Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Électrophorèse Capillaire: Appareillage
Électrophorèse Capillaire: Appareillage
Appareillage
par Myriam TAVERNA
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
Isabelle LE POTIER
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
et Philippe MORIN
Professeur de chimie analytique
Institut de chimie organique et analytique
Université d’Orléans
Ceci est le deuxième volet de l’étude sur l’électrophorèse capillaire qui comprend :
[P 3 365] : Électrophorèse capillaire. Principe ;
[P 3 366] : Électrophorèse capillaire. Appareillage ;
[P 3 367] : Électrophorèse capillaire. Applications.
Pour un exposé sur la théorie générale de l’électrophorèse capillaire, le lecteur pourra consul-
ter l’article [P 1 815], référence [4], dans ce traité.
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 366 − 1
ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE ___________________________________________________________________________________________________________
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 3 366 − 2 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
___________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
Surpression
Échantillon Échantillon
a par surpression
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 366 − 3
ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE ___________________________________________________________________________________________________________
façon moins fréquente ont été mentionnées dans la littérature la Tableau 1 – Exemples de quelques agents de dérivation
détection ampérométrique, conductimétrique et radiométrique. fréquemment utilisés en électrophorèse capillaire pour la
Si les concentrations minimales détectables en EC sont souvent détection par fluorescence ou fluorescence induite par
plus élevées qu’en CPL, les quantités minimales détectables sont laser (LIF) [1]
plus faibles, permettant ainsi d’analyser des échantillons disponi-
bles uniquement en faible quantité. Mode de détection
Réactif et limite de Applications
détection (1)
4.1 Détection UV/visible CBQCA LIF 457 nm, 442 nm, Acides aminés, peptides,
488 nm sucres aminés mono et
10 zmol à 200 amol oligosaccharides
Tous les appareils commercialisés possèdent ce mode de détec-
tion. En général, la détection des composés a lieu à travers le capil- FITC 494 nm, 488 nm Acides aminés
laire lui-même, près de l’extrémité de sortie. Le capillaire sert ainsi de 9 zmol à 1 amol
cellule de détection cylindrique dont le trajet optique est environ égal Fluorescamine 280, 365, 390 nm Protéines, peptides, acides
à 60 % du diamètre du capillaire. La couche de polyimide recouvrant 20 fmol aminés
le capillaire, opaque aux rayons UV, est éliminée par combustion sur FMOC 260 nm Acides aminés, amines
une longueur de 1 cm, à quelques centimètres de l’extrémité de sor- 0,2 amol à 0,8 fmol secondaires, ADN,
tie. Plusieurs catégories de lampes UV peuvent être employées : catécholamines
— lampes ayant une bande passante étroite et une intensité NDA 442 nm Acides aminés, protéines,
d’émission forte telles que les lampes de mercure basse pression 0,5 à 70 amol neurotransmetteurs
(254 nm) ;
AP LIF 325 nm Mono et oligosaccharides
— photomètres multilongueurs d’onde à filtres qui se composent
d’une lampe de mercure moyenne pression permettant une bonne OPA 340 nm, LIF 325 nm Acides aminés, protéines
sensibilité à 254, 280, 313 et 335 nm ; 80 amol
— enfin lampes au deutérium ou arc à xénon permettant d’obte- ANTS 325 nm Oligosaccharides
nir une source continue dans l’UV allant de 180 à 380 nm.
APTS 488 nm Mono et oligosaccharides
Les lampes au tungstène souvent ajoutées au système précédent 2 pmol
permettent d’élargir la gamme au domaine visible ; de plus sont
apparus récemment les détecteurs multilongueurs d’onde permet- (1) pmol : picomole (10−12 mole) ; fmol : femtomole (10−15 mole) ; amol :
tant de détecter simultanément, au cours d’une même analyse, attomole (10−18 mole) ; zmol : zeptomole : (10−21 mole)
deux composés possédant des propriétés spectrales très différentes
ainsi que des détecteurs à barrette de diodes permettant un
balayage spectral entre 190 et 380 nm au cours de chaque analyse. La fluorescence émise peut provenir de la fluorescence intrinsè-
que des molécules analysées, comme pour les protéines ou pepti-
Les limites de détection atteintes avec ce mode de détection des dont la fluorescence native provient de la présence des résidus
varient selon les propriétés absorbantes des solutés entre 10−5 tryptophane et qui sont détectés par fluorescence avec des lon-
et 10−6 M, ce qui correspond à des valeurs de l’ordre de 0,1 à gueurs d’onde d’excitation de 280 nm et d’émission de 305 nm.
100 femtomoles injectées (pour un volume d’injection de 10 nL). Cependant, dans la plupart des cas, il est nécessaire de dériver les
molécules. Les fluorophores les plus couramment employés sont
l’o-phtaldialdéhyde (OPA), le 3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinoline
carboxaldéhyde (CBQCA), la fluorescéine isothiocyanate (FITC), le
4.2 Détection par fluorescence 9-fluorényl-méthylchloroformate (FMOC), la fluorescamine, le naph-
talène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), l’acide 8-aminonaphtalène-
La détection par fluorescence constitue la détection la plus sensi- 1,3,6-trisulfonique (ANTS), le 9-aminopyrène-1,4,6-trisulfonate
ble pour l’électrophorèse capillaire. (APTS) ou la 2-aminopyridine (AP). Le tableau 1 présente quelques
agents de dérivations précolonne employés pour ce type de détec-
tion ainsi que quelques-unes de leurs applications.
Les limites de détection se situent entre 10−15 et 10−17 mole
injectée. L’utilisation de la fluorescence induite par laser a per-
mis de repousser les limites de détection qui peuvent atteindre
10−18 à 10−20 mole. 4.3 Détection spectrométrique par
La détection est réalisée directement au sein du capillaire en diminution d’absorbance (détection
envoyant un faisceau de lumière excitatrice et en collectant le fais- indirecte)
ceau de lumière émise perpendiculairement au rayon incident et au
capillaire par des cellules photosensibles telles que des photodio-
des ou un tube photomultiplicateur. Les sources lumineuses utili- La méthode de détection absorptiométrique selon un mode indi-
sées sont de deux types : les lampes ou les lasers. rect est universelle et très utile pour détecter des espèces ioniques
n’absorbant pas ou peu dans le domaine UV. Elle est réalisée sans
Les lampes les plus communément employées sont les lampes au
modification de l’appareillage et son principe repose sur le déplace-
xénon ou au mercure et les lampes à arc « xénon-mercure ».
ment d’une substance ionique du tampon (dénommé le co-ion) par
Les lasers, quant à eux, émettent des lumières monochromatiques ; l’ion analysé et peut être mise en œuvre avec la spectrométrie, mais
les plus communs sont constitués par les sources hélium-cadmium, aussi la fluorimétrie. Lorsque le capillaire est rempli avec le tampon,
qui émettent à 325 et 442 nm, et les sources argon qui peuvent être le détecteur UV étant réglé sur la longueur d’onde d’absorption
adaptées à différentes longueurs d’onde (350, 360, 476, 488 ou maximale du co-ion, un signal d’absorbance élevé est obtenu. Lors
514 nm). Les limites de détection augmentent généralement avec de l’analyse d’ions n’absorbant pas dans le domaine UV, une dimi-
l’inverse de la racine carrée de la puissance des lasers. nution d’absorbance et l’apparition d’un pic négatif seront obser-
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 3 366 − 4 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
___________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
∆Ai = εAlkiCi
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 366 − 5
ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE ___________________________________________________________________________________________________________
Absorbance
domaines de pH acide (2,7 à 5,2) ou basique (8,8 à 10,2). D’autre 0,024
part, citons deux tampons intéressants : le tampon acide acétique-
hydrogénocarbonate d’ammonium, dont le domaine de travail est
assez étendu (pH 3,2 à 6,8) et le tampon carbonate d’ammonium-
triéthylamine dans un domaine relativement basique (pH 9,3 à 11,3). dA
Les figures 5 a et 5 b montrent que le couplage EC-SM permet la 0,016
séparation rapide d’un mélange de nucléosides naturels et anti-VIH
sans perte notable de la résolution par rapport à une séparation
A
classique avec une détection UV. En mode d’ionisation positif, les
nucléosides donnent préférentiellement des ions pseudomolé-
culaires de type [ M H + ] . Afin de diminuer les limites de détection 0,008
ddA
obtenues en EC-SM (0,1 mg/L), l’analyse par EC-SM-SM (ou en 3TC
C
mode tandem) est souvent réalisée. Dans cet exemple, pour détec-
ter les ions produits par fragmentation des nucléosides, le premier
quadripôle est fixé sur les masses des nucléosides protonés et joue
le rôle de filtre. Le deuxième quadripôle est utilisé comme cellule de 0
collision et le troisième quadripôle balaye une gamme de masses 3 4 5
comprises entre 100 et la valeur [ M H + ] du nucléoside. Les Temps de migration (min)
nucléosides se fragmentent tous de la même façon en perdant leur Capillaire de silice fondue : 37 cm (30 cm) 75 µm
unité sucre pour donner un ion produit correspondant à l’unité base Tampon acide formique-ammoniaque (force ionique : 10 mM, pH 2,5)
protonée. Tension : + 20 kV
Détection UV : 254 nm
Ainsi, les limites de détection obtenues en EC-SM-SM sont de Température : 25 °C
l’ordre de quelques µg · L−1, c’est-à-dire 100 fois inférieures à Injection hydrodynamique : 10 s
celles obtenues en EC-UV. Concentration des solutés : 10 mg · L–1
a par EC – UV
Les applications les plus importantes du couplage EC-SM concer-
Intensité (cps)
nent l’analyse des molécules biologiques et pharmaceutiques. dA
6 105
b par EC – MS
4.5.1 Empilement d’échantillon
Nucléosides : A. adénosine ; C : cytidine ; 3TC : 2'-désoxy-3'-3-thiacytidine ;
(Field Amplified Sample Stacking)
dA : désoxyadénosine ; ddA : 2',3'-didésoxyadénosine
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
P 3 366 − 6 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
___________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
tension (c’est-à-dire soit au cours d’une injection électrocinétique, 4.5.2 Amplification du champ électrique
soit au tout début de la séparation lorsque l’injection hydrodynami- à l’injection (Field Amplified Sample
que a été employée). Cette méthode repose sur la différence de Injection)
champ électrique local de part et d’autre de la frontière entre
l’échantillon et le tampon électrophorétique. En effet, dans ces con-
ditions, le champ électrique présent au niveau de la zone de migra- La méthode de préconcentration d’échantillon par amplification
tion de l’échantillon est plus important que celui existant dans le du champ électrique (Field-Amplified Sample Injection ou FASI) est
tampon de séparation. Les ions migrent alors très rapidement une technique d’injection électrocinétique de l’échantillon avec
jusqu’à l’interface entre les zones de faible et de forte conductivité, l’injection au préalable d’un créneau d’eau dans le capillaire. Le
puis ralentissent dès lors qu’ils atteignent la frontière, créant une
principe est expliqué dans le cas de la séparation de cations. Dans
accumulation des ions sur une zone de plus faible largeur.
un premier temps, un créneau d’eau (environ 5 s) est injecté de
Un autre moyen de réaliser la compression de bandes est d’utili- façon hydrodynamique pour créer une zone de très faible conducti-
ser une différence de pH entre le milieu de dissolution de l’échan- vité (champ électrique local élevé) puis, dans un second temps,
tillon et celui du tampon d’analyse (pH – induced focusing). l’échantillon dissous dans un solvant de dissolution, de faible force
L’injection d’un petit volume d’échantillon contenant, par exemple, ionique et souvent acidifié, est injecté de façon électrocinétique. Le
des peptides dissous dans un tampon de pH supérieur au pI de solvant de dissolution est en général un mélange hydroorganique
l’analyte et l’utilisation d’un tampon de séparation de pH plus faible eau-méthanol (par exemple, 10/90 v/v) contenant de l’acide phos-
vont conduire à la migration des peptides anioniques vers l’anode phorique (20 à 100 µM) afin de protoner les espèces cationiques
sous l’influence du champ électrique. Lorsque les analytes pénè- dans la zone échantillon. Lors de l’application de la tension de sépa-
trent dans la zone de plus faible pH, la charge apparente du peptide ration, l’amplification du champ électrique local dans la zone échan-
est inversée ainsi que la direction de la migration. Il en résulte une tillon et, surtout, dans le créneau d’eau provoque une migration très
diminution de la largeur de la zone de l’analyte. En dernier lieu, rapide des cations vers la zone tampon puis une focalisation à
après dissipation du gradient de pH qui s’est formé, les analytes l’interface entre le créneau d’eau et le tampon de séparation. Par
migreront vers la cathode. Il en résulte un gain de sensibilité qui comparaison avec l’injection hydrodynamique classique, le gain en
généralement ne dépasse pas un facteur de 10. sensibilité est de deux à trois ordres de grandeur.
Références bibliographiques
[1] COUDERC (F.), CAUSSE (E.) et BAYLE (C.). – tion tandem mass spectrometry. J. Chroma- Dans les Techniques de l’Ingénieur
Drug analysis by capillary electrophoresis togr. A 895, p. 101-109 (2000). Traité Analyse et Caractérisation
and laser induced fluorescence. Electropho-
resis 19, p. 2777-2790 (1998). [3] BREADMORE (M.C.) et HADDAD (P.R.). –
[2] CAHOURS (X.), DESSANS (H.), MORIN (P.), Approches to enhancing the sensitivity of [4] GAREIL (P.) et PELTRE (G.). – Électrophorèse.
DREUX (M.) et AGROFOGLIO (L.). – Determi- capillary electrophoresis methods for the [P 1 815]
nation at ppb level of an anti-human immu- determination of inorganic and small organic
nodeficiency virus nucleoside drug by anions. Electrophoresis 22 (12) p. 2464- 2489 [5] MONÉGIER (B.). – Électrospray. [P 3 350]
capillary electrophoresis-electrospray ioniza- (2001). (1997).
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 366 − 7