VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016

PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET
PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG
À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ
DANS DES TUBES CONTENANT UN
ANTICOAGULANT

DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME

MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS ­– DMP-MON-05B

1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION

Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour le prélèvement d’échantillons sanguins par
ponction veineuse et la préparation de frottis et de gouttes épaisses à partir de sang veineux collecté dans
des tubes contenant un anticoagulant.
Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance
de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont
obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de
référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des
établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme.

2. HISTORIQUE
Dans certains établissements sanitaires, les échantillons de sang veineux sont collectés pour effectuer
plusieurs analyses, dont le diagnostic microscopique du paludisme. On prélève des volumes de sang
veineux plus abondants que pour le sang prélevé au bout du doigt. Les prélèvements de sang veineux
sont stockés dans des tubes contenant un anticoagulant (de préférence de l’acide éthylène diamine tétra-
acétique [EDTA]). Les échantillons de sang veineux traités à l’aide de l’EDTA peuvent être utilisés dans la
préparation de frottis et de gouttes épaisses pour le diagnostic du paludisme. Les procédures à suivre sont
abordées dans ce document.

3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS

• Des lames de verre propres de 25 × 75 mm, avec une extrémité en verre dépoli permettant
l’étiquetage, de préférence comportant des bords rodés et de bonne qualité (voir DMP-MON-01 :
Nettoyage et stockage des lames de microscope).
• Une seringue par patient, avec une aiguille (de calibre 21 ou 23).
• Un tube à vide (tube électronique) par patient de 4 à 5 ml, contenant un anticoagulant tel
que l’EDTA.
• De l’alcool éthylique à 70 % ou des tampons d’alcool.
• Du coton hydrophile (tampon d’ouate ou de gaze, coton-tige).
• Des gants de protection en latex (sans talc).
• Un garrot.
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À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT

• Un contenant biorisque ou tout autre collecteur d’aiguilles résistant aux perforations (voir DMP-
MON 13 : Gestion des déchets issus de tests de diagnostic du paludisme).
• Un conteneur pour déchets infectieux (voir DMP-MON 13 : Gestion des déchets issus de tests de
diagnostic du paludisme).
• Une micropipette.
• Un embout de pipette.
• Un gabarit pour la préparation d’un frottis.
• Un râtelier de séchage.
• Des formulaires d’enregistrement (c’est-à-dire un registre pour le paludisme).
• Un crayon à mine ou un stylo indélébile.

4. CONSIGNES DE SÉCURITÉ
• Pour votre sécurité et afin d’éviter les traces de graisse sur la lame pouvant entraver la préparation
du frottis, enfilez des gants de protection en latex avant de prélever des échantillons sanguins
et lorsque vous manipulez les lames. Portez des gants de protection pour manipuler du sang et
retirez-les avant de quitter la zone où vous travaillez ou lorsque vous prenez des notes.
• Utilisez toujours une nouvelle seringue et une nouvelle aiguille pour chaque patient.
• Évitez de vous mettre du sang, séché ou frais, sur les doigts ou les mains.
• Mettez un pansement étanche sur les coupures ou les écorchures de la main.
• Évitez de vous piquer accidentellement en manipulant des instruments tranchants qui ont été en
contact avec du sang.
• Lavez-vous soigneusement les mains à l’eau et au savon dès que vous avez fini un travail.
• Si vous avez du sang sur la peau, essuyez-le rapidement avec un coton-tige imbibé d’alcool. Lavez
ensuite dès que possible la zone touchée à l’eau et au savon.

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À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT
5. PROCÉDURE
SCHÉMA
4.1. Prélèvement d’échantillons sanguins par
ponction veineuse
1.
Étiquetez le tube en
indiquant « EDTA », conformément
au DMP-MON 6a : étiquetage des
étalements de sang à la recherche
du paludisme.
2-3. Posez un garrot autour du haut du
bras du patient et cherchez une grosse
veine peu mobile.
4-5. Désinfectez le site de l’injection avec
de l’alcool et laissez sécher à l’air.
6. Insérez l’aiguille (fixée à une seringue
ou un tube Vacutainer) et prélevez
progressivement le sang.
7. Défaites le garrot, retirez l’aiguille et
appuyez fermement sur le site de la
ponction avec du coton hydrophile sec.
7. Défaites le garrot, retirez l’aiguille et
appuyez fermement sur le site de la
ponction avec du coton hydrophile sec.
8.
Transvasez le sang dans le
tube contenant l’EDTA et mélangez
délicatement en retournant le
tube six fois.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
4.1. Prélèvement d’échantillons sanguins par
ponction veineuse
1. Étiquetez un tube contenant de l’EDTA
avec le nom du patient, la date et l’heure
du prélèvement. Voir DMP-MON-06a :
Étiquetage des étalements de sang à la
recherche du paludisme.
2. Posez un garrot autour du haut du bras du
patient pour pouvoir distinguer ou sentir les
veines. Demandez au patient de serrer le
poing pour faire ressortir les veines.
3. De l’index, cherchez une veine assez grosse
et stable.
4. Désinfectez le site avec un tampon d’alcool
ou un coton imbibé d’alcool éthylique ou
isopropylique à 70 %. Ne touchez plus la
zone désinfectée.
5. Laissez sécher à l’air pendant 30 secondes
pour vous assurer de ne pas contaminer
l’échantillon sanguin avec de l’alcool, ce qui
peut provoquer une hémolyse.
6. Insérez une aiguille de phlébotomie stérile,
à usage unique (fixée à une seringue ou un
tube Vacutainer) dans la veine, biseau vers
le haut. Prélevez progressivement >2 ml à
4 ml de sang.
Note : Les anticoagulants peuvent interférer
avec l’adhésion du sang à la lame et
avec le colorant de Giemsa, en particulier
si la proportion du sang par rapport
à l’anticoagulant n’est pas optimale.
Par conséquent, le volume de sang dans un
tube de 5 ml devrait être >2 ml.
7. Lorsque vous avez prélevé une quantité
de sang suffisante, défaites le garrot et
demandez au patient de défaire son poing.
Retirez l’aiguille et appuyez fermement
sur le site de la ponction veineuse avec du
coton hydrophile sec. Demandez au patient
de continuer à appuyer sur le site de la
ponction, en gardant le bras levé, jusqu’à ce
qu’il n’y ait plus de saignement.
8. Transvasez le sang dans le tube contenant
l’EDTA et mélangez délicatement en
retournant le tube six fois. Ne secouez pas le
tube.
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À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT
SCHÉMA
4.2. Préparation de gouttes épaisses et de
frottis minces
1.
Mélangez délicatement
le sang dans un tube contenant de
l’EDTA avant de l’utiliser.
2. Placez une lame de microscope
propre et étiquetée sur le gabarit
de préparation de la lame pour le
paludisme (voir Figure 1)
3. À l’aide d’une micropipette à embout,
déposez 6 µl de sang sur le cercle plus
grand de la lame et préparez la goutte
épaisse.
4. À l’aide d’une micropipette à embout,
déposez encore 2 µl de sang sur le petit
cercle de la lame et préparez le frottis
mince.
5-7. En utilisant une lame propre pour
étaler les gouttes, préparez le frottis
mince en poussant la goutte de sang
vers l’avant dans un mouvement doux et
continu.
8. Laissez
sécher à l’horizontale.
Si vous désirez un séchage rapide
des lames, vous pouvez utiliser une
plaque chauffante.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
4.2. Préparation de gouttes épaisses et de
frottis minces
1. Mélangez délicatement le prélèvement de
sang veineux dans un tube à vide contenant
de l’EDTA.
2. Placez une lame de microscope propre
et étiquetée sur un gabarit normalisé de
préparation de la lame pour le frottis et
la goutte épaisse (1,2 cm ou 12 mm de
diamètre) (voir Figure 1).
3. À l’aide d’une micropipette à embout,
déposez 6 µl de sang sur le cercle plus
grand de la lame. Remuez le sang avec
le bout de la micropipette pour former
un cercle d’environ 1 cm de diamètre et
préparez la goutte épaisse ; il suffit de
frotter le sang trois ou six fois avec le bout
de la micropipette.
4. Prélevez 2 µl supplémentaires de sang
à l’aide d’une micropipette à embout
et déposez le sang sur le petit cercle du
gabarit de la lame.
5. Pour préparer le frottis, placez le bord
d’une lame propre servant à répartir la
goutte à 45° devant la goutte de sang
prévue pour le frottis mince.
6. Tirez délicatement la lame servant à
l’étalement de la goutte vers l’arrière jusqu’à
ce qu’elle touche la goutte de sang et que
celle-ci se répartisse le long du bord de la
lame d’étalement.
7. Poussez rapidement la deuxième lame
vers l’avant (éloignez-la du centre) avec un
mouvement continu, sans à-coups, jusqu’à
ce que la deuxième lame ait permis un
étalement en forme de « plume », qui servira
pour le frottis.
8. Séchez les lames que vous avez préparées
à l’horizontale. Le sang traité à l’EDTA a
tendance à mal adhérer à la lame. Si vous
désirez un séchage rapide des lames,
séchez les étalements avec de l’air chaud
provenant d’un sèchecheveux, à une
distance raisonnable. Il faut toutefois éviter
de placer les lames trop près du sèche-
cheveux, faute de quoi la chaleur risque de
fixer les étalements de sang.
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À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT

6. REMARQUES
• Le sang collecté dans des tubes contenant de l’EDTA ne doit pas être conservé plus de quatre
heures avant la préparation des frottis et des gouttes épaisses, sans quoi l’anticoagulant risque
d’altérer la morphologie du parasite.
• Si vous prélevez du sang veineux ailleurs que dans le laboratoire où les frottis et les gouttes
épaisses seront préparés, l’échantillon doit être acheminé sans délai (dans l’heure, idéalement) au
laboratoire, sans refroidissement ni réfrigération.
• Les gouttes épaisses devraient sécher à l’horizontale et être protégées des mouches et de la saleté.
• La goutte épaisse peut se fixer spontanément en cas d’exposition à une chaleur élevée et devrait
donc être colorée immédiatement.
• On peut sécher la goutte épaisse en douceur en utilisant un sèche-cheveux à air chaud ou toute
autre méthode de séchage, pour autant que l’étalement ne se fixe pas spontanément avec la
chaleur, ce qui peut survenir rapidement. Ne remettez un sèche-cheveux qu’aux techniciens sachant
utiliser cette méthode.
• N’utilisez pas de stylo à bille ou de stylo à encre gel pour étiqueter les lames, car l’encre se
répandra sur la lame au moment de la fixation.
• Quand la préparation est correcte, il reste très peu de sang sur la lame qui a servi à faire les
étalements. Celle-ci peut donc être utilisée pour recueillir le sang du patient suivant et y faire la
goutte épaisse et le frottis avec une nouvelle lame propre tirée du paquet.

7. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES

DMP-MON-01 : Nettoyage et stockage des lames de microscope
DMP-MON-06a : Étiquetage des étalements de sang à la recherche du paludisme
DMP-MON-13 : Gestion des déchets issus de tests de diagnostic du paludisme

8. RÉFÉRENCES
OMS. Manuel sur l’assurance de la qualité pour le diagnostic microscopique du paludisme. Version 2.
Genève, 2015.

9. HISTORIQUE DU DOCUMENT
Date Personne responsable
Version Commentaires
(mois/année) (Nom, prénom)
Examiné et finalisé par Gonzales, Glenda
Janvier 2016 1 des experts, édité et mis Fonctionnaire technique,
en page WPRO

Figure 1. Gabarit pour la préparation d’étalements de sang

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