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Vol. 67, No. 10 Chem. Pharm. Bull. 67, 1023-1029 (2019) 1023

Révision

Synthèse combinatoire et
évaluation biologique des
Destruxines
Masahito Yoshida
Faculté des sciences pures et appliquées, Université de Tsukuba ;
1-1-1 Tennoudai, Tsukuba, Ibaraki 305-8571, Japon.
Reçu le 26 mars 2019

La synthèse combinatoire et l'évaluation biologique des destruxines sont décrites ici. Tout d'abord, la
synthèse totale de la destruxine E a été réalisée et sa configuration absolue a été déterminée avec succès comme
étant (S). En o u t r e , la préparation d'une bibliothèque combinatoire basée sur la structure des destruxines a été
r é a l i s é e par la méthode "split-and-pool". L'évaluation biologique des analogues obtenus contre les cellules
multinucléées de type ostéoclaste (OCL) a révélé que le résidu N-méthyl-alanine était crucial pour induire des
changements morphologiques dans les OCL. En particulier, la fonctionnalisation en p o s i t i o n β- du résidu
proline (Pro) s'est avérée tolérante pour l'activité biologique souhaitée de la destruxine E, ce qui suggère que la
p o s i t i o n β- du résidu Pro devrait être un site prometteur pour l'introduction d'une étiquette chimique en vue
de la préparation d'une sonde moléculaire.
Mots clés produit naturel ; peptide cyclique ; synthèse totale ; bibliothèque combinatoire

1. Introduction Des analogues de la destruxine ont été isolés au cours des

Les produits naturels sont depuis longtemps considérés
comme un espace chimique prometteur pour la découverte de
médicaments.1,2) En particulier, les peptides bio- logiquement
actifs isolés de la nature possèdent des propriétés structurelles et
biologiques uniques ; les produits naturels peptidiques sont donc
une source potentielle pour le développement de nouveaux
médicaments candidats.3–5) D'autre part, une méthode efficace de
synthèse des peptides cycliques devrait être établie afin de
permettre l a préparation rapide d'analogues pour les études
de relation structure-activité et de fournir une molécule
souhaitée à l'échelle du gramme pour les études in vivo. Dans
cet article, nous nous concentrons sur le cyclodepsipeptide
biologiquement actif, la destruxine E, et nous décrivons son
étude de relation structure-activité basée sur la s y n t h è s e
totale de la destruxine E en vue de l'élucidation d'un mode
d'action.
2. Destruxine E
La Destruxine E (1), isolée de Metarhizium anisopliae par
Päis et al. en 1981, est un cyclodepsipeptide à 19 chaînons,
composé de cinq résidus d'acides aminés (β-alanine (Ala), N-
méthyl-alanine (MeAla), N-méthyl-valine (MeVal), isoleucine
(Ile) et proline (Pro)) et d'un dérivé d'acide α-hydroxy contenant
un époxyde terminal dans la chaîne latérale6) (Fig. 1). Plusieurs
dernières décennies,7–13) et ces analogues sont connus pour
montrer plusieurs activités biologiques, y compris l'inhibition de
la V-ATPase qui a été identifiée comme une cible prometteuse
dans le développement récent de médicaments pour le traitement
du cancer.14–16) En particulier, la destruxine E (1) présente une
puissante activité cytotoxique contre les cellules cancéreuses,
par exemple, contre KB-31 (IC50 = 0,05 µM), HCT116 (IC50 =
0,04 µM), et
A549 (IC50 = 0,22 µM).17) En outre, Nakagawa et al. ont
ont rapporté que la destruxine E (1) et B (2) inhibe de manière
réversible les activités de résorption osseuse des ostéoclastes en
induisant des changements morpho- logiques sans affecter la
viabilité cellulaire.18) En fait, la plupart des inhibiteurs de
l'activité de résorption osseuse sont connus pour être
irréversibles, conduisant à l'induction de l'apoptose19,20) ; par
conséquent, le mode d'action de la destruxine E (1) semble être
unique et devrait être élucidé pour développer un nouvel agent
anti-résorptif pour les traitements de l'ostéoporose. À ce jour,
des études synthétiques sur les destruxines ont été rapportées par
plusieurs groupes de recherche.21–29) La plupart des études
synthétiques récentes ont été réalisées en phase de solution, et la
préparation de la structure macrocyclique à 19 membres des
destruxines a été réalisée par macrométhanisation.
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Fig. 1. Structures de la Destruxine E (1) et B (2) Fig. 2. Positions pour la formation d'un macrocycle

e-mail : masahito@chem.tsukuba.ac.jp
2019 La Société pharmaceutique du Japon
Vol. 67, No. 10 Chem. Pharm. Bull. 67, 1023-1029 (2019) 1023

Graphique 1. Préparation des précurseurs de cyclisation

lactamisation (entre les résidus Pro et Ile, ou entre les résidus
MeAla et β-Ala) (Fig. 2). Récemment, la biosyn- thèse des
destruxines a été rapportée et a révélé que la structure
macrocyclique des destruxines pouvait être biosynthétisée par
macrolactamisation après la synthèse pep- tide non ribosomale
d'un précurseur de cyclisation.30,31) Ainsi, les résultats de la
biosynthèse ci-dessus suggèrent que la macrolactamisation est
une méthode efficace pour la formation d'une structure
macrocyclique dans la synthèse de la destruxine. D'autre part, la
synthèse en phase solide est une méthode puissante pour
préparer une bibliothèque combinatoire en vue de l'élucidation
des relations structure-activité. Cependant, la formation d'une
liaison ester sur le polymère
On sait que l'immobilisation du résidu β-Ala sur un support
polymère est problématique, comparée à celle d'une liaison
amide, en raison de la faible nucléophilie du groupe hydroxyle
correspondant32) ; par conséquent, la synthèse d'un précurseur de
cyclisation pour les destruxines devrait être initiée à partir du
résidu β-Ala immobilisé sur un support polymère.
L'établissement de conditions de ré-action pour la
macrolactonisation devrait être essentiel pour réaliser la
synthèse totale de la destruxine E (1) et de ses analogues en
utilisant la synthèse en phase solide.
3. Synthèse totale et détermination de la structure de la
Destruxine E (1)33)
Vers la compréhension de la relation structure-activité

Biographie
Masahito Yoshida a obtenu son doctorat en 2006 sous la direction des professeurs Takashi Takahashi
et Takayuki Doi à l'Institut de technologie de Tokyo. Après avoir étudié en tant que boursier
postdoctoral au département de biologie chimique de l'Institut Max-Planck de physiologie moléculaire
(Dortmund, Allemagne) sous la direction du professeur Herbert Waldmann, M. Yoshida a travaillé avec
le professeur Doi à l'École supérieure des sciences pharmaceutiques de l'Université Tohoku en tant que
boursier COE (2008-2011), puis en tant que professeur adjoint (2011-2018). Il a été nommé professeur
associé en 2018 à la faculté des sciences pures et appliquées de l'université de Tsukuba. Il a reçu le prix
Masahito Yoshida
du jeune chercheur de la Société japonaise des peptides en 2016 et le prix de la division de chimie
organique
2018. de la Société
Les recherches dupharmaceutique du Japon.
Dr Yoshida portent sur l'élucidation du mode d'action des produits naturels biologiquement actifs et
de leurs analogues, sur la base d'une synthèse totale.
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Graphique 2. Synthèse totale et détermination de la structure de la Destruxine E (1)

de la destruxine E (1), nous avons d'abord étudié la synthèse puissance biologique de la destruxine E (1).
totale de 1 en utilisant la synthèse en phase solide qui permet
une synthèse combinatoire des analogues de la destruxine, et
nous avons ensuite essayé de d é t e r m i n e r la configuration
absolue de la partie époxyde. Tout d'abord, le groupe Fmoc-
βAla-OH a été immobilisé sur un Lantern34) lié au chlorure de
trityle dans des conditions basiques, ce qui a permis d'obtenir le
polymère 3. Sa quantité de charge a été déterminée par analyse
gravimétrique comme étant de 35 µmol/unité (quantitatif) après
clivage d u polymère-support. Après élimination du groupe
Fmoc sur le support polymère, le Fmoc-MeAla-OH a été couplé
à l'aide de diiso- propylcarbodiimide (DIC)/1-
hydroxybenzotriazole (HOBt) pour obtenir le dipeptide 4. Dans
l'étape suivante, l'acylation de l'acide aminé NMe supporté par le
polymère est souvent problématique. En fait, la méthode
conventionnelle mentionnée ci-dessus (DIC/HOBt) n'était pas
efficace pour le couplage avec Fmoc-MeVal-OH. Après des
recherches approfondies, l'utilisation du
bromotri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
(PyBroP)35) s'est avérée la meilleure pour la condensation d'un
NMe-amine supporté par un polymère, conduisant au tripeptide
5. La synthèse du tétrapeptide 6 a également été réalisée en
utilisant le PyBroP/N,N-diisopropyléthylamine (DIEA) pour le
couplage avec le Fmoc-Ile-OH et les précurseurs de cyclisation.
9 ont été préparés avec succès sur le support polymère 8 par
couplage avec les acylprolines 7a-b, suivi de l'élimination du
groupe tert-butyl diméthylsilyl (TBS) et du clivage du support
polymère (graphique 1).
La macrolactonisation des précurseurs de cyclisation 9a-b a
été étudiée et nous avons constaté avec succès que la
macrolactonisation se déroulait sans problème par la méthode de
Shiina (anhydride 2-méthyl-6-ni- trobenzoïque (MNBA)/4-
(diméthylamino)pyridine N-oxyde (DMAPO))36–40) dans des
conditions de haute dilution (3 mM). Les macrolactones 10a-b
souhaitées ont été obtenues avec des rendements modérés sans
formation d'un produit dimérisé correspondant. Enfin, un
époxyde dans la chaîne latérale d'un dérivé d'acide α-hydroxy a
été préparé avec succès, conduisant à la destruxine E (1) et à son
épimère epi-1 (graphique 2). Sur la base de la synthèse totale ci-
dessus, la stéréochimie de l'époxyde dans le produit naturel a été
déterminée comme étant (S). En outre, l'évaluation de
l'inhibition de la V-ATPase par la destruxine E (1) et l'épi-1 a
révélé que l'activité du produit naturel est 10 fois plus forte que
celle de son épimère, ce qui indique que la partie époxyde, y
compris sa stéréochimie, affecte de manière critique la
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Graphique 3. Synthèse évolutive du tétrapeptide 11

4. Synthèse évolutive de la Destruxine E (1)41)

La préparation d'un produit naturel à l'échelle de plusieurs
grammes est nécessaire pour évaluer ses activités biologiques
in vivo. Cependant, la production de destruxine E (1) à partir
de sources naturelles est connue pour être significativement
faible (environ 7 mg/L)6) ; par conséquent, l'établissement
d'une procédure synthétique pour la production de 1 à l'échelle
de plusieurs grammes serait nécessaire pour nos objectifs. Pour
réaliser la synthèse évolutive de la destruxine E (1), nous avons
appliqué la synthèse en phase de solution pour la préparation
du précurseur de cyclisation, qui pourrait ensuite être
synthétisé par couplage avec des tétrapeptides.
11 et l'acylproline 7a. La synthèse en phase de solution du
tétrapeptide 11 a été réalisée en utilisant des acides aminés
protégés par Cbz plutôt que par Boc, en raison des liaisons N-
méthylamides résultantes qui sont instables dans des conditions
acides pour la récupération du groupe Boc42) ; le 11
correspondant a été facilement obtenu à partir de H-β-Ala-
OTMSE (12) sur une échelle de plusieurs grammes (graphique
3).
En r e v a n c h e , l'acylproline 7a doit être préparée en
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de manière stéréosélective pour une synthèse évolutive. Ainsi,
nous avons tenté une dihydroxylation asymétrique de
Sharpless43,44) de l'alcène terminal dans 14. Bien que la
stéréosélectivité soit connue p o u r ê t r e modérée dans la
dihydroxylation asymétrique d'un alcène terminal, nous avons
constaté que les conditions de réaction en présence de (DHQD)2
PHAL fournissaient favorablement le diol désiré 17 dans un
rapport de 17a : 17b = 86 : 14, alors que la réaction utilisant un
mélange AD β fournissait un diol dans un rapport de 17a : 17b
= 67 : 33. Les diastéréoisomères obtenus ont été facilement
séparés par chromatographie sur colonne de gel de silice après
protection du diol résultant par un acétal d'isopropylidène.
Enfin, l'élimination du groupe benzyle par hydrogénolyse a
permis d'obtenir l'acylproline 7a souhaitée à l'échelle du
gramme. Le précurseur de cyclisation 9a a été préparé avec
succès par couplage de l'acylproline 7a avec le tétrapeptide 11 à
l'aide de PyBroP/DIEA, suivi de l'élimination des groupes
protecteurs aux extrémités N- et C-terminales (graphique 4).
En vue d'une synthèse évolutive de 1, les conditions de
réaction pour la macrolactonisation devraient être réétudiées. En
général, les conditions de réaction pour la macrolactonisation
sont élevées.
Graphique 4. Synthèse améliorée du précurseur de cyclisation 9a
Chem. Pharm. Bull. 1027
Les conditions de dilution sont employées pour une
macrolactonisation afin d'éviter la formation d'un produit
dimérisé correspondant, ce qui signifie que la quantité de
solvant d e v r a i t également augmenter pour atteindre des
conditions de dilution élevées dans une synthèse à grande
échelle. Par conséquent, la concentration du substrat pour la
macrolactonisation a été étudiée afin de déterminer la meilleure
façon de réduire la quantité de solvant ; la réaction s'est déroulée
avec succès à la concentration de 6 mM, conduisant au
macrolac- tone 10a sans la formation du produit dimérisé
problématique. La synthèse du macrolactone 10a ayant été
réalisée à l'échelle du gramme, la synthèse évolutive de la
destruxine E (1) a ensuite été réalisée comme suit : l'élimination
de l'acétal isopropylidène dans 10a dans des conditions
faiblement acides, suivie de la tosylation sélective de l'alcool
primaire résultant, a permis d'obtenir le tosylate 19. Enfin, la
formation de l'époxyde dans des conditions basiques a permis
d'obtenir la destruxine E souhaitée (1) à l'échelle du gramme
avec une excellente pureté (> 95 %) (graphique 5).
5. Synthèse combinatoire d'analogues de la Destruxine
par la méthode Split-and-Pool45,46)
Sur la base des méthodes de synthèse de la destruxine E (1),
comme indiqué ci-dessus, une synthèse combinatoire
d'analogues de la destruxine E a été tentée en utilisant la
méthode "split-and-pool".47) Nous avons dé- signé les analogues
en nous référant à la structure des destruxines et des dérivés
apparentés précédemment isolés à partir de sources naturelles, et
nous avons prévu de synthétiser dix-huit analogues contenant
les acides aminés A, B et C, comme le montre le graphique 6.
Initialement, l'immobilisation de Fmoc-βAla-OH sur des
l a n t e r n e s a été réalisée par l'intermédiaire d'un lien
trityle qui peut être clivé dans des conditions faiblement acides.
Les lanternes sont des supports polymères en forme de pilier, et
se distinguent facilement par l'attachement de tiges colorées et
de rouages pour la reconnaissance de chaque analogue sur le
support polymère. Après avoir divisé les lanternes en récipients
de réaction, la synthèse du tétrapeptide a été réalisée de manière
combinatoire, guidée par les tiges et les rouages. L'acylation
avec l'acylproline 7a, suivie de l'élimination du groupe TBS, a
permis d'obtenir un hexapeptide sur support polymère qui a été
clivé des lanternes en parallèle pour fournir le précurseur de
cyclisation souhaité. A cette fin, la synthèse d'analogues de la
destruxine E a été réalisée avec succès par macrolactonisation,
suivie de la formation d'un époxyde de la même manière que
celle utilisée pour la synthèse totale de 1 (diagramme 7). Les
analogues de la destruxine E qui en résultent sont
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Graphique 5. Synthèse totale évolutive de la Destruxine E (1)

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Graphique 6. Stratégie de synthèse de la bibliothèque de la Destruxine E
Graphique 7. Synthèse combinatoire des analogues de la Destruxine E
ont été évalués pour déterminer les changements
morphologiques dans les OCL. Il convient de noter que le résidu
MeAla était crucial pour présenter l' activité biologique
souhaitée, et que les résidus MeVal ou Ile pouvaient être
modifiés pour la préparation d'une sonde chimique. Cependant,
la substitution par des dérivés d'acides aminés possédant un
azoture d'alkyle a significativement diminué l'activité (Fig. 3),
d'o ù la nécessité d'effectuer une autre étude de relation
structure-activité afin de déterminer une position appropriée
pour l'introduction d'une fraction de marquage chimique en vue
de la préparation d'une sonde moléculaire.
Chem. Pharm. Bull. 1029
Nakagawa et al. ont rapporté que l'analogue apparenté, la
destruxine B, possédant une chaîne latérale iso-butyle, présente
également un effet biologique contre les ostéoclastes,18) et
qu'elle peut être facilement préparée, contrairement à la
destruxine E qui possède un groupement époxyde dans la chaîne
latérale d'un dérivé acide α-hydroxy. Par conséquent, pour
obtenir davantage d'informations sur les relations structure-
activité, nous avons prévu de préparer une bibliothèque
combinatoire basée sur les structures de la destruxine A et B,
qui pourrait être synthétisée d'une manière analogue à celle
utilisée pour la synthèse de la destruxine E précédemment
rapportée33) (Fig. 4). En fait,
1030 Chem. Pharm. Bull. Vol. 67, No. 10 (2019)

Fig. 3. Évaluation biologique des analogues 20 et 21 contenant des azides d'alkyle

Fig. 4. Bibliothèque combinatoire de 64 membres basée sur les structures des Destruxines A et B

Tableau 1. Évaluation biologique des analogues de la Destruxine (sélectionné)

Substituant
Entré Activité [µM]e)
e
R1 R2 R3 R4 R5

1a)
Moi Pr
i
CH(CH3)C2H5 H iBu 0.78
2b)
Moi Pr
i
CH(CH3)C2H5 Moi iBu 0.78
3c)
Moi iPr
CH(CH3)C2H5 H Allyle 1.56
4d)
Moi iPr
CH(CH3)C2H5 Moi Allyle 1.56
5 Moi iPr
C6H11 H Allyle 3.13
6 Moi Moi Moi H iBu Inactif
7 H iPr
CH(CH3)C2H5 H iBu 50
8 Moi iPr CH(OMe)CH3 H iBu 25
a) Destruxine B, b) Roseocardin, c) Destruxine A, d) Roseotoxine B, e) Concentration minimale pour les changements morphologiques dans les OCL.

tous les analogues ont été synthétisés avec succès à l'aide d'une
méthode "split and pool", et les activités biologiques des
analogues résultants ont été évaluées contre les OCL.
Notamment, l'introduction d'un groupe méthyle en position β du
résidu Pro n'a pas diminué la puissance contre les OCL (tableau
1, entrée 1 vs entrée 2, entrée 3 vs entrée 4). En outre, la
substitution du résidu Ile par le résidu Chg n'a pas influencé la
capacité de changement morphologique (entrée 5), tandis que
les analogues possédant un substitut plus petit ou polaire ont
considérablement diminué l'activité souhaitée (entrées 6-8).
Ainsi, les résultats ci-dessus indiquent que nous avons réussi à
déterminer une position appropriée pour l'introduction d'une
étiquette chimique sans affecter la capacité de préparer une
sonde moléculaire pour l'identification d'une cible.
À cette fin, nous avons découvert une position appropriée
pour la fixation d'une étiquette chimique en vue de la
préparation d'une sonde moléculaire par une étude de relation
structure-activité basée sur la synthèse totale de la destruxine E
à l'aide d'une synthèse en phase solide et en phase de solution.
Les résultats fructueux décrits dans cette revue devraient aider à
déterminer une molécule cible pour la destruxine E par une
approche de biologie chimique. Le développement d'une sonde
moléculaire et l'élucidation du mode d'action, y compris
l'identification de la cible, sont actuellement en cours dans notre
laboratoire.
Remerciements Je remercie vivement le professeur Taka-
yuki Doi (université de Tohoku), qui m'a donné des
commentaires et des conseils inestimables sur les recherches
décrites dans cette revue. J'aimerais également exprimer ma
gratitude à tous m e s collaborateurs, le professeur Hiroshi
Nakagawa, M. Hayato Murase et Mme Yuna Niwa (tous de
l'université de Chubu) pour leurs contributions à l'évaluation
biologique, et M. Hisayuki Takeuchi, M. Yoshitaka Ishida et M.
Kenta Adachi (tous de l'université de Tohoku), ainsi que M.
Hiroshi Sato (Mitsubishi Tanabe Pharma) pour leur travail
important dans les études synthétiques. Ce travail a été soutenu
par une subvention du ministère de l'éducation, de la culture, des
sports, de la science et de la technologie (23710264), par la
Uehara Memorial Foundation, par la Takeda Sci- ence
Foundation et par la Protein Research Foundation.
Conflit d'intérêts L'auteur ne déclare aucun conflit d'intérêts.
l'intérêt.
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Street, Clayton, Victoria, 3168, Australie.
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