COURS : HEMATOLOGIE APPLIQUE/2013-2014

1. Détermination de la valeur de l'hématocrite.

2. Numération manuelle et automatique des globules rouges.
3. Dosage de l’hémoglobine total.
4. Calcul des constantes érythrocytaires.
5. Frottis sanguin

1. Détermination de la valeur de l'hématocrite.

a. Principe

L’hématocrite indique le pourcentage du volume occupé par les globules rouges par rapport
au volume total du sang.

La centrifugation est la méthode de référence en matière de détermination de l’hématocrite.

Elle permet de séparer les composants solides du sang des composants liquides et de les
concentrer

b. Matériel :
- Prélèvement de sang veineux sur EDTA
- Tube capillaire : diamètre = 1,5 mm, longueur = 75 mm.
- Cire molle en pâte à modeler
- Centrifugeuse à hématocrite ou à main si défaut.
- Réglette spéciale hématocrite pour la lecture
 c. Mode opératoire :

a) Remplissage :

Lors du remplissage, veiller à ce que l’extrémité du tube capillaire opposée à l’extrémité de

remplissage reste sèche. Pour la détermination de l’hématocrite, les tubes capillaires sont
remplis à environ 75 %.

b) Scellement :

Sceller l’extrémité de remplissage du tube capillaire avec de la pate à modeler. Pour ce faire,
enfoncer à la verticale le tube capillaire dans la pate à modeler jusqu’à ce que le bord du tube
capillaire touche le fond de la plaque de la pate.

Incliner légèrement le tube capillaire et le retirer.

c) Centrifugation :

Placer le tube, extrémité scellée vers le haut, dans la centrifugeuse à hématocrite et mettre le
couvercle en place.

d) Lecture :
 Mesurer la hauteur totale de sang : T
 Mesurer la hauteur des globules : G
On a : Ht = G/T
Valeurs normales :
 Hommes : 0,40 -0,54
 Femmes : 0,37 -0,47
 Enfants (5 ans) : 0,38 - 0,44
 Nourrissons (3 mois) : 0,35 - 0,40
 Nouveaux nés : 0,54 - 0,56
Les variations physiologiques et pathologiques :

Des variations physiologiques existent :

- l'hématocrite est plus élevée chez le nouveau-né, le vieillard, lors des séjours en haute
altitude,
- l'hématocrite est plus basse chez les sujets de race noire que chez ceux de race blanche.

- hémodilution comme au cours de la grossesse,

Variations pathologiques :
- l'hématocrite diminue en cas de baisse du nombre ou du volume des globules rouges
(anémie),

- dans les états œdémateux : cirrhose hépatique, insuffisance cardiaque.

- l'hématocrite peut être faussement normale si le nombre des globules rouges et le

volume plasmatique sont diminués (cas des sujets déshydratés)

- l'hématocrite est augmentée si le volume et/ou le nombre de globules rouges sont eux-
mêmes augmentés comme dans en cas de polyglobulie (voir maladie de Vaquez)...
 2. Numération manuelle et automatique des globules rouges.
a. Numération manuelle :
Principe :

La numération sanguine est basée sur la dilution du sang et le comptage des cellules : 1 mm3

de sang est dilué grâce à une solution de HAYEM

Le comptage est réalisé sous microscope en utilisant une cellule de numération dotée d'une

cuvette microscopique de 1 mm3 de volume et dont le fond est quadrillé en carrés.

La cellule de Malassez :

La gravure d'une lame de Malassez se compose d'un certains nombres de traits, délimitant en
fait, 100 grands carreaux, dont certains sont subdivisés en 20 petits carreaux

Longueur = 0,25 mm

Largeur = 0,20 mm

Profondeur = 0,20 mm

Le volume total de la cellule est de 1 mm3

(2,5 x 2 x 0,20)

Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales et de 10 bandes horizontales

formant ainsi 100 rectangles.

Pour réaliser le remplissage de la cellule, il faut :

· Humidifier les glissières latérales sur lesquelles va reposer la lamelle

· Déposer la lamelle sur les rebords, celle-ci doit adhérer par un "effet ventouses"

· Placer l'extrémité de la pipette sur la partie 2 contre la lamelle et délivrer par capillarité le
liquide en évitant tout débordement vers les rigoles.
La pipette de POTAIN :

La grande pipette est marquée 1O1 au-dessus de la boule, elle sert au comptage des hématies

dont le nombre est très grand. On dilue donc 0.5 partie de sang pour 1OO parties de solution
de HAYEM.

Mode opératoire :

La numération sera faite sur sang veineux prélevé sur tube EDTA

1. Dilution du sang :

- Plonger la pipette (1O1) qui doit être propre et sèche dans une goutte de sang, et
aspirer jusqu'au trait 0.5

- Essuyer la pointe à l’aide de papier hygiénique

- puis diluer avec les solutions de HAYEM
- Maintenir la pipette horizontalement et la faire rouler entre les doigts.
- La petite boule à l'intérieur assurera le mélange.

2. Comptage :

- Bien nettoyer la cellule avant de l'utiliser.

- Déposer alors une goutte du mélange sur la zone quadrillée de la cellule.
- Recouvrir d'une lamelle en évitant les bulles d'air.
- Disposer sous le microscope au grossissement 10 pour faire la mise au point puis
passer au grossissement 40 pour faire la lecture.
- Compter le nombre d'hématies dans 4 réctangles quadrillés en diagonale et faire la
moyenne.

Le nombre d'hématies NH = MH X200 X 100 /4 (hématies / mm3)

1mm3 = 100 réctangles, dilution du sang 200.

 b. Numération automatique :

Les compteurs d’hématologie ou automates d’hématologie sont des appareils plus ou moins
complexes utilisés pour la réalisation de l hémogramme.

L’hémogramme est l'étude cytologique quantitative et qualitative du sang circulant, Il

comprend :
- la détermination des nombres absolus de globules rouges, de globules blancs et des
plaquettes ;
- Le dosage de l’hémoglobine ;
- la mesure de l’hématocrite ;
- le calcul des constantes érythrocytaires : VGM, TCMH et CCMH ;
- l’établissement pour les globules blancs de la formule leucocytaire
- donnant les pourcentages des différents types de leucocytes : polynucléaires neutrophiles,
éosinophiles, basophiles, lymphocytes.
3. Dosage de l’hémoglobine :
Prélèvement veineux sur EDTA
Le délai de conservation a +4C° ne doit dépasser une semaine
La méthode recommandée par le comité national de Standardisation en hématologie :
drabkin
Elle permet la transformation de l’Hb en cyanméthémoglobine par la solution de
drabkin contenant du ferricyanure et de cyanure de potasium.
La coloration rouge obtenue est appréciée par spectrophotomètrie à 540nm