Analyse des acides nucléiques

par Béatrice PARFAIT

et Dominique VIDAUD
Université René Descartes, faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques (Paris V),
Laboratoire de génétique moléculaire

1. Techniques de préparation des acides nucléiques ......................... P 3 315 - 2

1.1 ADN............................................................................................................... — 2
1.2 ARN............................................................................................................... — 3
2. Techniques d’analyse des acides nucléiques :
les outils de base ..................................................................................... — 4
2.1 L’électrophorèse........................................................................................... — 4
2.2 Les enzymes................................................................................................. — 4
2.3 Le Southern blot .......................................................................................... — 6
2.4 Le Northern blot........................................................................................... — 6
2.5 PCR, RT-PCR ................................................................................................. — 6
2.6 Application de la PCR à l’analyse quantitative : la PCR en temps réel.... — 10
2.7 Séquençage.................................................................................................. — 10
3. Application à l’analyse moléculaire :
l’identification des mutations .............................................................. — 11
3.1 Diagnostic direct .......................................................................................... — 11
3.2 Diagnostic indirect, utilisation de marqueurs polymorphes de l’ADN ... — 14
Bibliographie ...................................................................................................... — 16

es vingt dernières années, les progrès de la biologie moléculaire et du génie

C génétique ont rendu possible l’analyse moléculaire des gènes par l’étude
de l’ADN (acide désoxyribonucléique) et/ou du produit de leur expression, l’ARN
(acide ribonucléique). Cette avancée technologique remarquable a abouti à la
mise au point d’un nombre considérable de méthodes de diagnostic direct et
indirect applicables aux maladies génétiques mais également aux pathologies
infectieuses. Cependant, avant 1985, ces techniques dépassaient rarement le
stade du laboratoire de recherche ou de quelques services hospitaliers spécia-
lisés. En effet, les méthodes utilisées jusqu’alors étaient particulièrement lourdes,
faisant le plus souvent appel aux systèmes d’hybridation classiques (de type
« Southern blot » par exemple) et à des sondes radioactives. Bien que très puis-
santes et largement utilisées en recherche, elles n’étaient pas applicables en rou-
tine en raison de la manipulation de produits radioactifs, de la complexité de
la préparation des échantillons et de leur coût.
3 - 2002

Dans le domaine de l’analyse moléculaire, 1985 marque un tournant décisif

avec l’invention d’une nouvelle technique qui allait révolutionner à la fois le
quotidien des biologistes moléculaires et leur façon de penser. Cette décou-
verte valut à son auteur, Kary Mullis, le prix Nobel de chimie en 1993. Appelée
en anglais « PCR », pour « Polymerase Chain Reaction » cette technique qui
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réalise un véritable clonage in vitro, permet l’amplification spécifique d’une

séquence nucléotidique. Cette technologie est à présent bien au point et se
popularise de jour en jour du fait de la simplification de son utilisation au
travers de trousses commerciales disponibles pour le diagnostic de maladies
héréditaires et la mise en évidence de nombreux agents infectieux.

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On peut ainsi détecter aisément et rapidement la présence directe de génomes
viraux et bactériens, réaliser le diagnostic de maladies héréditaires sur des pré-
lèvements de très faible volume de cellules amniotiques ou trophoblastiques,
suivre l’apparition et l’évolution de cellules malignes, établir une carte d’identité
génétique à partir de quelques racines de cheveux (médecine légale) et, dans
l’industrie agroalimentaire, analyser la qualité des produits, rechercher la
présence d’agents pathogènes et de contaminants, typer les semences et les
races, déterminer le sexe des embryons, etc.
1. Techniques de préparation
des acides nucléiques
Un grand nombre de méthodes sont utilisées pour effectuer
l’extraction des acides nucléiques. Le choix de l’une ou l’autre de
ces techniques va dépendre du type cellulaire utilisé (cellules de
mammifères, eucaryotes inférieurs, plantes, bactéries, virus...), du
matériel de départ (organe entier, tissu, culture cellulaire, sang...),
du résultat escompté (pureté, temps de préparation...) et des
applications envisagées (PCR, RT-PCR, clonage, marquage d’une
sonde, Southern, Northern blot, protection à la RNase...).
1.1 ADN
Il existe de nombreuses méthodes permettant d’extraire l’ADN :
extraction saline, colonnes d’affinité, lysats leucocytaires [1].
L’extraction de l’ADN cellulaire de bonne qualité est souvent le
point de départ pour d’autres techniques de biologie moléculaire :
Southern blot (§ 2.3), amplification par PCR (§ 2.5), construction de
banques génomiques... En général, la qualité de l’extraction est
appréciée par l’absence d’ARN, protéines, lipides et autres consti-
tuants cellulaires qui pourraient interférer avec les enzymes de
restriction, ligases, ADN polymérases.
La grande taille de l’ADN génomique des mammifères impose
que la méthode d’extraction soit menée avec précaution afin de
minimiser les chocs mécaniques qui pourraient fragmenter l’ADN
génomique au cours de la préparation.
■ Choix, recueil et conservation du matériel biologique
L’étude de l’ADN est menée à partir de tout tissu disponible, frais
ou congelé, y compris à partir de taches de sang séché après
recueil sur papier (« carte de Guthrie »), de frottis buccaux, de
cheveux mais également de prélèvement de placenta, cellules en
culture... Il faut souligner la difficulté et le caractère aléatoire de
l’extraction de l’ADN à partir de tissus inclus dans la paraffine, le
formol ou le liquide de Bouin (étude post mortem sur des tissus
recueillis en anatomopathologie).
Habituellement, l’ADN est extrait à partir de sang circulant
recueilli sur anticoagulant (EDTA si possible). Le sang peut alors
être conservé deux ou trois jours à température ambiante ou éven-
tuellement plusieurs mois au congélateur avant extraction de
l’ADN. La quantité de sang nécessaire à la réalisation de l’étude
moléculaire est fonction du type de méthode mise en œuvre. Si
quelques centaines de microlitres peuvent suffire lorsqu’il s’agit de
réaliser des analyses par PCR, il faut par contre au moins 5 mL de
sang pour la réalisation d’un Southern blot.
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Glossaire
Amorce (également appelée oligonucléotide ou primer) : courte
séquence nucléotidique (15 à 25 bases en général) s’appariant spé-
cifiquement à une séquence cible et permettant l’initiation de la
synthèse d’un brin complémentaire par une polymérase.
Carte de restriction : localisation des sites de clivage par une (des)
enzyme(s) de restriction au sein d’un fragment d’ADN.
DNases : enzymes digérant l’ADN.
Exon : segment d’ADN transcrit et conservé dans l’ARNm.
Gène : unité héréditaire de l’information correspondant à un seg-
ment d’ADN transcrit en ARN et codant le plus souvent un poly-
peptide.
Haplotype : succession des allèles de plusieurs gènes sur un sec-
teur chromosomique de petite taille.
Hétéroduplexe : appariement de chaînes polynucléotidiques
complémentaires, de nature (ADN, ARN) ou d’origine différente
(par exemple : deux allèles d’un même gène différant par une
modification nucléotidique).
Intron : séquence d’ADN transcrite et secondairement éliminée
par épissage au cours de la maturation des ARN.
Microsatellite : segment d’ADN contenant des répétitions en
tandem de courts motifs de 1 à 5 pb (le plus typique est le
doublet (CA)n). Très nombreux et dispersés sur tout le génome, les
microsatellites sont le siège de variations du nombre de répéti-
tions, génératrices de polymorphismes multialléliques très infor-
matifs, détectables par PCR. Environ 100 000 microsatellites sont
présents dans le génome humain.
Mutation : désigne n’importe quel changement intervenu dans la
séquence de l’ADN en rapport avec l’expression d’une maladie.
S’il ne concerne qu’une seule base, on parle de mutation ponc-
tuelle.
Polymorphisme : fait référence à l’existence simultanée dans la
population, de génomes présentant des variations alléliques sans
rapport direct avec l’expression d’une maladie quelconque.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) : abréviation
employée pour désigner les polymorphismes de restriction biallé-
liques de l’ADN.
Répétitions en tandem : multiples copies en série de la même
séquence.
Ribonucléases (RNases) : enzymes clivant les ARN.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : polymorphisme nucléoti-
dique biallélique de l’ADN présent tous les 1 000 pb environ.
Sonde : séquence d’acide nucléique d’au moins 15 nucléotides,
homologue à une séquence d’ADN ou d’ARN, avec laquelle elle
s’hybride de façon stable et spécifique par réassociation entre
bases complémentaires.
_______________________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
■ Méthode du phénol/chloroforme
Les nombreuses méthodes proposées emploient un tampon
contenant un ou plusieurs détergents, dodécylsulfate de sodium
(SDS), Triton X100. Ces détergents permettent la lyse cellulaire. La
déprotéinisation est réalisée par utilisation de la protéinase K dans
le tampon de lyse. Cette enzyme est active en présence de SDS et
reste fonctionnelle à température élevée (56 à 65 oC). Sous ces
conditions dénaturantes, les protéines sont mieux digérées par la
protéinase K. D’autre part, la combinaison protéinases K-déter-
gent-température élevée est importante pour l’inactivation des
nucléases endogènes.
Les protéines restantes sont éliminées avec les lipides par
extraction avec le phénol et le chloroforme.
Le phénol utilisé est équilibré à pH 8,0 afin que l’ADN soit
retrouvé dans la phase aqueuse. Dans le cas contraire, la majorité
de l’ADN serait retenue dans la phase organique et au niveau de
l’interphase.
■ Précipitation de l’ADN
Après extraction, l’ADN est récupéré par précipitation, soit avec
l’éthanol 100 % (2 volumes) en présence de sels (NaCl ou acétate
de sodium), soit avec l’isopropanol (1 volume). Après précipitation,
l’échantillon est centrifugé à grande vitesse afin d’obtenir un culot
d’ADN. Les sels sont éliminés par lavage du culot avec l’éthanol à
70 %. Après séchage, le précipité est repris dans de l’eau stérile
(eau pour préparation injectable).
■ Dosage de l’ADN
La méthode la plus simple de quantification de l’ADN consiste à
mesurer, par spectrophotométrie à la longueur d’onde λ = 260 nm,
l’absorbance d’une solution d’ADN pure et homogène.
Selon la loi de Beer-Lambert :
DO = ε [C ]

avec DO densité optique, absorbance,
ε coefficient d’absorption spécifique à une longueur
d’onde λ donnée (L · g–1 · cm–1),
[C ] concentration de la solution (g · L–1),

largeur de la cuve de mesure traversée par le faisceau
monochromatique (cm) ; en général, cette largeur est de
1 cm.
Pour une longueur d’onde λ correspondant au maximum
d’absorption d’une substance donnée, la concentration [C ] de cette
substance en solution sera :
[C ] (g · L–1) = (DO λ × facteur de dilution)/ελ
Pour l’ADN double brin, ε 260 = 20 L · g–1 · cm–1. La concentration
d’une solution d’ADN est habituellement exprimée en µg /µL.
La mesure de la densité optique à 280 nm permet de s’assurer
de l’absence de contamination significative par les protéines. La
pureté de la solution est estimée par le rapport des absorbances
DO 260 /DO 280 . Un rapport compris entre 1,8 et 2 suggère une
contamination protéique minimale. L’ADN purifié se conserve bien
à 4 oC. Les successions de congélation-décongélation peuvent
entraîner une dégradation de l’ADN et doivent être évitées.
1.2 ARN
■ Choix, recueil et conservation du matériel biologique
L’ARN peut être recueilli à partir de cellules en culture, fibro-
blastes, lymphoblastes..., de tissus frais lymphocytes, hépatocytes,
cerveau, cœur... fraîchement isolés ou conservés par congélation à
– 80 oC ou dans l’azote liquide. Le facteur important pour obtenir
une qualité optimale des ARN extraits est bien évidemment la qua-
lité des ARN eux-mêmes présents avant l’extraction dans le tissu
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ou le type de cellules manipulées. Aussi est-il indispensable de
prendre les précautions nécessaires pour inhiber toute action de
ribonucléases (RNases). Les RNases, ubiquitaires, sont extrême-
ment difficiles à inactiver. Dans la mesure du possible, la manipu-
lation s’effectue à l’aide de vaisselle propre stérile, ou à l’aide de
matériel commercialisé « RNase free » à l’aide de gants, dans la
glace et sur du matériel frais ou congelé à au moins – 80 oC.
■ Extraction de l’ARN
L’isolement d’ARN total non dégradé et de haute qualité est
souvent le point de départ de nombreuses procédures de biologie
moléculaire. Les méthodes décrites sont nombreuses et peuvent
concerner certains types cellulaires, tissus...
De manière générale, le principe des techniques d’extraction
consiste à solubiliser les composants cellulaires et à inactiver
simultanément les RNases intracellulaires en conservant l’ARN
biologiquement actif. Le but des techniques est d’obtenir de l’ARN
pur sous forme non dégradée utilisable pour des manipulations
ultérieures (de la traduction in vitro, la RNase protection, reverse
transcription et analyse par Northern blot...).
Les procédures d’extraction combinent l’utilisation de plusieurs
agents solvants organiques (phénol, chloroforme), de détergents
(SDS, N lauryl sarcosine, déoxycholate de sodium), de sels chao-
tropiques (isothyocyanate de guanidium, trifluoroacétate de guani-
dium, urée). La combinaison de ces différents agents permet de
dénaturer les protéines mais également d’inactiver les RNases et
d’extraire les lipides.
Une procédure très efficace d’extraction de l’ARN a été introduite
par Chomczynski et Sacchi en 1987. Cette méthode est basée sur
les propriétés de l’isothiocyanate de guanidium à dénaturer les
protéines et inactiver les RNases intracellulaires.
L’association de l’isothyocyanate, du lauroyl sarcosine et du
bêta-mercaptoéthanol augmente les propriétés de solubilisation du
mélange obtenu. L’étape suivante utilise une extraction par le phé-
nol acide (pH < 5,0) qui retient sélectivement l’ADN dans la phase
organique et extrait protéines et lipides. L’addition de chloroforme
au phénol permet d’éliminer les lipides et d’obtenir deux phases
distinctes :
— une phase organique contenant l’ADN, protéines et lipides ;
— une phase aqueuse contenant l’ARN.
Une seconde extraction par le mélange phénol/chloroforme peut
augmenter la pureté de l’ARN isolé obtenu.
De nombreux réactifs commercialisés pour l’extraction de l’ARN
dérivent de cette méthode. La présence d’ADN contaminant la
préparation des ARN doit être éliminée. En effet, cette contamina-
tion peut présenter un problème pour la réalisation de différentes
techniques de biologie moléculaire comme par exemple la PCR où
l’on pourrait observer une coamplification de l’ADNc et de frag-
ments génomiques tels que des exons, des rétropseudogènes.
Un certain nombre de protocoles permettent de séparer ARN et
ADN en utilisant un gradient de chlorure de césium ou de trifluoro-
acétate de césium et nécessitent donc l’ultracentrifugation. Une
autre approche consiste à précipiter sélectivement l’ADN ou l’ARN
du mélange (éthanol, chlorure de lithium). Monstein et al. (1995)
ont proposé d’effectuer un traitement de l’ARN obtenu par la
DNase (dénuée de RNase) ce qui nécessite une seconde extraction
phénol/chloroforme.
■ Précipitation de l’ARN
Comme pour l’ADN, elle est effectuée à l’aide d’éthanol ou d’iso-
propanol. Le culot de précipité est lavé à l’éthanol 70 %. Après
séchage, le culot est repris dans de l’eau stérile (eau pour prépara-
tion injectable). L’ARN est immédiatement congelé à – 80 oC pour
sa conservation.
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ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES _______________________________________________________________________________________________________

■ Dosage de l’ARN
La quantification de l’ARN s’effectue par mesure de l’absorbance MW 1 2 3 4 5 6 7
à 260 nm :
[C ] (g · L–1) = (DO 260 × facteur de dilution)/ε260
800 pb
Pour l’ARN, ε 260 = 25 L · g–1 · cm–1. La concentration d’une solu-
tion d’ARN est habituellement exprimée en µg /µL.
500 pb
D’autre part, il est possible de déterminer la pureté de la prépa-
ration d’ARN de deux façons :
— la détermination de l’absorbance de l’échantillon à 260 et
280 nm permettant de caractériser la contamination en protéine de 100 pb
l’échantillon. Un rapport des absorbances DO 260 /DO 280 > 1,8 cor-
respond à un ARN de bonne qualité ;
— l’électrophorèse en gel d’agarose permet une évaluation plus
directe de la qualité de l’ARN. Après électrophorèse puis coloration MW : marqueur de taille.
par le bromure d’éthydium, l’absence de coloration au niveau du
puits de dépôt (c’est-à-dire l’absence d’ADN) et la présence d’ARNr Le produit de PCR a été soumis à une électrophorèse en gel d’agarose
2 %. Le gel est étalonné avec un marqueur de poids moléculaires
28S et 18S doivent être observées. contenant des fragments de tailles connues ce qui permet de
L’ARN est conservé à – 80 oC. Le stockage à long terme de l’ARN déterminer la taille du produit de PCR.
peut nécessiter l’addition d’un inhibiteur de RNase (RNasin, inhibi-
teur isolé du pancréas de bovin).
Figure 1 – Vérification de la qualité de produits d’amplification
par PCR de 302 pb (colonnes 1 à 7)

2. Techniques d’analyse plaques de verre où s’effectue la réaction de polymérisation de

des acides nucléiques :
les outils de base
2.1 L’électrophorèse
Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioni-
ques chargées pouvant migrer dans un champ électrique. L’élec-
trophorèse permet de séparer les fragments d’ADN ou les
molécules d’ARN en fonction de leur poids moléculaire, donc du
nombre de bases ou de paires de bases, avec des degrés de
résolution variables en fonction de la nature et de la densité de
réticulation du gel utilisé. Deux types de gels existent : les gels
d’agarose et les gels de polyacrylamide. En fonction de la taille du
produit à examiner, la concentration d’agarose ou d’acrylamide
à utiliser sera différente (tableau 1).
Le gel de polyacrylamide est utilisé pour la séparation des petits
fragments d’ADN de une à plusieurs centaines de paires de bases
(pb). Ses applications majeures sont la séparation des petits frag-
ments d’ADN, le séquençage (gels dénaturants) et la purification
d’oligonucléotides de synthèse. Les gels sont coulés entre deux
Tableau 1 – Choix de la concentration
du support d’électrophorèse en fonction
de la taille des fragments à séparer
Acrylamide Taille des fragments à séparer
(%, poids/volume) (en paires de bases, pb)
l’acrylamide et du N,N′-méthylènebisacrylamide en présence de
N,N,N′,N′-tetraméthyléthylènediamine (TEMED) et de persulfate
d’ammonium, catalyseurs de la réaction.
L’agarose est un polymère extrait de l’algue marine et com-
mercialisé sous la forme d’une poudre blanche. Après chauffage
en présence du tampon de migration, l’agarose fondu (liquide)
forme un gel en refroidissant grâce à la mise en jeu de ponts
hydrogène. La résolution du gel est déterminée par la
concentration en agarose (exprimée en %, poids/volume). En pra-
tique, les gels d’agarose sont utilisés à des concentrations
comprises entre 0,6 et 2 % (c’est-à-dire entre 0,6 et 2 g/100 mL)
ce qui permet la séparation de fragments d’acides nucléiques
d’une taille allant jusqu’à 20 kb (produits de PCR, fragments
d’ADN, molécules d’ARN). Certaines sociétés commercialisent
des agaroses plus ou moins résolutifs permettant de discriminer
des produits de PCR présentant une différence de 4 pb.
Dans les deux cas, la visualisation des acides nucléiques s’effec-
tue par addition d’un agent intercalant, le bromure d’éthydium
(BET). Molécule spontanément non fluorescente, le BET intercalé
entre les bases des acides nucléiques présente après illumination
à 300 nm une fluorescence orange. Cette molécule est incorporée
au gel de migration avant ou après migration et le gel peut être
photographié.
La migration des acides nucléiques est inversement proportion-
nelle au logarithme du nombre de paires de bases du fragment.
Plus le fragment est petit, plus il migre rapidement. En parallèle
des fragments étudiés, l’électrophorèse d’un marqueur de poids
moléculaires contenant des fragments de tailles connues est effec-
tuée ce qui permet par exemple de vérifier la taille d’un fragment
de PCR (figure 1).

4 200 à 800
5 80 à 500
8 60 à 400
2.2 Les enzymes
12 40 à 200
20 5 à 100
2.2.1 Enzymes de restriction
Agarose Taille des fragments à séparer
(%, poids/volume) (en kilobases, kb) Il s’agit d’endonucléases de restriction habituellement d’origine
bactérienne. Ces enzymes coupent l’ADN double brin par clivage
0,6 à 0,8 1 à 30 de deux fonctions phosphodiesters au niveau de séquences
0,9 à 1,2 0,5 à 10 nucléotidiques spécifiques (sites de restriction de 4 à 8 pb). Ces
1,2 à 1,5 0,2 à 5 sites correspondent le plus souvent à des palindromes, la

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_______________________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
EcoRI HaeIII
5'-G
3'-CTTAA
5'-G AATT C-3' 5'-GG CC-3'
3'-C TTAA G-5' 3'-CC GG-5'
AATTC-3'
G-5'
Figure 2 – Clivage enzymatique à bout collant (EcoRI) ou à bout franc (HaeIII, MspI, HpaII). MspI clive le site de restriction CCGG quel que soit
l’état de méthylation (*) du dimère CpG, son isoschizomère HpaII ne coupe le site CCGG que si la cytosine n’est pas méthylée.
séquence étant identique sur les deux brins lorsqu’elle est lue dans
le sens 5′ → 3′. À titre d’exemple, l’enzyme de restriction EcoRI
coupe l’ADN au niveau de la séquence GAATTC.
Les enzymes de restriction peuvent générer deux types de
coupure : les coupures à bouts francs (blunt ends ) : l’enzyme
coupe au même niveau sur les deux brins d’ADN, ou les coupures
à bouts collants (cohesive ends) décalés l’un par rapport à l’autre
sur les deux brins (figure 2).
Certaines enzymes sont sensibles aux méthylations observées
au niveau de certaines cytosines précédant une guanine (dimères
CpG). À titre d’exemple, MspI clive le site de restriction CCGG quel
que soit l’état de méthylation du dimère CpG central. Son isoschi-
zomère (enzyme clivant la même séquence nucléotidique) HpaII ne
coupe le site CCGG que si la cytosine n’est pas méthylée (figure 2).
Les facteurs affectant l’activité enzymatique sont : la température
(en général, la température optimale est 37 oC), le pH, la force
ionique.
Les enzymes de restriction sont utilisées pour établir des cartes
de restriction de gènes ou de régions chromosomiques, la réalisa-
tion de Southern blot, le clonage de gènes, la caractérisation de
mutations, l’étude de l’état de méthylation d’un gène...
2.2.2 Polymérases
■ ADN polymérases ADN dépendantes
Ces enzymes catalysent la formation d’une chaîne d’ADN à par-
tir d’une matrice d’ADN monobrin et de l’extrémité 3′OH libre d’un
oligonucléotide (ou amorce) d’environ 20 nucléotides en présence
de magnésium (Mg2+) et de dNTPs (déoxynucléotides triphos-
phates : dATP, dGTP, dCTP et dTTP).
Une ADN polymérase peut catalyser trois types de réactions
enzymatiques :
— activité ADN polymérase nécessitant une matrice ADN copiée
par extension d’une amorce ayant une extrémité 3′OH libre ;
— activité exonucléase 3′ → 5′ de relecture (proofreading ) ayant
pour but d’éliminer toute base incorporée par erreur dans le brin
d’ADN en cours de synthèse ;
— activité exonucléase 5′ → 3′ ayant pour but d’éliminer les
nucléotides à partir de l’extrémité 5′ des ADN double brin.
Plusieurs ADN polymérases sont utilisées en biologie molécu-
laire selon les activités enzymatiques que l’on souhaite mettre à
profit.
L’ADN polymérase I d’Escherichia coli présente les trois activités
enzymatiques, en revanche le fragment de Klenow, issu de sa
protéolyse limitée, a perdu l’activité exonucléase 5′ → 3′. L’intro-
duction de deux mutations au sein de la séquence codant le frag-
ment de Klenow a permis d’obtenir une enzyme dépourvue
d’activité exonucléasique employée pour le marquage de sondes
(random priming ).
Les T4 et T7 ADN polymérases isolées à partir des bactériopha-
ges T4 et T7 présentent des activités polymérasiques et 3′ → 5′
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MspI MspI
HpaII HpaII
*
5'-GG 5'-CC 5'-CC
3'-CC 3'-GG 3'-GG
*
5'-C C GG-3' 5'-CC GG-3'
3'-GG CC-5' 3'-GG CC-5'
GG-3' GG-3'
CC-3'
CC-5' CC-5'
GG-5'
exonucléasiques et permettent d’effectuer le marquage d’ADN en
3′, la mutagénèse dirigée...
La Taq ADN polymérase a été purifiée à partir de Thermus aqua-
ticus, eubactérie se développant dans les sources chaudes (80 oC).
Il s’agit d’une ADN polymérase ADN dépendante présentant une
activité exonucléase 5′ → 3′ mais dépourvue d’activité de relecture
correctrice. Sa remarquable propriété de thermorésistance est à la
base de son utilisation en PCR (§ 2.5).
Un certain nombre d’ADN polymérases thermostables ont été
extraites d’autres bactéries thermophiles, chacune ayant une parti-
cularité la destinant à un usage particulier : Tli (Thermococcus
litoralis ) et Pwo (Pyrococcus woesei ) ADN polymérases présentant
une activité 3′ → 5′ exonucléasique, la Tth ADN polymérase (Ther-
mus thermophilus ), présentant également une activité de trans-
criptase inverse. Des enzymes dérivant de la Taq polymérase sont
également commercialisées, telles que l’AmpliTaq Gold (inactive
à température ambiante, éliminant ainsi les extensions d’amorces
hybridées de manière aspécifique) ou le fragment de Stoffel
(dépourvu d’activité exonucléase 5′ → 3′).
■ ADN polymérases ARN dépendantes :
transcriptases inverses
Les transcriptases inverses sont codées par le gène pol de
différents rétrovirus.
Elles permettent la synthèse d’un ADN complémentaire (ADNc)
à partir d’une matrice constituée d’ARNm. Comme toutes les
polymérases, une transcriptase inverse fonctionne dans le sens
5′ → 3′ à partir de l’extrémité OH libre d’une amorce sur laquelle
vient se fixer un désoxynucléotide par l’intermédiaire d’une liaison
phosphodiester. Différents types d’amorces peuvent être utilisés :
oligo-dT s’hybridant sur la queue polyA des ARNm, random hexa-
mers (combinaisons aléatoires de 6 nucléotides) s’hybridant à dif-
férents niveaux des ARNm ou oligonucléotide spécifique de
l’ARNm à étudier.
■ ARN polymérases ADN dépendantes
Ce sont des ARN polymérases capables d’initier la synthèse
d’ARN à partir de promoteurs phagiques (T3, T7). Elles permettent
la synthèse de grandes quantités d’ADNc à partir des séquences
d’ADN liées à ces promoteurs pour des études, par exemple, de
maturation de l’ARNm.
2.2.3 Autres enzymes
■ ADN ligases
Les ligases assurent la formation d’une liaison phosphodiester
entre une extrémité 3′OH libre et une extrémité 5′phosphate de
deux nucléotides. L’ADN ligase d’Escherichia coli ne peut agir que
si les deux extrémités sont associées de manière cohésive. Elle
utilise comme cofacteur le nicotinamide dinucléotide (NAD+).
L’ADN ligase T4 extraite de bactéries infectées par le phage T4 est
capable d’effectuer des « ligations » entre deux ADN présentant
des bouts francs ou des bouts collants. Elle utilise l’ATP comme
cofacteur.
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ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES _______________________________________________________________________________________________________
■ Nucléases
La nucléase S1 est une endonucléase dégradant l’ADN simple
brin et, à forte concentration, l’ADN double brin. Elle permet de
générer des extrémités à bouts francs à partir d’extrémités à bouts
collants générées par une enzyme de restriction lors des manipu-
lations de clonage.
■ DNase I
Endonucléase clivant l’ADN simple ou double brin, elle agit
préférentiellement après une pyrimidine en libérant des extrémités
3′OH et 5′phosphate libres. Cette enzyme est utilisée pour le
marquage des sondes par « nick translation » c’est-à-dire par
création de cassures (nicks ) au sein de l’ADN double brin. Elle est
également utilisée pour l’analyse des gènes actifs de la chroma-
tine.
■ Transférases
Ce sont des enzymes permettant l’addition de déoxynucléotides
à l’extrémité 3′OH libre des molécules d’ADN. Elles sont utilisées
pour ajouter des séquences homopolymériques à l’extrémité
d’ADNc et de vecteurs mais également pour marquer une sonde
en 3′.
■ Phosphatase alcaline
Extraite de bactéries ou de muqueuses intestinales de bovins, la
phosphatase alcaline permet l’hydrolyse du phosphate en 5′ de
l’ADN, ARN ou nucléotide libre créant ainsi une extrémité 5′OH.
Empêchant ainsi toute action ultérieure de ligase, elle est utilisée
en particulier au cours des manipulations de clonage pour éviter la
recircularisation des molécules recombinantes. Cette enzyme
permet également d’éliminer un phosphate en 5′ avant marquage
des acides nucléiques par la T4 polynucléotide kinase.
■ Kinases
Extraite de bactéries infectées par le phage T4, la T4 polynucléo-
tide kinase transfère le phosphate en γ d’un ATP sur l’OH en 5′ d’un
polynucléotide. Les applications sont donc la phosphorylation en 5′
et le marquage en 5′ lorsque l’ATP utilisé comme donneur de
groupement phosphate est marqué en γ (γP 32ATP, γ S35ATP).
2.3 Le Southern blot
Cette méthode a été décrite pour la première fois en 1975 par
Edwin Southern. Le Southern blot permet l’étude d’un fragment
d’ADN particulier au sein du génome après transfert des frag-
ments d’ADN d’un gel d’électrophorèse sur une membrane. Les
fragments d’ADN sont ainsi immobilisés et peuvent ensuite être
étudiés. Les principales étapes de cette technique sont présen-
tées figure 3.
Dans un premier temps, l’ADN génomique double brin de haut
poids moléculaire est digéré par une ou plusieurs enzymes de
restriction. Les fragments de différentes tailles sont alors séparés
par électrophorèse en gel d’agarose (0,7 % en général). De nombreux
fragments étant présents, la visualisation du gel sous UV après addi-
tion de bromure d’éthydium donne un aspect de frottis (smear ). Cet
aspect permet de s’assurer d’une bonne digestion de l’ADN. Le gel
d’agarose est ensuite soumis à un traitement alcalin pour dénaturer
les fragments d’ADN double brin en ADN simple brin. L’ADN est
ensuite transféré (blot ) par un phénomène de capillarité sur un
support solide (membrane de nitrocellulose ou de Nylon). En
présence de soude, la fixation de l’ADN à la membrane s’effectue
de manière covalente. La membrane subit alors un premier traite-
ment, la préhybridation, afin de saturer les sites de fixation non
spécifiques de la sonde sur la membrane. Lors de l’étape d’hybrida-
tion, la sonde marquée (radioactive ou froide) est ajoutée et s’hybride
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de manière spécifique sur la séquence complémentaire. Une étape
de lavage est nécessaire afin d’éliminer des fixations non spécifiques
de la sonde. Ces lavages se font en solutions plus ou moins
stringentes (les solutions riches en sels sont peu stringentes et les
solutions pauvres en sels sont stringentes). Une solution stringente
déstabilise les séquences appariées. La révélation du signal est
ensuite fonction du type de sonde utilisée (autoradiographie,
chimiluminescence...).
Cette technique permet de mettre en évidence des remanie-
ments de l’ADN (délétions, insertions, inversions), d’effectuer des
cartographies de restriction. Cette méthode semi-quantitative per-
met une approche du dosage génique.
2.4 Le Northern blot
Cette technique dérivée du Southern blot est adaptée à l’analyse
d’un ARN particulier au sein de l’ARN total.
Au cours d’un Northern blot, les ARN totaux d’un tissu sont
séparés selon leur taille par électrophorèse dans un gel d’agarose
dénaturant suivie d’un transfert sur une membrane inerte. Les ARN
totaux ne sont pas digérés avant électrophorèse, leur taille étant
compatible avec une migration dans l’agarose. D’autre part, l’élec-
trophorèse est réalisée en milieu dénaturant (formaldéhyde) pour
éliminer les liaisons hydrogène éventuelles entre molécules ou au
sein des molécules d’ARN.
L’utilisation d’une sonde moléculaire spécifique complémentaire
de l’ARN recherché permet de révéler, après autoradiographie de
la membrane, une ou plusieurs bandes dans le cas de transcrits
multiples.
Cette technique permet de mettre en évidence l’absence ou la
diminution d’un ARNm (réarrangements majeurs, mutation du
promoteur, anomalie de la transcription ou transcrit instable), d’en
déterminer la taille normale ou anormale en cas de mutation
d’épissage par exemple.
2.5 PCR, RT-PCR
La technique de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain
Reaction ou PCR) consiste en une amplification in vitro d’une
courte séquence d’ADN située entre deux oligonucléotides de
synthèse d’environ 20 nucléotides (encore appelés amorces
ou primers) grâce à l’utilisation d’une ADN polymérase thermo-
stable : la Taq polymérase. Il s’agit d’une technique majeure de bio-
logie moléculaire permettant l’obtention d’une grande quantité de
matériel nucléique à partir d’une séquence d’ARN ou d’ADN dont
on ne possède que des quantités infimes.
En pratique, les acides nucléiques doivent dans un premier
temps, être extraits des échantillons à analyser (§ 1).
■ L’ensemble de la réaction d’amplification est constitué d’une suc-
cession d’une trentaine de cycles, eux-mêmes constitués de trois éta-
pes (figure 4) :
— 1) une étape de dénaturation par la chaleur de l’ADN double
brin afin de générer des simples brins. Le mélange réactionnel est
chauffé à 95 oC pendant environ 1 min ;
— 2) une étape d’hybridation des amorces complémentaires des
séquences encadrant la région à amplifier, chacune se fixant à un
brin d’ADN, dans des polarités opposées. On se place alors dans
des conditions de renaturation (aux alentours de 55 oC) ce qui permet
l’hybridation immédiate et spécifique des oligonucléotides avec
leurs séquences complémentaires. Ces oligonucléotides sont
présents à des molarités au moins 10 fois supérieures à celle de leurs
séquences cibles. Dans ces conditions, l’hybridation est pratique-
ment instantanée ;
— 3) une étape de polymérisation au cours de laquelle les brins
matrices sont recopiés à partir de chacune des deux amorces par
_______________________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
ADN total
Digestion par
une enzyme de restriction
Haut PM
Électrophorèse
des produits de
digestion
Bas PM
+
Dénaturation alcaline
Transfert sur membrane
nitrocellulose ou Nylon
Figure 3 – Les différentes étapes du Southern blot
une ADN polymérase ADN dépendante, la Taq polymérase en pré-
sence de Mg2+ et des 4 dNTPs. La Taq polymérase, extraite de la
bactérie Thermus aquaticus, présente la particularité d’être ther-
mostable, de pouvoir fonctionner à haute température (72 oC) et de
supporter le chauffage à 95 oC. Cette première étape double le nom-
bre des séquences cibles.
Après cette élongation, le mélange est à nouveau chauffé à 95 oC
pour dénaturer à nouveau l’ADN, puis replacé dans des conditions
d’hybridation. Les oligonucléotides vont à nouveau s’hybrider à
leurs séquences complémentaires et l’ADN polymérase va recopier
l’ensemble des matrices à partir des amorces, dupliquant ainsi les
deux séquences obtenues lors de l’étape précédente. Après ces
deux premiers cycles, la séquence recherchée, encadrée par les
deux oligonucléotides, aura été synthétisée en quatre exemplaires.
Après n cycles, la concentration en séquence cible sera multi-
pliée par 2 n. Ainsi, après 30 cycles, le facteur d’amplification sera
de 2 30. Cette valeur est cependant purement théorique, et corres-
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Sonde d’ADN
Marquage de la sonde
(ex : radioactivité)
Dénaturation de la sonde double brin
Hybridation de la sonde monobrin et
de l’ADN immobilisé sur la membrane
Lavage de l’excès de sonde
+ révélation (ex : autoradiographie)
9 kb
7 kb
pond à un rendement idéal de 100 % pour chaque réaction ce qui
est rarement le cas.
En fait, le rendement moyen des réactions d’élongation est de
l’ordre de 50 %. Si l’on appelle X le facteur d’amplification, Y le
nombre de copies initiales de la séquence cible et R le rendement,
on a X = Y (1 + R )n. Chaque cycle dure environ 3,5 min, ce qui
signifie qu’une amplification peut être effectuée en 2 heures.
Ce processus est aisément automatisable, et de nombreuses
machines effectuant les cycles de dénaturation /élongation en
continu existent déjà. L’utilisation d’une ADN polymérase thermo-
stable (Taq polymérase) permet d’effectuer les amplifications en
chaîne, sans que l’enzyme soit dénaturée par les très hautes
températures atteintes lors de l’étape de dénaturation. Les élonga-
tions à température élevée augmentent également le rendement
de la réaction en supprimant la majorité des structures secondai-
res de l’ADN, réduisant ainsi d’autant les risques d’arrêt préma-
turé de l’ADN polymérase.
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5’ 3’
3’ 5’ ADN double brin
Dénaturation (95 °C)
5’ 3’
ADN simple brin
3’ 5’

Cycle 1 Hybridation des oligonucléotides (
55 °C)

5’ 3’

3’ 5’
Élongation (72 °C)

5’ 3’
Synthèse de brins
complémentaires
3’ 5’
Dénaturation ( 95 °C)
Hybridation des oligonucléotides (
55 °C) Cycle 2
Élongation (72 °C)
5’ 3’

3’ Brins néoformés servant de

3’ matrice au cycle suivant

3’ 5’

5’ 3’
3’
3’
3’
3’
3’ 5’
Cycle 3

5’ 3’
3’
Cycle 2 à n

3’
3’

3’

3’ 5’

5’ 3’
3’
3’

3’
3’

3’
3’
3’ 5’

Cycle n

Les rectangles bleu pâle correspondent aux oligonucléotides hybridés lors de chaque cycle. Les fragments néoformés représentés en pointillé correspondent
aux fragments de taille attendue. Au dixième cycle, 98 % des molécules présentes ont une taille identique, déterminée par la position des oligonucléotides.
L’automatisation permet l’enchaînement de plus de 30 cycles en quelques heures.

Figure 4 – Représentation des trois premiers cycles d’une PCR

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490 nm 520 nm
490 nm

Quenching
FAM TAMRA FAM

TAMRA
Polymérisation
Taq polymérase
Activité 5’-3’ exonucléasique

470 nm
470 nm 640 nm

530 nm FRET
FITC
FITC Red
Hybridation

Red

470 nm

530 nm
SG 470 nm

SG SG SG SG
SG

SG

Polymérisation
SG SG SG

a Chimie TaqMan®.
Cette technologie met à profit l’activité 5’→ 3’ exonucléasique de la Taq polymérase. Au cours de la PCR et lors de l’étape d’hybridation, la sonde
doublement marquée est non fluorescente (quenching de la fluorescence du fluorophore rapporteur, FAM, par le fluorophore quencher, TAMRA).
Lors de l’étape de polymérisation la sonde est dégradée par la Taq polymérase. Le fluorophore rapporteur libre émet alors un signal après excitation.
Ce signal de fluorescence est enregistré à la fin de l’étape de polymérisation.

b Sondes d’hybridation.
Lors de l’étape d’hybridation, les deux sondes sont fixées sur le brin matrice et sont séparées par une à trois pb. Après excitation, le fluorophore (FITC)
en 3’ de la première sonde émet une quantité d’énergie capable d’exciter le fluorophore (Red 640) en 5’ de la deuxième sonde.
L’émission du signal à 640 nm est enregistrée à la fin de l’étape d’hybridation.

c Utilisation du SYBR® Green (SG).

En présence d’ADN double brin, le SYBR‚ Green se « glisse » au niveau des sillons d’ADN. Il émet alors une fluorescence à 530 nm après excitation à
470 nm. L’enregistrement de la fluorescence s’effectue après polymérisation.

Figure 5 – Représentation des différents types de fluorescence utilisés pour la PCR en temps réel

■ Il est également possible d’amplifier des séquences d’ARN par
RT-PCR en faisant précéder la réaction d’amplification proprement
dite par une réaction de transcription inverse grâce à une transcrip-
tase inverse (ou Reverse Transcriptase, RT) qui transforme l’ARN,
difficilement manipulable, en ADNc simple brin qui sera recopié au
cours du premier cycle d’amplification. On peut citer à titre d’exem-
ple la mise en évidence de transcrits illégitimes qui ne peuvent être
étudiés par aucune autre technique étant donné leur très faible
niveau d’expression.
■ Une fois les réactions d’amplification effectuées, il est néces-
saire dans un premier temps de vérifier la qualité du produit
obtenu ce qui est facilement réalisable après électrophorèse en gel
d’acrylamide ou d’agarose et coloration par le bromure d’éthydium
(figure 1, § 2.1). Il est également possible de détecter la séquence
recherchée en utilisant des sondes radioactives ou des sondes
froides stables selon des technologies immuno-enzymatiques clas-
siques.

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2.6 Application de la PCR à l’analyse

quantitative : la PCR en temps réel
Produit de PCR dénaturé
Le développement de la PCR a également révolutionné le 3’ ACTGCTAGCGATGAG
domaine de la quantification des acides nucléiques. La PCR quanti- 5’
amorce Extension d’amorce par
tative repose sur l’exploitation de la cinétique de la réaction. Der- l’ADN polymérase
nière née des méthodes de quantification, la PCR en temps réel est Incorporation aléatoire
réalisée grâce à un appareillage permettant de suivre en continu de ddNTP fluorescents
l’apparition des produits d’amplification grâce à l’émission d’une
quantité de fluorescence proportionnelle à la quantité de produits 3’ ACTGCTAGCGATGAG
formés elle même dépendant de la quantité de cible présente dans 5’ T
l’échantillon à analyser. TG
Plusieurs chimies peuvent être utilisées pour générer un TGA
niveau de fluorescence détectable (figure 5) : TGAC
— le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) mis à pro- TGACG
fit dans l’utilisation de sondes d’hybridation et de sondes d’hydro- TGACGA Obtention de fragments
lyse (TaqMan) ; TGACGAT fluorescents
de différentes tailles
— l’incorporation de SYBR Green, agent intercalant de l’ADN TGACGATC
émettant à 530 nm. TGACGATCG
TGACGATCGC
L’émission de fluorescence est enregistrée à chaque cycle ce
TGACGATCGCT
qui permet de tracer une courbe reflétant la cinétique de la réac-
TGACGATCGCTA
tion et de déterminer le cycle exact de démarrage de la phase
exponentielle. La précocité de ce cycle est directement propor- TGACGATCGCTAC
tionnelle à la quantité de cible présente dans l’échantillon à quan- TGACGATCGCTACT
tifier. TGACGATCGCTACTC

Il est donc possible d’établir une droite d’étalonnage à l’aide de

solutions de concentrations connues et de doser ainsi une solution Électrophorèse
de concentration inconnue. Gel de polyacrylamide
dénaturant
Plusieurs appareils sont actuellement disponibles sur le
marché : –
C
— le « Sequence Detection System 7700 » (PE Biosystems) qui T
C Hauts poids moléculaires
utilise la configuration classique de cyclers de cette firme associée A
à 96 fibres optiques permettant l’enregistrement par une caméra T
C
CCD de l’émission d’une fluorescence générée à partir d’une G
source laser ; C
T
— le « LightCycler » (Roche Diagnostics) : la réaction d’ampli- A
G
fication est réalisée en capillaires de verre. L’excitation des fluo- C
+ A
rophores s’effectue grâce à une source d’énergie dans le visible
G Bas poids moléculaires
et la mesure de la fluorescence s’effectue par spectrofluorimétrie. Laser T
Conçue initialement pour la quantification, cette technologie
s’applique également à l’analyse qualitative des acides nucléiques Détection des fragments
fluorescents
par l’utilisation de sondes ou d’amorces spécifiques de fragments Analyse électronique du
d’ADN sauvages ou mutés. signal par l’appareil de
séquençage
AC T GC T AGC GAT GAG

2.7 Séquençage
Les méthodes chimiques de séquençage de l’ADN utilisant les
modifications chimiques spécifiques de base et le clivage secon-
daire de l’ADN ont longtemps été employées (technique de Maxam
Gilbert, 1977).
Actuellement, l’essentiel du séquençage de l’ADN est réalisé
Figure 6 – Principe du séquençage automatique de l’ADN
grâce à la technique enzymatique rapportée par Sanger en 1977. La
utilisant les ddNTPs fluorescents
matrice d’ADN permettant le séquençage est un ADN simple brin
généré à partir d’un produit PCR ou par clonage dans un vecteur adé-
quat (M13) d’un fragment d’ADN génomique ou d’ADNc. La Taq
polymérase réalise la synthèse d’un nouveau brin en présence d’un
oligonucléotide, de dNTPs, de didéoxynucléotides (ddNTPs) La réaction de séquençage est effectuée en utilisant une
analogues aux dNTPs normaux mais différents en ce qu’ils ne concentration en ddNTP nettement inférieure à celle de son ana-
possèdent pas de groupement hydroxyle en position C3′ du logue normal dNTP et la terminaison de chaîne survient au
déoxyribose. Les ddNTPs sont incorporés dans la chaîne d’ADN en hasard au niveau de toutes les positions contenant la base en
croissance en formant une liaison phosphodiester entre leur C5′ et le question. À la fin de la réaction, une collection de fragments
C3′ du nucléotide précédemment incorporé. Le ddNTP incorporé d’ADN de tailles différentes est obtenue avec une extrémité 5′
dépourvu d’hydroxyle en C3′ entraîne un arrêt de la synthèse de la commune (l’oligonucléotide) et une extrémité 3′ variable se ter-
chaîne. minant par un ddNTP.

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Les fragments qui diffèrent en taille, même par un seul nucléo-
tide peuvent être séparés par électrophorèse en gel de polyacryla-
mide dénaturant.
Les fragments de tailles différentes peuvent être détectés en
utilisant des ddNTPs marqués ou des oligonucléotides marqués.
Les méthodes traditionnelles de séquençage utilisaient un mar-
quage par des radio-isotopes. Ces dernières années, une amélio-
ration majeure a eu lieu avec le développement de techniques
automatisées permettant le séquençage fluorescent de l’ADN. Ces
techniques utilisent des amorces ou des ddNTPs auxquels sont cou-
plées des molécules fluorescentes. Le marquage des 4 ddNTPs par
4 fluorophores différents permet de réaliser le séquençage en une
seule réaction. Les fragments d’extension sont donc marqués en
3′ par incorporation de ddNTPs fluorescents (dye terminators ). Les
fragments d’extension sont séparés par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide. En cours d’électrophorèse, des données brutes
sont générées dans l’appareil de séquençage semi-automatique
par la détection en temps réel des fragments fluorescents résultant
de la réaction de séquençage après excitation des fluorophores par
un laser bichromatique. Les signaux de fluorescence sont ensuite
digitalisés puis transmis à une unité informatique qui permet
l’enregistrement, le traitement et enfin le stockage des données
brutes. Après traitement, les données de la séquence sont visua-
lisées ou imprimées sous forme d’électrophorégramme (figure 6).
3. Application à l’analyse
moléculaire : l’identification
des mutations
diffèrent selon que le gène a été ou non cloné, identifié, et que
la mutation en cause est connue ou non. Néanmoins il y a une
condition préalable commune à toutes les stratégies : aucune
exploration génomique ne peut être envisagée si la maladie n’a
pas été déjà solidement diagnostiquée.
Il existe deux types de méthodes d’analyse génotypique : les
méthodes directes qui mettent en évidence la lésion génétique
elle-même et les méthodes indirectes qui utilisent des marqueurs
polymorphes.
3.1 Diagnostic direct
La mise en évidence d’une lésion génomique est de difficulté
variable selon la nature du gène et le type de lésion. Dans tous les
cas, pour explorer directement un gène, il faut disposer d’une
sonde clonée spécifique de ce gène (sonde d’ADN génomique
cloné ou d’ADNc) ou en connaître la séquence normale, soit pour
synthétiser une oligosonde spécifique, soit pour amplifier par PCR
le segment génomique où siège la lésion.
3.1.1 Détection de mutations connues
■ Les différents types de mutations
La pathologie moléculaire d’un gène connu recouvre l’ensemble
des mécanismes qui peuvent conduire à l’extinction ou à la modi-
fication de son expression. Ces mécanismes vont dépendre de la
nature de la mutation de la séquence nucléotidique de ce gène
(figure 7). Ces mutations peuvent être classées de la façon sui-
vante.
● Mutations ponctuelles

Depuis l’avènement de la PCR, de nombreuses stratégies dia- Elles sont constituées par le remplacement d’un nucléotide par
gnostiques se sont développées dans le but d’identifier les muta- un autre. Leur effet dépend de leur localisation au sein du gène.
tions à l’origine de pathologies héréditaires. Ces stratégies Elles peuvent se produire :

Site d’initiation
de la traduction
Site d’initiation
de la transcription
Séquences en amont STOP Site de
ATG polyadénylation
CAAT TATA

5’ 3’

5’UTR 3’UTR

anomalie de la polyadénylation
mutation du codon stop
absence d’épissage
site 3’ alternatif d’épissage
site 5’ alternatif d’épissage
absence d’épissage
mutations faux sens, non sens, décalage du cadre de lecture, site alternatif d’épissage
anomalie de l’initiation de la traduction
modification quantitative de l’expression

Les exons sont représentés par des rectangles bleus et séparés par les introns.
Une partie du premier et du dernier exon est non codante : UTR (UnTranslated Region)

Figure 7 – Principales mutations ponctuelles pouvant toucher un gène et leurs conséquences (d’après [2])

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— au sein de séquences régulatrices en amont du gène,

MW wt P M E perturbant la régulation de la transcription de l’ARNm en abon-
dance ;
— au niveau des régions codantes : mutations au niveau du codon
d’initiation de la traduction ; mutations faux sens entraînant la
160 pb substitution d’un acide aminé par un autre ; mutations non sens
140 pb
introduisant un codon Stop prématuré ; mutations faisant dispa-
raître un codon Stop normal ce qui conduit à un allongement de
la protéine issue de la traduction du messager ;
— au niveau des introns : mutations au niveau des séquences
Père Mère consensus d’excision-épissage, entraînant soit la délétion d’une
partie d’un exon, soit la rétention d’un fragment intronique au
niveau de l’ARNm entraînant le plus souvent l’absence de protéine
ou la présence de protéines largement tronquées par décalage du
cadre de lecture ;
Enfant — dans des régions en aval du gène, perturbant l’arrêt de la
transcription ou encore la stabilité de l’ARNm.
P père wt témoin sauvage
M mère (non porteur de la mutation) ● Mutations modifiant le nombre de nucléotides
E enfant MW marqueur de taille Insertions ou délétions de petite taille : de petites insertions ou
atteint de de petites délétions (inférieures à quelques dizaines de nucléo-
la maladie tides) peuvent modifier considérablement l’expression d’un gène.
Lorsque la mutation est présente, le produit PCR de 160 pb est digéré En effet, si la taille de ces microremaniements n’est pas multiple
par l’enzyme de restriction en deux fragments de 20 et 140 pb. de 3 bases, le décalage de la phase de lecture de l’ARNm (muta-
tion frameshift ) qui en résulte conduit le plus souvent à l’appari-
Figure 8 – Recherche de l’origine parentale d’une mutation tion d’un Stop prématuré. Lorsque la taille du réarrangement est
ponctuelle après digestion enzymatique du produit d’amplification multiple de 3 bases, la protéine aura perdu ou acquis une série
par PCR d’acides aminés entraînant parfois la modification de sa fonction.

ADN génomique normal ADN génomique muté

Oligosonde normale Oligosonde mutée Oligosonde normale

ADN normal ADN normal ADN muté ADN muté

Lavage contrôlé Lavage contrôlé

ADN normal ADN normal ADN muté ADN muté

Autoradiographie Autoradiographie

Signal présent Signal absent Signal présent Signal absent

Allèle normal Allèle muté
La version normale de la sonde ne peut s’hybrider qu’avec l’allèle normal. Réciproquement, la version mutée de la sonde ne peut s’hybrider qu’avec
l’allèle muté. Les hybridations croisées ne sont pas stables par suite de mauvais appariement (mismatch) entre bases non complémentaires.

Figure 9 – Principe de la détection d’une mutation ponctuelle par oligosonde de synthèse (méthode dite ASO) (d’après [2])

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Insertions ou délétions de grande taille : elles vont naturelle-

ment modifier profondément l’expression d’un gène, supprimant Séquence normale (sauvage)
par exemple une série d’exons.
EcoRI
■ Détection des mutations ponctuelles
● Modification de la carte de restriction
Le diagnostic direct par modification de la carte de restriction Sonde
concerne les mutations qui abolissent un site de restriction pré-
existant ou qui créent un nouveau site. La probabilité d’une telle 1,5 kb 3,5 kb
situation est relativement faible mais lorsque la coïncidence existe,
elle facilite considérablement le diagnostic, puisqu’une simple Séquence inversée (mutée)
digestion par l’enzyme suffit à fournir la réponse.
Cette méthodologie nécessitait autrefois la mise en œuvre d’un
Southerm blot ce qui pouvait prendre plusieurs jours. Actuelle-
ment, les digestions s’effectuent après amplification par PCR de
la séquence d’intérêt. Une simple électrophorèse en agarose suivie
d’une coloration par le bromure d’éthydium permet de visualiser
directement la présence ou l’absence de coupure (figure 8). 3 kb 2 kb
L’avènement de la PCR a permis de développer un certain nom-
bre de techniques permettant de créer ou d’abolir un site lorsque PM S M H
la mutation ne modifie pas naturellement la carte de restriction. –
On peut citer à titre d’exemple l’ACRS (Allele Created Restriction
Site ). Un site de restriction est créé artificiellement dans le produit 7 kb
d’amplification en utilisant une amorce modifiée positionnée juste
avant le site susceptible d’être muté. Cette amorce a subi une modi-
fication de séquence telle qu’un site de restriction est créé dans
le produit d’amplification normal, et aboli dans le produit d’ampli- 4 kb
fication muté ou inversement. 3,5 kb
● Techniques basées sur la spécificité de l’hybridation
3 kb
Diagnostic direct par hybridation spécifique : Allele Specific
Oligoprobe (ASO) : on utilise des oligosondes d’une vingtaine de
nucléotides, internes par rapport aux amorces d’amplification, et 2 kb
Sens de migration
dont la séquence est spécifique de l’allèle recherché. L’hybridation
est réalisée après immobilisation sur filtre (figure 9). +
Amplification Refractory Mutation System (ARMS) : une autre
approche consiste à amplifier spécifiquement l’allèle muté (ou H hétérozygote
sauvage) en utilisant des oligonucléotides s’hybridant de manière M allèle muté
spécifique sur l’un des deux allèles. PM poids moléculaire = marqueur de taille
Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) : deux types d’oligonu- S sauvage
cléotides de synthèse sont choisis pour correspondre, lorsqu’ils
sont placés bout à bout, à une séquence continue chevauchant la Figure 10 – Mise en évidence d’une inversion par la méthode
mutation recherchée. En l’absence de mutation, l’hybridation de Southern
parfaite des deux oligonucléotides permet l’action d’une ligase.
En présence de la mutation, l’hybride formé avec le second oligo-
nucléotide est imparfait et la ligase ne peut agir. La différence de Il est également possible de caractériser une délétion de grande
taille des oligonucléotides liés ou non est observée après électro- taille par PCR dans la mesure où l’on possède des oligonucléotides
phorèse. flanquant cette délétion. Dans le cas des insertions, soit l’insertion
est de taille modérée (inférieure à 1-2 kb) et le produit d’amplifica-
■ Mutations modifiant le nombre de nucléotides tion présentera une taille supérieure à la taille attendue, soit l’inser-
Les délétions, insertions, duplications, inversions de grande tion est de grande taille et l’amplification de l’ADN ne sera pas
taille sont en général faciles à mettre en évidence par la méthode possible dans les conditions classiques de réaction.
de Southern (figures 10 et 11).
Pour les délétions, il existe deux cas de figure. Dans le premier
cas, le territoire de l’ADN génomique exploré par la sonde ou 3.1.2 Détection de mutations inconnues
par la PCR est délété en totalité, et il s’ensuit une abolition du
La mise en évidence de mutations inconnues, surtout au sein
signal normal lorsque la délétion se retrouve à l’état homo-
de gènes de grande taille, utilise des techniques de screening qui
zygote. Si la délétion ne porte que sur un seul chromosome, elle
permettent de repérer l’emplacement de la mutation dans le gène
ne se traduit que par un affaiblissement du signal qui peut être
afin de limiter l’étape ultime de séquençage qui identifie la muta-
difficile à mettre en évidence et oblige à recourir à un dosage
tion. On peut citer à titre d’exemple les suivantes.
génique par comparaison de l’intensité du signal d’hybridation
avec celui donné par une sonde explorant un gène témoin. ■ Électrophorèse en gradient de dénaturants (DGGE : Dena-
Dans le second cas de figure, le territoire exploré par la sonde turing Gradient Gel Electropheresis)
est partiellement délété. Cette anomalie provoque dans tous les Cette technique repose sur le principe suivant : les variations de
cas une perturbation du fragment de l’ADN génomique hybridant séquence dans un segment d’ADN peuvent affecter la température
avec la sonde. de fusion d’un domaine donné. On peut comparer la séquence où
Ces considérations méthodologiques imposent de choisir avec l’on recherche une mutation à une séquence de référence servant
soin la ou les sondes à utiliser, ainsi que les enzymes de restriction. d’étalon.

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kb
18
13,5
9,8
8,6
Cette maladie héréditaire à transmission autosomique dominante est
due à une amplification d'un triplet CTG localisé dans la région 3' non
codante du gène de la myotonine protéine kinase. Il existe une grande
variabilité de l'expression clinique de la maladie corrélée à la taille de
l'expansion du triplet CTG. Le trait pointillé délimite les formes
« normale » (en dessous du trait) et mutée (au-dessus du trait) du gène.
On observe l'existence d'une expansion d'environ 4 kb (1300 CTG) sur
l'un des deux allèles maternels. Cette expansion a été transmise de
façon instable (accroissement de la taille de l'expansion : environ 8 kb,
2800 CTG) à son fils.
Figure 11 – Caractérisation d’une expansion de triplets
nucléotidiques par Southern blot dans une famille présentant
une maladie de Steinert
■ Analyse du polymorphisme de conformation de l’ADN
simple brin (SSCP : Single-Strand Conformational Poly-
morphism)
Elle repose sur le principe suivant : lorsqu’un segment d’ADN
double brin est dénaturé par la chaleur puis refroidi brutalement,
les brins restent séparés. Si on les soumet ensuite à une électro-
phorèse non dénaturante, chaque brin se renature sur lui-même et
prend une conformation spécifique dépendant de sa séquence
nucléotidique et conditionnant sa migration électrophorétique. Une
variation de séquence aussi minime qu’une mutation ponctuelle
peut se manifester par une différence de conformation et donc de
migration électrophorétique par rapport à une séquence de réfé-
rence.
Les techniques SSCP et DGGE sont capables de révéler une
variation de séquence dans un produit d’amplification. En cas de
résultat positif, il faudra analyser la séquence pour positionner et
identifier la mutation.
■ Analyse des hétéroduplexes
Certaines mutations, en particulier les microdélétions et les
micro-insertions, génèrent après PCR des hétéroduplexes dont la
conformation est telle qu’ils deviennent visibles après électro-
phorèse en gel non dénaturant. Par ailleurs, il existe sur le marché
des gels beaucoup plus discriminants que les simples gels d’acry-
lamide et qui permettent de séparer les hétéroduplexes dus à de
simples mutations ponctuelles.
■ Chromatographie liquide haute performance dénaturante
(DHPLC)
Les produits de PCR sont soumis à une chromatographie liquide
haute performance dénaturante en phase inverse par formation de
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paires d’ions au sein d’une colonne contenant des particules alky-
lées non poreuses. Dans des conditions dénaturantes partielles
(gradient linéaire d’acétonitrile), les hétéroduplexes formés par les
produits de PCR contenant une variation de séquence présentent
un temps de rétention plus faible au sein de la colonne que leurs
homoduplexes correspondants. L’identification d’échantillons pré-
sentant un polymorphisme ou une mutation est réalisée grâce à
l’analyse des profils d’élution. Les avantages majeurs de cette tech-
nologie sont l’automatisation, la rapidité de l’analyse (moins de
5 min par échantillon) et la taille des fragments d’ADN analysables
(jusqu’à 1 500 pb).
■ Clivage chimique des mésappariements
Après dénaturation des produits d’amplification et renaturation,
l’utilisation de réactifs chimiques permet la reconnaissance et la
modification spécifique des bases impliquées dans des mésappa-
riements. L’hydroxylamine modifie les cytosines et le tétroxyde
d’osmium les thymines. L’ADN est ensuite clivé au niveau des
bases altérées et les produits de clivage sont analysés par
électrophorèse.
■ Test des protéines tronquées (PTT)
Cette technique permet de mettre en évidence les mutations
ayant pour conséquence la synthèse d’une protéine tronquée. Elle
est basée sur la synthèse in vitro d’un ARNm « artificiel » qui est
ensuite traduit en présence d’un lysat de réticulocytes en incorpo-
rant un acide aminé marqué. Les produits de traduction sont
ensuite analysés en gel d’acrylamide. Si le cadre de lecture de cet
ARNm inclut un codon Stop, alors la protéine néosynthétisée est
de taille inférieure à celle obtenue avec un ARNm témoin traité
dans les mêmes conditions.
■ Séquençage direct
Lui seul permet l’identification de la mutation. Il peut bien
entendu être utilisé dans tous les cas de figure mais peut se
révéler particulièrement lourd pour des gènes de grande taille et
des pathologies présentant une hétérogénéité allélique impor-
tante.
3.2 Diagnostic indirect, utilisation
de marqueurs polymorphes de l’ADN
Le diagnostic indirect par analyse de liaison avec des marqueurs
polymorphes est envisagé lorsque la mutation causale n’est pas
connue et dans la mesure où l’on connaît précisément la localisa-
tion chromosomique du gène en cause. La mise en œuvre de cette
méthode suppose l’existence d’une certitude diagnostique absolue
et l’absence d’hétérogénéité génique de la maladie.
Le principe du diagnostic indirect consiste à distinguer le chro-
mosome porteur du gène pathologique de son homologue normal,
non plus par détection de la lésion génomique elle-même, mais
par l’étude de marqueurs localisés au voisinage de celle-ci, à une
distance génétique faible et connue, voire à l’intérieur du gène en
question. Lorsque les distances génétiques entre gène et marqueur
sont importantes, il existe un risque de recombinaison entre le site
polymorphe et le site muté.
Cette méthode fait donc appel à des marqueurs génotypiques
tels que les polymorphismes de restriction (RFLP), les minisatel-
lites, les microsatellites, les polymorphismes nucléotidiques
(Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Ces marqueurs sont dif-
férents d’un individu à l’autre et sont transmissibles à la descen-
dance.
_______________________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES

Tableau 2 – Principales caractéristiques des différents marqueurs polymorphes

utilisés pour le diagnostic moléculaire indirect
Année de Nombre dans
Marqueurs (1) Caractéristiques Domaines d’application
découverte le génome

RFLP 1975 > 105 Marqueurs bialléliques Southern blot, PCR-RFLP

VNTR Informativité +++ Southern blot

1985 > 104
Minisatellites Regroupés aux extrémités des chromosomes

VNTR Informativité +++ PCR

1989 > 105
Microsatellites Répartition homogène dans le génome

Moins informatifs que les microsatellites PCR-RFLP

SNP 1998 > 106
Répartition homogène sur l’ensemble du génome PCR spécifique d’allèle

(1) RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphisms.

VNTR : Variable Number of Tandem Repeat.
SNP : Single Nucleotide Polymorphisms.

La réalisation d’un diagnostic indirect impose d’étudier au moins

un cas index dans la famille, et de reconstituer sans ambiguïté la
phase. Ceci n’est obtenu qu’au prix d’une étude familiale parfois Taille du produit
exhaustive, et seulement si la constellation étudiée est informative. d’amplification
Certains membres essentiels pour reconstituer la phase peuvent Répétitions CA (en pb)
Amorce Amorce
faire défaut parce qu’ils sont morts ou inaccessibles, ce qui affaiblit gauche droite
plus ou moins le résultat final. 102
21
À l’informativité familiale s’ajoute l’informativité des marqueurs.
100
Plus ils sont polymorphes, meilleures sont les chances de pouvoir 20
discriminer les deux chromosomes porteurs du gène anormal et de
suivre leur ségrégation dans la famille jusqu’au sujet à explorer. 98
19
Les caractéristiques de chaque catégorie de marqueurs sont repré-
sentées dans le tableau 2. 96
18
Les marqueurs les plus informatifs sont constitués de répétitions
94
en tandem de longueur variable (Variable Number of Tandem 17
Repeat, VNTR) de type minisatellites et microsatellites.
92
Les minisatellites sont des séquences tout à fait particulières, à 16
la fois répétitives (il peut y avoir plus de 1 000 répétitions en tan-
dem, ayant en commun un motif central de 11 à 16 paires de Les amorces de PCR sont des séquences uniques situées de part et
bases), dispersées et très polymorphes. En dehors de l’hétérochro- d’autre du microsatellite. Dans cet exemple, 6 allèles allant de 25 à 20
répétitions sont indiqués avec la taille des amplimères. Ceux-ci sont en
matine des centromères, ces séquences sont dispersées sur tous général résolus par électrophorèse en gel d’acrylamide dénaturant.
les chromosomes et un certain nombre d’entre elles sont regrou-
pées au niveau des régions télomériques des chromosomes. À
chaque localisation chromosomique, les VNTR sont d’une extraor-
Figure 12 – Amplification par PCR d’un microsatellite de type CA (n)
dinaire variabilité. Ce type de séquence permet d’explorer simulta-
(d’après [2])
nément une soixantaine de loci autosomiques chez un seul
individu. Comme chacun d’entre eux est multiallélique, la probabi-
lité de rencontrer deux individus non apparentés avec un profil de
restriction identique est infime (< 10 –20 ). L’image obtenue est une L’analyse des microsatellites est systématiquement utilisée,
véritable empreinte génétique (médecine légale). simultanément au diagnostic direct des mutations, pour effectuer
Les microsatellites sont un exemple extrême de la répétition en un diagnostic prénatal (figures 13a et 13b ).
tandem où le motif de base est très court de 1 à 4 paires de bases.
Les SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) correspondent à la
Le motif le plus fréquemment répété est la paire CA(n) ou GT(n)
dernière génération de polymorphismes. Ces polymorphismes
(figure 12). Il est rencontré en moyenne tous les 10 kb d’ADN
bialléliques correspondent non seulement aux RFLP mais également
génomique. Le nombre de répétitions ne dépasse pas une quaran-
aux polymorphismes qui ne créent ou n’abolissent pas de site de
taine et la limite inférieure des répétitions est autour d’une douzaine.
restriction. Les SNP sont localisés non seulement en dehors des
La mise en évidence du polymorphisme d’un microsatellite se fait
gènes mais également dans les gènes et en particulier au niveau
par PCR à l’aide d’amorces oligonucléotidiques situées dans les
des régions codantes (troisième base du codon). Leur utilisation se
séquences uniques flanquantes.
développe considérablement en raison de leur caractérisation faci-
Les microsatellites sont très polymorphes et donc très informa- lement automatisable à grande échelle par l’inter- médiaire des
tifs, ils sont répartis régulièrement sur l’ensemble du génome. puces à ADN.

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D7S 518 c a c b
6,8 cM
D7S 501 a d c b
0,9 cM
D7S 2459 b c a b
E3 0,8 cM
D7S 692 b a b a

110 pb
102 pb
90 pb

c b a b
a b d b
b b c b
b a a a

Il s'agit du diagnostic prénatal de la maladie de Duchenne à l’aide
d’un microsatellite situé dans la région promotrice du gène de la
dystrophine. Le fœtus porte le même allèle (102 pb) que son
oncle maternel myopathe (d'après [2]).
a diagnostic prénatal de maladie génétique récessive liée au
chromosome par méthode indirecte
Des marqueurs microsatellites liés au gène E3 (dihydrolipoamide
déshydrogénase localisé en 7q31-32) ont été amplifiés à partir d’ADN
provenant d’un sujet atteint de déficit en E3, de ses parents, et d’ADN
fœtal recueilli par biopsie de trophoblaste. La comparaison des
haplotypes parentaux avec celui du cas index permet de déduire la
« phase génétique ». L’allèle muté est porté par le chromosome marqué
en gras. Dans la mesure où le fœtus a reçu le chromosome portant
l’allèle morbide de sa mère et le chromosome portant l’allèle sain de
son père, il est donc hétérozygote pour la maladie.

b diagnostic prénatal de maladie génétique autosomique récessive

par méthode indirecte

Figure 13 – Exemples de diagnostic prénatal de maladie génétique

Bibliographie

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