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Mini projet
Thème : Identification de la population microbienne
métallo-tolérante de l’ancienne mine de fer de Sidi
maarouf –Jijel- par analyse méta génomique
Binôme :
1) Nom : Gouder Prénom : Yamina
2) Nom : Kismoune Prénom : Meriem
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MINI PROJET : IDENTIFICATION DE LA POPULATION MICROBIENNE METALLO-TOLÉRANTE DE
L’ANCIENNE MINE DE FER DE SIDI MAAROUF –JIJEL- PAR ANALYSE MÉTAGÉNOMIQUE
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Conclusion :..........................................................................................................................................28
Références :..........................................................................................................................................29
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Remerciement
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//fr.wikipedia.org/wiki/Parc_national_de_Yellowstone……………………………………………………………………10
Figure5 : [39a] > Martin Fisk, Microbes in oceanic basalt, Oregon State Univ.
//oceanexplorer.noaa.gov/explorations/02alaska/background/microbes/microbes.html
Figure 6 : Kathy Sheelan, David Patterson et al., L'algue rouge cyanidium, Nymph Creek, Parc
Lemonade du Yellowstone National Park, Montana State Univ., Wyoming, 2001. et La bactérie
Beggiatoa sur les sédiments du site marin Eel Pond, Woods Hole, Massachusetts, 2001.
//serc.carleton.edu/microbelife/extreme/acidic/index.html ……………………………………………………………13
figure10 : Michael Daly, ITEM image de Deinococcus radiodurans, USUHS, Bethesda, Maryland, USA.
http://www.usuhs.mil/pat/deinococcus/index_20.htm........................................................................15
Figure 11 : Ederer M.M. (2011). Metagenomics: methods, applications and challenges. In: Li
R.W. (ed.) Metagenomics and its Applications in Agriculture, Biomedicine, and
Environmental Studies.Nova. Sci. Inc. New York, USA……………………………………..25
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Introduction :
Les formes de vie sur Terre sont innombrables, comme les environnements qui les abritent.
Jusqu’au 20ème siècle, on pensait que la vie n’était possible que dans un environnement
«normal», c’est-à-dire là où les conditions sont compatibles avec la vie de l’homme. Puis, les
chercheurs ont commencé à découvrir des organismes qui survivent dans des conditions hors
de ces normes, dans des milieux caractérisés par des conditions physiques et/ou chimiques
extrêmes [1].
Ces êtres exceptionnels qui défient les lois de la biologie et créent la vie ou l’homme n’osait
l’imaginer sont qualifiées d’extrêmophiles [2] et ils ne sont pas seulement tolérants a ces
condition extrêmes mais celles-ci sont requises pour leur croissance et développement [3]. Il
existe des extrêmophiles qui prospèrent dans des biotopes combinant plusieurs conditions
extrêmes, ils sont baptisés polyextrêmophiles ce qualificatif englobe la résistance à des
conditions physiques (par exemple la température, la pression, les radiations) et géochimiques
(par exemple la dessiccation, la salinité, le pH) [4].
Selon les conditions extrêmes auxquelles les microorganismes extrêmophiles sont confrontés,
ils peuvent être thermophiles, psychrophiles, alcalophiles, acidophiles, piézophiles, halophiles
ou halotolérants… [5].
L’existence de la vie dans les écosystèmes extrêmes a conduit à s’interroger sur les stratégies
et les mécanismes cellulaires, moléculaires et génétiques mis en jeu pas ces microorganismes
atypiques pour se maintenir dans de tels milieux, et la mise en évidence d’une extraordinaire
biodiversité de ces formes de vie montre.
Les capacités étonnantes d’adaptation des microorganismes extrêmophiles au stress physico-
chimique offrent des perspectives en termes d’application biotechnologiques et conduit
également à s’interroger sur leur capacité de produire de nouvelles substances exceptionnelles
[5].
L’objectif de ce présent travail est de mettre en évidence l’étude du mode de vie extrêmophile
des bactéries métallo-résistantes dans les anciennes mines de Fer et l’application des
méthodes méta génomiques à leur découverte.
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devront être non seulement stables dans ces conditions, mais surtout, fonctionnels. La stabilité
de chacune des biomolécules prise isolément et testée dans les conditions du milieu extérieur
n’est toutefois pas toujours requise, du fait que le milieu intérieur peut bénéficier de l’effet de
certains solutés organiques ou d’une protection au sein de complexes macromoléculaires.
Nous n’illustrerons ici que certaines propriétés, et plus particulièrement la thermostabilité des
protéines et l’osmoadaptation.
3.1. Stabilité des constituants cellulaires
L’une des premières questions qui se pose pour les hyperthermophiles est celle de la stabilité
de leur matériel génétique. Comment est préservée l’intégralité du message génétique stockée
dans le chromosome et comment peuvent opérer la transcription et la traduction au-dessus de
100-110°C ? À ces températures, in vitro, l’ARN est dégradé et l’ADN linéaire et circulaire
est dénaturé (séparation des deux brins de la double hélice) puis dégradé. Les acides
nucléiques des hyperthermophiles sont formés à partir des mêmes nucléotides et possèdent
une structure identique à celle des mésophiles. Il a été démontré que des histones archéennes
ou des histones « like » augmentent la température de dénaturation de l’ADN, mais ne
préviennent pas la thermo dégradation. La stabilité des acides nucléiques à haute température
chez les hyperthermophiles résulte sans doute d’une interaction avec des protéines de liaisons
non spécifiques qui restent à découvrir. Il a également été démontré que la thermo dégradation
de l’ADN est réduite en présence de concentrations physiologiques de sels monovalents (50 à
500 mM de KCl ou NaCl) ou divalents (1 à 25 mM MgCl2). Les protéines et tout
particulièrement les enzymes des hyperthermophiles doivent être thermostables et fonctionner
dans les conditions de température rencontrées dans les sources thermales ou hydrothermales.
La thermostabilité d’une enzyme est corrélée à la température de croissance de l’organisme
source. Les recherches visant à trouver une loi générale qui permette de convertir une protéine
donnée en sa version thermostable, et réciproquement, ont échoué. Néanmoins, ces travaux
ont permis de caractériser les déterminants de la thermostabilité des protéines. À défaut de loi
générale, les mécanismes les plus fréquemment rencontrés font appel à : – une augmentation
des interactions de van der Waals ; – une hydrophobicité accrue ; – une extension du nombre
et de la taille des réseaux de liaisons hydrogène ; – une augmentation des interactions ioniques
; – une densité de compaction plus élevée ; – une diminution de longueur des boucles de
surface ; – une modification dans l’usage des codons avec un biais pour les codons AGR pour
l’arginine.
De plus, les travaux de protéomique comparée ont permis d’établir que la thermostabilité
d’une protéine est liée à une augmentation du nombre de résidus Glu (E) et Lys (K) combinée
à une réduction de résidus Gln (Q) et His (H). Un rapport (E + K)/ (Q + H) supérieur 4,5
signerait la présence d’un hyperthermophile. Le nombre de résidus chargés aurait un impact
sur la solubilité tandis que leur position serait importante pour la stabilité. Pour clore cette
liste, il semble que l’importance des ponts disulfures dans la stabilisation des protéines
thermostables d’archées ait été sous-estimée [10]. En bref, chaque protéine est le résultat
d’une évolution propre qui optimise son repliement et les interactions externes avec les
solvants par différents mécanismes [11]. Ces stratégies ne sont nécessairement utilisées toutes
simultanément pour conférer à une protéine une thermostabilité accrue. Elles semblent
correspondre à une « boîte à outils » dans laquelle l’évolution a puisé au fil du temps pour
répondre au besoin des extrêmophiles.
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3.2. Osmoadaptation
Tous les procaryotes ont dû développer des stratégies adaptatives leur permettant d’ajuster les
concentrations des solutés intracellulaires aux concentrations externes. Dans le cas des
halophiles, cette adaptation aux fortes concentrations du milieu extérieur implique
l’accumulation de solutés intracellulaires afin de contrer la pression osmotique qui autrement
conduirait à la déshydratation et à la mort. Deux stratégies principales ont été identifiées pour
équilibrer la pression osmotique extérieure : l’afflux de certains ions dans la cellule et
l’accumulation de solutés compatibles organiques de faible poids moléculaire. La première
stratégie semble être limitée à quelques genres d’archées halophiles extrêmes (Halobacterium,
Haloarcula, Haloquadratum, Halorhabdus, Natronobacterium, et Natronococcus) et de
bactéries halophiles extrêmes (Salinibacter). Le cation majoritairement accumulé est K+. De
nombreuses enzymes de ces espèces présentent un enrichissement en résidus acides et une
activité K+ dépendante. La seconde stratégie n’est pas limitée aux halophiles, mais les
propriétés remarquables de certains solutés organiques compatibles leur ont permis de
s’adapter aux conditions changeantes. Les solutés compatibles regroupent des molécules de
structures très diverses : acides aminés, sucres (tréhalose, sucrose), phosphodiesters, et
glycérates [12]. Phosphodiesters et glycérates sont des solutés chargés. Les autres sont neutres
ou zwittérioniques. Parmi les acides aminés et dérivés, seuls un petit nombre a un rôle de
soluté compatible : glutamine, glutamate, lysine (chez les méthanogènes), proline, glycine
bétaïne, ectoïne et hydroxyectoïne chez de nombreuses halophiles. Le tréhalose et le sucrose
sont des osmolytes très répandus depuis les bactéries et les archées jusqu’aux invertébrés. Ils
jouent également un rôle important chez certaines espèces halothermophiles. Les
phosphodiesters jouent le rôle de solutés compatibles plus spécialement chez les
hyperthermophiles. Le DIP (di-myo-inositol phosphate) est rencontré chez de nombreux
genres d’archées hyperthermophiles y compris chez Pyrolobus fumarii qui est l’espèce la plus
thermophile connue à ce jour. Les propriétés des solutés compatibles des extrêmophiles
suggèrent qu’il serait possible de les utiliser en biotechnologie pour protéger des
macromolécules ou des cellules soumises à des conditions de stress. Ces composés sont
regroupés sous l’appellation d’« extrêmolytes » [13].
3.3. Adaptation aux pH extrêmes
Le record de l’acidophilie est atteint par l’archée thermoacidophile Picrophilus torridus dont
l’optimum de croissance se situe à pH 0,7 et 65°C, capable de se diviser à pH 0 et dont le
milieu intracellulaire est à pH 4,6. Le séquençage du génome complet de P. torridus a permis
de rechercher les mécanismes d’adaptation à ce pH extrême. Elle est capable de produire des
enzymes extracellulaires, dégradant les polymères, résistantes aux conditions du milieu
extérieur. Elle offre ainsi l’opportunité d’analyser les spécificités d’enzymes thermostables
fonctionnelles en milieu acide. L’une des adaptations majeures de P. torridus tient à la
composition de sa paroi cellulaire. Elle présente une faible perméabilité aux protons (H+), une
grande stabilité aux acides et perd sa cohésion à pH 7 [14]. Elle comporte une couche-S
composée de protéines et une membrane monocouche possédant une structure originale à base
de lipides polaires de type caldarchaeol. Pour lutter contre les concentrations en protons
énormes du milieu extérieur, P. torridus possède des pompes à protons particulièrement
efficaces et limite les dépenses d’énergie en laissant pénétrer une quantité importante de
charges positives sous la forme d’ions potassium (K+). Les thermoacidophiles ont développé
des mécanismes de résistance aux métaux lourds qui sont physiologiquement toxiques pour la
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plupart des micro-organismes. Les données actuelles suggèrent que de multiples systèmes
fonctionnent en parallèle chez ces extrêmophiles [15]. À l’autre extrémité de l’échelle des pH,
les alcaliphiles possèdent des parois cellulaires qui permettent de limiter le pH du milieu
interne tout en assurant l’approvisionnement en énergie. Elles présentent l’intérêt de produire
des enzymes fonctionnelles à pH élevé, dont des lipases et des protéases très utilisées dans
l’industrie des détergents.
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Figure (5) : des micro-colonies de lichen dans une roche d'une vallée sèche de l'Antarctique
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Figure (6) : Lemonade Spring (YellowStone Park) tapis microbien de 1 cm à 42°C, formé par
une algue thermophile et acidophile (pH 2-3) : le cyanidium.
Exemple de microorganismes acidophiles :
Le microbe Ferroplasma acidarmanus : une archée qui se développe à pH ~0,5 et ~40°C à
Iron Mountain, Californie...et pourtant la membrane des cellules semble très fine.
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Conditions de vie :
Vertébrés : concentration en sel inférieure à 1,5M Halobactéries : de 1,5M à 3M
Haloarchées : de 3M à 5,2M.
Figure (9) : Grand lac salé, Utah ; lac Owens, Californie ; Lac rose, Sénégal ; Lac Asal,
Djibouti ; Mer morte.
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devrait être mentionné lorsque les organismes survivent à la présence de métaux à l'aide de
mécanismes de détoxification spécifiques induits en présence du contaminant [28].
De manière globale, les métaux exercent une pression sélective augmentant la tolérance de
base de certains microorganismes, mais diminuent la biodiversité des microorganismes
retrouvés dans ces sols en comparaison avec des sols non pollués [28]. La sensibilité des
microorganismes peut se traduire par une diminution de l'expression protéique alors qu'une
augmentation de l'expression protéique signifierait une tentative d'adaptation au nouveau
contaminant (expression d'un mécanisme de résistance) [28]. Chez les bactéries, les gènes
codant pour l'expression des protéines impliquées dans ces mécanismes sont principalement
plasmidiques, bien que quelques-uns soient chromosomiques [28]. L'origine plasmidique de
certains gènes peut résulter en une fréquence de transfert plus élevée de ces plasmides en
conditions de stress. Un tel exemple a été démontré chez Rhizobium leguminosarum bv.
viciae qui, en présence de métaux, transférait ses plasmides lui procurant sa résistance [28].
- De nombreuses bactéries sont désormais connues pour leur capacité à excréter les
métaux par des systèmes d’efflux. Ces types de transporteurs se caractérisent par une
forte affinité au substrat et permettent de maintenir de faibles concentrations
métalliques dans le cytosol [31, 32, 33]. L’un des exemples les plus connus est la
bactérie C. metallidurans CH34 qui a fait l’objet de nombreuses études. Trois grandes
familles de protéines responsables de l’efflux chez les microorganismes [33] ont été
décrites :
les protéines de la famille « resistance-nodulation-cell division » (RND) dont
la première découverte fut la protéine CzcCBA de la bactérie C .metallidurans
[34] chez laquelle le plasmide pMOL30 permet la résistance au cobalt, zinc et
cadmium (czc) via un mécanisme d’efflux. De même pour la protéine
permettant la résistance au cobalt et nickel (cnr) porté par le plasmide
pMOL28. L’efficacité de ce système serait due au fait que non seulement il
permet de diminuer la concentration cytoplasmique mais également la
concentration périplasmique. Dans ce cas les cations peuvent être excrétés
avant même leur entrée dans la cellule [33].
la famille « cation diffusion facilitators » (CDF) dont les substrats principaux
sont le zinc, cobalt, nickel, cadmium et le fer. Ces systèmes d’efflux sont
contrôlés par le gradient de concentration. Toutes les protéines CDF décrites
chez les bactéries sont impliquées dans la résistance au Zn. C’est le cas de la
protéine CzcD chez C. metallidurans CH34. Chez E. coli, la protéine ZitB a été
mise en évidence pour son implication dans la résistance au Zn (contrôlée par
le gradient de potassium et la « force motrice protonique»), l’expression de
cette protéine est induite par la présence de Zn. Les protéines de la famille
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Etude des caractères biochimiques : Les caractères biochimiques sont détectés par
diverses techniques commerciales (galeries API, systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…).
L’identification repose sur l’utilisation de galeries d’identification. Elles permettent
une identification rapide des bactéries [51].
Parmi l’ensemble de ces systèmes, la galerie API (analytical profile index) est
couramment utilisée. Elle se présente sous forme de cupules prêtes à l’emploi
contenant les substrats lyophilisés nécessaires aux différents tests biochimiques.
Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les
différentes alvéoles de la micro-galerie, les métabolites produits durant la période
d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par
addition de réactifs. Elles ont l’avantage de standardiser les caractères biochimiques
recherchés. Elles limitent la variabilité technique et permettent l’identification d’une
centaine de bacilles à Gram négatif [52].
1.4. Les limites de l’identification phénotypique
Les méthodes d'identification conventionnelles présentent des limites. Elles permettent de
différencier les espèces mais elles sont lentes, nécessitent suffisamment de cultures et un
certain nombre de variantes échappent à la classification car elles ne présentent pas tous les
caractères de l'espèce type. Certaines bactéries sont mal identifiées phénotypiquement pour
diverses raisons. En effet, certaines expriment peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres
espèces, une situation de stress peut avoir altéré ces caractères. Une identification basée
exclusivement sur le phénotype bactérien peut donc mener à un résultat erroné. Par ailleurs,
les bactéries rares ne sont pas répertoriées dans les bases de données des systèmes
commercialisés et en conséquence, les techniques d'identification conventionnelles ne
permettront pas de les identifier. Enfin, pour certaines bactéries à croissance difficile, les
caractères phénotypiques sont difficiles à déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce
cas l’identification [53].
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gènes codant pour des ARNr 16S connus [71, 72, 73]. Par contre, si nous s’intéressons cette
fois au potentiel métabolique d'un écosystème, nous allons s'efforcer d'analyser l'ensemble des
acides nucléiques de l'échantillon. L'ADN ou l'ADNc (ADN complémentaire obtenu par
rétrotranscription de l'ARN isolé) extrait peut être alors traité essentiellement de trois
manières différentes :
- Il peut être fragmenté aléatoirement, puis séquencé directement en utilisant des technologies
de séquençage à haut débit. Il faut noter que ce séquençage direct d'acides nucléiques après
extraction est de plus en plus privilégié à l'heure actuelle, étant donné qu'il permet de se
soustraire à toute étape de clonage. À noter cependant que la plupart des techniques de
séquençage à haut débit nécessitent la création d'une librairie de fragments d'ADN, néanmoins
ces derniers ne sont pas clonés, et il ne faut donc pas confondre ce type de librairie avec celui
mentionné dans le paragraphe suivant;
- Après fragmentation aléatoire, l'ADN peut également être cloné afin de constituer une
librairie de clones à petits ou larges inserts qui sera ensuite séquencée par la technique de
Sanger [74] ou par une technologie à haut débit; c'est ce que nous appelons le séquençage en
aveugle. Cette librairie peut ensuite être parcourue pour rechercher puis séquencer des clones
comportant un gène d'intérêt, ou bien séquencée en totalité pour permettre la reconstitution de
génomes complets [75];
- Troisièmement, l'ADN génomique extrait peut aussi être analysé par des biopuces de type
GeoChip 3.0 contenant un ensemble de sondes spécifiques à des marqueurs phylogénétiques
(Tel que gyrB) et à des gènes d'intérêts connus (appartenant à des cycles biogéochimiques par
exemple) [76,77].
Dans tous les cas, le volume conséquent de fragments séquencés (appelés " reads " en
anglais) lors d'une étude de métagénomique, fait en sorte que l'utilisation de la
bioinformatique est indispensable afin d'analyser ces derniers.
D'un point de vue général, toute étude faisant appel à la métagénomique doit s'orienter vers
l'une des approches suivantes [78] :
- La première est centrée sur le " génome " afin de déterminer les membres composant une
communauté bactérienne, avec le but ultime de tenter d'assembler leur génome complet;
- La seconde aspire quant à elle, à réaliser une analyse fonctionnelle de la communauté
échantillonnée afin de déceler son potentiel métabolique. Elle est donc basée cette fois-ci non
pas sur le " génome " mais sur le " gène ".
- La combinaison des deux approches citées précédemment est également envisageable.
Les études métagénomiques effectuées jusqu'à présent ont porté sur trois principaux types de
communautés microbiennes :
- Les communautés que l'on retrouve à l'état naturel (environnements tempérés ou extrêmes);
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2.3.3 Défis
Conceptuellement, une approche métagénomique semble plutôt simple; il suffit d'extraire,
puis de séquencer les acides nucléiques d'un échantillon environnemental, pour ensuite
analyser le tout afin de caractériser la communauté bactérienne de l'échantillon en question.
Mais en réalité, l'utilisation de la métagénomique amène certains défis et limites dont il faut
tenir compte lors de la conception de la méthodologie d'un projet et dans l'interprétation des
résultats obtenus. Les éventuels problèmes associés à une étude de métagénomique
peuvent être comme suit :
- Environnement analysé : Il faut toujours être conscient que l'échantillonnage d'un
environnement donné se fait en un point géographique bien particulier, et à un
moment précis dans le temps, et que par conséquent, la composition d'une
communauté peut varier grandement si l'un ou l'autre de ces paramètres change [79,
80].
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Conclusion :
Les organismes vivant en milieux extrêmes et en particulier, les microorganismes présentent
un répertoire de voies métaboliques et de biomolécules originales leur permettant non
seulement de survivre dans ces conditions, mais aussi de se développer souvent de manière
optimale. L’intérêt porté à ces microorganismes a abouti à la découverte d’une diversité
inouïe, complètement inattendue, dans des milieux supposés hostiles à la vie. Egalement, les
propriétés singulières de leurs biomolécules à savoir les enzymes ont très vite attiré l’attention
des biotechnologues.
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