SAS-1 SP-6 SB Kit

Fiche technique

Helena Biosciences Europe

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Web: www.helena-biosciences.com
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UTILISATION

Le SAS-1 SP-6 SB Kit est destiné à la séparation des protéines par électrophorèse.

Le sérum contient plus de 100 protéines individuelles, chacune avec un ensemble spécifique de fonctions soumises à une
variation spécifique de concentration dans différentes conditions pathologiques1.

Depuis l'introduction de l'électrophorèse à migration libre par Tiselius2, et l'utilisation ultérieure de l'électrophorèse par zones, des
protéines sériques ont été fractionnées selon leur charge à un pH particulier. Le SAS-1 SP-6 SB Kit sépare les protéines sériques
en 6 classes principales (albumine, alpha-1 globuline, alpha-2 globuline, bêta-1 globuline, bêta-2 globuline et gamma globuline)
selon la charge dans un gel d'agarose. Les protéines sont ensuite colorées pour permettre la visualisation et l'interprétation
quantitative. Chacune des zones électrophorétiques classiques, à l'exception de l'albumine, contient normalement 2 composants
ou plus. Les proportions relatives de ces fractions se sont révélées utiles pour le diagnostic et le pronostic de certains états
pathologiques3-5.

AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS

Les réactifs du kit sont à usage diagnostique in vitro uniquement – NE PAS INGÉRER. Porter un équipement de protection
individuelle approprié lors de la manipulation de tous les composants du kit. Consulter la fiche de données de sécurité du produit
pour obtenir le lien vers les phrases de risque et les conseils de prudence le cas échéant. Éliminer les composants conformément
aux réglementations locales.

COMPOSITION

1. SAS-1 SP-6 SB GEL (x 10)

REF HL-3-2603SA
Contient de l'agarose dans un tampon tris / barbital avec du thiomersal et de l'azide de sodium comme conservateur. Le gel est
prêt à l'emploi tel qu'emballé.
2. ACID BLUE STAIN (1 x 75mL)
REF HL-3-2084SA
Contient du colorant bleu acide concentré. Diluez le contenu du flacon dans 700mL d'eau purifiée. Remuer pendant la nuit et
filtrer avant utilisation. Conserver dans un flacon hermétiquement fermé.
3. DESTAIN (A) (1 x 10g)
REF HL-3-2041SA
4. DESTAIN (B) (1 x 40mL)
REF HL-3-2042SA
Diluer le contenu du DESTAIN (A) dans 1 litre d'eau purifiée. Ajouter ensuite le contenu de DESTAIN (B) et ajouter encore
lentement 1 litre d'eau purifiée.
5. Autres composants du kit
Chaque kit contient du BLOTTER C en quantité suffisante pour 10 gels.

CONSERVATION, DURÉE DE VIE UTILE ET STABILITÉ

1. SAS-1 SP-6 SB GEL

Les gels doivent être conservés entre 15...30°C et sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'emballage. NE PAS
RÉFRIGÉRER NI CONGELER. La détérioration du gel peut être indiquée par 1) un aspect cristallin indiquant que le gel a été
congelé, 2) des fissures et des écailles indiquant que le gel est sec ou 3) une contamination visible de l'agarose par des

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 sources bactériennes ou fongiques.
Mise en garde: les gels d'agarose sont fragiles. Manipuler les poches et les gels uniquement par les bords. Éviter toute
pression sur le centre de la poche.
2. ACID BLUE STAIN
L'ACID BLUE STAIN doit être conservé entre 15...30°C et il est stable jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette. La
solution de colorant acide bleu diluée est stable pendant 6 mois entre 15...30°C. Il est recommandé de jeter immédiatement le
colorant utilisé pour éviter la perte du pouvoir colorant. De faibles performances de coloration peuvent indiquer une
détérioration de la solution de colorant.
3. DESTAIN (A)
4. DESTAIN (B)
La DESTAIN (A) / DESTAIN (B) doit être conservée entre 15...30°C et elle est stable jusqu'à la date d'expiration indiquée sur
l'étiquette. La solution de décolorant est stable pendant 6 mois entre 15...30°C.

MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI

REF 1531 SAS-1 Plus

REF 1212 SAS-2

REF 210200 SAS-1 Applicators

REF 210300 SAS-1 Applicators
REF 210100 Disposable Sample Cups
REF 3100 REP PREP

Eau purifiée

PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Du sérum récemment prélevé représente le spécimen de choix. Le sérum doit être prélevé selon les procédures établies utilisées
dans les tests de laboratoire clinique. Les échantillons de sérum doivent être réfrigérés (entre 2...8oC) dès que possible après le
prélèvement et sont stables pendant une semaine, bien que la bande Beta 2 commence à se dégrader après 3 ou 4 jours. Pour
des périodes de conservation plus longues, conserves les échantillons congelés à -20oC (pendant plus d'un mois) ou à -80oC
(pendant au moins un ans).

PROCÉDURE

1. Pipeter 35µL d'échantillon(s) dans les puits 4 à 9 des Disposable Sample Cups. Placez soigneusement le SAS-1 Sample
Tray sur le tiroir de l'applicateur. Veillez à ce que le plateau soit poussé fermement vers le bas.

2. Retirez le gel de l'emballage, jetez le recouvrement et distribuez 400µL de REP PREP sur le puits de chaleur. Placez le gel
sur le puits de chaleur, côté agarose vers le haut, en alignant les côtés positif et négatif avec les électrodes correspondantes,
en prenant soin d'éviter les bulles d'air sous le gel. Retirez tout excès de REP PREP sur le pourtour des bords du gel. Ne pas
toucher la surface du gel.

3. Tamponner la surface du gel avec un BLOTTER C, jeter le buvard.

4. Fixez les SAS-1 Carbon Electrodes sur la face supérieure des électrodes de façon qu'elles soient en contact avec les blocs
de gel. Placez le couvercle sur le gel et les électrodes et appuyez fermement pendant 5 secondes pour assurer le contact.

5. Mettez un SAS-1 Applicator en position supérieure sur l'instrument.

6. Effectuez l'électrophorèse:

Etape Temps (mm:ss) Température (°C) Tension Autres

Électrophorèse 22:00 20 100 1 Application

7. Électrophorèse suivante:
i) Retirez le couvercle et les électrodes.
ii) Retirez les deux blocs de gel à l'aide du Gel Block Remover.

8. Fixez le gel au support de chambre de coloration.

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9. Sélectionnez le programme du test de protéines sériques sur l'appareil de coloration et, lorsque vous y êtes invité, colorez,
décolorez et séchez le gel.

SAS-2 (Auto-Stainer)
Etape Solution Temps (mm:ss) Port Température (°C)
Colorer Colorant acide bleu 10:00 6 -
Laver Eau purifiée 01:00 1 -
Sécher - 15:00 - 65
Décolorer Solution de décoloration 05:00 2 -
Sécher - 10:00 - 65
Décolorer Solution de décoloration 05:00 2 -
Laver Eau purifiée 01:00 1 -
Sécher - 10:00 - 65

10. À la fin du cycle de coloration, retirez le gel du support de la chambre de coloration. Le gel est maintenant prêt à être examiné.

CONTRÔLE QUALITÉ

Le Kemtrol Serum Control – Normal Kit (REF 7024) et le Kemtrol Serum Control – Abnormal Kit (REF 7025) peuvent être utilisés
pour vérifier toutes les phases de la procédure et doivent être utilisés sur chaque passage de plaque. Se reporter à la notice
fournie pour les valeurs de dosage appropriées.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

Il est recommandé que toute évaluation des gels soit effectuée par rapport aux valeurs normales produites pour cette méthode
dans chaque laboratoire individuel.

Pour un examen complet de l'évaluation des protéines sériques, se reporter à Ritzmann, S.E, 19825. Des études montrent que les
valeurs sont les mêmes pour les hommes et les femmes non enceintes. Certaines différences sont observées chez les femmes
enceintes à terme et chez les femmes sous contraceptifs oraux.

L'âge a un certain effet sur des niveaux normaux. Le sang ombilical présente une diminution de la protéine totale, de l'albumine et
des fractions alpha-2 et bêta; une légère augmentation de l'alpha-1 et de la fraction gamma normale ou augmentée
(principalement d'origine maternelle). Les gammaglobulines chutent rapidement jusqu'à l'âge d'environ 3 mois, tandis que
d'autres fractions ont atteint des niveaux adultes à ce moment-là. Les niveaux adultes des gammaglobulines ne sont pas atteints
avant l'âge de 10 à 16 ans L'albumine diminue et la bêta-globuline augmente après 40 ans.

1. Évaluation qualitative:
Les gels peuvent être inspectés visuellement pour déceler la présence ou l'absence de bandes d'intérêt particulier.
2. Évaluation quantitative:
Scannez le gel, côté gel en bas, avec le logiciel Platinum Software.

Dans les deux cas, une élévation ou une diminution de certains composants sériques ou la détection de composants sériques
inhabituels doivent faire l'objet d'un examen plus approfondi. Le gel terminé est stable pendant une période indéfinie.

LIMITES

Comme toutes les procédures d'électrophorèse sont non linéaires, il est important de suivre attentivement Fiche technique pour
garantir une résolution optimale et des résultats reproductibles. Le non-respect de Fiche technique peut affecter les résultats
obtenus.

En raison des limites de résolution et de sensibilité de l'électrophorèse de zone, certains composants monoclonaux peuvent ne
pas être détectés par cette méthode.

FACTEURS INTERFÉRENTS

1. L'hémolyse peut causer une fausse élévation des fractions alpha-2 et bêta.
2. Des résultats inexacts peuvent être obtenus sur des spécimens laissés découverts, à cause de l'évaporation.

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VALEURS DE RÉFÉRENCE

En utilisant 121 échantillons normaux6 provenant de donneurs mâles et femelles âgés de 16 à 86 ans, les plages normales
suivantes ont été obtenues (elles ne sont présentées qu'à titre indicatif):
Fraction protéique Moyenne (%) Intervalle de confiance de 95%
Albumin 55,22 47,41 - 61,19
Alpha-1 3,53 2,49 - 6,07
Alpha-2 9,65 7,11 - 13,67
Beta-1 9,33 7,52 - 11,07
Beta-2 5,28 3,37 - 7,39
Gamma 16,99 11,15 - 26,13

CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES

Précision:

Deux (2) échantillons différents, un sérum de patient regroupé normal et un sérum pathologique, ont été analysés sur une période
de vingt jours avec deux séries de chaque échantillon par jour et deux répétitions de chaque échantillon par série. Il s'agit de
l'étude classique 20 x 2 x 2 décrite dans les directives CLSI7. Les mêmes numéros de lot de gel et de réactif ont été utilisés pour
l'étude de vingt jours. Les moyennes, SD et CV (n = 80) ont été calculées pour chaque échantillon et chaque bande. Les deux
tableaux suivants montrent les résultats pour les deux échantillons.

Résultats de l'échantillon de sérum normal

Moyenne Répétabilité Entre passages Entre jours En laboratoire
Bande N
Valeur SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV
Albumin 55,8 80 0,79 1,42 0,85 1,52 0,44 0,78 1,24 2,22
Alpha-1 3,1 80 0,17 5,65 0,10 3,21 0,07 2,35 0,21 6,91
Alpha-2 9,2 80 0,26 2,87 0,21 2,28 0,10 1,09 0,35 3,83
Beta-1 9,5 80 0,25 2,66 0,23 2,46 0,15 1,57 0,37 3,95
Beta-2 5,7 80 0,18 3,24 0,18 3,10 0,03 0,48 0,26 4,51
Gamma 16,8 80 0,38 2,26 0,29 1,70 0,28 1,66 0,55 3,28

Résultats de l'échantillon de sérum pathologique

Moyenne Répétabilité Entre passages Entre jours En laboratoire
Bande N
Valeur SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV
Albumin 46,8 80 0,66 1,40 0,46 0,98 0,44 0,94 0,91 1,95
Alpha-1 2,9 80 0,18 6,17 0,14 4,76 0,00 0,00 0,22 7,60
Alpha-2 7,6 80 0,18 2,41 0,20 2,70 0,00 0,00 0,26 3,48
Beta-1 7,3 80 0,19 2,63 0,10 1,34 0,14 1,96 0,26 3,54
Beta-2 4,4 80 0,19 4,23 0,14 3,21 0,12 2,66 0,26 5,94
Gamma 31,0 80 0,33 1,07 0,20 0,65 0,24 0,77 0,45 1,46

Reproductibilité:

Trois (3) échantillons différents, un sérum de patients regroupés normal, un enrichi avec une bande monoclonale de 15g/L et un
enrichi avec une bande monoclonale de 30g/L ont été testés sur 5 jours avec une série de chaque échantillon par jour et cinq
répétitions de chaque échantillon par série. Les tests ont été effectués en trois exemplaires sur trois machines différentes, chaque
machine étant conduite par un opérateur différent. Il s'agit de l'étude classique 3 x 5 x 5 décrite dans les directives CLSI7. Les
moyennes, SD et CV (n = 75) ont été calculées pour chaque échantillon et chaque bande. Les trois tableaux suivants montrent
les résultats pour les 3 échantillons.

Résultats pour l'échantillon de sérum normal

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 Moyenne Répétabilité Entre passages Entre jours Entre sites Reproductibilité
Bande N
Valeur SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV
Albumin 55,94 75 0,60 1,07 0,36 0,64 0,52 0,92 0,06 0,11 0,97 1,73
Alpha-1 3,31 75 0,15 4,58 0,02 0,70 0,02 0,62 0,00 0,00 0,21 6,30
Alpha-2 9,66 75 0,22 2,29 0,05 0,50 0,08 0,78 0,00 0,00 0,35 3,65
Beta-1 9,34 75 0,21 2,21 0,04 0,46 0,04 0,47 0,05 0,53 0,37 3,95
Beta-2 5,37 75 0,19 3,49 0,04 0,66 0,00 0,05 0,00 0,01 0,20 3,64
Gamma 16,37 75 0,32 1,98 0,10 0,64 0,03 0,21 0,00 0,00 0,37 2,28

Résultats pour l'échantillon avec bande monoclonale de 15g/L

Moyenne Répétabilité Entre passages Entre jours Entre sites Reproductibilité
Bande N
Valeur SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV
Albumin 46,54 75 0,52 1,12 0,27 0,58 0,32 0,68 0,00 0,00 0,77 1,65
Alpha-1 2,73 75 0,21 7,82 0,05 1,67 0,02 0,82 0,02 0,86 0,30 11,08
Alpha-2 7,49 75 0,24 3,23 0,06 0,78 0,02 0,33 0,01 0,08 0,30 3,99
Beta-1 6,90 75 0,23 3,35 0,05 0,77 0,07 1,04 0,00 0,00 0,35 5,12
Beta-2 3,95 75 0,18 4,51 0,03 0,81 0,04 0,96 0,03 0,71 0,31 7,92
Gamma 32,38 75 0,32 0,99 0,10 0,32 0,04 0,11 0,25 0,77 0,62 1,93

Résultats pour l'échantillon avec bande monoclonale de 30g/L

Moyenne Répétabilité Entre passages Entre jours Entre sites Reproductibilité
Bande N
Valeur SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV
Albumin 40,85 75 0,33 0,82 0,11 0,27 0,06 0,14 0,21 0,51 0,61 1,50
Alpha-1 2,47 75 0,19 7,81 0,04 1,51 0,01 0,35 0,00 0,15 0,22 9,03
Alpha-2 5,98 75 0,21 3,59 0,05 0,77 0,02 0,33 0,02 0,31 0,29 4,87
Beta-1 4,95 75 0,18 3,58 0,03 0,63 0,03 0,56 0,01 0,19 0,26 5,28
Beta-2 2,83 75 0,11 3,94 0,01 0,44 0,00 0,09 0,00 0,00 0,12 4,35
Gamma 42,92 75 0,38 0,89 0,15 0,34 0,23 0,53 0,38 0,88 0,87 2,02

Sensibilité :

Un échantillon pathologique a été dilué en série à la fois dans du sérum (sensibilité fonctionnelle) et une solution saline
(sensibilité absolue) et passés sur un gel SAS-1 SP-6 SB pour déterminer la limite de détection (LOD). Pour la sensibilité
fonctionnelle, la méthode s'est révélée sensible à 0,25g/L et pour la sensibilité absolue, la méthode s'est révélée sensible à
0,13g/L, déterminée comme étant la plus faible concentration de protéines qui était évidente sous la forme d'une bande discrète
sur le gel complété.

Il est toutefois important de remarquer que les limites de détection peuvent varier selon la position de migration de la bande
monoclonale et le niveau de contexte polyclonal.

Linéarité :

La linéarité de la méthode est fonction de la spécification du densitomètre, ainsi que des performances du gel. Il est recommandé
à chaque client de déterminer la linéarité de la méthode en fonction du densitomètre utilisé dans le laboratoire.

Comparaison des méthodes8:

Cent vingt (120) échantillons de sérum pathologique et normal ont été testés en double sur des gels SAS-1 SP-6 SB et SAS-1
SP-24 SB. Le tableau ci-dessous récapitule les résultats.

Bande Coefficient de corrélation ordonnée y Pente Plage de valeurs en %

Albumin 0,978 0,654 1,001 31,88 - 59,82
Alpha 1 0,881 0,103 0,982 1,65 - 4,72
Alpha 2 0,970 0,567 0,920 2,63 - 13,59
Beta 1 0,972 0,491 0,938 2,19 - 11,09
Beta 2 0,999 -0,081 0,999 1,90 - 52,51
Gamma 0,998 0,013 0,973 2,23 - 56,09

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BIBLIOGRAPHIE

1. Alper, C.A. 'Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid', N. Eng. J. Med., 1974; 291 : 287-290.
2. Tiselius, A. 'A New Apparatus for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures', Trans. Faraday Soc., 1937; 33 : 524.
3. Ritzmann, S.E. and Daniels, J.C. 'Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of Proteins, Qualitative and
Quantitative Assays' in Laboratory Medicine, Harper and Row, Inc., Hagerstown, 1979.
4. Tietz, N.W. (Ed.), Textbook of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pages 579-582, 1986.
5. Ritzmann, S.E. (Ed.), Protein Abnormalities Volume 1 : Physiology of Immunoglobulins - Diagnostic and Clinical Aspects’, Allen
R. Liss, Inc., New York, 1982.
6. CLSI. Defining, Establishing and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guideline - Third Edition.
CLSI document EP28-A3c. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008.
7. CLSI. Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Procedures; Approved Guideline - Third Edition. CLSI document
EP05-A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014.
8. CLSI. Measurement Procedure Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline - Third Edition.
CLSI document EP09-A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013.

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