Modèles animaux :

génétique de la souris

Jean Jaubert
1
Plan général
Eléments de nomenclature
- Origine des souris de laboratoire

- Données Génétiques de base pour la souris

- Les types de lignées : consanguines, congéniques, consomiques,

recombinantes consanguines, recombinantes congéniques;
les colonies non consanguines

- Effet du fonds génétique

- Contrôle de qualité génétique

- La séquence et après…

2
Origine des souris

3
 Origine des souris de laboratoire

Ancestral
Mus musculus
species

1M
domesticus castaneus musculus années

molossinus
2000
ans
European East asian
fancy mouse fancy mouse
100
ans
Laboratory
strains
Wade et al. (2002), Nature, 420, 574-578 4
Phylogénie des souris

domesticus

M. musculus
musculus
molossinus
castaneus
bactrianus

M. spicilegus
M. macedonicus

M. spretus

M. caroli
M. cooki
M. cervicolor

M.A.
1,10

0,23
0,35
2,40

1,75

0
5
Miss Abbie C. Lathrop

Origine des principales lignées consanguines

d'après Mouse in Biomedical Research
Ed. by Henry L. Foster, J. David Small and James G. Fox
Academic Press, 1981 6
 William E.
Castle
(1867-1962)

Clarence C.
Little
(1888-1971)

Leonell C.
Strong

7
 C3H
DBA/2

SJL/J BALB/c
129
FVB/N

ICR

C57BL/6

CAST

ftp://ftp.informatics.jax.org/pub/datasets/misc/genealogy/genealogy.pdf
8
Eléments de nomenclature

9
La nomenclature

- Elle est indispensable

- Elle doit être rigoureuse

- Elle apporte des informations

… malheureusement, les règles dépendent des espèces !

Référence (Mouse Genome Informatics ou MGI)

- http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen

10
Définitions

Allèle Variant de séquence d'un gène, identifié au niveau de l'ADN

(polymorphisme) ou d'un phénotype (mutant).

Locus Site quelconque du génome, fonctionnel ou non, qui peut être cartographié
par une analyse génétique formelle.

Gène Une séquence d'ADN à laquelle on peut attribuer une fonction ou un

caractère.

Gènes chez Le symbole est en italiques, le premier caractère est en majuscule, les
autres en minuscule (ex : Apc, Adenomatosis polyposis coli). Les protéines
la souris
sont écrites en majuscules et sans italiques (APC).

Gènes chez Le symbole est en italiques, tous les caractères sont en majuscule (ex :
APOA1). Les protéines sont en majuscules et sans italiques (APOA1).
l'homme

11
Définitions
Marqueur Moyen permettant l’identification d’un gène ou d’un locus

Haplotype Association d’allèles (tout type de marqueurs) génétiquement liés

Variant Formes d’épissage alternatives d’un gène résultant de la combinaison de

différents exons
d’épissage

Mutation Allèle conférant une différence phénotype identifiable par rapport à la

référence « sauvage »

Génotype Description de la composition génétique d’un animal (allèles particuliers à

des loci particuliers)

Phénotype Résulte de l’interaction entre génotype et environnement, mesurable

Dominant et Comment est hérité le phénotype

récessif : les 2 allèles sont porteurs du variant ou de la mutation
récessif
Dominant : un seul variant allèlique est suffisant

Quantitativ Loci polymorphes contenant des allèles affectant de façon différente

l’expression de traits phénotypiques quantitatifs ou à distribution
e Trait Loci
continue
(QTLs)
12
« Laboratory codes »

„ Le Laboratory Registration Code or Laboratory code

„ Usuellement composé de 3 à 4 lettres (1ère lettre en majuscule, ensuite
en minuscules)
„ identifie un institut, un laboratoire ou un chercheur qui a produit ou
détient de stocks d’animaux
„ Sous-lignées, congéniques, autres lignées… devraient être identifiées
par ce Lab code, pour les distinguer entre elles
„ Attribués par « Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) »
(http://dels-old.nas.edu/ilar_n/ilarhome/register_lc.php).

„ Exemples de Laboratory codes :

„ J The Jackson Laboratory
„ Rl W.L. and L.B. Russell
„ Jr John Rapp
„ Mcw Medical College of Wisconsin
„ Kyo Kyoto University
„ Rj Centre d’élevage Robert Janvier
„ Hsd Harlan Sprague Dawley
„ Crl Charles River Laboratories
„ Pas Institut Pasteur…

13
Données génétiques de base chez la souris

19 chromosomes acrocentriques + XX ou XY

Environ 1500 cM (1 cM de souris = 1,8 Mb

d’ADN)

10.000 marqueurs (6000 microsatellites) =

résolution théorique 0,1 cM

Nombreuses homologies de synténie avec

les chromosomes humains

14
Homologies de synténie homme-souris

„ Sur de courtes distances,

l’arrangement linéaire des
gènes sur les chromosomes
est le même chez l’homme et A
a
chez la souris B
b
„ Cela permet de faire des C

centromère
prédictions sur la probable ? c
localisation d’un gène D
lorsque celle ci est connue e
dans une espèce et pas dans
l’autre
E d
„ Cela permet aussi de valider
certains modèles
15
Homologies interspécifiques

Souris Homme

Chr 5

Chr 18

Chr 2

Chr 1

16
Le génome de l’homme

„ Compétition public/privé

„ Différences de méthodes: WGS vs Contig-based

„ The sequence of the human genome (CELERA)

Science. 2001 Feb 16; 291(5507): 1304-51

„ Initial sequencing and analysis of the human genome

(Human genome consortium)
Nature. 2001 Feb 15; 409(6822): 860-921

„ 1ers assemblages mis en ligne en 2001: golden path

17
Le séquençage des génomes

18
Le génome de la souris

„ 3 x 109 bp (comme l ’homme), environ 750 Mo

„ Certainement > 30,000 gènes mais probablement < 100,000

„ Pas plus de 5 à 8 % d’ADN code pour des protéines

„ Beaucoup de séquences répétées (2 à 105 copies par génome)

„ Chr10 souris = génome de la Drosophile

„ Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.

Nature. 2002 Dec 5; 420(6915): 520-62

19
Les autres génomes

„ Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights

into mammalian evolution
Nature. 2004 Apr 1;428(6982): 493-521

„ Genome sequence, comparative analysis and haplotype

structure of the domestic dog
Nature. 2005 Dec 8;438(7069): 803-19

„ Should the draft chimpanzee sequence be finished ?

Trends Genet. 2006 Mar;22(3): 122-5

20
La fuite en avant…

„ Séquenceurs haut-débit: 454 et Solexa

„ Puces hautes densités en SNPs (1M) pour génotypage

et/ou recherche de CNVs chez l’homme et chez la souris

„ 17 autres lignées de souris en cours de séquençage

„ 74 autres lignées de souris pour avec données de SNPage

haute densité

„ Projet 1000 Génomes (Humain) pour fin 2009

21
Bases de données phénotypiques souris

• Souris
• MGI: //www.informatics.jax.org
• Phenome Mouse: //phenome.jax.org/pub-
cgi/phenome/mpdcgi?rtn=docs/home
• Trans-NIH Knock-out mouse project: en construction
• Mouse Knockout & Mutation Database:
//research.bmn.com/mkmd payant
• Homme
• OMIM:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

22
Bases de données marqueurs/SNPs souris

• Whitehead/ MIT: //www.broad.mit.edu/tools/data/genvar.html

• Genethon: //www.cephb.fr/ceph-genethon-map.html

• NCBI: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi/
ou, …gov/SNP/MouseSNP.cgi

• MGI: //phenome.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?rtn=snps/door

• Roche (SNPs): //mousesnp.roche.com/cgi-bin/msnp.pl

• WTCHG: //zeon.well.ox.ac.uk/rmott-bin/strains.cgi

23
Bases de données séquence souris

• NCBI: //www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview

• ENSEMBL: //www.ensembl.org

• UCSC: //genome.ucsc.edu

• DOE Joint Genome Institute: //www.jgi.doe.gov

(Community Sequencing Programs)

24
Les populations de souris de laboratoire

Lignée consanguine (inbred strain)

Lignée co-isogénique

Lignée congénique (et speed congenic)

Colonies non consanguines

Lignées recombinantes consanguines

Lignées recombinantes congéniques

25
Lignée consanguine

Lignée
DBA/2J
F175

F176

F177

26
Les quatre types de croisement

INCROSS (OUT)CROSS

A/A x A/A a/a x a/a A/A x a/a

A/A a/a A/a

BACKCROSS INTERCROSS

A/a x a/a A/a x A/a

50% A/a 50% A/a

50% a/a 25% a/a
25% A/A
27
 Quatre types de croisements

I) INCROSS IV) CROSS

Descendants
A/A x A/A a/a x a/a A/A x a/a
Type Génotypes a/a a/a' a'/a'
A/A a/a A/a I a/a x a/a 1

II) BACKCROSS III) INTERCROSS II a/a' x a/a 0,5 0,5

A/a x a/a A/a x A/a a/a' x a'/a' 0,5 0,5

50% A/a 50% A/a

III a/a' x a/a' 0,25 0,5 0,25
50% a/a 25% a/a
25% A/A IV a/a x a'/a' 1

Fréquences des types de croisements à la génération N+1

en fonction de la génération N
Génération N+1
Type (gén. N) I II III IV
I 1
II 0,25 0,5 0,25
III 0,125 0,5 0,25 0,125
IV 1

28
 Evolution des types de croisements au cours des générations

Type Génotypes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

I a/a x a/a 0,125 0,281 0,414 0,525 0,616 0,689 0,748 0,796 0,835 0,867 0,892 0,913 0,929 0,943 0,954 0,963 0,970 0,976 0,980 0,984

II a/a' x a/a 0,500 0,375 0,344 0,273 0,225 0,181 0,147 0,119 0,096 0,078 0,063 0,051 0,041 0,033 0,027 0,022 0,018 0,014 0,012 0,009

III a/a' x a/a' 0,250 0,313 0,203 0,176 0,138 0,113 0,091 0,073 0,059 0,048 0,039 0,031 0,025 0,021 0,017 0,013 0,011 0,009 0,007 0,006

IV a/a x a'/a' 0,125 0,031 0,039 0,025 0,022 0,017 0,014 0,011 0,009 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,003 0,002 0,002 0,001 0,001 0,001

Hétéro 0,875 0,719 0,586 0,475 0,384 0,311 0,252 0,204 0,165 0,133 0,108 0,087 0,071 0,057 0,046 0,037 0,030 0,024 0,020 0,016

1,000

0,900
0,800

0,700
Type I
0,600
Fréquence

Type II
0,500
Type III
0,400
Type IV
0,300

0,200
0,100

0,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2

Générations

29
Évolution du pourcentage du génome à l'état hétérozygote
au cours des générations de consanguinité

1
Pourcentage des locus
à l'état hétérozygote

0,1

0,01

0,001
0 5 10 15 20 25

Nombre de générations de consanguinité

30
Lignées consanguines : sous-lignées

F16

F17

F18

F19

31
Entretien d'une lignée consanguine

F16

F17

F18

F19

32
Propriétés des lignées consanguines

- Populations génétiquement homogènes et (assez) stables dans le temps

- Tous les individus sont identiques : un couple suffit à définir la lignée

(ex : duplication ou congélation de la lignée)

- Pas de variance phénotypique d'origine génétique : variance phénotypique

totale faible, plus grande facilité à mettre en évidence une différence

- Plusieurs centaines de lignées consanguines disponibles

- Possibilité d'étudier l'effet du sexe à génotype constant

- Possibilité d'étudier un phénotype apparaissant avec une fréquence faible

- Certaines lignées ont des propriétés biologiques très particulières

(NOD, DDK, etc…) et sont des modèles d'étude

- Croisements entre lignées consanguines : configurations génétiques simples

33
Lignées consanguines : avantages

Faible variabilité biologique : grande puissance

pour détecter des différences

Nombreuses lignées disponibles avec

caractéristiques originales

Possibilité d'identifier des gènes responsables

de différences phénotypiques

34
Lignées consanguines : limites

Fragilité, difficulté d'élevage

Sensibilité à l'influence de facteurs génétiques

(mutations) et non génétiques (environnement)

Risque de faire des observations non

représentatives ou généralisables

35
Mouse Phenome Database (1)

Red blood cell count (x109/mL)

36
Mouse Phenome Database (2)

Phospholipid protein transfer activity after 6 wks on atherogenic diet

www.jax.org/phenome
37
Eléments de nomenclature

38
Lignées consanguines
- Définition : au moins 20 générations FxS; générations de consanguinité : F50

- Symbole : une lettre majuscule + autres lettres ou chiffres

ex : A, AKR, NZB, C3H
exception : 129

- Sous-lignées : barre oblique

+ chiffre : DBA/2
+ lettre(s) : C3H/He, FVB/N
+ les deux : C57BL/6J

39
Hybrides F1
- Définition : issus du croisement entre deux lignées consanguines

- Symbole : abréviation en majuscules des deux lignées parentales

40
Abréviations autorisées
129 129 strains (may include subtype, e.g., 129S6 for strain 129S6/SvEvTac)

A A strains

A K AKR strains

B C57BL

B 6 C57BL/6 strains

B10 C57BL/10 strains

B R C57BR/CD

C BALB/c strains

C 3 C3H strains

C B CBA

D 1 DBA/1 strains

D 2 DBA/2 strains

H R HRS/J

L C57L/J

R 3 RIIIS/J

J SJL

SW SWR

41
Hybrides F2
- Définition : issus du croisement entre des F1 issus de deux lignées consanguines

- Symbole : abréviation en majuscules des deux lignées parentales

42
Nomenclature quizz

„ BALB/cByJRj
„ La lignée BALB, sous-lignée /c, crée par le Dr Bayley élevée
au Jackson puis maintenue par l’elévage Janvier

„ ACI/N (F159)
„ Lignée de rat ACI, élevée au NIH avec 159 générations de
croisements frères x soeurs.

43
 Lignée consanguine ségrégeant pour une mutation
récessive viable et fertile à l'état homozygote

Lignée
129/SvJ +/bal bal/bal
F?+6

bal/bal +/bal
F?+7

+/bal bal/bal
F?+8

44
 Lignée consanguine ségrégeant pour une mutation
récessive létale (ou stérile)
Lignée BALB/cJ
+/rl +/rl F?+26

F?+27

[rl] [+] [+] [+] [+]

rl/rl +/rl ? +/rl ? +/rl ? +/rl ?

Au moins un [rl] dans les 10 Pas de [rl] dans les 10

premiers petits: premiers petits:
les deux parents sont +/rl l'un des parents est
"probablement" +/+

Nouveaux couples à partir des petits Éliminer le couple F?+28

normaux frères et sœurs de [rl]
45
Lignée co-isogénique

Lignée C57BL/6J [+] [+]

F65

[+] [+] [+] [+]

F66

[+] [+] [+] [+]

F67
+/c
[+] [+] [+] [+]
F68
+/c

[+] [+] [+] [+]

F69
+/c +/c
[c] [+] [+] [+]
F70
c/c +/c

46
Eléments de nomenclature

Allèles chez Le symbole est en italiques et en exposant du symbole du gène. Le

premier caractère est une majuscule si la mutation est (co-)dominante
la souris
(ex: Apc , multiple intestinal neoplasia). C'est une minuscule si la
Min

mutation est récessive (ex: Leprdb, gène = leptin receptor, allèle =

diabetes).
Quand un allèle n'est reconnu que par un phénotype mutant, les symboles
du gène et de l'allèle sont identiques (db était le symbole de diabetes).

47
Mutations spontanées ou induites non ciblées
- Définition : mutations apparues spontanément ou obtenues après mutagénèse
physique (rayonnements ionisants) ou chimique aléatoire.

- Symbole : Nom de la lignée consanguine

+ symbole de l'allèle muté

48
Mutations co-isogéniques
-Définition : lignée consanguine différent pour un seul locus (en général suite à une
mutation).

- Symbole : symbole de la lignée + tiret et le symbole du gènes différent, en italique

„ C57BL/6JEi-tth
„ The tremor with tilted head mutation in the C57BL/6JEi
strain.

„ C57BL/6J-Aqp2cph
„ The congenital progressive hydronephrosis mutation in the
aquaporin 2 gene arose on the C57BL/6J strain

49
Lignée congénique

- Lignée consanguine dans laquelle on a introduit une mutation ou un

transgène par croisement

Tg/+

n"
tioa
Tg/+
nis
gé
on
"C

+/+

50
Lignée congénique pour un locus
Backcross

Lignée FVB/N Tg/+ +/+ Lignée C57BL/6

Identification des Tg/+ C57BL/6 +/+ F1 = N1

Identification des Tg/+ C57BL/6 +/+ N2

Identification des Tg/+ C57BL/6 +/+ N3

Répéter jusqu'à N10

Identification des Tg/+
N10

Identification des Tg/Tg

N10F1
Lignée congénique de C57BL/6
51
Lignée congénique pour un locus
Intercross
Lignée BALB/cJ c/c +/+ Lignée C57BL/6

+/c +/c F1 = N1

Identification des c/c C57BL/6 +/+ F2 = N1F1

+/c +/c N2

Identification des c/c C57BL/6 +/+ F2 = N2F1

Répéter jusqu'à N10

Identification des c/c N10F1

Identification des c/c N10F2

Lignée congénique de C57BL/6

52
Lignée congénique : proportions théoriques de
provenance du génome

% moyen % génome % génome

segments hét. donneur receveur
Génération

F1 100 50 50
N2 50 25 75
N3 25 12,5 87,5
N4 12,5 6,25 93,7
N5 6,3 3,125 96,7
N6 3,1 1,56 98,4
N7 1,6 0,78 99,2
N8 0,8 0,39 99,6
N9 0,4 0,2 99,8
N10 0,2 0,1 99,9

53
Lignée congénique : évolution du segment transféré

30

25

20
cM

15

10

0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Générations de backcross (N)

54
Lignée congénique : évolution du segment transféré

A B N3 B

Tg Tg

N1 B N4 B
Tg Tg

N2 B N5 B

Tg Tg

55
Lignée congénique : sélection par marqueurs

F1 B

m1
X
m2

B
m1
X
m2

B
m1
X
m2

56
Lignée speed congénique
Wakeland et al., Immunology today, 1997, 18, 472-477

57
Lignée speed congénique

Souris D1Mit12 D2Mit4 D4Mit7 …… D19Mit65 % B/B

1 B/B B/B A/B ... A/B 53

2 B/B A/B B/B ... A/B 49

3 A/B A/B A/B ... B/B 41

4 A/B B/B B/B … A/B 55

5 A/B B/B A/B … B/B 62

6 B/B B/B A/B … B/B 74

…. …. …. …. …. …. ….

96 B/B A/B A/B … A/B 57

97 B/B A/B B/B … B/B 43

98 A/B A/B B/B … B/B 52

99 A/B A/B B/B … A/B 48

100 B/B B/B A/B … B/B 46

% B/B 47 54 50 … 42

58
Lignée speed congénique

59
Lignée speed congénique

N2 (15%) N3 (3%) N4 (<1%)

60 30 30
50 25 50
Nb souris

40 20 40
30 15 30
20 10 20
10 5 10

0,3 0,5 0,7 0,05 0,15 0,25 0,01 0,03 0,05

Hétérozygotie

Intercross pour produire la lignée congénique

Voire même possibilité de lignée « Supersonique » congénique !
60
Lignée consomique ou CSS

- Lignée consanguine dans laquelle on a introduit par croisement

une paire de chromosomes d’origine différente
F1 B

B
Consomique A-Chr XB

61
Eléments de nomenclature

62
Lignées congéniques
- Définition : produites par >10 générations de croisement sur une lignée consanguine

- Symbole : abbréviation en majuscules des deux lignées parentales

+ symbole de l'allèle provenant de la lignée donneuse

63
Lignées consomiques
- Définition : lignée consanguine dans laquelle on a transféré par croisements répétés
un chromosome entier d’une autre lignée

- Symbole : Lignée receveuse-Chr #Lignée Donneuse

„ SHR-Chr YBN
„ Pour cette lignée consomique de rat, le chromosome Y de BN a été transféré
par backcross répétés sur le fonds SHR.

„ C57BL/6J-Chr 19SPR
„ Pour cette lignée consomique de souris, un Chromosome 19 s’origine Mus
spretus a été backcrossé sur C57BL/6J.

„ C57BL/6J-Chr 1A/J Chr 3DBA/2J

„ Pour cette lignée consomique de souris, le Chromosome 1 de la lignée A/J et
le Chromosome 3 de la lignée DBA/2J ont été backcrossés sur C57BL/6J.

64
Les colonies non consanguines

- Produire des animaux qui ressemblent davantage aux populations

naturelles
- Entretenir une hétérogénéité génétique

- Eviter au maximum les croisements consanguins

- Objectif : < 1% d'augmentation de la consanguinité par génération

- La population est définie par des fréquences alléliques

65
Colonies non consanguines

Rotation des géniteurs

Colonie de grande taille

66
Propriétés des colonies non consanguines

- Populations génétiquement hétérogènes, plus proches des

populations naturelles

- Robustes et faciles d'entretien

- Tous les individus sont différents : il faut un très grand échantillon

d'individus pour s'approcher de la composition génétique

- L'entretien d'une colonie non consanguine doit se faire à grande échelle,

avec des règles strictes

- Variance phénotypique totale assez grande : moins de puissance pour

mettre en évidence une différence
Lignée consanguine
Fréquence
Colonie non
consanguine

Paramètre 67
Origine colonies non consanguines

ƒ La plupart des colonies non-consanguines ont une origine

commune :
- Elles dérivent d’une seule colonie Swiss d’environ
200 souris à partir de laquelle 2 mâles et 7 femelles ont été
importées au Rockefeller Institute for Medical Research in
New York

- Outbred Swiss stocks disponibles actuellement :

NMRI, CFW, MF1, CD1, ICR, NIHS, ND4 and SW.

ƒ Toutes les outbreds ne proviennent pas de Lausanne en

Suisse (Switzerland).
- Exemples de lignées Non-Swiss :
CF-1, NSA, OF1, SABRA et TO.

68
Origine colonies non consanguines

69
- Manque de puissance

ex : sommeil après hexobarbital :

- de 18 à 48 min (sd 3,2 min) chez consanguines
- 43 et 48 min (sd 13,5 min) dans 2 stocks

pour rechercher une différence de 4 min. (5%, puissance 80%) :

- 12 souris consanguines
- 180 souris non consanguines

puissance pour détecter 4 min. de différence avec 20 souris :

- 97% avec souris consanguines
- 14% avec souris non consanguines

70
Faut-il vraiment continuer d'utiliser des
souris non consanguines ?

- Composition génétique de chaque stock est mal connue, mal contrôlée

- Hétérogénéité génétique très variable d'un stock à l'autre
- Accidents de population souvent mal documentés (bottleneck,
sélection directionnelle) avec conséquences importantes
- Ségrègent parfois pour des mutations récessives délétères
- Génétiquement instables

- Et pourtant: résolution génétique plus fine (math), variabilité plus

proche de ce qu’on observe chez l’homme

71
Colonies non consanguines : avantages

Grande robustesse et prolificité, faible coût

Génétiquement hétérogènes donc plus

représentatives d'une population naturelle

72
Colonies non consanguines : limites

Résultats plus hétérogènes d'un individu à l'autre

Populations difficiles à stabiliser génétiquement

Nécessité de recourir à de groupes importants

73
Eléments de nomenclature

74
Colonies non consanguines
„ Pour les outbreds, la racine de la lignée est précédée par le
code ILAR de l’institution qui maintient la colonie.

„ Tac:ICR
„ Le stock ICR outbred maintenu par Taconic Farms, Inc.

„ Hsd:NIH Swiss
„ Le stock NIH Swiss outbred maintenu par Harlan Sprague
Dawley, Inc..

„ C57BL/6Tac-Bmp4tm1Blh[cc]
„ Une colonie fermée de souris provenant de la lignée
consanguine C57BL/6Tac et portant une mutation ciblée
(tm1Blh) sur le gène Bmp4

75
Conplastiques
„ Les lignées conplastiques sont des lignées dans lesquelles le
génome « nucléaire » d’une lignée a été introduit dans le
cytoplasme d’une autre, i.e., le donneur mitochondrial est
toujours le parent femelle lors du programme de backcross
répétés

„ NUCLEAR GENOME-mt CYTOPLASMIC GENOME

„ C57BL/6J-mt CAST/Ei
„ Une lignée avec le génome nucléaire de C57BL/6J et le
génome cytoplasmique (mitochondrial) de CAST/Ei.

76
Les lignées recombinantes consanguines
(Recombinant inbred strains)

Lignée A Lignée B

F1 F1

F2
....

20 générations de croisements consanguins

AXB-1 AXB-25

77
Les lignées recombinantes consanguines

F1 25 couples F2

A
…..

F20
…..

AXB-1 AXB-25

78
Propriétés des lignées rec. consanguines

- Populations génétiquement homogènes et stables (consanguines)

- Génotypes recombinants fixés de façon définitive

- Possibilité de les reproduire à l'infini

- Cumuler les observations faites dans plusieurs laboratoires

- Etudier l'effet du sexe à génotype recombinant constant

- Etudier des caractères quantitatifs avec répliques, des

caractères mesurés par moyenne et écart-type, par des
pourcentages, des taux de survie, etc...

79
Grisel et al., J. Neurosci., 1997, 17, 745-754

80
Les lignées recombinantes congéniques
(Recombinant congenic strains)

Lignée A Lignée B

F1 Lignée B

BC1 B .... B

20 générations de croisements consanguins

AcB-1 AcB-25

81
Les lignées recombinantes congéniques

25 couples BC x B
F1 BC × B BC × B

A
…..

× × 20 générations de
croisements consanguins
B B

F20
…..

AcB-1 AcB-25
82
Propriétés des lignées rec. congéniques

- Tous les avantages des lignées recombinantes consanguines :

stabilité, génotypes fixés, résultats cumulables, ...

- Plus grande puissance pour l'étude des caractères multigéniques

et la recherche d'interactions épistatiques

26 lignées recombinantes 26 lignées recombinantes

Caractère consanguines congéniques
contrôlé par 9 14
8 12
5 locus
7

Nombre de lignées
Nombre de lignées

10
6
5 8
4 6
3
4
2
1 2
0 0
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
Nombre de locus différant entre Nombre de locus différant entre
une lignée recombinante consanguine une lignée recombinante congénique
et la lignée parentale A et la lignée receveuse B
83
Eléments de nomenclature

84
Lignés recombinantes consang. ou cong.

„ CXB
„ Lignée recombinant consanguine produite par croisement
entre les lignées BALB/c x C57BL/6J

„ BXD1, BXD2, BXD3

„ Membres du panel de lignées RI BXD obtenues par
croisement entre C57BL/6 x DBA/2.

„ CcS
„ Lignée Recombinante congénique entre BALB/c receveuse et
STS donneur.

85
Le "Collaborative Cross"

- Produire un jeu de lignées

consanguines hybrides entre 8
lignées consanguines très
différentes

- Mélanger le génome de
différentes sous-espèces pour
obtenir un "feu d'artifice" de
phénotypes nouveaux

- Objectif : > 1000 lignées !

Actuellement : > 700 en cours

- Intérêts :
→ Créer des phénotypes très variés dans des lignées stables
→ Avoir les moyens d'identifier les gènes responsables (voies métaboliques)
→ Permettre de comparer phénotypes / expression / génotypes
86
 C57BL/6

129S1/Sv

NZO

NOD/Lt
Le "Collaborative Cross"

A/J

WSB/Ei

CAST/Ei

PWD
87
Le "Collaborative Cross"

1.000 lignées indépendantes dont le génome est un réassortiment unique

88
 GeneNetwork.org

Génotypes Expression des gènes Phénotypes

Quels gènes contrôlent

le niveau d'expression ?

Quels gènes sont

co-exprimés ?
Lignées

Quels phénotypes
sont corrélés ?

Quels gènes ont un niveau

d'expression corrélé à un phénotype ?

Quels gènes contrôlent un phénotype ?

89
GeneNetwork.org

90
Effet du fonds génétique

91
Effet du fonds génétique: exemples

C57BL/6 C57BL/Ks
diabetes (db), obésité diabète
obese (ob)
(B6 x AKR)F1 C57BL/6
Multiple intestinal ~ 6 polypes ~ 30 tumeurs
neoplasia (Min) intestinales

CD-1 CF-1
EGF-R knock-out survie à mort à
3 semaines l'implantation

92
Effet du fonds génétique

Modèles animaux et pathologie humaine

Lignée
B A C consanguine

Population
Fréquence

humaine

Sévérité du phénotype

93
Gènes modificateurs chez la souris

Peuvent être localisés dans des croisements

- F2 ou BC à partir de lignées consanguines

Leur fonction physiologique peut être étudiée

- lignées congéniques, variants présents dans des lignées consanguines
- lignées transgéniques, KO, KI, KO conditionnels

Fournissent des candidats pour l'homme

- difficiles à identifier chez l'homme (gènes x environnement)
- homologies homme-souris : gènes, fonctions, voies métaboliques

Enjeu majeur pour les maladies monogéniques

- dépistage précoce des formes à évolution sévère
- traitements pour réduire la gravité des symptômes

94
Ferrochelatase deficiency

- Apparue après mutagénèse à l'ENU

- Backcross répétés sur BALB/c

- Anémie, ictère, hépatomégalie, splénomégalie

- Dépôts de pigment brun et de cristaux dans les cellules de

Küppfer et les voies biliaires

- Déficit partiel en ferrochelatase :

3 à 5 % d'activité résiduelle chez les homozygotes
55% d'activité résiduelle chez les hétérozygotes
95
Ferrochélatase

Me Vi Me Vi

Fe2+
Me N Me Me N Me
NH HN N Fe2+ N
Pr Vi Pr Vi
N N

Ferrochélatase

Pr Me Pr Me

Protoporphyrine IX Hème

- Membrane interne de la mitochondrie

- Hème : érythropoïèse, cytochromes

96
Protoporphyrie érythropoïétique (homme)

- Déficit partiel en ferrochelatase

- Photosensibilité d'apparition précoce (jeune enfant)

- Accumulation de protoporphyrines (peau, foie)

- < 5% des cas : accumulation massive de PP dans le foie,

troubles excrétoires, lésion hépatocellulaires,
insuffisance hépatique fatale

97
Physiopathologie de le PPE

PEAU
Photosensibilité

ERYTHROBLASTES PLASMA FOIE

Cristaux,
Protoporphyrine lésions et mort
cellulaires
Fe++
Ferrochélatase Dégradation Bilirubine Conjugaison

HEME Excrétion
biliaire

ANEMIE ICTERE INSUFFISANCE

HEPATIQUE

98
Effet du fonds génétique

Non-transgéniques
f/f
50% BALB/cJ
SJL 25% SJL
25% C57BL/6J
cDNA
C57BL/6J
ferrochelatase
humaine

Hormones +/+ +/f Proto: ++

Ictère: -
+/f
BALB/cJ
f/f

Proto: +++
Ictère: +++

99
Lignées congéniques

BALB/cJ
f/f

SJL C57BL/6J

f/f f/f

100
Recherche de gènes modificateurs

Gènes
Quel phénotype
modificateurs
étudier ?

Fonctions cellulaires

Interactions cellulaires
/ tissulaires
SOUS-
PHENOTYPES

Fonctions biologiques

EVALUATION Etat physiologique global

CLINIQUE

101
Lignées congéniques (3 mois)
Masse corporelle (g)
BALB/c 32
C57BL/6 30
SJL
28

26
24
22
20
BALB/cJ SJL
+/+ fech/fech

GR (x109/mL) Hb (g/dL) Ht (%)

11 16 54
15 52
10 50
14
48
9 13
46
12
8 44
11 42
7 10 40
+/+ fech/fech +/+ fech/fech +/+ fech/fech

102
Lignées congéniques (3 mois)
BALB/c
C57BL/6
SJL

Fluorescence GR (x1000) Bilirubine totale (μmol/L) PAL (UI/L)

90 160 600
80 140 500
70 120
60 100 400
50
80 300
40
60
30 200
20 40
20 100
10
0 0 0
+/+ fech/fech +/+ fech/fech +/+ fech/fech

103
Analyse factorielle discriminante
6

y = 0.025×RBC + 0.623×Hb + 0.204×MCV + 0.537×Log(RBC fluo)

4

SJL/J
2
BALB/c
+ 0.174×Log(TBil) + 0.953×Log(ALP)

Function 2
0

-2

C57BL/6
-4

-6
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

Function 1
x = 0.951×RBC - 1.102×Hb + 1.532×MCV - 1.131×Log(RBC fluo)
+ 0.986×Log(TBil) + 0.398×Log(ALP)

104
Lignées congéniques : bilan

BALB/c C57BL/6 SJL

Impact sur l'état général +++ ++ +/-

PP érythrocytaire ++ ++ ++++
Anémie +++ ++ +
Ictère +++ +/- +/-
Accumulation de PP dans le foie ++ +++ +
Hépatite chronique ++ +++ +

105
Fonds génétique et souris GM

Souris G.M. souvent produites sur des fonds

hybrides

Les résultats doivent être comparables avec

ceux de la littérature

Plusieurs mutations peuvent être croisées pour

obtenir des doubles K.O., etc…

Le phénotype est souvent modifié par le fonds

génétique

106
Les lignées transgéniques (souris GM)

Les lignées génétiquement modifiées permettent

de répondre à plusieurs questions. Que se
passe-t-il :

- lorsqu'une souris exprime ce nouveau gène ?

- lorsqu'une souris exprime ce gène à un

niveau plus élevé que la normale ?

- lorsqu'une souris ne possède plus ce gène ?

- lorsque ces modifications sont induites dans

certains organes ou à certains moments ?

107
La transgénèse

But : ajouter un nouveau gène (ou de nouvelles copies d'un gènes)

dans le génome de la souris.

Isoler le gène

Œuf fécondé

108
La transgénèse

Tous les œufs n'intégrent pas le transgène.

Une fois que le transgène est intégré dans un chromosome, il se

transmet comme un caractère dominant (gain de fonction).

Le transgène s'insère en un seul endroit du génome, sous la forme de

plusieurs copies en tandem.

Selon le site d'intégration, le transgène peut ou non être exprimé

par les cellules.

On peut faire que le transgène sera exprimé à un temps ou dans un

tissu donné.

Par cette technique (assez simple), on ne contrôle ni le site

d'intégration, ni le nombre de copies du transgène), donc il y a
une grande variabilité d'un embryon à l'autre. Il faut étudier
plusieurs souris issues d'embryons différents.

109
La recombinaison homologue

But : inactiver un gène ou le remplacer par une autre version

Fabriquer une Blastocyste

copie inactive receveur
du gène

Insérer la copie
dans des
cellules ES

110
La recombinaison homologue

Technique beaucoup plus compliquée (culture de cellules souches,

injection de cellules dans le blastocyste).

On sélectionne l'évènement génétique souhaité en culture de cellules

et on n'injecte que les bonnes cellules.

Permet l'inactivation totale d'un gène ou son remplacement par une

autre version (par exemple le gène humain).

Permet d'intégrer des séquences permettant de contrôler

l'inactivation du gène à un moment ou dans un tissu donné.

111
Souris GM : Intercross
Le fonds génétique est :
129-B6 B6 WT WT - Différent entre
chimera
chimère témoins et
mutants
- Indéfini (pas de
Ho Ho
comparaison avec
études
antérieures)
Het. Het.. He He
- Non consanguin
(variabilité inter-
F1 F2 F3 individuelle, faible
puissance pour
DNA détecter des
effets)
WT WT
- Instable (dérive
avec les
générations)
(C57BL/6× He He - Non reproductible
SJL/J)F1

Female Male
112
Souris GM : croisements avec F1 ou non-consanguine
Het. B6xD2 Het. B6xD2

B6x129 B6xD2

G1 G2 G3

Le fonds génétique est : - hétérogène entre hétéros et contrôles

- non défini et instable au cours des générations
113
Travailler avec des lignées co-isogéniques (KO)

129/SvJ 129/SvJ Heterozygotes Homozygotes sur fonds 129/Sv

chimère

129/SvJ 129/SvJ 129/SvJ 129/SvJ

Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene n

114
Souris GM : utiliser des lignées congéniques

129/SvJ 129/SvJ 129/SvJ 129/SvJ

Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene n

C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6

Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene n

115
Souris GM : travailler avec hybrides F1

129S1/Sv

B6129SF1
Gene 1

C57BL/6 Gene 1

Gene 1

116
Eléments de nomenclature

117
Transgènes
- Définition : mutations obtenues par injection d'une séquence d'ADN exogène dans un
embryon au stade une cellule.

118
Mutations ciblées
- Définition : mutations obtenues par inactivation d'un gène dans des cellules ES, injection
des cellules mutées dans un blastocyste receveur et implantation de l'embryon.

119
Nomenclature quizz

„ B6;129-Acvr2tm1Zuk
„ Une lignée de fonds mixte, dérivé de C57BL/6J et de
cellules souches d’origine 129, et portant une mutation ciblée
pour le gène Acvr2

„ STOCK Rb(16.17)5Bnr
„ Une lignée consanguine d’origine complexe ou inconnus et
portant une translocation chromosomique Robertsonienne
Rb(16.17)5Bnr.

„ C57BL/6N-Tg(CAG-RNAi:Trp53,-EGFP)1Pas
„ Lignée transgénique sous fonds C57BL/6N, pour un RNAi
ciblant le gène Trp53 et exprimant également la GFP, le tout
sous contrôle du promoteur CAG, et ayant été créée à
Pasteur
120
Hémizygote ou hétérozygote ?
-Définition hémizygote : une seule copie du gène est présente dans le génome, ex:
chromosomes sexuels et Transgénèse par insertion

- Définition hétérozygote : une copie « mutée » du gène est présente sur un

chromosome alors qu’une copie « sauvage » est présente sur l’autre chromosome, ex:
transgénèse par recombinaison homologue

Tg par insertion KO ou KI

Hémizygote Hétérozygote
Homozygote Homozygote

121
Contrôle de qualité génétique

122
Le contrôle de qualité génétique

Contrôler que les caractéristiques génétiques

d'un groupe d'animaux de laboratoire sont
identiques à des valeurs de références.

S'assurer de la constance des propriétés

biologiques d'une colonie d'animaux de
laboratoire.

Effectuer des mesures génotypiques

appropriées à chaque type de population à
contrôler, en fonction des "dérives" qui
peuvent se produire

123
Caractère biologique intégré

Caractère résultant de l'interaction entre le

potentiel génétique d'un individu et son
environnement physique, chimique et
biologique, depuis la conception de l'individu
jusqu'au moment de l'analyse.

124
Variance phénotypique

Variance génétique part explicable par des gènes

+
Variance d'environnement part due à des paramètres
analysables
+
Variance résiduelle part due à des facteurs non
contrôlés ou à des fluctuations
individuelles

Génétique Environnement Résiduelle

125
Types de populations

Lignées consanguines

Colonies non consanguines

Lignées génétiquement modifiées

126
Lignées consanguines : variations

Mutations

Hétérozygotie résiduelle

Contamination génétique

127
Lignées consanguines : mutations

Modification ponctuelle du génome

- Inévitables et aléatoires
- Fréquence faible (10-5 - 10-6 / locus)
- Détection des mutations récessives
favorisée par la consanguinité

128
Lignées consanguines : mutations

Effet visible immédiatement

- mutation albinos sur fonds C57BL/6
- mutation de squelette, etc...

Effet sur phénotype non visible

- mutation Lpsd dans C3H/HeJ
- gène modificateur de Min

Mutations silencieuses
- dans parties non codantes des gènes
- les plus fréquentes

129
Lignées consanguines : mutations

A+/+ Am/m
Fréquence

Paramètre biologique

130
Lignées consanguines : hétérozygotie résiduelle

Résulte d'une consanguinité incomplète

- Incontrôlable
- Différente entre sous-lignées

131
Lignées consanguines : hétérozygotie résiduelle

Eviter la formation de sous-lignées

F31

F32

F33

132
Lignées consanguines : hétérozygotie résiduelle

F18 F25a
F25b
Fréquence

Paramètre biologique

133
Lignées consanguines : contamination

Mélange entre lignées

Modification massive du génome

134
Lignées consanguines : contamination

- Impact génétique majeur : catastrophe

- Irréversible

- Toujours des conséquences biologiques graves

- Détectable parfois facilement (couleur), toujours

par augmentation de fertilité

135
Lignées consanguines : contamination

A A*B
Fréquence

Paramètre biologique

136
Lignées consanguines : que contrôler ?

Mutations : impossible

Hétérozygotie résiduelle : trop limitée

Contamination génétique

137
Marqueurs génétiques

Nombreux

Faciles à génotyper

Polymorphes entre les lignées

Stables dans le temps

138
Marqueurs de couleur de pelage
DBA/2 : a/a, b/b, d/d, +c/+c

Couleur
Lignée Génotype Lignée pure F1 avec DBA/2

SJL/J c [+]

AKR a, c [a]
noire

BALB/c b, c [b]
marron

A/J a, b, c [a, b]
marron,
non agouti

139
Microsatellites
SSLP (simple sequence length polymorphism)

- Répétitions de séquence simple

- Environ 105 répétitions CA dans génome souris
CTAAGCTCGAT
..CTGATTCGAGCTAGG cacacacacaca TTGCTTGACAGGT..
..GACTAAGCTCGATCC gtgtgtgtgtgt AACGAACTGTCCA..
TGCTTGACAGG

Lignée Nombre de répétitions Taille du fragment

BALB/c 15 127
DBA/2 21 139

BALB/c BALB/c F1 F1 DBA/2 DBA/2

140
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Polymorphisme portant sur une paire de bases

- identifiés par reséquençage des génomes

- 4 types possibles : C ⇔ T (ou G ⇔ A)
C ⇔ A (ou G ⇔ T)
C⇔G
T⇔A
- Présents dans les populations naturelles
- Fréquence de l'allèle le plus rare >1%
- Presque toujours di-alléliques
- cSNP : dans un cDNA
- par extension : toute variation de séquence (indel, > 1pb)

141
Single Nucleotide Polymorphism

Locus 1 Locus 2 Locus 3

C57BL6 CTAGTAGGATCGGCCC GCTATACGGGGC CTGTAGTCGAGGGGC

DBA/2 CTAGTTGGATCGGTCC GCTATACGGGGC CTGTAGTCGAGGGGC
BALB/c CTAGTAGGATCGGCCC GCTAGCCGGGGC CTATAGTCGACGGGC
CBA CTAGTAGGATCGGCCC GCTATACGGGGC CTATAGTCGACGGGC
C3H CTAGTTGGATCGGTCC GCTATACGGGGC CTATAGTCGAGGGGC
AKR CTAGTTGGATCGGTCC GCTAGCCGGGGC CTGTAGTCGAGGGGC
A CTAGTTGGATCGGTCC GCTAGCCGGGGC CTATAGTCGACGGGC
SJL CTAGTTGGATCGGTCC GCTAGCCGGGGC CTATAGTCGAGGGGC
FVB CTAGTTGGATCGGTCC GCTAGCCGGGGC CTATAGTCGAGGGGC

142
SNP et phylogénie des lignées

Wade et al. (2002), Nature, 420, 574-578

143
SNP et phylogénie des lignées

1638 SNP
Petkov et al. (2004), Genome Research, 14, 1806-11
144
SNP et phylogénie des lignées

Petkov et al. (2004), Genome Research, 14, 1806-11

145
SNP

Avantages
- très nombreux (plusieurs centaines de milliers décrits chez
l'homme et la souris)
- données massives de polymorphisme (reséquençage de lignées
consanguines)
- très denses : identification d'haplotypes communs
- génotypage automatisable à très grande échelle (peu coûteux)

Inconvénient
- génotypage demande équipement spécifique coûteux pour un
petit laboratoire

146
Lignées génétiquement modifiées

Tester la présence de la mutation

Tester l'absence de contamination du fonds génétique

Tester l'absence de contamination par d'autres

mutations

147
Colonies non consanguines : variations

Mutations

Evolution vers la consanguinité (dérive)

148
Colonies non consanguines : mutations

Effet "noyé" dans le polymorphisme naturel de la

colonie

Mutations récessives presque jamais à l'état

homozygote

149
Colonies non consanguines : consanguinité

Inévitable car population de taille finie

Modifie les fréquences alléliques

Conduit à la perte d'allèles

Effets probablement compensés

150
Colonies non consanguines : que contrôler ?

Taux d'hétérogénéité génétique mesurable

(fréquences alléliques de microsat.)

Allèles
Locus a b c d
L1 0,72 0 0,28 0
L2 0 1 0 0
L3 0,2 0,43 0,17 0,2
L4 0 0,68 0,22 0,1

- Quelle variation acceptable ?

151
Colonies non consanguines : que contrôler ?

Taux d'hétérogénéité génétique mesurable

(fréquences alléliques de microsat.)

Fluctuations très faibles ⇒ grands échantillons

Tests peu sensibles

Quelle valeur pour l'expérimentateur ?

152
Colonies non consanguines : que contrôler ?

Contrôle phénotypique

Mesurer moyenne et variance de paramètres utiles

variés

Contrôle des valeurs de référence de la colonie

Evaluation de la dérive et l'hétérogénéité

153
Contrôle génétique : un bilan

Impossible de contrôler toutes les variations

La qualité génétique repose avant tout sur la conduite

d'élevage

La cryopréservation permet de revenir à un fonds

génétique de référence (lignées consanguines)

Une faible dérive génétique est inévitable et fait

partie du "réactif animal"

154
La conduite d’élevage au Jackson Laboratory

- Nb de générations limité en
« Foundation & Expansion »

- 3 types de colonies séparées

- Apport régulier en production

depuis stock fondateur

- Renouvellement fondateurs
(embryons congelés) après F5

155
Quelques conclusions…
- Chaque espèce de souris résulte de la co-évolution d'allèles qui sont capables de
fonctionner ensemble. Les souris de laboratoire dérivent d'hybrides artificiels entre
plusieurs sous-espèces.

- Les populations d'animaux de laboratoire ont des structures variées qu'il est
important de bien connaître pour bien les utiliser.

- Dans chaque lignée consanguine est fixée une combinaison particulière. C'est cette
combinaison qui définit les caractéristiques de la lignée. Ce patrimoine génétique est
en interaction permanente avec l'environnement pour déterminer le phénotype.

- Un phénotype est rarement déterminé par un seul gène mais résulte d'interactions
souvent complexes entre un ou quelques gènes majeurs et de nombreux gènes
modificateurs.

- Le contrôle de qualité génétique apporte en général peu d'information car il ne peut

contrôler qu'une partie limitée de la variation génétique au cours du temps.

- Les données de séquence, d'expression et de phénotype qui sont produites sur des
lignées consanguines, recombinantes consanguines ou recombinantes congéniques vont
permettre d'identifier des corrélations, des réseaux d'interaction et des gènes qui
contrôlent des caractères complexes, par une approche in silico.

156
Combler le « fossé » biologique

- Projets de mutagenèse à l’ENU

- Japon (RIKEN)
- Angleterre (Harwell)
- Allemagne (GSF)
- USA (Baylor College, McLaughlin Research Institute,
NorthWestern…)

- Projets de mutagenèse de cellules ES

- EUCOMM : European Conditional Mouse Mutagenesis

- http://www.eucomm.org/

- NIH KOMP : Knock-Out Mouse Project

- http://www.komp.org/

157
Produire de nouveaux modèles
Phenotype- Induire des mutations
driven aléatoires dans le génome

Cribler les souris

mutantes

Phénotype

Créer une mutation Localiser puis identifier

dans le gène le(s) gène(s) muté(s)

Gène(s)
Gene-
driven Sélectionner les gènes
probablement impliqués
158
Pour en savoir plus
sur la souris :

159