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MINI PROJET : IDENTIFICATION DE LA POPULATION MICROBIENNE METALLO-TOLÉRANTE DE

L’ANCIENNE MINE DE FER DE ‫الشعبية‬


SIDI‫الديمقراطية‬
MAAROUF ‫الجزائرية‬
–JIJEL-‫الجمهورية‬
PAR ANALYSE MÉTAGÉNOMIQUE
République Algérienne Démocratique et Populaire
‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬
Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche

Ecole Nationale ‫ـ الوطـنـية‬


‫الـمـدرسـة‬

Supérieure de Biotechnologie ‫ـ فـي‬


‫الـعــلـيـا‬
‫البــيـوتـكـنـولــوجـيــا‬

___________________________________________

Mini projet
Thème : Identification de la population microbienne
métallo-tolérante de l’ancienne mine de fer de Sidi
maarouf –Jijel- par analyse méta génomique

Binôme :
1) Nom : Gouder Prénom : Yamina
2) Nom : Kismoune Prénom : Meriem

Enseignant référant : Année d’étude :


Mr K.Chekroud 4ème année

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MINI PROJET : IDENTIFICATION DE LA POPULATION MICROBIENNE METALLO-TOLÉRANTE DE
L’ANCIENNE MINE DE FER DE SIDI MAAROUF –JIJEL- PAR ANALYSE MÉTAGÉNOMIQUE

Table des matières


Remerciement........................................................................................................................................4
Table des figures :..................................................................................................................................5
Introduction :.........................................................................................................................................6
Chapitre I : Les milieux extrêmes et les extrêmophiles..........................................................................7
1. Qu’est-ce qu’un milieu extrême ?..............................................................................................7
2. Qu’est-ce qu’un extrêmophile ?.................................................................................................7
3. Propriétés des extrêmophiles.....................................................................................................7
3.1. Stabilité des constituants cellulaires...................................................................................8
3.2. Osmoadaptation.................................................................................................................9
3.3. Adaptation aux pH extrêmes..............................................................................................9
4. Quelques exemples de milieux extrêmes :...............................................................................10
4.1 Les milieux chauds :..........................................................................................................10
4.2 Les milieux froids :............................................................................................................11
4.3 Les milieux sous haute pression :......................................................................................12
4.4 Les milieux rocheux..........................................................................................................12
4.5 Les milieux acides.............................................................................................................13
4.6 Les milieux basiques :.......................................................................................................14
4.7 Les milieux salés :.............................................................................................................14
4.8 Les milieux à fort rayonnement........................................................................................15
Chapitre II : les métaux lourds et les micro-organismes métallo-tolérants..........................................16
1. Définition des métaux lourds....................................................................................................16
2. Effet des métaux lourds sur l’environnement..........................................................................16
3. Effet toxique des métaux lourds sur les microorganismes.......................................................16
4. Tolérance des métaux lourds par les micro-organismes :.........................................................17
Chapitre III : Techniques d’identification des microorganismes extrêmophiles...................................19
1. Méthodes d’identification phénotypiques...................................................................................19
1.1. L’examen direct.....................................................................................................................19
1.2. L’examen après coloration....................................................................................................19
1.3. Identification après mise en culture......................................................................................20
1.4. Les limites de l’identification phénotypique..........................................................................21
2. Méthodes d’identification protéomique et génotypique.............................................................21
2.1. Méthodes d’identification protéomique...............................................................................22
2.2. Méthodes d’identification génomiques.................................................................................22
2.3 Approche Meta-génomique...................................................................................................25

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Conclusion :..........................................................................................................................................28
Références :..........................................................................................................................................29

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Remerciement

C'est avec un grand plaisir que nous adressons nos profondes et


extrêmes gratitudes à l'égard de Mr K.Chekroud, notre encadrant
pédagogique pour nous avoir aidé à la réalisation de ce modeste
travail, pour nous avoir accordé du temps à nous guider, pour ses
conseils et ses recommandations précieux qui nous ont aidé tout au
long de la réalisation de ce présent travail.
Nous le remercions également d'être toujours disponible, à l'écoute de
nos nombreuses questions, et d'être purement intéressé par
l'avancement et l'évolution de ce travail.
Nous remercions également les membres de Jury pour l'attention
qu'ils ont bien voulu accorder à la lecture et l'évaluation de ce mini
projet.

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Table des figures :


Figure1 : Castle Geyser en éruption, Parc national de Yellowstone, Wyoming, USA.

//fr.wikipedia.org/wiki/Parc_national_de_Yellowstone……………………………………………………………………10

Figure2 : Thomas Brock, Thermus aquaticus, Bactérie thermophile grossie au microscope


électronique, 1969……………………………………………………………………………………………………………………………11

Figure3 : Guillaume Dargaud, Le lichen de l'Antarctique, 2005. avec l'autorisation de l'auteur.


www.gdargaud.net/Antarctica/Animals.html.......................................................................................11

Figure5  : [39a] > Martin Fisk, Microbes in oceanic basalt, Oregon State Univ.

//oceanexplorer.noaa.gov/explorations/02alaska/background/microbes/microbes.html

> Monica Bruckner, Montana State


Univ…………………………………………………………………………………………..12

Figure 6 : Kathy Sheelan, David Patterson et al., L'algue rouge cyanidium, Nymph Creek, Parc
Lemonade du Yellowstone National Park, Montana State Univ., Wyoming, 2001. et La bactérie
Beggiatoa sur les sédiments du site marin Eel Pond, Woods Hole, Massachusetts, 2001.
//serc.carleton.edu/microbelife/extreme/acidic/index.html ……………………………………………………………13

Figure  7  : Wilehlm Nultsch, Botanique générale,de Boeck, p.290,


1998…………………………………………….13

Figure8  : Brett Leigh Dick, Microbial life in alkaline environments,


http://serc.carleton.edu/microbelife/extreme/alkaline/index.html......................................................1
4

figure9  : Guillaume Calu, L'écophysiologie des bactéries, 2008 www.spectrosciences.com/spip.php?


article59 > Didier Pol, Halobacterium salinarum, Biologie-Géologie, 1, 2008
//www.didierpol.net/3halobact.htm………………………………………………………..…………..14

figure10  : Michael Daly, ITEM image de Deinococcus radiodurans, USUHS, Bethesda, Maryland, USA.
http://www.usuhs.mil/pat/deinococcus/index_20.htm........................................................................15

Figure 11 : Ederer M.M. (2011). Metagenomics: methods, applications and challenges. In: Li
R.W. (ed.) Metagenomics and its Applications in Agriculture, Biomedicine, and
Environmental Studies.Nova. Sci. Inc. New York, USA……………………………………..25

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Introduction :
Les formes de vie sur Terre sont innombrables, comme les environnements qui les abritent.
Jusqu’au 20ème siècle, on pensait que la vie n’était possible que dans un environnement
«normal», c’est-à-dire là où les conditions sont compatibles avec la vie de l’homme. Puis, les
chercheurs ont commencé à découvrir des organismes qui survivent dans des conditions hors
de ces normes, dans des milieux caractérisés par des conditions physiques et/ou chimiques
extrêmes [1].
Ces êtres exceptionnels qui défient les lois de la biologie et créent la vie ou l’homme n’osait
l’imaginer sont qualifiées d’extrêmophiles [2] et ils ne sont pas seulement tolérants a ces
condition extrêmes mais celles-ci sont requises pour leur croissance et développement [3]. Il
existe des extrêmophiles qui prospèrent dans des biotopes combinant plusieurs conditions
extrêmes, ils sont baptisés polyextrêmophiles ce qualificatif englobe la résistance à des
conditions physiques (par exemple la température, la pression, les radiations) et géochimiques
(par exemple la dessiccation, la salinité, le pH) [4].
Selon les conditions extrêmes auxquelles les microorganismes extrêmophiles sont confrontés,
ils peuvent être thermophiles, psychrophiles, alcalophiles, acidophiles, piézophiles, halophiles
ou halotolérants… [5].
L’existence de la vie dans les écosystèmes extrêmes a conduit à s’interroger sur les stratégies
et les mécanismes cellulaires, moléculaires et génétiques mis en jeu pas ces microorganismes
atypiques pour se maintenir dans de tels milieux, et la mise en évidence d’une extraordinaire
biodiversité de ces formes de vie montre.
Les capacités étonnantes d’adaptation des microorganismes extrêmophiles au stress physico-
chimique offrent des perspectives en termes d’application biotechnologiques et conduit
également à s’interroger sur leur capacité de produire de nouvelles substances exceptionnelles
[5].
L’objectif de ce présent travail est de mettre en évidence l’étude du mode de vie extrêmophile
des bactéries métallo-résistantes dans les anciennes mines de Fer et l’application des
méthodes méta génomiques à leur découverte.

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Chapitre I : Les milieux extrêmes et les extrêmophiles


1. Qu’est-ce qu’un milieu extrême ?
Pour pouvoir définir un environnement extrême, il faudrait d'abord définir ce qu'est un
environnement non-extrême ou normal. Pour cela, un consensus général établit les facteurs
physiques et chimiques les plus importants pour un environnement normal. Ces facteurs se
situeraient approximativement à des valeurs de température de 4 à 50°C, de pH de 5 à 8,5 et
de salinité entre celle de l'eau douce et celle de l'eau de mer (3,5%, p/v). Loin des
environnements normaux, la diversité des espèces diminue et le stress environnemental
augmente. Les facteurs de stress environnementaux sont habituellement additifs,
l'augmentation d'un facteur, augmente la susceptibilité du microorganisme envers d'autres
facteurs [6].

2. Qu’est-ce qu’un extrêmophile ?


Les extrêmophiles sont des micro-organismes qui se développent de manière optimale dans
des conditions de milieux mortelles pour la quasi-totalité des autres espèces.
Le concept d’extrêmophile a été forgé à partir des travaux de microbiologistes qui ont eu un
rôle de pionnier en découvrant de nouvelles espèces de micro-organismes dans des milieux
considérés jusque-là comme stériles. C’est le cas de T. Brock qui, à la fin des années soixante,
découvrit les premières espèces se développant à des températures de l’ordre de 70°C dans
des sources thermales du parc de Yellowstone aux États-Unis. En 1969, il isola en particulier
Thermus aquaticus qui sera à la base de la découverte des ADN polymérases thermostables
[7]. À la même période, K. Horikoshi, au Japon, mettait en évidence l’existence de microbes
ne se développant qu’à des pH alcalins et passés presque totalement inaperçus auparavant [8].
Puis les microbiologistes allemands W. Zillig et K. Stetter allaient donner une impulsion
déterminante en explorant systématiquement les milieux extrêmes de la planète, avec une
prédilection marquée pour le chaud et la mise en évidence d’espèces ayant un optimum de
croissance supérieur à 100°C. Pyrolobus fumari est notamment capable de survivre à 121°C,
température à laquelle sont effectuées les opérations de stérilisation courantes en laboratoire
et dans l’industrie. De 1980 à 2000, le laboratoire de K. Stetter isola plus de 50 nouvelles
espèces appartenant à de nouveaux genres, voire de nouvelles familles [9]. De ces travaux et
de ceux consacrés à d’autres types d’environnements émergea le concept d’extrêmophile.

3. Propriétés des extrêmophiles


Le concept d’extrêmophilie, à la différence de celui de résistance aux conditions extrêmes,
implique que l’ensemble de la machinerie cellulaire soit adapté aux conditions extrêmes et
que les cellules fonctionnent de manière optimale dans ces conditions. Pour autant, chaque
constituant cellulaire ne fonctionne pas nécessairement à l’optimum dans les conditions du
milieu extérieur. Les cellules sont capables de contrôler jusqu’à un certain point les conditions
intracellulaires pour certains paramètres comme l’osmolarité. De ce fait, le pH intracellulaire
de souches alcaliphiles sera inférieur à celui du milieu extérieur et inversement pour les
espèces acidophiles. En revanche, pour certains paramètres, comme la température, la
pression, les conditions du milieu extérieur s’imposent aux cellules dans leur globalité,
membranes, milieu intérieur et totalité des constituants cellulaires. Ces constituants cellulaires

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devront être non seulement stables dans ces conditions, mais surtout, fonctionnels. La stabilité
de chacune des biomolécules prise isolément et testée dans les conditions du milieu extérieur
n’est toutefois pas toujours requise, du fait que le milieu intérieur peut bénéficier de l’effet de
certains solutés organiques ou d’une protection au sein de complexes macromoléculaires.
Nous n’illustrerons ici que certaines propriétés, et plus particulièrement la thermostabilité des
protéines et l’osmoadaptation.
3.1. Stabilité des constituants cellulaires
L’une des premières questions qui se pose pour les hyperthermophiles est celle de la stabilité
de leur matériel génétique. Comment est préservée l’intégralité du message génétique stockée
dans le chromosome et comment peuvent opérer la transcription et la traduction au-dessus de
100-110°C ? À ces températures, in vitro, l’ARN est dégradé et l’ADN linéaire et circulaire
est dénaturé (séparation des deux brins de la double hélice) puis dégradé. Les acides
nucléiques des hyperthermophiles sont formés à partir des mêmes nucléotides et possèdent
une structure identique à celle des mésophiles. Il a été démontré que des histones archéennes
ou des histones « like » augmentent la température de dénaturation de l’ADN, mais ne
préviennent pas la thermo dégradation. La stabilité des acides nucléiques à haute température
chez les hyperthermophiles résulte sans doute d’une interaction avec des protéines de liaisons
non spécifiques qui restent à découvrir. Il a également été démontré que la thermo dégradation
de l’ADN est réduite en présence de concentrations physiologiques de sels monovalents (50 à
500 mM de KCl ou NaCl) ou divalents (1 à 25 mM MgCl2). Les protéines et tout
particulièrement les enzymes des hyperthermophiles doivent être thermostables et fonctionner
dans les conditions de température rencontrées dans les sources thermales ou hydrothermales.
La thermostabilité d’une enzyme est corrélée à la température de croissance de l’organisme
source. Les recherches visant à trouver une loi générale qui permette de convertir une protéine
donnée en sa version thermostable, et réciproquement, ont échoué. Néanmoins, ces travaux
ont permis de caractériser les déterminants de la thermostabilité des protéines. À défaut de loi
générale, les mécanismes les plus fréquemment rencontrés font appel à : – une augmentation
des interactions de van der Waals ; – une hydrophobicité accrue ; – une extension du nombre
et de la taille des réseaux de liaisons hydrogène ; – une augmentation des interactions ioniques
; – une densité de compaction plus élevée ; – une diminution de longueur des boucles de
surface ; – une modification dans l’usage des codons avec un biais pour les codons AGR pour
l’arginine.
De plus, les travaux de protéomique comparée ont permis d’établir que la thermostabilité
d’une protéine est liée à une augmentation du nombre de résidus Glu (E) et Lys (K) combinée
à une réduction de résidus Gln (Q) et His (H). Un rapport (E + K)/ (Q + H) supérieur 4,5
signerait la présence d’un hyperthermophile. Le nombre de résidus chargés aurait un impact
sur la solubilité tandis que leur position serait importante pour la stabilité. Pour clore cette
liste, il semble que l’importance des ponts disulfures dans la stabilisation des protéines
thermostables d’archées ait été sous-estimée [10]. En bref, chaque protéine est le résultat
d’une évolution propre qui optimise son repliement et les interactions externes avec les
solvants par différents mécanismes [11]. Ces stratégies ne sont nécessairement utilisées toutes
simultanément pour conférer à une protéine une thermostabilité accrue. Elles semblent
correspondre à une « boîte à outils » dans laquelle l’évolution a puisé au fil du temps pour
répondre au besoin des extrêmophiles.

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3.2. Osmoadaptation
Tous les procaryotes ont dû développer des stratégies adaptatives leur permettant d’ajuster les
concentrations des solutés intracellulaires aux concentrations externes. Dans le cas des
halophiles, cette adaptation aux fortes concentrations du milieu extérieur implique
l’accumulation de solutés intracellulaires afin de contrer la pression osmotique qui autrement
conduirait à la déshydratation et à la mort. Deux stratégies principales ont été identifiées pour
équilibrer la pression osmotique extérieure : l’afflux de certains ions dans la cellule et
l’accumulation de solutés compatibles organiques de faible poids moléculaire. La première
stratégie semble être limitée à quelques genres d’archées halophiles extrêmes (Halobacterium,
Haloarcula, Haloquadratum, Halorhabdus, Natronobacterium, et Natronococcus) et de
bactéries halophiles extrêmes (Salinibacter). Le cation majoritairement accumulé est K+. De
nombreuses enzymes de ces espèces présentent un enrichissement en résidus acides et une
activité K+ dépendante. La seconde stratégie n’est pas limitée aux halophiles, mais les
propriétés remarquables de certains solutés organiques compatibles leur ont permis de
s’adapter aux conditions changeantes. Les solutés compatibles regroupent des molécules de
structures très diverses : acides aminés, sucres (tréhalose, sucrose), phosphodiesters, et
glycérates [12]. Phosphodiesters et glycérates sont des solutés chargés. Les autres sont neutres
ou zwittérioniques. Parmi les acides aminés et dérivés, seuls un petit nombre a un rôle de
soluté compatible : glutamine, glutamate, lysine (chez les méthanogènes), proline, glycine
bétaïne, ectoïne et hydroxyectoïne chez de nombreuses halophiles. Le tréhalose et le sucrose
sont des osmolytes très répandus depuis les bactéries et les archées jusqu’aux invertébrés. Ils
jouent également un rôle important chez certaines espèces halothermophiles. Les
phosphodiesters jouent le rôle de solutés compatibles plus spécialement chez les
hyperthermophiles. Le DIP (di-myo-inositol phosphate) est rencontré chez de nombreux
genres d’archées hyperthermophiles y compris chez Pyrolobus fumarii qui est l’espèce la plus
thermophile connue à ce jour. Les propriétés des solutés compatibles des extrêmophiles
suggèrent qu’il serait possible de les utiliser en biotechnologie pour protéger des
macromolécules ou des cellules soumises à des conditions de stress. Ces composés sont
regroupés sous l’appellation d’« extrêmolytes » [13].
3.3. Adaptation aux pH extrêmes
Le record de l’acidophilie est atteint par l’archée thermoacidophile Picrophilus torridus dont
l’optimum de croissance se situe à pH 0,7 et 65°C, capable de se diviser à pH 0 et dont le
milieu intracellulaire est à pH 4,6. Le séquençage du génome complet de P. torridus a permis
de rechercher les mécanismes d’adaptation à ce pH extrême. Elle est capable de produire des
enzymes extracellulaires, dégradant les polymères, résistantes aux conditions du milieu
extérieur. Elle offre ainsi l’opportunité d’analyser les spécificités d’enzymes thermostables
fonctionnelles en milieu acide. L’une des adaptations majeures de P. torridus tient à la
composition de sa paroi cellulaire. Elle présente une faible perméabilité aux protons (H+), une
grande stabilité aux acides et perd sa cohésion à pH 7 [14]. Elle comporte une couche-S
composée de protéines et une membrane monocouche possédant une structure originale à base
de lipides polaires de type caldarchaeol. Pour lutter contre les concentrations en protons
énormes du milieu extérieur, P. torridus possède des pompes à protons particulièrement
efficaces et limite les dépenses d’énergie en laissant pénétrer une quantité importante de
charges positives sous la forme d’ions potassium (K+). Les thermoacidophiles ont développé
des mécanismes de résistance aux métaux lourds qui sont physiologiquement toxiques pour la

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plupart des micro-organismes. Les données actuelles suggèrent que de multiples systèmes
fonctionnent en parallèle chez ces extrêmophiles [15]. À l’autre extrémité de l’échelle des pH,
les alcaliphiles possèdent des parois cellulaires qui permettent de limiter le pH du milieu
interne tout en assurant l’approvisionnement en énergie. Elles présentent l’intérêt de produire
des enzymes fonctionnelles à pH élevé, dont des lipases et des protéases très utilisées dans
l’industrie des détergents.

4. Quelques exemples de milieux extrêmes :


4.1 Les milieux chauds : Les organismes sont appelés hyperthermophiles.
On les trouve dans les régions volcaniques et dans les sources hydrothermales continentales.
La plupart proviennent principalement des fonds marins, au niveau des sources
hydrothermales des dorsales océaniques.

Figure (1) : Parc de Yellowstone, geysers


La plupart des micro-organismes hyperthermophiles sont des archéobactéries. Ex : le
procaryote Pyrolobus fumarii (espèce du genre Pyrolobus, dans l'ordre des Igneococcales,
dans le phylum Crenarchaeota) trouvée sur les parois d'un fumeur noir sur le site TAG (3650
m) en Atlantique, se développe entre 90°C et 113°C avec un optimum de croissance à 106°C.
Son type morphologique est une coque [16,17].
La protection contre la dénaturation (dépliement puis regroupement pour former des agrégats
sphériques et tubulaires [18]) des protéines par la chaleur, pourrait être expliquée par la
formation de DIP (Di-myo-Inositol Phosphate) et de sucresUDP (Uridine Di-Phosphate) [19,
20].

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Exemple de microorganismes hyperthermophiles :


Thermus aquaticus (bactérie thermophile, tubulaire ~1µm)

Figure (2) : Thermus aquaticus


4.2 Les milieux froids :
L'Antarctique est le milieu le plus froid sur Terre. ---> -89,2 °C, De nombreuses espèces
vivent en harmonie dans ce milieu très froid. Celles qui résistent le mieux sont les lichens.
Exemple de microorganismes hypo thermophiles :

Figure (3) : photo représentant le Lichen de l’Antarctique

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4.3 Les milieux sous haute pression :


Les organismes sont appelés piézophiles (ou barophiles). Ils sont présents dans les grands
fonds ou dans la croûte terrestre.
Une nouvelle espèce d’archéobactérie, Pyrococcus CH1 (appartenant au genre Pyrococcus
dans l'ordre Thermococcales du phylum Euryarchaeota) a été découverte en 2007 [21, 22] sur
le site Ashadze à 4080 m de profondeur (408 bars=41MPa de pression hydrostatique). Elle se
développe entre 80°C et 108°C et entre 20 et 120 MPa (1200 bars) avec des optima de 98°C et
53 MPa. C'est un micro-organisme hyperthermophile et piézophile
Exemple de microorganismes piézophiles :
Dans ce genre, se trouve Pyrococcus Abyssi découverte à 2000 m au niveau d'une source
hydrothermale de l'Océan Pacifique. Son optimum de croissance est 96°C à P = 1atm et
100°C à 20 MPa. Les cellules ont une forme de coque avec flagelles.

Figure (4) : Pyrococcus Abyssi en microscopie électronique à balayage. 0,8 à 2 µm


4.4 Les milieux rocheux
Les endolithes : des organismes qui vivent à l'intérieur des roches
Exemple de microorganismes endolithes :

Figure (5) : des micro-colonies de lichen dans une roche d'une vallée sèche de l'Antarctique

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4.5 Les milieux acides


Les espèces sont dites acidophiles
Environnements des acidophiles : cheminées hydrothermales, sources chaudes à production
de sulfures.

Figure (6) : Lemonade Spring (YellowStone Park) tapis microbien de 1 cm à 42°C, formé par
une algue thermophile et acidophile (pH 2-3) : le cyanidium.
Exemple de microorganismes acidophiles :
Le microbe Ferroplasma acidarmanus : une archée qui se développe à pH ~0,5 et ~40°C à
Iron Mountain, Californie...et pourtant la membrane des cellules semble très fine.

Figure (7) : Micro-colonie de ferroplasma acidarmanus

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4.6 Les milieux basiques :


Les espèces sont dites alcalophiles.
Environnements des alcalophiles : zones à ph > 9 : sols riches en carbonate, lacs de soude.
Exemple de microorganismes alcalophiles  :

Figure (8) : La cyanobactérie alcalophile Microcystis aeruginosa, une algue bleue


4.7 Les milieux salés  :
Les espèces sont dites halophiles. La plupart d'entre elles contiennent des pigments qui
donnent à l'eau une couleur rose, orangée ou pourpre selon l'espèce.

Conditions de vie :
Vertébrés : concentration en sel inférieure à 1,5M Halobactéries : de 1,5M à 3M
Haloarchées : de 3M à 5,2M.

Figure (9) : Grand lac salé, Utah ; lac Owens, Californie ; Lac rose, Sénégal ; Lac Asal,
Djibouti ; Mer morte.

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Exemple de microorganismes halophiles  :


L’Archée : halobacterium salinarum
4.8 Les milieux à fort rayonnement 
Une espèce capable de résister à de grande radiations est appelée radio-résistante.
Exemple de microorganismes radio-résistants :
Le Deinococcus Radiodurans est l'organisme le plus radio-résistant du monde. C'est un
procaryote.

Figure(10) : Deinococcus Radiodurans

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Chapitre II : les métaux lourds et les micro-organismes métallo-


tolérants
1. Définition des métaux lourds
D’un point de vue purement chimique, les éléments de la classification périodique formant
des cations en solution sont des métaux.
D’un point de vue physique, le terme « métaux lourds » désigne les éléments métalliques
naturels, métaux ou dans certains cas métalloïdes (environ 65 éléments), caractérisés par une
forte masse volumique supérieure à 5 g.cm3 [23].
D’un point de vue biologique, on en distingue deux types en fonction de leurs effets
physiologiques et toxiques : métaux essentiels et métaux toxiques.
Les métaux essentiels sont des éléments indispensables à l’état de trace pour de
nombreux processus cellulaires et qui se trouvent en proportion très faible dans les
tissus biologiques [24]. Certains peuvent devenir toxiques lorsque la concentration
dépasse un certain seuil. C’est le cas du cuivre (Cu), du nickel (Ni), du zinc (Zn), du
fer (Fe). Par exemple, le zinc (Zn), à la concentration du milli -molaire, est un oligo-
élément qui intervient dans de nombreuses réactions enzymatiques (déshydrogénases,
protéinase, peptidase) et joue un rôle important dans le métabolisme des protéines, des
glucides et des lipides [23].
Les métaux toxiques ont un caractère polluant avec des effets toxiques pour les
organismes vivants même à faible concentration. Ils n’ont aucun effet bénéfique connu
pour la cellule. C’est le cas du plomb (Pb), du mercure (Hg), du cadmium (Cd).
Le terme métaux lourds, « heavy metal », implique aussi une notion de toxicité. Le terme
« éléments traces métalliques » est aussi utilisé pour décrire ces mêmes éléments, car ils se
retrouvent souvent en très faible quantité dans l’environnement [25].

2. Effet des métaux lourds sur l’environnement


Contrairement aux contaminants organiques, les métaux lourds générés par les activités
anthropiques ne peuvent pas être dégradés biologiquement et persistent indéfiniment dans
l’environnement. De plus, les environnements pollués tels que les sites miniers sont
généralement soumis à de fortes contraintes topographiques, climatiques et hydriques, érodant
fortement les déchets et induisant une pollution pour les eaux et les sols environnants. Les
sols miniers sont pauvres en matière organique et en minéraux fertilisants comme l’azote
empêchant alors le développement d’une couverture végétale pouvant faire office de barrière
à la dispersion des métaux lourds. De ce fait, la non-gestion des sites miniers pose un
problème environnemental conduisant à de graves dégâts écologiques [26].

3. Effet toxique des métaux lourds sur les microorganismes


Les concepts de tolérance, résistance et sensibilité aux métaux peuvent être facilement
confondus les uns avec les autres ou utilises un peu à toutes les sauces. De plus, les définitions
précises des termes tolérance et résistance portent parfois à confusion dans la littérature. Une
publication de Gadd (1992) [27] propose une terminologie plus précise et spécifique. Le
terme «tolérance » devrait être employé lorsque les organismes supportent la présence des
métaux grâce à leurs caractéristiques biologiques intrinsèques, alors que le mot « résistance »

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devrait être mentionné lorsque les organismes survivent à la présence de métaux à l'aide de
mécanismes de détoxification spécifiques induits en présence du contaminant [28].
De manière globale, les métaux exercent une pression sélective augmentant la tolérance de
base de certains microorganismes, mais diminuent la biodiversité des microorganismes
retrouvés dans ces sols en comparaison avec des sols non pollués [28]. La sensibilité des
microorganismes peut se traduire par une diminution de l'expression protéique alors qu'une
augmentation de l'expression protéique signifierait une tentative d'adaptation au nouveau
contaminant (expression d'un mécanisme de résistance) [28]. Chez les bactéries, les gènes
codant pour l'expression des protéines impliquées dans ces mécanismes sont principalement
plasmidiques, bien que quelques-uns soient chromosomiques [28]. L'origine plasmidique de
certains gènes peut résulter en une fréquence de transfert plus élevée de ces plasmides en
conditions de stress. Un tel exemple a été démontré chez Rhizobium leguminosarum bv.
viciae qui, en présence de métaux, transférait ses plasmides lui procurant sa résistance [28].

4. Tolérance des métaux lourds par les micro-organismes :


Les métaux qui n’ont pas de fonction biologique sont généralement tolérés à faibles
concentrations, alors que les métaux essentiels sont acceptés à plus forte concentration [29].
Ces derniers participent au fonctionnement métabolique des cellules en tant que constituants
d’enzymes ou constituants structurels (exemple de la membrane). La concentration et la
spéciation du métal déterminent si celui-ci est utile ou nocif à la cellule [30]. Le contrôle des
concentrations internes, ou homéostasie, s’avère donc nécessaire. C’est pourquoi les bactéries
ont développé différentes stratégies de défense pour se protéger de la toxicité des métaux :

- De nombreuses bactéries sont désormais connues pour leur capacité à excréter les
métaux par des systèmes d’efflux. Ces types de transporteurs se caractérisent par une
forte affinité au substrat et permettent de maintenir de faibles concentrations
métalliques dans le cytosol [31, 32, 33]. L’un des exemples les plus connus est la
bactérie C. metallidurans CH34 qui a fait l’objet de nombreuses études. Trois grandes
familles de protéines responsables de l’efflux chez les microorganismes [33] ont été
décrites :
 les protéines de la famille « resistance-nodulation-cell division » (RND) dont
la première découverte fut la protéine CzcCBA de la bactérie C .metallidurans
[34] chez laquelle le plasmide pMOL30 permet la résistance au cobalt, zinc et
cadmium (czc) via un mécanisme d’efflux. De même pour la protéine
permettant la résistance au cobalt et nickel (cnr) porté par le plasmide
pMOL28. L’efficacité de ce système serait due au fait que non seulement il
permet de diminuer la concentration cytoplasmique mais également la
concentration périplasmique. Dans ce cas les cations peuvent être excrétés
avant même leur entrée dans la cellule [33].
 la famille « cation diffusion facilitators » (CDF) dont les substrats principaux
sont le zinc, cobalt, nickel, cadmium et le fer. Ces systèmes d’efflux sont
contrôlés par le gradient de concentration. Toutes les protéines CDF décrites
chez les bactéries sont impliquées dans la résistance au Zn. C’est le cas de la
protéine CzcD chez C. metallidurans CH34. Chez E. coli, la protéine ZitB a été
mise en évidence pour son implication dans la résistance au Zn (contrôlée par
le gradient de potassium et la « force motrice protonique»), l’expression de
cette protéine est induite par la présence de Zn. Les protéines de la famille

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CDF sont généralement responsables de l’efflux des métaux présents dans le


cytoplasme [35].
 la troisième grande famille impliquée dans l’efflux de métaux est celle des « P-
type ATPases » qui forment une grande famille de transporteurs actifs dont
l’énergie provient de l’hydrolyse de l’ATP. Il existe des ATPases qui
importent et d’autres qui vont exporter les métaux. Par exemple les Zn-CPx-
type ATPases impliquées dans le transport de Zn, Cd et Pb principalement du
cytoplasme vers le milieu extérieur ou le périplasme. La première protéine
décrite fut CadA, qui est impliquée dans l’efflux de Cd, découverte chez S.
aureus [33].
- Les microorganismes peuvent produire et rejeter vers l’extérieur des substances
organiques (EPS) ou inorganiques (métabolites) qui sont susceptibles de modifier la
mobilité des métaux soit en les immobilisant (précipitation, adsorption) soit en les
(re-) mobilisant (solubilisation) [36]. Ce mécanisme est souvent décrit comme du «
bioweathering » ou biolixiviation [37, 38, 39].
- Si les métaux toxiques sont entrés dans la cellule et ne peuvent pas être excrétés par
des systèmes d’efflux, plusieurs organismes ont développé des mécanismes de
séquestration cytosolique pour se protéger. Il a été montré chez beaucoup
d’organismes résistants aux métaux que des composés internes comme, par exemple,
des granules de polyphosphates ou des groupements thiols (contenant du soufre),
étaient capables de séquestrer des grandes quantités de cations métalliques [40, 41, 42,
43]. La bioaccumulation de métaux lourds et leur stockage subséquent dans la cellule
sous forme inerte permet à la cellule de diminuer leur toxicité. C’est par exemple le
cas chez C. metallidurans CH34 qui réduit le sélénite sous forme de sélénium
élémentaire (rouge) et l’accumule sous forme de nodules dans le cytoplasme [44, 45].
- La précipitation extracellulaire intervient quand les microorganismes produisent ou
sécrètent des substances qui réagissent avec les métaux solubles pour produire un
composé métallique insoluble. Les métabolites inorganiques tels que des ions sulfate,
carbonate ou phosphate issus principalement du métabolisme respiratoire peuvent
précipiter des ions métalliques toxiques. La formation de sulfures métalliques par les
bactéries sulfatoréductrices (sédiments anoxiques, sols faiblement aérés) est par
exemple l’un des processus d’immobilisation microbiologique les plus connus [46].
Pour être efficace, la coprécipitation doit diminuer de façon conséquente la
concentration en éléments dissous, c'est-à-dire en dessous de la concentration pour
laquelle la croissance bactérienne est affectée par la concentration en métaux (MIC :
Minimum Inhibition Concentration).
- Enfin, les métaux peuvent être biotransformés par des mécanismes d’oxydoréduction
(ex Fe et Mn) liés à la respiration cellulaire, ou par alkylation (ex Hg). Ces
transformations sont très importantes pour certaines bactéries (bactéries sulfato-
réductrices en particulier) et ont une incidence sur la biodisponibilité, la mobilité et la
toxicité du métal (dépendant de sa spéciation). Les métaux toxiques peuvent être
également transformés en une forme moins toxique voire non toxique par oxydation
ou réduction enzymatique. Pour leur métabolisme énergétique, de nombreux
procaryotes peuvent utiliser les métaux présents sous différents états d’oxydation (Cr,
Mn, Fe, Co, Cu, As ou Se) comme donneurs ou accepteurs d’électrons [46].

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Chapitre III : Techniques d’identification des microorganismes


extrêmophiles
Historiquement, l'identification et la classification des eubactéries se sont fondées sur des
caractéristiques phénotypiques. Les premières techniques moléculaires utilisées dans la
classification bactérienne étaient basées sur le taux de GC* ou l’étude du profil plasmidique.
Actuellement, deux applications moléculaires fondamentales sont grandement utilisées dans
la détection et l’identification bactérienne. Elles se basent sur l’hybridation et le séquençage
nucléotidique.
* Taux de GC : Le taux de GC d’une séquence d’ADN correspond au pourcentage de guanine
(G) et de cytosine (C) que contient une molécule d’ADN. Ces deux bases azotées constituants
font partie des constituants de l’ARN et de l’ADN.

1. Méthodes d’identification phénotypiques


L’identification phénotypique repose sur des méthodes traditionnelles de microbiologie, dites
pasteuriennes. L’identification et le dénombrement des micro-organismes se font sur des
critères morphologiques ou de coloration, ou encore par des tests biochimiques après
isolement et culture sur boîtes de Pétri ou en milieux liquides [47]. La technique consiste en la
comparaison de divers caractères phénotypiques de la souche à étudier vis à vis de ceux d’une
souche de référence. Cette identification utilise un faible nombre de caractères considérés
comme importants. De fait, elle ne reflète qu’un nombre réduit d’informations, les caractères
considérés comme importants étant subjectifs et dépendant des conditions environnementales.
1.1. L’examen direct
L’examen direct au microscope à contraste de phase permet d’observer les espèces mobiles
(Campylobacter, Selenomonas, Treponema, etc. …) et permet également d’apprécier la forme
végétative des micro-organismes [48].
1.2. L’examen après coloration
L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame et ayant
subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées sur des frottis secs et fixes,
sont classées en :
- Coloration simple, avec un unique colorant. La coloration au bleu de méthylène apporte des
informations concernant l’agencement et la morphologie des germes ;
- Coloration différentielle de Gram ;
- Coloration spéciale des structures bactériennes (capsules, spores, …) [49].
La coloration différentielle de Gram est la coloration de référence en bactériologie pour
l’identification bactérienne. Toutefois, cet examen ne permet pas l’obtention de données
précises quant à l’espèce ou au genre bactérien. La coloration de Gram ne donne qu’un
faisceau de présomption d’identification (caractérisation des bactéries par leur morphologie,
le Gram positif ou négatif et leur disposition spatiale).

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1.3. Identification après mise en culture


L’intérêt de la culture bactérienne porte sur le développement de la bactérie et son isolement
(obtention d’une culture pure pour les tests phénotypiques), ses caractéristiques culturales …
Cela nécessite de regrouper des conditions d’atmosphère (aérobie, anaérobie, enrichi en
CO2), de température et de culture favorable au développement microbien. La flore orale est
extrêmement diversifiée et chaque espèce présente des conditions de culture propres. Chez
l’adulte sain, elle est composée de plusieurs centaines d’espèces bactériennes. On estime à
près de 10%, le nombre de micro-organismes pouvant être régulièrement isolés en utilisant
des méthodes de culture conventionnelles. En règle générale, l’identification des bactéries
anaérobies est plus contraignante et peut demander un temps de culture de plusieurs jours. Au
laboratoire, l’inoculum est ensemencé pur et/ou dilué. Six milieux permettent d’identifier les
flores dominantes, ils seront choisis selon le genre à identifier :
- La gélose au sang en aérobiose permet la croissance des espèces aérobies ;
- La gélose au sang en anaérobiose permet la croissance des espèces anaérobies facultatifs ou
stricts (streptocoques oraux, Porphyromonas, Fusobacterium, etc.) ;
- La gélose au sang avec vancomycine et kanamycine en anaérobiose permet la sélection des
bacilles Gram négatifs anaérobies stricts (Porphyromonas, Fusobacterium, etc.) ;
- La gélose chocolat (sang cuit) sous 5% de CO2 est utilisée pour les espèces microaérophiles
(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, etc.) ;
- La gélose à la bacitracine sous 5% de CO2 est un milieu sélectif pour les bactéries du genre
Haemophilus par exemple ;
- Le milieu « Actinobacillus » sous 5% de CO2 est un milieu dépourvu de sang contenant du
sérum de veau, de l’extrait de levure, de la vancomycine, de la bacitracine et de
l’amphotéricine B. Il est notamment sélectif de l’espèce bactérienne A.
actinomycetemcomitans.
Le prélèvement initial et les boîtes de culture pour les bactéries anaérobies doivent rester le
moins longtemps possible à l’aire libre, soit environ 20 à 30 minutes. Les cultures anaérobies
sont réalisées sous sachets scellés ou en jarre contenant un sachet générateur d’anaérobiose,
ou encore en enceinte anaérobie reliée à une pompe ou à des bouteilles de gaz. Les boîtes en
anaérobiose sont incubées durant 24 heures, et toutes les autres au moins 5 jours à 37°C. Le
bactériologiste détermine les colonies prédominantes à ré-isolé pour identification [50,51].
Les techniques d’identification « après culture » :
 Examen macroscopique : Analyse des caractères culturaux : L’aspect des colonies
dépend du milieu de culture utilisé, de la durée ainsi que de la température
d’incubation [51]. Les milieux de culture contenant du sang permettent de mettre en
évidence une éventuelle hémolyse.
 Examen microscopique des bactéries : Analyse morphologique : L’examen
microscopique se fait par l’étude des bactéries isolées d’un prélèvement. Un frottis est

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réalisé à partir de la culture bactérienne, coloré au Gram et examiné au microscope


[50].

 Etude des caractères biochimiques : Les caractères biochimiques sont détectés par
diverses techniques commerciales (galeries API, systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…).
L’identification repose sur l’utilisation de galeries d’identification. Elles permettent
une identification rapide des bactéries [51].

Parmi l’ensemble de ces systèmes, la galerie API (analytical profile index) est
couramment utilisée. Elle se présente sous forme de cupules prêtes à l’emploi
contenant les substrats lyophilisés nécessaires aux différents tests biochimiques.
Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les
différentes alvéoles de la micro-galerie, les métabolites produits durant la période
d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par
addition de réactifs. Elles ont l’avantage de standardiser les caractères biochimiques
recherchés. Elles limitent la variabilité technique et permettent l’identification d’une
centaine de bacilles à Gram négatif [52].
1.4. Les limites de l’identification phénotypique
Les méthodes d'identification conventionnelles présentent des limites. Elles permettent de
différencier les espèces mais elles sont lentes, nécessitent suffisamment de cultures et un
certain nombre de variantes échappent à la classification car elles ne présentent pas tous les
caractères de l'espèce type. Certaines bactéries sont mal identifiées phénotypiquement pour
diverses raisons. En effet, certaines expriment peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres
espèces, une situation de stress peut avoir altéré ces caractères. Une identification basée
exclusivement sur le phénotype bactérien peut donc mener à un résultat erroné. Par ailleurs,
les bactéries rares ne sont pas répertoriées dans les bases de données des systèmes
commercialisés et en conséquence, les techniques d'identification conventionnelles ne
permettront pas de les identifier. Enfin, pour certaines bactéries à croissance difficile, les
caractères phénotypiques sont difficiles à déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce
cas l’identification [53].

2. Méthodes d’identification protéomique et génotypique


L'identification des bactéries, isolées à partir de prélèvements biologiques a été basée, pendant
des années, uniquement sur des critères morphologiques et biochimiques. Le développement
et l'utilisation des techniques de biologie moléculaire ont révolutionné toutes les disciplines
biologiques au XXème siècle et ont permis d'introduire ces approches au sein des laboratoires
d'analyse biologique. Le microbiologiste peut se tourner vers ces méthodes d’identification
pour deux applications principales. La première correspond à l’identification de bactéries
isolées en culture mais dont l’identification par les méthodes conventionnelles est difficile. La
seconde correspond à l’utilisation de la technique directement sur des prélèvements cliniques.
Ces techniques permettent de caractériser les micro-organismes d’un échantillon, qu’ils soient
cultivables ou non, dans leur environnement naturel. Les méthodes moléculaires peuvent
s’affranchir de la mise en culture [54]. Certaines applications de biologie moléculaire, dans un
souci de spécificité, nécessitent une étape préliminaire d’extraction d’ADN. Les techniques de
biologie moléculaire peuvent également permettre de détecter et d'identifier les supports
moléculaires des résistances aux antibiotiques et des facteurs de virulence [55].
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L’identification bactérienne moléculaire peut se faire par méthodes protéomique ou


génotypique.
2.1. Méthodes d’identification protéomique
La protéomique consiste à étudier (identifier, caractériser et quantifier) l’ensemble des
protéines d’un organisme, d’un fluide biologique, d’un organe, d’une cellule ou même d’un
compartiment cellulaire. Cet ensemble de protéines est nommé « protéome ». La bactérie
possède un protéome. Elle est constituée à 55% de protéines.
L’analyse protéomique se compose de trois étapes :
1) Séparation des protéines contenues dans l’échantillon biologique étudié par électrophorèse
bidimensionnelle (E-2D) ;
2) Traitement et mise en image de la séparation protéique permettant l’établissement d’une
carte protéique ;
3) Spectrométrie de masse, notamment la technique MALDI-TOF
2.2. Méthodes d’identification génomiques
Chaque espèce possède dans son génome au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN
ou ARN) qui lui est propre et qui la distingue des autres espèces. Le diagnostic moléculaire
fait appel à des techniques fondées sur l’étude, la détection et la modification de ces
séquences. En microbiologie, ces techniques permettent d’étudier, de classer et d’identifier les
microorganismes. Ainsi, dans le cadre du diagnostic microbiologique, on peut rapidement et
simultanément détecter, identifier, voire quantifier les bactéries en s’affranchissant des
techniques conventionnelles. De plus, contrairement aux méthodes de culture, il n’est pas
nécessaire de préserver la vitalité cellulaire en biologie moléculaire. Les techniques
moléculaires ont un bénéfice clinique lié à un gain de sensibilité, de spécificité, de temps et
une détection d’organismes morts ou difficilement cultivables [50].
2.2.1. La technique d’électrophorèse des acides nucléiques sur gel
L’électrophorèse sur gel consiste en la séparation des macromolécules (acides nucléiques et
également protéines) en fonction de leur taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés
physiques. Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous
l’influence d’un champ électrique [56]. La technique se fait sur gel d’agarose ou de
polyacrylamide. L'électrophorèse des acides nucléiques sur gel est une technique de base au
laboratoire de biologie moléculaire. Elle peut être utilisée :
- Soit à des fins analytiques, dans le but de séparer et identifier des fragments d'ADN,
pour déterminer leur taille, pour en estimer la quantité ;
- Soit à des fins préparatives, afin de purifier un fragment d'ADN de taille connue.
La taille des fragments d’ADN qu'il est possible de séparer est comprise entre 0,2 et 50
kilobases. Ces derniers sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le
bromure d'éthidium (BEI). On peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles
d'ADN (de l'ordre de 5-10 nanogrammes). La technique est très sensible ; elle est de plus
rapide et simple à mettre en œuvre [56,57].

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2.2.2. Les techniques d’hybridation (identification bactérienne avec sondes nucléiques)


Le principe des sondes nucléiques est de faire agir l’ADN ou l’ARN bactérien à identifier (la
cible), avec une séquence d’ADN ou d’ARN spécifique de la bactérie recherchée (la sonde).
Cette technique repose sur le phénomène d’hybridation qui se produit entre ces deux
séquences d’acides nucléiques et qui peut s’effectuer sur un support solide ou en milieu
liquide. De plus, l’une de ces séquences est toujours marquée de manière radioactive,
enzymatique ou chimique. De cette façon, lorsque l’hybridation entre la sonde et la cible se
produit, un signal est émis par le complexe, et il peut être étudié. Cette méthode permet alors
la détection et l’identification de la cible [58].
Il existe deux types d’hybridation : l’hybridation in situ et l’hybridation après transfert.
L’hybridation in situ ou HIS est une technique qui permet de mettre en évidence et de
localiser des séquences d’acides nucléiques dans les cellules ou les tissus par l’utilisation de
sondes complémentaires. Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radioactifs
ou par des produits non radioactifs fluorescents [59] (hybridation in situ en fluorescence ou
FISH, fluorescent in situ hybridization) ou non fluorescents. La technique offre également des
informations sur la forme des bactéries, les regroupements inter-bactériens et leurs rapports
avec les cellules hôtes.
L’hybridation après transfert comprend les techniques de Southern et Northern blot (transfert
à partir d’un gel d’électrophorèse) [60], le dot et le slot blot [61] et les puces à ADN [51].
2.2.3. Les méthodes d’amplification génique
Afin d’améliorer la sensibilité des méthodes diagnostiques, des systèmes permettant
d’amplifier le signal obtenu lors d’une hybridation moléculaire entre la cible et la sonde ont
été développés. Ces méthodes mettent en œuvre soit l’amplification des sondes, soit
l’amplification du signal (proprement dit), soit l’amplification de la cible [62].
L’amplification des sondes
Elle permet d’obtenir un nombre de copies comparable à celui qui est obtenu par
l’amplification des cibles. Il s’agit notamment la réaction de ligation en chaîne ou
LCR, Ligase Chain Reaction, qui est une méthode permettant l'amplification d'une
sonde complémentaire d'une cible ADN. Elle met en jeu deux couples de sondes
spécifiques de la séquence nucléique à rechercher, et une enzyme de type ligase. Les
deux sondes sont adjacentes sur le brin. Une ligase réalise une ligature entre les deux
sondes en formant une liaison covalente. Il en résulte la formation d'un ADN constitué
des deux sondes, qui pourra servir de matrice dans les cycles suivants [63].
L’amplification du signal (proprement dit)
La technique de l'ADN branché ou « branched DNA » (bDNA) permet l'amplification
d'une ou plusieurs sondes hybridées à un acide nucléique cible. Elle est basée sur
l'amplification du signal de détection. L'acide nucléique, après avoir été libéré des
particules virales, est hybridé à des sondes spécifiques de la cible qui sont ensuite
immobilisées sur un support solide. Ces sondes s'hybrident à d'autres sondes,
aboutissant à l'émission d'un signal quantifiable. Cette technique a été développée pour
détecter et quantifier des ADN ou des ARN [64].
L’amplification de la cible
Elle peut s’effectuer soit par des méthodes d’amplification in vivo utilisant des
bactéries, le clonage, soit par des méthodes d’amplification in vitro par voie

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enzymatique, la Polymérase Chain Reaction (PCR) ou réaction de polymérisation en


chaîne / amplification en chaîne par polymérase, en français. Le clonage consiste à
insérer une séquence, appelée insert, dans un vecteur (plasmide bactérien ou
bactériophage) par des techniques de recombinaison / insertion, pour obtenir un ADN
recombinant qui se répliquera dans une bactérie. Cela permet de disposer de plusieurs
copies identiques d’une séquence (gène ou fragment de gêne) in vivo. Cette technique
permet la constitution d’une banque d’ADN complémentaire et génomique. Ces
séquences peuvent ensuite être étudiées, notamment par séquençage. Cette approche,
bien qu’exhaustive, n’est actuellement pas utilisable en routine pour le diagnostic
microbiologique en odontologie, du fait de sa mise en œuvre longue et fastidieuse.
Toutefois, cette technique a permis d’étudier la diversité microbienne du sillon
gingivo-dentaire.
Les méthodes d’amplification par voie enzymatique (PCR et méthodes variantes) sont
fondées sur l'utilisation d'une enzyme ADN polymérase qui permet de recopier à partir
d'une amorce (amorce d'ADN) une séquence cible (ADN cible) connue [65]. La PCR
fournit une méthode ingénieuse afin d’amplifier spécifiquement une séquence d’ADN
de façon exponentielle in vitro. Cette méthode publiée par Mullis et al. en 1987,
repose sur la succession de cycles d’amplification. Elle est constituée d'une trentaine
de cycles, chacun d'eux comportant trois étapes essentielles :
1. La dénaturation thermique des ADN double brin en ADN simple brin ;
2. L’hybridation de deux oligonucléotides (couples d’amorces) de part et d’autre de la
séquence à amplifier (sur les brins cibles dénaturés) ;
3. L’extension ou élongation enzymatique des amorces par une ADN polymérase
thermorésistante. Cette dernière phase permet la synthèse d’un brin d’ADN complémentaire
par une ADN polymérase ADN dépendante thermostable (la Taq polymérase étant la plus
utilisée). Elle reste fonctionnelle tout au long de la PCR.
Le contrôle de ces trois étapes est réalisé par la modification de la température du milieu
réactionnel. La spécificité de la méthode dérive des amorces d’oligonucléotides synthétiques
utilisées, qui s’apparient de manière complémentaire aux brins d’ADN matrices et définissent
par conséquent les extrémités et la taille des séquences devant être amplifiées. Les fragments
d’ADN cibles sont amplifiés de façon exponentielle. En effet, à partir d’une matrice cible, un
nombre considérable de copies identiques est généré : les amplicons (ADN double brin bordé
par les amorces). Ainsi, celle-ci est détectée plus facilement, a posteriori.
La détection est différente suivant le type de PCR mis en œuvre. La PCR conventionnelle
peut être définie comme une PCR en point final et elle est opposée à la PCR en temps réel.
⁃ La PCR en point final : Les amplicons sont séparés en fonction de leur masse par
électrophorèse sur gel d’agarose, et visualisés à l’aide d’un agent intercalant fluorescent
(bromure d’éthidium) sous lumière ultraviolette (UV). La vitesse de migration est dépendante
du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons pourront donc être
vérifiées.
⁃ La PCR en temps réel (real-time PCR) ou PCR quantitative (ou qPCR) consiste à mesurer
la quantité d'ADN polymérisé à chaque cycle grâce à un marqueur fluorescent.

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Il existe de nombreuses variantes de la PCR, parmi lesquelles la « nested » PCR et la «


seminested » PCR [55], la PCR multiplexe [66], la PCR « universelle » 16S ou PCR
séquençage de l'ARN 16S [67], la RT-PCR (PCR après transcription inverse) et la PCR allèle-
spécifique [66].
2.3 Approche Meta-génomique
2.3.1 Définition
La métagénomique consiste à analyser l'ADN génomique d'une communauté bactérienne dans
son ensemble. En d'autres mots, c'est une approche basée sur l'isolation directe de l'intégralité
des acides nucléiques présents dans un échantillon prélevé dans un environnement donné, et
ceci sans aucun isolement ou culture de bactéries au préalable [68, 69].
Le préfixe " méta " qui en grec veut dire littéralement « au-delà », induit une distinction
majeure entre les termes " métagénomique " et " génomique ", ce dernier représentant l'étude
de l'ADN génomique issu d'un seul microorganisme ou d'une cellule unique [70].
2.3.2 Quels sont les types d'approches métagénomiques et leurs principales étapes en
termes de protocole ?
Cela dépend bien évidemment du but de l'étude en question mais pouvons résumer ces étapes
à la manière de celles illustrées dans la figure 11.

Figure 11 : Schématisation de plusieurs méthodologies courantes dans une analyse


métagénomique (figure adaptée d'Ederer, 2011).
Dans tous les cas, nous devons procéder après échantillonnage de l'écosystème en question, à
une extraction de l'ensemble de l'ADN ou l'ARN génomique présent dans le ou les
échantillon(s). Si l'estimation de la diversité bactérienne est le seul but de l'étude en question,
une amplification PCR spécifique des gènes codant pour l'ARNr 16S sera réalisée afin de
séquencer uniquement ces derniers en bout de ligne; nous obtiendrons ainsi une librairie à
grande échelle de gènes d'ARNr. Une telle librairie peut ensuite être soumise à une biopuce de
type PhyloChip afin de pouvoir comparer la diversité de cette dernière avec un ensemble de

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gènes codant pour des ARNr 16S connus [71, 72, 73]. Par contre, si nous s’intéressons cette
fois au potentiel métabolique d'un écosystème, nous allons s'efforcer d'analyser l'ensemble des
acides nucléiques de l'échantillon. L'ADN ou l'ADNc (ADN complémentaire obtenu par
rétrotranscription de l'ARN isolé) extrait peut être alors traité essentiellement de trois
manières différentes :
- Il peut être fragmenté aléatoirement, puis séquencé directement en utilisant des technologies
de séquençage à haut débit. Il faut noter que ce séquençage direct d'acides nucléiques après
extraction est de plus en plus privilégié à l'heure actuelle, étant donné qu'il permet de se
soustraire à toute étape de clonage. À noter cependant que la plupart des techniques de
séquençage à haut débit nécessitent la création d'une librairie de fragments d'ADN, néanmoins
ces derniers ne sont pas clonés, et il ne faut donc pas confondre ce type de librairie avec celui
mentionné dans le paragraphe suivant;
- Après fragmentation aléatoire, l'ADN peut également être cloné afin de constituer une
librairie de clones à petits ou larges inserts qui sera ensuite séquencée par la technique de
Sanger [74] ou par une technologie à haut débit; c'est ce que nous appelons le séquençage en
aveugle. Cette librairie peut ensuite être parcourue pour rechercher puis séquencer des clones
comportant un gène d'intérêt, ou bien séquencée en totalité pour permettre la reconstitution de
génomes complets [75];
- Troisièmement, l'ADN génomique extrait peut aussi être analysé par des biopuces de type
GeoChip 3.0 contenant un ensemble de sondes spécifiques à des marqueurs phylogénétiques
(Tel que gyrB) et à des gènes d'intérêts connus (appartenant à des cycles biogéochimiques par
exemple) [76,77].
Dans tous les cas, le volume conséquent de fragments séquencés (appelés " reads " en
anglais) lors d'une étude de métagénomique, fait en sorte que l'utilisation de la
bioinformatique est indispensable afin d'analyser ces derniers.
D'un point de vue général, toute étude faisant appel à la métagénomique doit s'orienter vers
l'une des approches suivantes [78] :
- La première est centrée sur le " génome " afin de déterminer les membres composant une
communauté bactérienne, avec le but ultime de tenter d'assembler leur génome complet;
- La seconde aspire quant à elle, à réaliser une analyse fonctionnelle de la communauté
échantillonnée afin de déceler son potentiel métabolique. Elle est donc basée cette fois-ci non
pas sur le " génome " mais sur le " gène ".
- La combinaison des deux approches citées précédemment est également envisageable.
Les études métagénomiques effectuées jusqu'à présent ont porté sur trois principaux types de
communautés microbiennes :
- Les communautés que l'on retrouve à l'état naturel (environnements tempérés ou extrêmes);

- Les communautés vivant dans un environnement modifié par l'activité humaine;


- Les communautés qui dépendent d'un hôte pour survivre.

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2.3.3 Défis
Conceptuellement, une approche métagénomique semble plutôt simple; il suffit d'extraire,
puis de séquencer les acides nucléiques d'un échantillon environnemental, pour ensuite
analyser le tout afin de caractériser la communauté bactérienne de l'échantillon en question.
Mais en réalité, l'utilisation de la métagénomique amène certains défis et limites dont il faut
tenir compte lors de la conception de la méthodologie d'un projet et dans l'interprétation des
résultats obtenus. Les éventuels problèmes associés à une étude de métagénomique
peuvent être comme suit :
- Environnement analysé : Il faut toujours être conscient que l'échantillonnage d'un
environnement donné se fait en un point géographique bien particulier, et à un
moment précis dans le temps, et que par conséquent, la composition d'une
communauté peut varier grandement si l'un ou l'autre de ces paramètres change [79,
80].

- la notion de microenvironnement vient compliquer le processus d'échantillonnage, qui


généralement n'est pas assez précis pour différencier les sous écosystèmes qui peuvent
coexister dans un même environnement.

- le principe même de la métagénomique fait en sorte que les fragments séquencés à


partir d'un échantillon d'ADN génomique sont issus d'un plus ou moins grand nombre
d'espèces différentes dont, pour la majeure partie, le génome complet n'est pas présent.
L'identification de l'espèce d'origine auquel appartient un fragment donné n'est donc
pas chose aisée.

- Une analyse métagénomique permet habituellement d'identifier seulement les


membres les plus abondants d'une communauté [81], car les espèces les plus
nombreuses masquent celles qui sont rares, en fournissant une part beaucoup plus
importante du matériel génétique total de la population bactérienne en question. Ainsi,
les chances de retrouver des fragments appartenant aux espèces moins représentées
dans l'échantillon sont plus faibles.

- Les approches métagénomiques ont nécessité le développement de méthodes


recherchant la meilleure efficacité en termes d’exhaustivité et de représentativité de
l’ADN extrait. Des protocoles ont alors été développés afin d’extraire et de purifier
l’ADN à partir des échantillons environnementaux, mais aucun n’a encore été
démontré suffisamment universel pour être accepté comme standard [82].

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Conclusion :
Les organismes vivant en milieux extrêmes et en particulier, les microorganismes présentent
un répertoire de voies métaboliques et de biomolécules originales leur permettant non
seulement de survivre dans ces conditions, mais aussi de se développer souvent de manière
optimale. L’intérêt porté à ces microorganismes a abouti à la découverte d’une diversité
inouïe, complètement inattendue, dans des milieux supposés hostiles à la vie. Egalement, les
propriétés singulières de leurs biomolécules à savoir les enzymes ont très vite attiré l’attention
des biotechnologues.

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