABAT

NF T 72-281 — 28 —

5.4.5.4 Suspension de bactériophages de titre élevé


À partir des suspensions stocks de bactériophages (voir 5.4.5.3), préparer des dilutions décimales dans le diluant
pour phages (voir 5.2.2.3.4). Pour ce faire, ajouter 1,0 mL de suspension stock de phages à 9,0 mL de diluant
pour phages. Mélanger et préparer de la même façon les dilutions suivantes jusqu’à la dilution 10–5.
Prélever en double un échantillon de 0,1 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon de 0,1 mL dans
un tube à essai distinct. Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h, qui s’est développée
dans le bouillon de culture M17. Ajouter 0,1 mL de solution de CaCl2 à 50 mmol/L (voir 5.2.2.3.6), mélanger
brièvement et incuber 10 min à température ambiante pour permettre l’adsorption des phages sur les cellules
bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3,0 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion
dans un bain d’eau bouillante ou dans un four à micro-ondes puis refroidie dans un bain d’eau à (47  1) °C.
Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons dans des boîtes contenant de la gélose de fond
M17 (voir 5.2.2.3.2). Pour obtenir une répartition homogène des échantillons, il faut incliner lentement les boîtes
à la main avant solidification de la gélose de recouvrement.
Il faut prendre toutes les précautions afin d'éviter qu'une surchauffe incontrôlée du four ne provoque une ébullition
excessive et non contrôlée de la gélose liquéfiée. Il faut dévisser les bouchons des récipients afin de prévenir tout
risque d’explosion.
Incuber les boîtes à (30  1) °C pendant au moins 6 h, ou jusqu’au lendemain pendant 16 h à 24 h.
Examiner les boîtes pour vérifier l’apparition de zones de lyse dues aux phages (plages) claires et uniformes dans
le tapis bactérien.
NOTE 1 Les plages du phage P008 présentent des arêtes vives et un diamètre de 1 mm à 2 mm. Les plages du phage
P001 sont plus grandes (de 2 mm à 3 mm de diamètre) et entourées de halos troubles (NF EN 13610).

Choisir parmi les boîtes ensemencées à partir des dilutions en cascade celles qui présentent une lyse confluente.
Sur ces boîtes, les plages doivent se toucher et un fin tapis de cellules restantes non lysées doit être à peine
visible. 3) Ne pas choisir des boîtes sur lesquelles le tapis bactérien a été entièrement éliminé ou sur lesquelles
les plages individuelles ne se touchent pas (c’est-à-dire sur lesquelles les plages sont totalement isolées),
car il n’est pas possible d’obtenir des lysats de titre élevé à partir de ces boîtes.
Prélever les phages sur les boîtes de gélose qui révèlent une lyse confluente en grattant la gélose molle avec une
baguette en verre coudée stérile, et les transférer dans un tube ou une fiole à centrifuger.
Rincer soigneusement chaque boîte avec 5 mL de tampon SM (voir 5.2.2.3.5) et verser ces tampons dans les
tubes à essai (à centrifuger) correspondant aux boîtes.
Agiter doucement les tubes de temps à autre pendant au moins 15 min à température ambiante.
Faire sédimenter la gélose molle et les débris cellulaires par centrifugation (c’est-à-dire pendant 15 min à 4 000 g).
Le surnageant doit être filtré à travers une membrane filtrante (voir 5.3.2.7).
Les phages provenant d’une même souche mais récoltés sur différentes boîtes doivent être regroupés avant de
déterminer le titre de la suspension de phages.
NOTE 2 Un lysat de phages préparé selon cette méthode est quasiment exempt de contamination protéique.
D’une manière générale, les titres des suspensions de phages ainsi obtenus se situent entre 1  1010 et 5  1011 UFP/mL).

Conserver la suspension de bactériophages de titre élevé entre 4 °C et 8 °C pendant trois mois au maximum.

3) La lyse confluente se produit généralement sur les boîtes de gélose ensemencées à partir des dilutions de
rangs 10-3 ou 10-4.
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Pour : PIERRE LABAT

— 29 — NF T 72-281

Pour le dénombrement des suspensions de bactériophages de titre élevé, préparer des dilutions en série dans le
diluant pour phages (voir 5.2.2.3.4). Pour ce faire, ajouter 1,0 mL de la suspension de bactériophages de titre
élevé à 9,0 mL du diluant pour phages. Mélanger et préparer de la même façon les dilutions suivantes jusqu’à la
dilution 10-9. Prélever en double un échantillon de 0,1 mL dans les dilutions 10-8 et 10-9 et verser chaque
échantillon de 0,1 mL dans un tube à essai distinct. Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h
à 24 h dans le bouillon de culture M17 (voir 5.4.4.3.1.6). Ajouter 0,1 mL d’une solution de CaCl2 à 0,05 mol/L
(voir 5.2.2.3.6), mélanger brièvement et incuber 10 min à température ambiante pour permettre l’adsorption des
phages sur les cellules bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion dans
un bain d’eau bouillante ou dans un four à micro-ondes puis refroidie dans un bain d’eau à (47  1) °C.
Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons dans des boîtes contenant de la gélose de
fond M17 (voir 5.2.2.3.2). Pour obtenir une répartition homogène des échantillons, il faut incliner lentement les
boîtes à la main avant solidification de la gélose de recouvrement.

5.4.5.5 Préparation de la suspension de bactériophages d’essai


Avant d’appliquer le mode opératoire d’essai pour déterminer l’activité virucide des produits, le titre en phages de
la suspension de bactériophages de titre élevé (voir 5.4.5.4) est ajusté entre 8.108 et 3.109 UFP/mL avec le
tampon SM (voir 5.2.2.3.5) afin d’obtenir la suspension de bactériophages d’essai finale permettant de mettre en
œuvre le mode opératoire.
Avant de procéder à l’essai proprement dit, vérifier le titre réel de la suspension de phages en préparant une série
de dilutions de la suspension de bactériophages d’essai à l’aide du diluant pour phages (voir 5.2.2.3.4). Pour ce
faire, ajouter 1,0 mL de la suspension de bactériophages d’essai à 9 mL de diluant pour phages. Mélanger et
préparer de la même façon les dilutions suivantes jusqu’à la dilution 10-7. Prélever en double un échantillon
de 0,1 mL des dilutions 10-6 et 10-7 et transférer chaque échantillon de 0,1 mL dans un tube à essai distinct.
Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 (voir 5.4.5.2).
Ajouter 0,1 mL de solution de CaCl2 à 50 mmol/L (voir 5.2.2.3.6), mélanger brièvement et incuber 10 min
à température ambiante pour permettre l’adsorption des phages sur les cellules bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion dans un
bain d’eau bouillante ou un four à micro-ondes puis refroidie dans un bain d’eau à 47 °C. Mélanger brièvement,
puis étaler uniformément les échantillons dans des boîtes contenant de la gélose de fond M17 (voir 5.2.2.3.2).
Pour obtenir une répartition homogène des échantillons, il faut incliner lentement les boîtes à la main avant
solidification de la gélose de recouvrement.
Il faut prendre toutes les précautions afin d'éviter qu'une surchauffe incontrôlée du four ne provoque une ébullition
excessive et non contrôlée de la gélose liquéfiée. Il faut dévisser les bouchons des récipients afin de prévenir tout
risque d’explosion.

5.4.5.6 Préparation des phages dans la substance interférente


À partir de la suspension de bactériophage d’essai, ajouter le petit lait acide ou le lait écrémé afin d’obtenir une
dilution de ce dernier au 1/20ème. Le titre final de phages doit être compris entre 8.108 et 3.1010 UFP/mL.
Conserver cette suspension dans le bain d’eau à (20  1) °C et l’utiliser dans les 2 h qui suivent sa préparation.
Pour le dénombrement dans le petit lait acide ou le lait écrémé, procéder de la même manière qu’en 5.4.5.5.
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Pour : PIERRE LABAT

NF T 72-281 — 30 —

5.5 Mode opératoire pour évaluer l’activité du procédé


5.5.1 Mode opératoire pour évaluer l’activité du procédé selon les conditions d’usage transmises par le
fabricant (bactéries, levures, moisissures, spores, virus, bactériophages et mycobactéries)

5.5.1.1 Conditions expérimentales (obligatoires, complémentaires obligatoires et additionnelles)


Outre les conditions obligatoires des conditions expérimentales complémentaires et additionnelles peuvent être
choisies en fonction de l’utilisation prévue du procédé, à savoir :
a) Durée de contact (exposition au procédé de désinfection) :
- la durée de contact peut varier en fonction des indications du fabricant ;
- les contrôles de la survie de certains germes sur les témoins T risquent de ne pas donner de résultats
valides. Dans ces conditions, il ne sera pas possible de déterminer des taux de réduction
logarithmiques  3, 4 ou 5 log tels qu’exigés par le document (voir 4).
b) Température :
- température obligatoire : (20  2) °C en début d’essai ;
- températures obligatoires complémentaires (dans le cas où l’usage courant se fait en dehors des conditions
de températures ci-dessus) : pour les grands volumes : 15 – 25° en début d’essai ;
- toute autre température selon les exigences des différents secteurs d’activité. La justification du choix de
cette température devra être fournie dans le procès-verbal, sous la responsabilité de l’industriel.
c) Humidité
- humidité obligatoire : 40 % à 80 % Humidité Relative, uniquement pour les secteurs dans lesquels ces taux
d’humidité sont rencontrés et en l’absence de recommandations spécifiques en début s’essai ;
- humidités obligatoires complémentaires dans le cas où l’usage courant se fait en dehors des conditions
d’humidité ci-dessus) : Toute autre humidité selon les exigences des différents secteurs d’activité.
La justification du choix de cette humidité devra être fournie dans le procès-verbal, sous la responsabilité
de l’industriel.
d) volume du local
Le fabricant de procédés précise les limites d’utilisation de son procédé en termes de volume à traiter. Sur cette
base, il sera vérifié que le volume de la salle de test est adapté au procédé et à l’essai à mettre en œuvre.
De même que pour la température et le taux d’humidité, il n’est pas requis que l’essai soit répété à des volumes
différents.
- volume obligatoire : 30 m3 à 150 m3 ;
- si le procédé revendique aussi des volumes d’usage en dehors des volumes obligatoires ci-dessus, un test
complémentaire doit être réalisé ;
- si le procédé ne revendique que des volumes d’usage en dehors des volumes obligatoires ci-dessus,
seul le test correspondant aux conditions d’usage doit être réalisé et est obligatoire.
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Pour : PIERRE LABAT

— 31 — NF T 72-281

— Le tableau ci-dessous décrit des modalités de mise en œuvre selon le cas rencontré.
NOTE

Cas 1 Cas 2 Cas 3

Limite basse du volume 30 m3 Entre 30 m3 et 150 m3 > 150 m3


d'usage du procédé
selon la revendication
du fabricant

Limite haute du volume 150 m3  150 m3 et à préciser par le fabricant À préciser par le fabricant
d'usage du procédé
selon la revendication
du fabricant

Tests requis Tests en conditions Tests en conditions obligatoires dans Test en fonction de la technologie de
obligatoires dans un un volume entre 30 m3 et 150 m3 l'appareil et des salles de tests disponibles
volume entre 30 m3 + comme indiqué ci-dessous :
et 150 m3 Tests conformément au document
dans le volume maximum revendiqué
par le fabricant en fonction des salles
de test disponibles comme indiqué
ci-dessous :
Disponibilité d’une salle d'essai Disponibilité d’une salle d'essai
correspondant au volume maximum correspondant au volume maximum
revendiqué, dans laquelle il est revendiqué, dans laquelle il est possible de
possible de manipuler les manipuler les micro-organismes tests
micro-organismes tests (classe 2) (classe 2) spécifiés dans le document
spécifiés dans la norme
ð Oui : Les tests seront réalisés sur ð Oui : Les tests seront réalisés sur ces
ces souches en suivant les exigences souches en suivant les exigences du
du document document
ð Non : Les tests seront réalisés dans ð Non : Les tests seront réalisés avec
le volume maximum d’application du l'appareil destiné aux grands volumes ou
procédé avec des souches de classe avec un autre appareil de technologie du
1 selon les exigences décrites même type adapté au volume du local
ci-dessous (*) (dans le cas où il n'est pas possible
techniquement d'utiliser le même appareil),
dans un volume compris entre 30 m3 et
150 m3 avec les micro-organismes de
référence en suivant les exigences du
document et des tests complémentaires
doivent être faits dans le volume maximum
d’application du procédé avec l'appareil
destiné à l'usage dans les grands volumes
avec des souches de classe 1 selon les
exigences décrites ci-dessous (*)
Les résultats doivent être conformes Les essais dans les deux conditions devront
aux exigences requises dans les deux être réalisés avec une dose de produit
conditions expérimentales, pour diffusée par m3 et un temps de contact,
statuer de la conformité au document identiques.
Les résultats doivent être conformes aux
exigences requises dans les deux
conditions expérimentales, pour statuer de
la conformité au document.

(*) Souches de classe 1 :


Les souches choisies devront avoir été testées avec le produit soumis à essai selon la norme NF EN 1040 et démontrer une sensibilité au
produit, si possible équivalente aux souches de référence décrites dans la norme (sauf dans le cas 2 et 3 où la comparaison pourra être
faite en analysant les résultats obtenus avec la norme NF T 72-281) ;
Il est préférable d’utiliser, lors de ces essais, des souches de classe 1 réputées non potentiellement pathogènes. Il est recommandé de
privilégier des souches d’intérêt technologique :
— pour l’activité bactéricide on choisira au moins deux souches : une à Gram positif et une à Gram négatif. Exemple de souches
bactériennes : E.coli K12, S.carnosus, S.xylosus, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis, etc.
— pour l’activité levuricide et les autres activités, une seule souche sera testée par revendication. Exemple de souches de levures :
Saccharomyces cerevisae (DSM 1333) ou Saccharomyces cerevisae var. diastaticus (DSM 70487).
— Pour l'activité fongicide, une moisissure de classe 1.
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NF T 72-281 — 32 —

e) nature des supports, orientation et emplacement :


- supports obligatoires : disques d’acier inox ;
- supports additionnels : tout support non poreux à condition qu’il soit décrit dans le procès-verbal d’essai.
1) Cas des dispositifs non-dirigés :
• orientation et emplacements obligatoires : distance selon l’Annexe B à une hauteur comprise entre 1 m
et 1,5 m, position verticale, orientation vers côté opposé appareil ;
• orientation et emplacements additionnels : toute possibilité en fonction de l’utilisation prévue du procédé.
2) Cas des dispositifs dirigés (voir 5.5.1.4.2.2).
f) Nature des micro-organismes
- micro-organismes obligatoires : voir. 5.2.1 ;
- micro-organismes additionnels : tout micro-organisme en fonction de l’utilisation prévue du procédé.
g) substances interférentes
Pour certaines applications spécifiques, et en fonction des recommandations du fabricant des méthodes
d’évaluation en présence d’autres substances interférentes sont également possibles en conditions additionnelles.

5.5.1.2 Témoins de survie des germes sur les supports


À effectuer en même temps que l’essai proprement dit.

5.5.1.2.1 Contamination artificielle et séchage des supports


Contaminer les supports (5.2.3.1) placés dans des boîtes de Petri stériles par dépôt de 0,05 mL = 50 l de
suspension. (Pour les bactériophages, déposer 0,05 mL = 50 L de suspension de bactériophage d’essai).
Procéder ensuite à l’étalement homogène de l’inoculum sur le support en recouvrant une surface de 3 cm2
( 0,5 cm2).
Pour cela, utiliser une anse d’inoculation stérile et réaliser l’étalement en faisant plusieurs mouvements circulaires
afin de recouvrir la surface adéquate (le dépôt étalé doit recouvrir une surface d’environ 2 cm de diamètre).
Il est impératif de changer d’anse entre chaque étalement.
Pour chaque souche, contaminer deux exemplaires identiques de chaque support.
Procéder ensuite au séchage des supports.
Le séchage des supports peut être réalisé selon différentes méthodes (PSM, étuve ventilée ou non, dessiccateur,
paillasse, etc.). Les supports sont placés dans une boîte de Petri, couvercle ouvert, puis soumis au séchage pour
une durée maximale de 120 min à une température ne dépassant pas 37 °C (les échantillons n’étant pas secs
à la fin de cette période ne pourront être utilisés pour les tests).
Il appartient au laboratoire en charge des essais de surveiller régulièrement l’état des dépôts afin de ne pas les
soumettre aux conditions de séchage inutilement. Une fois visiblement sec, les supports sont retirés et le
couvercle de la boîte de Petri est refermé.
NOTE 1 Avant de soumettre les supports au séchage, il est important de prendre en considération les points suivants :
La sensibilité à la dessiccation des différents micro-organismes d’essai peut varier de manière importante.
Aussi l’ajustement du titre de la suspension doit tenir compte de la perte potentielle durant l’étape de séchage. Les valeurs
cibles pour les titres des témoins après séchage et exposition sont mentionnées dans le tableau récapitulatif de l’Annexe D.

NOTE 2 Il a été observé lors d’essais qu’une température basse (23  1) °C et un séchage doux était moins traumatisant
pour les germes sensibles.
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— 33 — NF T 72-281

Une fois le séchage réalisé, la période d’exposition au procédé de désinfection commence (période plus ou moins
longue définie par les fabricants pour obtenir l’inactivation des micro-organismes). Les supports témoins seront
non exposés au désinfectant et conservés au laboratoire pendant la durée du temps de contact. En fin de période
d’exposition on procèdera au dénombrement des deux supports (voir 5.5.1.2.2).
NOTE 3 Sachant que le titre initial obtenu sur les supports témoins et la quantité de germes non-viables à la surface de
l’inoculum (perte N-T) peuvent avoir un impact sur les résultats et sur les conclusions de conformité au document, il pourra
être requis, pour certains procédés d’ajuster les titres initiaux avec précision juste au-dessus des limites fixées par la
norme. De même la méthode de séchage devra être sélectionnée avec soin, en particulier pour les germes connus pour
leur sensibilité au séchage.

NOTE 4 Dans le cas de tests effectués sur un même procédé et conduisant à des conclusions de conformité au
document opposées, une répétition des essais est recommandée avec une méthode de séchage correspondant à la perte
la plus faible et un titre ajusté à la valeur la plus basse.

Quel que soit la méthode de séchage choisie elle devra être documentée dans le rapport d’essais et permettre
l’obtention d’un titre microbien et d’une quantité de matière interférente conformément aux critères du document.

5.5.1.2.2 Dénombrement des micro-organismes sur les supports


À l’expiration du temps de séchage, les deux supports sont laissés dans leurs boîtes fermées pendant le temps
prévu pour l’essai (période d’exposition) dans des conditions de température et d’hygrométrie relative proches de
celles mesurées dans le local où s’effectue la désinfection proprement dite.
À la fin de la période correspondant à l’exposition, transférer les deux supports conservés au laboratoire dans
deux récipients coniques contenant 100 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8) stérile.
Agiter manuellement pendant quelques secondes. Avec un agitateur de verre ou bien à l’aide de la pointe d’une
pipette. Gratter pendant 1 min au moins en tous sens la surface du support pour détacher les micro-organismes.
On peut éventuellement compléter le grattage par l’utilisation d’un vibreur ultrasonique pendant 1 min (préciser la
fréquence et la puissance du vibreur utilisé et rechercher un éventuel effet antimicrobien avant utilisation). Si le
vibreur est utilisé pour les essais, il doit aussi l’être pour les témoins dans les mêmes conditions.
Après une nouvelle agitation rapide, diluer 1 mL du liquide de récupération dans 9 mL de diluant 5.2.2.1.5 et
continuer à effectuer des dilutions successives jusqu’à la dilution 10-3 (dilution à adapter selon les titres des
suspensions préparées). Transférer deux fois 1 mL du liquide de récupération aux dilutions 10-2 et 10-3 obtenues
ci-dessus en boîtes de Petri pour en réaliser le dénombrement par inclusion dans le milieu gélosé 5.2.2.1.3 pour
les souches 5.2.1.1 à 5.2.1.4, par inclusion dans le milieu gélosé 5.2.2.1.6 pour les souches 5.2.1.6 et 5.2.1.7 par
inclusion dans le milieu gélosé 5.2.2.1.11 pour les souches 5.2.1.5 et par inclusion dans milieu gélosé 5.2.2.1.10
pour les souches 5.2.1.13 et 5.2.1.14.
Pour chaque souche, dénombrer les colonies dans le milieu gélosé, déterminer les moyennes pour les dilutions
précitées et rapporter le résultat au nombre de bactéries, de levures, de spores de moisissures ou de spores de
bactéries récupérées sur les supports, soit T.
NOTE La perte de viabilité (séchage + exposition) pourra être calculée et mentionnée dans le rapport de test (N – T).

5.5.1.2.3 Dénombrement des bactériophages sur les supports


À l’expiration du temps de séchage, les deux supports sont laissés au laboratoire dans leurs boîtes fermées
pendant le temps prévu pour l’essai (période d’exposition) dans des conditions de température et d’hygrométrie
relative proches de celles mesurées dans le local où s’effectue la désinfection proprement dite.
À la fin de la période correspondant à l’exposition, transférer les deux supports conservés au laboratoire dans
deux récipients coniques contenant 100 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8) stérile.
Agiter manuellement pendant quelques secondes. Avec un agitateur de verre ou bien à l’aide de la pointe d’une
pipette. Gratter pendant 1 min au moins en tous sens la surface du support pour détacher les bactériophages.
NOTE L'utilisation d'un vibreur ultrasonique favorise le détachement des phages du support.
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Après une nouvelle agitation rapide, diluer 1 mL du liquide de récupération dans 9 mL de diluant pour phage
(voir 5.2.2.3.4) et continuer à effectuer des dilutions successives jusqu’à la dilution 10-3 (dilution à adapter selon
les titres des suspensions préparées).
Prélever en double 0,1 mL des dilutions 10-2 et 10-3 et transférer chaque échantillon dans un tube à essai distinct.
Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 (5.4.5.2).
Ajouter 0,1 mL de solution de CaCl2 à 50 mmol/L (voir 5.2.2.3.6), mélanger brièvement et incuber 10 min à
température ambiante pour permettre l’adsorption des phages sur les cellules bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion dans un
bain d’eau bouillante puis refroidie dans un bain d’eau à (45  1) °C. Mélanger brièvement, puis étaler uniformément
les échantillons sur les boîtes de gélose de fond M17 (voir 5.2.2.3.2). Pour obtenir une répartition homogène des
échantillons, il faut incliner lentement les boîtes à la main avant solidification de la gélose de recouvrement.
Pour chaque souche, dénombrer le nombre de phages dans le milieu gélosé, déterminer les moyennes pour les
dilutions précitées et rapporter le résultat au nombre de phages récupérés sur les supports, soit T.

5.5.1.3 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel

5.5.1.3.1 Récupération des résidus de désinfectant à la surface des supports et recherche de leur éventuel effet
antimicrobien
Réaliser au minimum deux supports :
— à une distance d définie dans le tableau en Annexe B, inoculum en position verticale orienté dans la direction
opposée à l’appareil de désinfection pour les procédés automatiques ;
— sur lesquels le spray dirigé sera pulvérisé pour les sprays dirigés.
Préparation des supports
Déposer avec une pipette de précision 0,05 mL = 50 L soit de lait reconstitué dilué au 1/20ème soit de substance
interférente seule diluée au 1/10ème v/v dans le diluant 5.2.2.1.5.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 déposer 50 L de lait reconstitué au 1/5ème pour les essais
retenant cette option.
Laisser sécher les supports comme en 5.5.1.2.1.
Mise en contact des supports avec le produit à essayer
Exposer les supports au produit dispersé dans le local d’essai ou pulvériser le spray dirigé à leur surface,
afin d’obtenir la même fixation de désinfectant que lors d’un essai.
Récupération du désinfectant déposé
Retirer les supports après le temps de contact revendiqué par le fabricant et les transférer dans 100 mL de liquide
de récupération.
Soit S cette solution de recueil.

5.5.1.3.2 Recherche d’un effet inhibiteur en gélose


Dans une boîte de Petri, déposer 1 mL de la dilution 10-4 et/ou 10-5 et/ou 10-6 et/ou 10-7 et/ou 10-8 des
suspensions de micro-organismes (selon le type de germe testé, voir 5.4.3) et 1 mL de la solution S obtenue
en 5.5.1.3.1 sans mettre en contact les deux liquides. Pour les bactériophages, utiliser la même méthode de
dénombrement qu’en 5.5.1.2.3 (pour les dilutions concernées).
Couler le milieu gélosé selon la souche, bien homogénéiser, refroidir et incuber.
Comparer le nombre n1 de colonies obtenu à celui trouvé par dénombrement en gélose sans contact avec cette
solution de recueil des résidus de désinfectant N1.
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— 35 — NF T 72-281

5.5.1.3.3 Recherche d’un effet inhibiteur sur membrane filtrante


Filtrer 98 mL de solution S obtenue en 5.5.1.2.2 sur membrane et rincer trois fois avec 50 mL de liquide (5.2.2.1.8)
pour éliminer le produit.
Recouvrir la membrane une quatrième fois avec 50 mL de liquide (5.2.2.1.8) et y ajouter 1 mL de la suspension
diluée à 10-4, 10-5, 10-6, 10-7et/ou 10-8. Filtrer et porter la membrane sur le milieu gélosé pour dénombrement.
Effectuer cet essai en double exemplaire et procéder de même pour chacune des souches d’essai.
Après incubation, dénombrer les colonies apparues et noter le résultat n2 moyenne des deux essais effectués.
Comparer à N2 le nombre de colonies obtenu par filtration de 1 mL, des suspensions diluées 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
et/ou 10-8 sur des membranes n’ayant pas été en contact avec le désinfectant.
La technique par filtration n’est pas applicable pour les bactériophages et ne sera donc pas réalisée.

5.5.1.3.4 Recherche d’un effet inhibiteur dû au support dans le milieu gélosé


Dans une boîte de Petri, déposer 1 mL de la dilution 10-4 10-5 10-6 10-7et/ou 10-8 des suspensions microbiennes
et le support exposé obtenu en 5.5.1.2.2.
Couler le milieu gélosé selon la souche, bien homogénéiser, refroidir et incuber.
Comparer le nombre n3 de colonies obtenu à celui trouvé par dénombrement en gélose sans adjonction d’un
support N1.
Pour les bactériophages :
Déposer les supports sur fond de gélose M17.
Mélanger dans un tube 0,1 mL des dilutions de bactériophages concernées avec 0,3 mL d’une culture bactérienne
de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 et 0,1 mL de solution de CaCl2 à 50 mmol/L, mélanger
brièvement et incuber 10 min à température ambiante. Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17,
préalablement mise en surfusion dans un bain d’eau bouillante ou un four à micro-ondes puis refroidie dans un
bain d’eau à (45  1) °C. Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons sur les boîtes de gélose
de fond M17 contenant les supports.

5.5.1.4 Essai proprement dit

5.5.1.4.1 Contamination artificielle des supports


Procéder comme en 5.5.1.2.1 et préparer trois supports par souche.

5.5.1.4.2 Mise en contact des supports avec le produit à essayer


5.5.1.4.2.1 Cas des procédés non dirigées
Les conditions obligatoires en début d’essai sont les suivantes :
— température du local d’essai : (20  2) °C au début de l’essai à proximité des supports comme température
de référence ;
— humidité relative : comprise entre 40 % et 80 % en début d’essai ;
— chaque couple Temps de contact / concentration revendiqués par le fabricant devra être testée.
Le système permettant d’obtenir les conditions de température et d’hygrométrie requises doit être arrêté pendant
la durée de l’essai pour éviter toute turbulence parasite de l’air.
Le local d’essais, étanche, et isolé thermiquement, avec une température et une hygrométrie relative homogènes,
doit être d’un volume compris entre 30 m3 et 150 m3.
Comme décrit précédemment (5.5.1.1), des conditions obligatoires « complémentaires » peuvent être réalisées
pour les procédés dont l’usage serait clairement en dehors des conditions obligatoires ci-dessus.
Calfeutrer les issues pour éviter une fuite du gaz ou du produit dispersé.
Entre chaque essai, éliminer, par tout moyen adéquat (une ventilation-extraction est nécessaire), tout résidu de
produit qui pourrait avoir une action rémanente lors de l’essai suivant.
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Répartir les trois supports par souche à une hauteur (h) comprise entre 1 m – 1,5 m, à une distance (d) définie
dans le tableau en Annexe B en fonction du volume du local.
Position des supports : verticale.
Orientation : inoculum microbien orienté dans la direction opposée à l’appareil de désinfection.
Mettre le procédé en marche et diffuser le produit pendant le temps préconisé selon le volume du local. Déterminer
précisément les quantités diffusées par pesées ou mesures volumétriques.
Retirer les supports après le temps d’exposition revendiqué par le fabricant.
Le local devra être aéré après chaque essai et les supports traités devront être transférés aussitôt après l’essai
dans le liquide de récupération.
Fournir un schéma d’essai à l’échelle, indiquant précisément les contours du local, la position de l’appareil de
désinfection ainsi que des porte-germes pour chacune des manipulations effectuées.
Le cas particulier des UV non dirigés est décrit en Annexe E.
NOTE La méthode qui y est décrite représente les conditions de test considérées comme minimale pour pouvoir
revendiquer une désinfection par voie aérienne selon le présent document mais ne préjuge pas de l’efficacité de ces UV
par exposition directe.

5.5.1.4.2.2 Cas des procédés dirigés


Procédés sans pression :
Les trois supports (ne pas utiliser de supports concaves) devront être tenus horizontalement, inoculum orienté
vers le haut, à une distance d’au moins 20 cm sauf pour les procédés à UV dirigés pour lesquels cette distance
devra correspondre à la distance maximale spécifiée par le fabricant.
Tout ruissellement doit être proscrit car il rend l’essai ininterprétable.
Tous les paramètres pouvant influencer l’activité du procédé doivent être spécifiés : position des supports, temps
d’émission du produit, temps de contact, masse moyenne du produit dispersé se fixant sur le support, vitesse
d’évaporation et distance appareil-supports.
Procédés avec pression :
Les trois supports devront être tenus verticaux, inoculum orienté vers le manipulateur, à une distance à définir par
le fabricant.
Tout ruissellement doit être proscrit car il rend l’essai ininterprétable.
Ces procédés étant donc susceptibles de conduire à un déplacement de micro-organismes hors de la surface de
l’inoculum, la méthode de test devra permettre une récupération totale ou représentative des germes.
Tous les paramètres pouvant influencer l’activité du procédé doivent être spécifiés : position des supports, temps
d’émission du produit, temps de contact ou vitesse de déplacement au-dessus de la zone de test, masse moyenne
du produit dispersé se fixant sur le support, vitesse d’évaporation et distance appareil-supports.
Les conditions d’application devront impérativement être communiquées par le fabricant pour les deux types
de sprays.

5.5.1.4.3 Dénombrement des bactéries, des mycobactéries, des levures, des moisissures, des spores
bactériennes et des bactériophages récupérés
Transférer chaque support, dès qu’il est retiré du local d’essai ou dès la fin du temps de contact avec le
dispersat dirigé, dans un contenant 100 mL de liquide de récupération stérile (5.2.2.1.8).
Agiter manuellement pendant quelques secondes. Avec un agitateur de verre stérile ou à l’aide de la pointe
d’une pipette, gratter pendant 1 min au moins en tous sens la surface du disque acier pour détacher les
micro-organismes. Utiliser éventuellement un vibreur ultrasonique (5.3.2.27).
Après nouvelle agitation rapide, diluer 1 mL du liquide de récupération dans 9 mL de diluant 5.2.2.1.5 et continuer
à effectuer des dilutions successives jusqu’à la dilution 10-3.
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— 37 — NF T 72-281

Transférer deux fois 1 mL du liquide de récupération pur et/ou de ses dilutions 10-1 10-2 et/ou 10-3 en fonction de
l’efficacité présumée du procédé, en boîtes de Petri pour en réaliser le dénombrement par inclusion dans le milieu
gélosé adapté (5.2.2.1.3, 5.2.2.1.6 et 5.2.2.1.11). Pour les bactériophages, utiliser la même méthode de
dénombrement qu’en 5.5.1.2.3. Verser d’une part 10 mL du liquide de récupération sans faire tomber le support
dans un appareil de filtration stérile, puis séparément dans un autre appareil de filtration le restant du liquide
(environ 87 mL). (La technique par filtration n’est pas applicable pour les bactériophages et ne sera donc
pas réalisée.)
Filtrer, laver la membrane trois fois avec 50 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8) qui aura été versé au
préalable et agité dans la fiole conique avec le support.
Transférer ensuite la membrane sur le milieu gélosé pour dénombrement (5.2.2.1.3), (5.2.2.1.6), (5.2.2.1.10),
(5.2.2.1.11), solidifiée en couche de 4 mm d’épaisseur.
Prélever aseptiquement chaque support et les poser dans une boîte de Petri inoculum vers le haut. Couler une
quantité suffisante de gélose pour recouvrir le support de façon homogène.
Pour les bactériophages : Déposer les supports sur fond de gélose M17. Mélanger dans un tube 0,3 mL d’une
culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 et 0,1 mL de solution de CaCl2
à 50 mmol/L, mélanger brièvement et incuber 10 min à température ambiante. Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose
de recouvrement M17, préalablement mise en surfusion dans un bain d’eau bouillante ou un four à micro-ondes
puis refroidie dans un bain d’eau à (47  1) °C. Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons
sur les boîtes de gélose de fond M17 contenant les supports.
Procéder de même pour chacun des temps de contact et des souches d’essai et pour chacun des supports.

5.5.1.4.4 Incubation et dénombrement du mélange d’essai


Incuber :
— 48 h à 37 °C ou 36 °C  1 pour les souches bactériennes (5.2.1.1 à 5.2.1.4) ;
— 72 h à 30 °C  1 avec lecture à 48 h pour les spores (5.2.1.5) ;
— 48 h à 30 °C  1 pour C. albicans (5.2.1.6) ;
— 72 h à 30 °C  1 avec lecture à 48 h pour A. brasiliensis (5.2.1.7) ;
— 6 h ou 16 h – 24 h à 30 °C pour les bactériophages (5.2.1.11 et 5.2.12) ;
— 21 jours à 36 °C ou 37 °C  1 °C (si possible en incubateur à CO2) pour les souches mycobactériennes
(5.2.1.13 et 5.2.1.14).
Pour chaque souche et chaque type de support, dénombrer les colonies apparues à partir des inclusions dans les
boîtes de Petri et sur les membranes.
Calculer le résultat n’1 (moyenne des trois supports essais correspondant soit au nombre moyen de bactéries,
soit au nombre moyen de levures/moisissures, soit au nombre moyen de spores viables retrouvées dans 100 mL
de liquide de récupération).
Dénombrer de même les colonies apparues sur les supports inclus dans le milieu gélosé, soit n’2 la moyenne
correspondante des trois essais.

5.5.2 Essais de virucidie


Les conditions expérimentales (obligatoires et additionnelles) sont décrites en 5.5.1.1.

5.5.2.1 Généralités
Avant d'effectuer un essai, équilibrer tous les réactifs — à l'exception de la suspension virale d'essai —,
c'est à dire la substance interférente, l'eau, le milieu de culture cellulaire, le diluant et la solution d'essai du produit
à (20  3) °C ou (10  2) °C au moyen d'un bain thermostaté.
Les tubes sont remplis de milieu (MEM 2 % SFV) glacé pour les divers titrages qui doivent être réalisés après les
différents temps de contact et placés dans un bain de glace fondante. Les plaques de microtitration sont
étiquetées pour identification.
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NF T 72-281 — 38 —

5.5.2.2 Essai préliminaire pour valider l’absence d’effet résiduel

5.5.2.2.1 Récupération des résidus de désinfectant sur le support et évaluation de l’effet virucide potentiel

5.5.2.2.2 Tester au moins deux supports


— Situés à une distance d, telle que définie dans l’Annexe B, avec un inoculum vertical et orienté dans la direction
opposée au procédé de désinfection.
— Sur lesquels le produit dispersé sera dirigé pour les procédés manuels.
Préparation des supports
À l’aide d’une pipette de précision, déposer 50 L de diluant contenant la substance interférente reconstituée
à la concentration finale adéquate sur les supports puis procéder à l’étalement puis au séchage (5.5.1.2.1).
Exposition des supports au procédé testé
Exposer les supports au procédé automatique de désinfection dans la salle de test ou au procédé manuel lors de
la phase d’essais.
Récupération des supports et neutralisation de l’activité du désinfectant déposé
À la fin du temps de contact, récupérer les supports et les transférer dans 20 mL de liquide de récupération afin
de neutraliser l’action du désinfectant à la surface.
On obtient ainsi la solution de récupération S.
NOTE la neutralisation par effet de dilution ou par ajout d’un agent spécifique devra être explicitée dans le rapport. Une
neutralisation incomplète des résidus de désinfectant invalidera les essais.

5.5.2.2.3 Sensibilité des cellules au virus


La réduction de sensibilité des cellules aux virus est évaluée par les titrages comparatifs du virus sur les cellules
traitées ou non par des désinfectants :
Traitement des cellules :
a) tapis cellulaires : 0,1 mL de la solution S ou de PBS est distribué dans chacun des puits de la microplaque
à 96 puits. Après 1 h à 37 °C, le surnageant est écarté ;
b) cellules en suspension : 0,1 mL de la solution S ou de PBS est ajouté à un volume de suspension de cellules
concentré deux fois. Après 1 h à 37 °C, les cellules sont centrifugées et remises en suspension dans le milieu
de culture.
Titrage comparatif des virus :
Le virus est dilué de 10-2 à 10-10 et titré sur les cellules traitées ou non traitées en parallèle. Il y a une absence de
perte de sensibilité lorsque cette solution S :
a) indique un faible degré de destruction cellulaire ( 25 % des cellules en monocouche) ; ou
b) produit une réduction du titre du virus  1 log.

5.5.2.2.4 Contrôle de l’efficacité de l’arrêt de l’activité du désinfectant


Un volume de solution S ou unvolume d’eau distillée est ajouté à un volume de suspension virale mélangé à la
substance interférente. Après un contact de 30 min à 20 °C, des séries de dilutions sont réalisées et les titres
viraux sont comparés.
La différence entre les titres doit être inférieure à 0,5 log.
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— 39 — NF T 72-281

5.5.2.3 Test proprement dit


5.5.2.3.1 Contamination artificielle des supports
Préparer trois supports par souche :
Neuf volumes de suspension virale sont mélangés avec 1 volume de substance interférente.
Pour chaque test préparer trois supports d’essai et deux supports de contrôle en déposant 50 L de la suspension
décrite ci-dessus. Procéder ensuite à l’étalement puis au séchage des supports comme définit précédemment
(5.5.1.2.1).
Utiliser les supports secs durant l’heure suivante afin d’éviter l’inactivation du virus due au temps.

5.5.2.3.2 Exposition des supports au procédé testé

5.5.2.3.3 Détermination du titre viral après exposition


Immédiatement après récupération, à la fin du temps de contact, chaque support doit être transféré dans un flacon
contenant 20 mL de liquide de récupération. La quantité de liquide de récupération peut être réduite tant que son
pouvoir neutralisant reste conforme.
NOTE Il est recommandé aux laboratoires de test de réaliser des essais préliminaires afin de s’assurer que la
neutralisation des résidus a bien été complète.
Mélanger à la main pendant quelques secondes. À l’aide d’un agitateur en verre stérile, gratter chaque face du
disque pour décrocher toute trace de résidus séchés. Il est également possible d’utiliser les vibrations
ultrasoniques (5.3.2.27).
Après une dernière agitation rapide, diluer 1 mL de solution de récupération dans 9 mL et continuer les dilutions
en séries. Le titre viral est déterminé en accord avec 5.4.4.

5.5.2.4 Calcul et expression des résultats


Protocole des résultats
Les résultats de la culture cellulaire sont enregistrés en tant que « 0 » pour l’absence d’ECP, et « 1 »
(approximativement 25 % des cellules avec ECP) à « 4 » (toutes les cellules avec ECP) (titrage par ECP) ou en
tant que nombre de plages de lyse (unités formant plage, UFP).
Il convient de réaliser le calcul de la concentration estimée du virus au moyen de méthodes appropriées :
— le calcul de la concentration virale peut être effectué via la méthode Spearman-Kärber (voir NF EN 14476 et
NF EN 14675) ;
— calcul des UFP : le nombre d’unité formant une plage (UFP/mL) doit être calculé. Seules les unités de culture
cellulaire avec des plages de lyse non confluentes doivent être utilisées pour le calcul.
La réduction du titre viral est calculée en faisant la différence entre les titres viraux séchés avant et après
traitement par le procédé de désinfection.
Vérification de la méthodologie
Un test n’est valide que si les critères suivants sont remplis :
a) la suspension virale d'essai a une DICT50 comprise entre 1.107/mL et 1.109/mL, ou possède au moins un titre
qui permet de déterminer une réduction de 4 log du titre viral ;
b) la réduction de titre détectable est d'au moins 4 log ;
c) contrôle de la susceptibilité cellulaire : réduction du titre viral  1 ;
d) contrôle de neutralisation du désinfectant : différence entre les essais et les témoins de contrôle  0,5 log.
Calcul de l’activité virucide des produits
L'inactivation du virus induite par l'activité virucide de chaque solution d'essai du produit est déterminée pour
chaque durée d'exposition par comparaison avec les témoins viraux de contrôle non exposés au désinfectant et
conservés pendant la durée du temps de contact. La réduction, exprimée en log, est alors calculée par la
différence entre le titre logarithmique des échantillons de contrôle et les titres logarithmiques de chaque essai.
Tous les résultats sont rapportés en tant que données brutes et sont présentés de plus en valeurs logarithmiques
négatives de DICT50 ou UFP.
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5.5.3 Mode opératoire pour évaluer l’activité mycobactéricide du procédé : description dans l’Annexe F
(voir F.3)
Les conditions expérimentales des essais sont décrites en 5.5.1.4.2.1 pour procédés automatiques et en 5.5.1.4.2.2
pour procédés dirigés.

5.6 Données expérimentales et calculs (bactéries, levures, moisissures, spores bactériennes


et bactériophages et mycobactéries)
5.6.1 Généralités
— La première étape est la détermination du nombre moyen de micro-organismes ou de plage de lyse par mL
à partir des valeurs brutes.
— La deuxième étape consiste à déterminer les valeurs N (nombre de germes/mL de suspension de travail),
T (nombre de germes sur les témoins), n1 – n2 – n3 (recherche du pouvoir inhibiteur), n’1 et n’2 (nombre de
germes survivants).
— La troisième étape est le calcul du taux de réduction en logarithmes décimaux d.

5.6.2 Dénombrement des colonies et limites à respecter


— Sur gélose : ne pas compter les boîtes pour lesquelles le nombre de colonies excède 330 ou est inférieur à 14
pour les souches bactériennes, la souche de levure et les souches mycobactériennes, excède 165 ou est
inférieur à 14 pour A. brasiliensis ;
— sur membranes : ne pas compter les boîtes pour lesquelles le nombre de colonies excède 165 pour les
souches bactériennes, mycobactériennes et la souche de levure, excède 55 pour A. brasiliensis ;
— les dénombrements sur disques (par inclusion en gélose) et membranes issus des essais représentent la
totalité des micro-organismes ayant survécu à la décontamination. Chaque colonie obtenue doit être
réellement prise en compte lors des calculs d’efficacité ;
— les titres en phages doivent être calculés à partir des plages de lyse dans le tapis des cellules bactériennes
hôtes de la manière suivante :
- seuls les dénombrements de plages inférieurs à 300 UFP (Unité Formant Plage par mL) par boîte pour le
phage P008 ou à 200 UFP par boîte pour le phage P001 doivent être utilisés pour calculer les
dénombrements de plages. Pour qu’un résultat puisse être pris en compte, il faut qu’une boîte au moins
contienne 14 plages ou plus. Deux boîtes au moins sont nécessaires pour calculer les titres en phages :
une des deux boîtes ou les deux contiennent plus de 14 plages et les deux en contiennent moins de 300.
NOTE Le dénombrement de plages individuelles sur une boîte est limité par le début de la lyse confluente dans le tapis
des cellules bactériennes hôtes. Les plages du phage P001 étant sensiblement plus grandes que celles du
bactériophage P008, la limite supérieure de dénombrement des plages dérivées du bactériophage P001 est en réalité
inférieure à 300 plages par boîtes (c’est-à-dire 200 plages par boîte).

5.6.3 Détermination du nombre de germes N dans les suspensions microbiennes, de bactériophages et


de phages (5.4)
Effectuer la moyenne des nombres de colonies ou de phages obtenus pour une dilution ou pour deux dilutions
successives si le calcul pondéral est possible, et multiplier par le facteur de dilution pour obtenir le taux N en
germes/mL de suspension.
Pour le calcul du dénombrement moyen pondéré des phages, utiliser la formule suivante :
c / ((n1 + 0,1 n2)  d  V) en UFP/mL
où :
c est la somme des plages dénombrées sur toute les boîtes prises en compte ;
n1 est le nombre de boîtes prises en compte à la première dilution ;
n2 est le nombre de boîtes prises en compte à la deuxième dilution ;
d est le facteur de dilution correspondant à la première dilution prise en compte ;
V est le volume de l’échantillon (1 mL ou 0,1 mL).
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— 41 — NF T 72-281

EXEMPLE On obtient pour 1 mL de suspension de S. aureus : 233 et 215 colonies à 10-6 et, 27 et 21 colonies à 10-7.
Le taux de germes dans la suspension N s’obtient en faisant :

N = [(233 + 215 + 27 + 21) / 2,2]  106 = 225  106 = 2,3.108 germes/mL

5.6.4 Détermination du nombre de germes T sur les supports-témoins (5.5.1.2)


Effectuer la moyenne des nombres de colonies obtenus pour une dilution ou pour deux dilutions successives si le
calcul pondéral est possible, et multiplier par le facteur de dilution du liquide de récupération des supports puis
par 100.
Ne pas compter les boîtes avec un nombre de colonies  14.
EXEMPLE On obtient pour deux supports contaminés par C. albicans les moyennes suivantes : 225 et 232 colonies à 10-2
du liquide de reprise et, 21 et 23 colonies à 10-3.
Le nombre de germes par support T s’obtient en faisant :

T = [(225 + 232 + 21 + 23) / 2,2]  102  100 = 228  104 = 2,3.106 germes/support
Pour le calcul des phages sur les supports témoins (T), formule de calcul spécifique pour les bactériophages :
Le nombre de phages par support T s'obtient en faisant :
c/((n1 + 0,1 n2)  d  V))  100 où V = 0,1 ml dans le cas des phages dénombrés sur support.

5.6.5 Détermination des valeurs obtenues dans l’essai préliminaire (5.5.1.3)


— Recherche d’un effet inhibiteur en gélose : faire la moyenne des valeurs n1 obtenues.
— Recherche d’un effet inhibiteur sur membranes : faire la moyenne des valeurs n2 obtenues.
— Recherche d’un effet inhibiteur dû au support en gélose : faire la moyenne des valeurs n3 obtenues.

5.6.6 Détermination du nombre de germes et de plages sur les supports-essais après contact et du taux
de réduction logarithmique d (5.5.1.4.3)
Pour les supports essais, n’1 représente le nombre de germes (ou de plages) survivants dans 100 mL de liquide
de reprise ; il s’obtient :
— soit à partir de la filtration de 87 mL de liquide de reprise (en faisant la règle de 3) ;
Si le dénombrement sur une membrane est supérieur à 165 pour les bactéries et levures ou 55 pour les moisissures,
consigner le nombre comme > 165 (ou > 55).
— soit à partir de la filtration de 10 mL de liquide de reprise ;
— soit à partir du nombre de colonies ou de plages obtenu à partir de 1 mL de liquide de reprise, ou d’une dilution
du liquide de reprise ;
— soit à partir de deux dilutions successives si le calcul pondéral est possible.
Le nombre n’2 est le nombre de colonies (ou de plages) obtenu directement par inclusion du support d’essai.
Si le dénombrement sur une boîte est supérieur à 330 pour les bactéries et levures ou 165 pour les moisissures
et les phages, consigner le nombre comme  330 (ou  165). Pour les phages noter 165 UFP.
La somme n’1 + n’2 correspond au nombre total de germes (ou de phages) survivants par support essai.
Le taux de réduction logarithmique d s’obtient en prenant en compte d’une part le nombre de germes (ou de phages)
sur les témoins T, d’autre part le nombre de germes (ou de phages) survivants n’1 + n’2.
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La formule permettant de l’obtenir s’écrit :

d = log T – log (n’1 + n’2) = log [T/(n’1 + n’2)]

Une fois la réduction logarithmique obtenue pour chaque support d’essais, la moyenne des trois supports
sera réalisée.
Pour considérer qu’un procédé de décontamination est conforme, il est impératif que la moyenne de réduction
logarithmique soit supérieure ou égale aux exigences rappelées dans le Tableau 1.
Si les dénombrements amenant au calcul de n’1 et n’2 sont tous égaux à 0, alors la valeur lue de d = log T.
EXEMPLE 1 Nombres de colonies dans l’intervalle comptable et taux de réduction intermédiaire.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont :
— 22 colonies en moyenne pour 1 mL de liquide de reprise pur ;
— 15 colonies en moyenne pour l’inclusion du support en gélose.
n’1 = 22  100 = 2,2.103 germes/100 mL ;
n’2 = 15.
Alors, le résultat obtenu est :
d = log [T / (n’1+n’2)] = log [4,5.106 / (2,2.103 +15)] soit d = 3,3.
NOTE Dans le cas où une des valeurs n’1 et/ou n’2 est indéterminable ( à une des limites mentionnées en 5.6.1),
le calcul peut être néanmoins effectué en prenant pour hypothèse n’1 ou n’2 = à la limite mentionnée et en rendant une
activité  à la valeur calculée en log pour cette limite :
EXEMPLE 2 Nombres de colonies  330 et taux de réduction d réduit.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont (pour les trois supports) :
—  330 colonies pour 1 mL de la dilution 10-1 du liquide de reprise ;
—  330 colonies pour l’inclusion du support en gélose.
Alors :
n’1  330  10  100 soit  3,3.105 germes/100 mL ;
n’2  330.
On a donc d = log [T / (n’1 + n’2)] = log [4,5.106 / (3,3.105 + 330)] soit d  1,1 log.
EXEMPLE 3 Nombres de colonies peu élevé et taux de réduction d fort.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont (pour les trois supports) :
— 3 colonies dans 87 mL de liquide de reprise filtré ;
— 0 colonies dans 10 mL de liquide de reprise filtré ;
— 0 colonies dans 1 mL de liquide de reprise pur et dilué 10-1 filtré ;
— 0 colonies pour l’inclusion du support en gélose.
Alors :
n’1 = 3 ;
n’2 = 0.
On obtient donc d = log [T / (n’1 + n’2)] = log [4,5.106 / (3 + 0)] soit d = 6,17 log.
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— 43 — NF T 72-281

5.7 Interprétation des résultats


Valeurs fondamentales :
— titre des suspensions de travail : N doit être compris :
- entre 5.107 et 2.109 UFC/mL pour les souches bactériennes (souches 5.2.1.1 à 5.2.1.4).
Éventuellement 5.109 UFC/mL pour Pseudomonas aeruginosa (voir 5.2.2.4.11 et 5.4.2.1) ;
- entre 2.107 et 1.108 UFC/mL pour Candida albicans (souche 5.2.1.6) ;
- entre 5.106 et 1.107 UFC/mL pour Aspergillus brasiliensis (souche 5.2.1.7) ;
- entre 2.105 et 5.105 UFC/mL pour la souche sporulée de Bacillus subtilis (souche 5.2.1.5) ;
- entre 1.107 et 1.109 UFP/mL (DICT50) pour les souches virales (5.2.1.8 à 5.2.1.10) ;
- entre 8.108 et 3.109 UFP/mL pour les bactériophages (5.2.1.11 et 5.2.1.12) ;
- entre 1.107 et 1.108 UFC/mL pour les souches mycobactériennes (souches 5.2.1.13 et 5.2.1.14).
— témoins supports non exposés au désinfectant : Pour toutes les souches à l’essai T doit être 1 log au-dessus
des objectifs de réduction logarithmique tel que défini en Annexe D ;
— essais préliminaires (voir 5.5.3) :
Si n1  0,5 N1
n3  0,5 N1
n2  0,5 N2
Les conditions expérimentales sont applicables lors de l’essai pour les quantités de produit mises en œuvre :
Si n1  0,5 N1
n3  0,5 N1
n2  0,5 N2
Il reste dans le milieu gélosé ou sur les membranes filtrantes une quantité de désinfectant suffisante pour
provoquer un effet inhibiteur.
Renouveler l’essai en modifiant la composition des géloses, en ajoutant un neutralisant dans le liquide de
récupération des supports ou en augmentant le nombre des lavages des membranes ou le volume de liquide
utilisé pour chacun d’eux.
(N1 – N2 – n1 – n2 – n3 sont définis en 5.5.2).
— essais proprement dits (voir tableau récapitulatif par domaine d’application en Annexe D)
* Taux de réduction minimum exigé pour satisfaire à la Norme NF T 72-281 : activité bactéricide :
d1  5 selon les domaines d’application
d2  5 selon les domaines d’application
d3  5 selon les domaines d’application
d4  5 selon les domaines d’application
* Taux de réduction minimum sur les spores bactériennes : activité sporicide :
d5  3
* Taux de réduction minimum sur les levures et moisissures : activité fongicide :
d6  4
d7  4
* Taux de réduction minimum sur les levures : activité levuricide :
d6  4
* Taux de réduction minimum sur les virus : activité virucide :
d8  4
d9  4
d10  4
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* Taux de réduction minimum sur l’activité virucide contre les bactériophages :


d11  4
d12  4
*Taux de réduction minimum sur les mycobactéries : activité mycobactéricide et /ou tuberculocide :
d13  4
d14  4
* Taux de réduction sur d’autres souches : selon l’utilisation prévue du procédé, on peut exiger une
activité désinfectante dx  3, 4 ou 5 log en fonction du type de micro-organisme testé : spores bactériennes
( 3 log) – levures/moisissures ( 4 log) – bactéries ( 5 log) – virus ( 4 log) – mycobactéries ( 4 log) sur diverses
souches adaptées aux secteurs d’utilisation.

5.8 Rapport d’essai


EXEMPLE DE PROCÈS-VERBAL D’ESSAI
— Identification du laboratoire d’essai ;
— identification de l’échantillon : nom du procédé (produit et appareil), type d’appareil, n° de lot et de série
(si connu), fabricant, date de réception, conditions de stockage, substances actives (facultatif) ;
— ajout de neutralisants dans les milieux ou les diluants, nature des membranes filtrantes, vibreur ultra-sons ;
— date de début d’essai et date de fin d’essai ;
— limites d’emploi notamment en matière de capacité de diffusion dans les locaux (volumes minimum
et maximum).
PROCÉDÉS NON-DIRIGÉS
— local d’essais : volume et dimensions (hauteur, largeur, profondeur), température et hygrométrie relative en
début et en fin d’essai, description, rapport surface totale/volume ;
NOTE 1 Il n’est pas nécessaire que l’humidité et la température reviennent aux conditions initiales à la fin de l’essai.

— quantités de produit utilisées : temps de diffusion, quantité initiale mise en œuvre dans le cas d'un procédé de
diffusion faisant appel à une réaction chimique, dose en g ou mL/m3 de local, débit mesuré de l’appareil ;
— supports : nature et disposition dans le local (distance de l’appareil, orientation) ;
— durée d’exposition depuis l’instant de la fin de diffusion au retrait du local.
Joindre un schéma d‘essai à l’échelle pour chaque manipulation effectuée.
Observations
— nature des supports ;
— distance entre l’appareil et les supports ;
— temps d’émission du produit dispersé (si mesurable) ;
— temps d’action (si mesurable) ;
— quantité moyenne de produit dispersé fixé par support ;
— vitesse d’évaporation (si mesurable).
NOTE 2 Séparer les conditions obtenues avec les 2 types de procédés de dispersion : sans pression et avec pression.

Conclusions
— Faire apparaitre la mention « conforme » ou « non conforme » pour chaque catégorie de micro-organisme
ainsi que les réductions logarithmiques obtenues pour chaque germe.
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— 45 — NF T 72-281

Tableau 1 — RÉSULTATS : exemple pour un procédé automatique


À rajouter données brutes N1, N2, n1,n2, n’1, n’2, T

N Validation de l’essai Essais :


Titre T réductions d
Souche
suspension Témoins en log
n1/N1 n2/N2 n3/N1
Initiale Distance =

voir interprétation
NORME n1  0,5 N1 n2  0,5 N2 n3  0,5 N1
(5.7)

5.107 à 5.109
P. aeruginosa  1.106 par support d1
UFC/mL

5.107 à 2.109
BACTÉRIES

S. aureus  1.106 par support d2


UFC/mL

5.107 à 2.109
E. coli  1.106 par support d3
UFC/mL

5.107 à 2.109
E. hirae  1.106 par support d4
UFC/mL
SPORES

B. subtilis 2.105 à 5.105


 1.104 par support d5
(spores) UFC/mL

2.107 à 1.108
ET MOISISSURES

C. albicans  1.105 par support d6


UFC/mL
LEVURES

5.106 à 1.107
A. brasiliensis  1.105 par support d7
UFC/mL

1.107 à 1.109
Adenovirus  1.105 par support d8
UFC/mL
VIRUS

1.107 à 1.109
Norovirus  1.105 par support d9
UFC/mL

1.107 à 1.109
Enterovirus  1.105 par support d10
UFC/mL

8.108 à 3.109
BACTÉRIOPHAGES

P001  1.105 par support d11


UFP/mL

8.108 à 3.109
P008  1.105 par support d12
UFP/mL
MYCOBACTÉRIES

Mycobacterium 1.107 à 1.108


 1.105 par support d13
avium UFC/mL

Mycobacterium 1.107 à 1.108


 1.105 par support d14
terrae UFC/mL
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Annexe A
(normative)
Préparation des suspensions stocks
de spores de Bacillus subtilis
Init numérotation des tableaux d’annexe [A]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [A]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [A]!!!

A.1 Matériel et réactifs : ceux définis en 5.2 et les suivants


A.1.1 Bouillon (TGB)
Pour la préparation de l’inoculum de Bacillus subtilis :
extrait de levure ................................................... 2,5 g
tryptone ............................................................... 5,0 g
glucose ................................................................ 1,0 g
eau qsp ........................................................ 1 000 mL
Répartir dans des tubes à essais à raison de 10 mL par tube. Stériliser par autoclavage. À l’issue de la stérilisation,
le pH du milieu doit être équivalent à 7,2  0,2 pour une mesure à 20 °C.

A.1.2 Gélose (MYA)


Pour la préparation des spores de Bacillus subtilis :
extrait de viande ................................................ 10,0 g
extrait de levure ................................................... 2,0 g
MnSO4,H2O ....................................................... 0,04 g
Gélose ............................................................... 15,0 g
eau qsp ........................................................ 1 000 mL
Répartir dans des fioles de Roux. Stériliser par autoclavage. À l’issue de la stérilisation, le pH du milieu doit être
équivalent à 7,0  0,2 pour une mesure à 20 °C.
Préparation des suspensions stock de spores de Bacillus subtilis
Ensemencer le milieu de TGB (voir A.1.1) avec environ 106 cellules d’un lot préalablement préparé.
Incuber à 30 °C afin d’obtenir une culture à croissance exponentielle (environ 24 h) contenant environ 107 cellules
par millilitre. Transvaser 2 mL ou 3 mL de cette culture dans une fiole de Roux contenant le milieu gélosé MYA
(voir A.1.2) et incliner plusieurs fois la fiole de façon à mettre l’inoculum en contact avec la totalité de la surface
du milieu gélosé. Retirer l’inoculum en excès.
Incuber les fioles de Roux à (30  1) °C. Au bout du troisième jour d’incubation, observer l’état de la culture
au microscope, de préférence à contraste de phase. Si la sporulation n’a pas commencé, il vaut mieux
recommencer l’essai. Sinon, poursuivre l’incubation jusqu’à disparition des cellules végétatives (de 8 j à 10 j).
Récupérer les cultures et les placer en suspension dans l’eau.
Procéder à quatre opérations successives de lavage par centrifugation pendant 20 min dans de l’eau.
Transvaser la dernière suspension dans une fiole à vis et la chauffer pendant 10 min à (75  1) °C.
Titrer les spores sur le milieu gélosé GGL après dilution appropriée dans l’eau, incuber pendant 72 h
à (30  1) °C.
Conserver la suspension stock de spores à (5  1) °C ou congelée.
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— 47 — NF T 72-281

Annexe B
(normative)
Distances appareil de désinfection –
porte-germes à mettre en œuvre

Init numérotation des tableaux d’annexe [B]!!!


Init numérotation des figures d’annexe [B]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [B]!!!

Ces valeurs s’appliquent avec une marge de tolérance de  10 %.

Tableau B.1

Conditions obligatoires

Volume du local d’essais Distance d’appareil de désinfection –


porte-germes à appliquer
(par paliers de 10 m3)
(m)

[30 – 40 m3 [ 2,6 m

[40 – 50 m3[ 3,0 m

[50 – 60 m3[ 3,3 m


3[
[60 – 70 m 3,6 m

[70 – 80 m3[ 3,9 m

[80 – 90 m3[ 4,1 m

[90 – 100 m3[ 4,4 m

[100 – 110 m3[ 4,6 m

[110 – 120 m3[ 4,8 m

[120 – 130 m3[ 5,0 m

[130 – 140 m3[ 5,2 m

[140 – 150 m3[ 5,4 m

Conditions obligatoires complémentaires – Volumes inférieurs à 30 m3

Volume du local d’essais Distance d’appareil de désinfection –


3) porte-germes à appliquer
(par paliers de 10 m

[10 – 20 m3[ 2,0 m

[20 – 30 m3[ 2,3 m

Conditions obligatoires complémentaires – Volumes > 150 m3

Volume du local d’essais Distance d’appareil de désinfection –


porte-germes à appliquer

 au 2/3 de la diagonale
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Annexe C
(normative)
Schémas d’essais
Init numérotation des tableaux d’annexe [C]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [C]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [C]!!!
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— 49 — NF T 72-281
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— 51 — NF T 72-281

Comparer n1 et n3 à N1 et n2 à N2
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Annexe D
(normative)
Tableau récapitulatif des conditions de test
et objectifs en fonction des revendications d’activité
Init numérotation des tableaux d’annexe [D]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [D]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [D]!!!

Tableau D.1

Micro-organismes d’essai et objectifs d’efficacité

Conditions obligatoires : Titre témoin minimal (log10) / Objectifs de réduction logarithmique (log10)

Santé humaine Vétérinaire Agro.,industrie,


collectivités
P. aeruginosa 6/5 6/5 6/5

S. aureus 6/5 6/5 6/5


Bactéries
E. coli 6/5 6/5 6/5

E. hirae 6/5 6/5 6/5

Spores B. subtilis 4/3 4/3 4/3

Levures et C. albicans 5/4 5/4 5/4


moisissures A. brasiliensis 5/4 5/4 5/4

Bovine Enterovirus NA 5/4 NA

Virus Murine Norovirus 5/4 NA 5/4

Adenovirus type 5 5/4 NA NA

P001 NA NA 5/4
Bactériophages
P008 NA NA 5/4

Mycobacterium avium NA 5/4 NA


Mycobactéries
Mycobacterium terrae 5/4 NA 5/4

Conditions additionnelles pour les trois domaines : Titre témoin minimal (log10) / Objectifs de réduction logarithmique (log10)
selon le microorganisme éventuel.
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— 53 — NF T 72-281

Substances interférentes

Conditions obligatoires :

Santé humaine Vétérinaire Agro., industrie, collectivités


Conditions de propreté : Lait 1/20ème, Conditions de saleté de bas niveau : Conditions de propreté :
sauf virus : BSA à 0,3 g/L. BSA à 3 g/L. Lait 1/20ème, sauf virus :
BSA à 0,3 g /L
Possibilité de lait 1/5ème pour les germes Possibilité pour germe fragile dont
fragiles dont Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa : Possibilité de lait 1/5ème
— d'utiliser le lait au 1/20ème en plus pour les germes fragiles dont
de la BSA à 3 g/L Pseudomonas aeruginosa

— d'augmenter le titre jusqu'à 5.109


Conditions Additionnelles

Santé humaine Vétérinaire Agro., industrie, collectivités


Conditions de saleté : BSA à 3 g/L Conditions de saleté de niveau élevé : Conditions de saleté : BSA à 3 g/L
+ 3 mg/L Erythrocytes BSA à 10 g/L + 10 g/L extraits de levures
Volume de l’inoculum

50 L — diluant : eau distillée

Type de support

Conditions obligatoires : disque inox de 3 cm à 4 cm de diamètre


Conditions additionnelles : Tout support non poreux, décrit en détail au procès-verbal d’essai
Santé humaine Vétérinaire Agro., industrie, collectivités
Tout support non poreux Tout support non poreux Tout support non poreux

Étalement

Étalement circulaire sur 3 cm2 (2 cm de diamètre) de façon à obtenir une répartition uniforme de l’inoculum et de la surface
interférente

Méthode de séchage
120 min au maximum à température maximale de (37  1) °C sous PSM, en étuve ventilée ou non
Conditions d’essais

Procédés non dirigés Procédés dirigés

Conditions obligatoires : Conditions obligatoires :


— Chaque couple Temps de contact / concentration — T °C et Humidité relative au début de l’essai
revendiqués par le fabricant devra être testée = (20  2) °C / 40 % à 80 %
— Volume : 30 m3 à 150 m3 — Procédés dirigés sans pression : trois supports/souche
— T °C et Humidité relative au début de l’essai (20  2) °C / horizontaux, inoculum face au système de diffusion à
40 % à 80 % une distance d’au moins 20 cm. Préciser tous les
paramètres pouvant influencer l’efficacité du procédé.
— Répartir les trois supports/souche à hauteur 1 m  hauteur  Tout ruissellement est proscrit
1,5 m et distance définie en Annexe B
— Procédés dirigés avec pression : Idem ci-dessus avec
— Inoculum orienté vers la direction opposée à la source supports verticaux à une distance à déterminer par le
— Cas particulier des UV : voir Annexe E fabricant. Évaluer l’effet mécanique et l’inactivation
effective
Conditions obligatoires complémentaires
Conditions additionnelles :
— Volume  30 m3 et  à 150 m3
— Selon besoin
— Température 15 °C à 25 °C en début d’essai
— Humidité  40 % et  80 %
Conditions additionnelles :
— Selon besoin
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NF T 72-281 — 54 —

Annexe E
(informative)
Méthodologie spécifique liée à l'évaluation
de l'efficacité antimicrobienne des procédés
de désinfection par rayonnement Ultra-violet non-dirigés

Init numérotation des tableaux d’annexe [E]!!!


Init numérotation des figures d’annexe [E]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [E]!!!

E.1 Généralités
La méthode décrite dans cette annexe concerne spécifiquement l’évaluation de l'efficacité antimicrobienne des
procédés de désinfection par rayonnement Ultra-Violet non-dirigés selon le présent document.
Les procédés de rayonnement par Ultra-violets sont caractérisés, entre autres, par l’intensité la longueur d’onde
du rayonnement, leur intensité exprimé en Watt/cm2, et la dose d’exposition (intensité  Temps) couramment
exprimée en mJ/cm2.
L'efficacité des procédés de désinfection par rayonnement Ultra-Violet dépend de la distance entre les supports
et la source émettrice. Elle est également influencée par la présence d’obstacle pouvant générer des zones
d’ombre. La nature des surfaces rencontrées peut conduire à la réflexion des rayonnements UV vers des surfaces
non directement exposées à la source de rayonnements Ultra-violets.
Afin d’établir une évaluation représentative de la réalité, les supports de test seront donc positionnés dans une
zone d’ombre face à un mur dont les propriétés réfléchissantes comme indiqué à l’Article 3 de cette annexe.
Bien que l’efficacité des procédés de décontamination par rayonnement UV soit dépendante des conditions
d’utilisation, des conditions de tests spécifiques sont définies pour vérifier la conformité aux exigences de
performance de ce document. Si les conditions d’utilisation préconisées par le fabricant diffèrent des conditions
d’essais décrites dans la présente annexe, le fabricant doit réaliser des essais complémentaires pour démontrer
la conformité aux exigences du présent document dans les conditions d’utilisation préconisées (conditions
complémentaires obligatoires). L’efficacité de désinfection des systèmes de décontamination par UV devra
cependant être toujours démontrée selon les conditions obligatoires conformément aux tests décrits ci-après.

E.2 Méthode d'évaluation


La salle d'essai doit être définie, pour son humidité, sa température et ses dimensions, conformément aux
indications fournies par le présent document (5.5.1.1 et 5.5.1.4.2.1).
a) Nature des surfaces de la salle
Une attention particulière sera portée aux propriétés réfléchissantes du mur faisant face aux supports de test
(voir Figure E.1).
Ce dernier doit être recouvert d’une peinture blanche brillante (couleur RVB R = 100 %, V = 100 %, B = 100 % ;
MJN = 0,0,0,0 ; NCS 0300-N) avec une finition mat.
NOTE 1 Si aucun mur ne présente les caractéristiques décrites ci-dessus, un panneau amovible ajusté aux dimensions
du mur et respectant les modalités prescrites pourra être utilisé.

Le reste de la pièce ne doit pas être constitué de matériaux réfléchissants aux UV (miroirs, surfaces métalliques,
etc.) ou fortement absorbants (verre, bois, etc.).
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— 55 — NF T 72-281

b) Positionnement des supports


La distance d entre la source de rayonnement et les supports de tests dépend du volume de la pièce et doit
respecter l’Annexe B du présent document.
Les supports seront préparés comme indiqués en 5.5.1.2.1 et positionnés verticalement, avec l’inoculum orienté
à l’opposé du procédé UV, comme indiqués pour les dispositifs à dispersion non dirigée (5.5.1.1 e)).
Afin de matérialiser les obstacles (zone d’ombre) pouvant se trouver dans une salle lors de sa décontamination,
un panneau non translucide et non poreux (acier inoxydable, PEHD, etc.) de dimensions 0,5 m  0,5 m sera placé
à 1 m du sol, à proximité des supports de test entre ces derniers et la source (voir Figure E.1)
NOTE 2 Les supports peuvent être directement fixés sur le panneau.

La distance entre les supports et le mur peint (E.2.a)) doit être de 0,5 m et ininterrompue.

Figure E.1 — Exemple de positionnement dans une salle de test (30 m3 à 150 m3)
lors d’une désinfection par procédés aux UV

E.3 Interprétation des résultats


E.3.1 En fin de désinfection les supports sont récupérés et traités comme indiqués en 5.5.1.2.2, 5.5.1.3.2-4
et 5.5.1.4.3.
E.3.1 Les règles de calcul sont celles mentionnées en 5.6 du présent document.
E.3.2 Les exigences de performances sont celles définies dans le 5.7 du présent document.
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NF T 72-281 — 56 —

Annexe F
(normative)
Mode opératoire pour l’évaluation
de l’activité mycobactéricide
Init numérotation des tableaux d’annexe [F]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [F]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [F]!!!
Init numérotation des tableaux d’annexe [G]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [G]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [G]!!!
Init numérotation des tableaux d’annexe [H]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [H]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [H]!!!

F.1 Matériels et réactifs


F.1.1 Micro-organismes d’essai
L’activité mycobactéricide dans les domaines médical et industriel doit être évaluée en utilisant la souche
suivante : Mycobacterium terrae ATCC 15755.
L’activité mycocobactéricide dans le domaine vétérinaire doit être évaluée en utilisant la souche suivante :
Mycobacterium avium ATCC 15769 = IP1 05415.

F.1.2 Milieux de culture et réactifs


F.1.2.1 Milieu Middlebrook et Cohn 7H10 + 10 % complexe dextrose-albumine, acide oléique (OADC)
(désigné par 7H10 dans le texte)
Pour réaliser les dénombrements de mycobactéries viables :
— gélose Middlebrook 7H10 : 19 g ;
— glycerol : 5 mL ;
— eau (voir 5.2.2.1.2) qsp 895 mL
Faire chauffer jusqu’à ébullition pour obtenir une dissolution totale. Stériliser dans l'autoclave pendant 10 min
à 121 °C et laisser refroidir à une température de 50 °C à 55 °C dans un bain d’eau.
Ajouter 100 mL du milieu d’enrichissement Middlebrook OADC dans des conditions aseptiques. pH final = 6,6 °C
à 25 °C.

F.1.3 Appareil
F.1.3.1 Homogénéisateur à haute vitesse, par exemple homogénéisateur POTTER

F.2 Préparation et dénombrement de la suspension mycobactérienne d'essai en


présence de substances interférentes
F.2.1 Suspension mycobactérienne d'essai
F.2.1.1 Conservation du microorganisme d’essai
Le microorganisme d’essai et leurs cultures mères doivent être préparés et conservés conformément aux
prescriptions de la NF EN 12353.
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F.2.1.2 Culture de travail du microorganisme d’essai


Afin de préparer une culture de travail du microorganisme d’essai, préparer une première subculture à partir de
la culture mère (F 2.1.1) :
Ensemencer en stries au moins deux boîtes de milieu 7H10 (voir F1.2.1) puis les incuber dans un incubateur
à (36  1) °C, (afin d’éviter le dessèchement des boîtes utiliser un incubateur à CO2 ou placer les boites dans des
sachets en polyéthylène ou scellées avec du ruban isolant pour empêcher le séchage du milieu puis incuber dans
une étuve à (36  1) °C.
Après 21 j, préparer de la même manière une deuxième subculture à partir de la première et l’incuber
pendant 21 j.
La première et/ou la deuxième subculture(s) constitue(nt) la ou les cultures de travail. Ne jamais réaliser ni utiliser
de troisième subculture.
Dans le cas de souches d'essai additionnelles, tout écart par rapport à cette méthode de culture des
mycobactéries ou dans la préparation des suspensions doit être noté dans le rapport d’essai en indiquant les
raisons qui ont justifié cet écart.

F.2.1.3 Préparation des suspensions mycobactériennes d'essai en présence de matière interférente


a) Préparer une suspension homogène adaptée à partir de la culture de travail (F 2.1.2) par homogénéisation
à l'aide de billes de verre : à l'aide d'une anse en plastique , transférer les micro-organismes d'essai d'au moins
deux boîtes de la culture de travail (F2.1.2) dans un tube à bouchon à vis et à base conique contenant 6 g à 7 g
de billes de verre (5.3.2.11). Les micro-organismes d’essai ainsi que 2 mL d'eau (5.2.2.1.2) sont homogénéisés
par mélange (5.3.2.6) pendant au moins 5 min pour les répartir de manière homogène sur les billes et sur
la plupart des parties de la surface interne du tube à bouchon à vis (5.3.2.22). Ajouter 10 mL d'eau (5.2.2.1.2)
goutte-à-goutte et les remettre en suspension en les mélangeant (5.3.2.6). Après une sédimentation
de 20 min, le surnageant est transféré dans un tube ;
ou
homogénéisation avec l’appareil de type Potter (F1.3.1) : à l'aide d'une pipette, transférer 5,0 mL d'eau
(5.2.2.1.2) sur chacune des boîtes (au moins deux) de la culture de travail (F 2.1.2.) et récupérer les
micro-organismes d’essai à l'aide d'une spatule en verre. À l'aide d'une pipette, introduire l'intégralité du liquide
des boîtes dans un tube de centrifugation de 25 mL. Compléter jusqu'à 18 mL d'eau (5.2.2.1.2).
Effectuer trois lavages consécutifs avec de l'eau (5.2.2.1.2), (centrifuger à chaque fois à environ 2 000 gN
pendant 15 min). Après chaque centrifugation, éliminer le surnageant, remettre en suspension en
mélangeant et remplir d'eau jusqu'au volume d'origine.
Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant et transférer les sédiments dans un récipient en
verre de 15 mL de l'appareil Potter (F1.3.1). Remplir d'eau jusqu'à 15 mL (5.2.2.1.2). Mélanger, refroidir avec de
la glace et homogénéiser pendant 15 min.
Après une sédimentation de 20 min durant laquelle il convient d'avoir suffisamment de glace pour permettre
le refroidissement, le surnageant est transféré dans un tube.
Remarque : D’autres méthodes d’homogénéisation sont autorisées à condition que le nombre d'unités
formant colonie par millilitre obtenu soit approprié et stable pour la durée de l’essai et qu’un examen
microscopique démontre que la suspension est aussi homogène qu'après les deux méthodes décrites
ci-dessus.

b) Ajouter au surnageant, les substances interférentes pour les désinfectants utilisés dans les trois domaines
d’activité.
Neuf volumes de surnageant mélangés à un volume de substance interférente.
Ajuster le nombre de cellules de la suspension d’essai à l’aide de diluant (5.2.2.1.5), Le nombre de cellules
peut être estimé au moyen d’un spectrophotomètre ou d’un néphélémètre.
Le titre final de la suspension d’essai doit être compris entre 1,0  107 UFC/mL et 1,0  108 UFC/mL.
Conserver cette suspension d’essai dans le bain d’eau à (20  1) °C et utiliser la préparation dans la
journée.
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F.2.2 Dénombrement et incubation de la suspension d’essai en présence de matières


interférentes
a) Pour le dénombrement de la suspension d’essai réalisé en parallèle en surface (N1) et par filtration (N2)
Préparer des dilutions à 10 -5 et à 10-6 de la suspension d’essai à l’aide de diluant (5.2.2.1.5). Mélanger (5.3.2.6).
En surface :
Prélever un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution en double. Diviser chaque échantillon en deux portions
de taille approximativement égale et les répartir sur des boîtes séchées contenant 18 mL à 20 mL de milieu
7H10 en surface (F1.2.1), c'est-à-dire au total quatre boîtes par 1,0 mL en double.
Par filtration :
Prélever un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution en double et transférer deux portions de taille
approximativement égale de chaque échantillon dans un appareil de filtration sur membrane (5.3.2.7).
Filtrer et rincer avec 50 mL d’eau de rinçage (5.2.2.1.8).
Déposer chaque membrane (quatre au total) à la surface de boites contenant 18 mL à 20 mL de gélose 7H10
(F1.2.1).

b) Incubation
Incuber les boîtes pendant 21 j à (36  1) °C (F.2.1.2). Écarter toutes les boîtes sur lesquelles il n'est pas possible
de compter les colonies. Compter les boîtes afin de déterminer le nombre d'unités formant colonie (UFC) sur
chaque boîte.
Incuber les boîtes pendant 7 j supplémentaires. Ne pas recompter celles où les colonies ne se présentent plus de
façon bien séparée. Recompter les boîtes restantes. Si le nombre a augmenté, ne retenir que le nombre le plus
élevé pour les calculs ultérieurs.
Pour chaque boîte, noter le nombre exact de colonies :
Sur gélose : noter  330 chaque fois que le nombre est supérieur à 330.
Si une valeur de est inférieure à 14, consigner le nombre (mais remplacer par «  14 » pour les calculs ultérieurs).
Sur membranes : Noter  165, chaque fois que le nombre est supérieur à 330.
Si une valeur de est inférieure à 14, consigner le nombre (mais remplacer par « < 14 » pour les calculs ultérieurs).
Calculer le nombre d’UFC/mL dans la suspension d’essai N1 et N2 au moyen de la méthode indiquée à l’Article
6 du présent document.

F.3 Mode opératoire pour évaluer l’activité mycobactéricide du procédé


F.3.1 Témoins de survie des germes sur support
À réaliser en même temps que l’essai.

F.3.1.1 Contamination artificielle et séchage des supports


Ensemencer deux supports stérilisés placés dans des boîtes de Petri par dépôt de 0,05 mL = 50 L de la
suspension d’essai (F.2.1.3 b)).
Étaler la microgoutte puis séchage (5.5.1.2.1).
Après séchage les supports sont conservés dans la boîte de Petri pendant le temps de contact de l’essai dans
des conditions de température et d’humidité proches de celle de l’essai.
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— 59 — NF T 72-281

F.3.1.2 Dénombrement des micro-organismes sur les supports


À l’expiration du temps de contact de l’essai, transférer chaque support dans 100 mL de liquide de récupération
(5.2.2.1.8).
Agiter manuellement pendant quelques secondes et à l’aide d’un agitateur en verre stérile gratter chaque surface
du support pour décrocher les restes de suspensions séchées.
Après une dernière agitation rapide, diluer 1 mL de la solution dans 9 mL de diluant (5.2.2.1.5) et continuer les
dilutions en série jusqu’à la dilution 10-3.
Prélever deux fois 1mL des dilutions 10-2 et 10-3 selon la technique d’un dénombrement en surface (F.2.2 a))
Incubation des géloses 7 H10 selon le F.2.2 b).

F.3.2 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel


F.3.2.1 Récupération des résidus de désinfectant à la surface des supports et recherche de leur éventuel
effet antimicrobien
Contamination des supports
Ensemencer deux supports stérilisés placés dans des boîtes de Petri par dépôt de 0,05 mL = 50 L de diluant
contenant la substance interférente reconstitué à la concentration finale dans l’essai (5.2.2.4.1.2).
Neuf volumes de diluant mélangés à un volume de substance interférente.
Étaler la microgoutte puis séchage.
Mise en contact des supports avec le produit à tester
Exposer les supports au produit pendant le même temps de contact que lors de l’essai pour obtenir une fixation
identique de désinfectant sur le support.
Récupération du désinfectant déposé sur support
À l’expiration du temps de contact, transférer les supports dans 100 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8)
afin de remettre en suspension le désinfectant fixé sur le support.
Soit S la solution de recueil.

F.3.2.2 Recherche d’un effet inhibiteur en gélose noté n1


Prélever 1 mL de la solution de recueil S, diviser en deux portions de taille approximativement égale et inoculer
les boîtes de gélose 7H10 (F.1.2.1). Laisser sécher, puis déposer sur ces mêmes géloses en surface 1 mL de la
dilution 10-5 ou 10-6 divisé en portions de taille égale en utilisant la technique de dénombrement en surface
(F.2.2 a)).
Pour l’incubation et le dénombrement, voir F.2.2 b).
Comparer le nombre n1 de colonies obtenu avec le dénombrement de la suspension d’essai N1.

F.3.2.3 Recherche d’un effet inhibiteur sur membrane filtrante noté n2


Filtrer 98 mL de solution S sur membrane et rincer avec trois fois 50 mL de liquide
Recouvrir la membrane avec 50 mL de liquide de rinçage et ajouter 1 mL de la dilution 10-5 ou dilution 10-6,
filtrer et transférer la membrane sur géloses 7H10 (voir F.1.2.1).
Pour l’incubation et le dénombrement, voir F.2.2 b) et noter n2 la moyenne des deux essais.
Comparer à N2 le nombre de colonies obtenu.
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F.3.2.4 Recherche d’un effet inhibiteur du au support dans le milieu gélosé noté n3
Dans une boite de Petri contenant 18 Ml à 20 mL de gélose 7H10 solidifiée (F1.2.1), déposer le support exposé
au produit.
Déposer 1 mL de la dilution 10-5 ou 10-6 sur la surface de la gélose (F.2.2 a)).
Comparer à N1 le nombre de colonies obtenues.

F.3.3 Essai proprement dit


F.3.3.1 Contamination des supports
Procéder comme en F 3.1.1 et préparer trois supports.

F.3.3.2 Mise en contact des supports avec le produit à tester

F.3.3.3 Dénombrement des micro-organismes sur les supports


À l’expiration du temps de contact pour dispersat dirigé ou lorsqu’il est retiré du local d’essai, transférer chaque
support dans 100 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8).
Agiter manuellement pendant quelques secondes et à l’aide d’un agitateur en verre stérile, gratter chaque surface
du support pour décrocher les restes de suspensions séchées.
Après une dernière agitation rapide, diluer 1 mL de la solution dans 9 mL de diluant (5.2.2.1.5) et continuer les
dilutions en série jusqu’à la dilution 10-3.
Transférer deux fois 1 mL de liquide de récupération pur et/ou les dilutions 10-1, 10-2 et 10-3 selon la technique de
dénombrement en surface (F.2.2 a)).
Incubation des géloses 7H10 (F1.2.1), voir F.2.2 b).
Filtrer les 97 mL du liquide de récupération. Verser d’une part 10 mL du liquide de récupération dans un appareil
de filtration puis séparément dans un autre appareil de filtration les 87 mL de liquide restant. Laver trois fois
avec 50 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8) qui aura été versé au préalable et agité dans la fiole conique
avec le support (pour les 87 mL).
Pour le dénombrement par filtration et incubation voir F.2.2 b).
Prélever le support aseptiquement et le déposer dans la boîte de Petri contenant 18 mL à 20 mL de gélose 7H10
solidifiée (F.1.2.1).
Soit n’1 le nombre moyen de colonies viables retrouvées dans les 100 mL de liquide de récupération et n’2 le
nombre moyen de colonies viables retrouvées sur supports.

F.4 Calculs et interprétation des résultats


F.4.1 Calculs : voir Article 6 du présent document

F.4.2 Interprétation des résultats


Test validé si :
— Le titre de la suspension de Mycobacterium avium ATCC15769 est compris entre 1,0  107 UFC/mL
et 1,0  108 UFC/mL ;
— Le titre de la suspension de Mycobacterium terrae ATCC15755 est compris entre 1,0  107 UFC/mL
et 1,0  108 UFC/mL ;
— Titre minimal du témoin sur support > à 5 log 10.
Pour Essais préliminaires : n1, n3  0,5 N1 et n2  0,5 N2
— La réduction du titre est d’au moins 4 log 10.
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— 61 — NF T 72-281

Bibliographie

[1] NF EN 1040, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation
de l'activité bactéricide de base des antiseptiques et des désinfectants chimiques — Méthode d'essai et
prescriptions (phase 1) (indice de classement : T 72-152)
[2] NF EN 1650+A1, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour
l'évaluation de l'activité fongicide ou levuricide des antiseptiques et des désinfectants chimiques utilisés dans
le domaine de l'agro-alimentaire, dans l'industrie, dans les domaines domestiques et en collectivité —
Méthode d'essai et prescriptions (phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-203)
[3] NF EN 10088-1, Aciers inoxydables — Partie 1 : Liste des aciers inoxydables (indice de classement :
A 35-572-1)
[4] NF EN 10088-2, Aciers inoxydables — Partie 2 : Conditions techniques de livraison des tôles et bandes
en acier de résistance à la corrosion pour usage général (indice de classement : A 35-572-2)
[5] NF EN 14204, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation
de l'activité mycobactéricide des antiseptiques et des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine
vétérinaire — Méthode d'essai et prescriptions (Phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-802)
[6] NF EN 14563, Désinfectants et antiseptiques chimiques — Essai quantitatif de porte-germe pour l'évaluation
de l'activité mycobactéricide ou tuberculocide des désinfectants chimiques utilisés pour instruments en
médecine humaine — Méthode d'essai et prescriptions (phase 2, étape 2) (indice de classement : T 72-246)
[7] ISO 4793, Filtres frittés de laboratoire — Échelle de porosité — Classification et désignation