République du Cameroun Republic of Cameroon

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Ministère de l’enseignement Ministry of higher education
supérieur ********
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Université de Ngaoundéré University of Ngaoundéré
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Ecole Nationale Supérieure des National School of Agro-
Sciences Agro-Industrielles Industrial Sciences

ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRO-INDUSTRIELLES

DE NGAOUNDERE
NATIONAL SCHOOL OF AGRO-INDUSTRIAL SCIENCE
B.P. 455 Ngaoundéré, CAMEROUN / Tél : (237) 225 27 51 / Fax : (237) 225 27 51

Thème : COUPLAGE DE LA
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
A LA SPECTROMETRIE DE MASSE

Filière : Chimie Industrielle et Génie de l’Environnement (CIGE)

Niveau : 3
Rédigé par le groupe 10
N° Nom(s) & Prénom(s) Matricule Signature
01 DJARSIA Paul 21C108EN
02 DJOUMENE KENNE Blondelle 21C110EN
03 FOPA TCHINDA Russell 21C115EN
04 MANGONDA SISSE Ben Wycliffe Barckay 21C125EN
05 REOUNODJI Christian 21C136EN

Enseignant :
Dr DOMGA Richard
 Table des matières
Liste de figures ........................................................................................................................... ii
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
I. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE .................................................................. 2
1. But ................................................................................................................................... 2
2. Principe............................................................................................................................ 2
3. Les types de chromatographie en phase liquide .............................................................. 2
II. SPECTROMETRIE DE MASSE ........................................................................................ 3
1. But ................................................................................................................................... 3
2. Principe............................................................................................................................ 4
III. COUPLAGE CPL-SM ....................................................................................................... 4
1. Les différents types de couplage ..................................................................................... 4
2. Avantages et inconvénients ............................................................................................. 5
3. Types de polluants pouvant être analysés par le couplage CPL-SM............................... 6
IV. APPLICATIONS (étude de cas) ......................................................................................... 6
1. Cas d’un échantillon d’eau .............................................................................................. 6
2. Cas d’un échantillon de sol ............................................................................................. 8
CONCLUSION ........................................................................................................................ 11
REFERENCES ......................................................................................................................... 12
QUESTIONNAIRES ET REPONSES..................................................................................... 13

i
 Liste de figures

Figure 1 : Schéma du principe de chromatographie en phase liquide ........................................ 2

Figure 2 : Schéma du principe de la spectrométrie de masse..................................................... 4

ii
 INTRODUCTION

En génie analytique l’analyse de différents échantillons occupe une place importante.

Pour ce faire, il est possible d’utiliser des méthodes précises d’analyse ou de faire des couplages
de certaines de ces méthodes. C’est le cas par exemple du couplage entre la chromatographie
liquide (CL) et la spectrométrie de masse (SM), qui est une technique analytique puissante et
polyvalente. La chromatographie liquide et la spectrométrie de masse sont deux techniques
analytiques largement utilisées et bien établies, chacune offrant ses propres avantages et
capacités. La chromatographie liquide permet la séparation efficace des composés chimiques
présents dans un échantillon, tandis que la spectrométrie de masse permet leur identification
précise et leur quantification. Le couplage de ces deux techniques, connu sous le nom de
couplage CL-SM, combine les avantages de la séparation chromatographique et de l'analyse
spectrométrique de masse. Il permet une analyse plus complète et approfondie des échantillons
complexes en fournissant des informations à la fois sur la séparation des composés et sur leur
structure moléculaire. L'intérêt du couplage CL-SM réside dans sa capacité à analyser une large
gamme de composés chimiques, des petits métabolites aux protéines complexes. Il sera donc
question dans ce travail de présenter brièvement la chromatographie en phase liquide et la
spectrométrie de masse, les types de couplage LC-SM leurs avantages et inconvénients et enfin
des études de cas, en utilisant ces couplages pour l’analyse des échantillons d’eau et de sol.

1
I. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

C’est une technique d'analyse quantitative, qualitative et séparative principalement

utilisée dans le domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi
dans des domaines variés tels que la chimie organique et la biochimie.

1. But

La chromatographie liquide est une technique utilisée dans le but de séparer les
différents composants d'un échantillon. Cette séparation se produit en fonction des interactions
chimiques ou physiques entre l'échantillon et les phases mobiles et stationnaires.

2. Principe

Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés entraînés par un

liquide (phase mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un
tube (colonne chromatographique), soit fixé sur une surface inerte. La séparation s'opère suivant
les interactions chimiques ou physiques des analytes avec la phase mobile ainsi qu'avec la phase
stationnaire.

Figure 1 : Schéma du principe de chromatographie en phase liquide

3. Les types de chromatographie en phase liquide

Ils sont classés selon les interactions des analytes avec la phase stationnaire :

2
 ➢ La chromatographie d’adsorption : dans cette chromatographie, la phase stationnaire
consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde
d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont
simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption
physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants.
➢ La chromatographie de partage : dans cette chromatographie les analytes sont séparés
en fonction de leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de
la polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire,
en mode inverse elle est apolaire.
➢ La chromatographie par échange d’ions : la phase solide est une résine insoluble
munie de groupes fonctionnels capable de se dissocier. Ce sont, habituellement, des
groupes "acide sulfonique" (SO3H) pour les échangeurs de cations et "ammonium
quaternaire" (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.
➢ La chromatographie d’exclusion stérique : cette technique consiste en séparer les
composants selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire est composée d'un
matériau poreux (petites particules de silice ou de polymères), les molécules dont le
diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La
durée de séjour dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue.
➢ La chromatographie d’affinité : est une technique de chromatographie qui permet de
séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique
(greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l'occurrence la molécule à
isoler. Sa principale application industrielle est la purification des anticorps
monoclonaux.

II. SPECTROMETRIE DE MASSE

1. But

Le but de la spectrométrie de masse est la mesure de la masse de la molécule et des ions

résultant de sa fragmentation, d'où :

- Proposition(s) de structure(s)

- Identification de substances inconnues

- Dosage de substances connues

3
 2. Principe

Consiste à séparer et à détecter des ions formés dans une source d’ionisation ou dans
une chambre de collision puis à mesurer le rapport de leurs masses par rapport à leurs charges
(m/z). Ces ions proviennent de la molécule à analyser.

Figure 2 : Schéma du principe de la spectrométrie de masse

III. COUPLAGE CPL-SM

La chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (Liquid

chromatography-mass spectrometry ou LC-MS) est une méthode d’analyse qui combine les
performances de la chromatographie en phase liquide et de la spectrométrie de masse afin
d’identifier et/ou de quantifier précisément de nombreuses substances.

1. Les différents types de couplage

Les types de couplage entre la chromatographie liquide (LC) et la spectrométrie de

masse (SM) sont les suivants :

• Couplage direct LC-SM : Dans ce type de couplage, l’échantillon est directement

introduit dans le spectromètre de masse à partir du système de chromatographie liquide.
Cela permet une analyse en temps réel des composés séparés par la chromatographie.
• Couplage LC-MS en ligne : Ce type de couplage implique l’utilisation d’une interface
entre le système de chromatographie liquide et le spectromètre de masse. L’échantillon
séparé par la chromatographie liquide est transféré à l’interface, où il est ensuite ionisé
et introduit dans le spectromètre de masse pour l’analyse.
• Couplage LC-MS hors ligne : Dans ce type de couplage, les fractions d’échantillon
séparées par chromatographie liquide sont collectées séparément et analysées

4
 ultérieurement par spectrométrie de masse. Cela permet une analyse plus approfondie
des composés individuels présents dans l’échantillon.

2. Avantages et inconvénients

❖ Avantages

• Sensibilité élevée : Les couplages CL-SM permettent une détection sensible des composés
présents dans les échantillons, même à de faibles concentrations.
• Sélectivité accrue : La combinaison de la chromatographie liquide et de la spectrométrie
de masse offre une sélectivité élevée pour l’identification et la quantification précise des
composés.
• Résolution améliorée : Les couplages CL-SM permettent une meilleure résolution des pics
chromatographiques, ce qui facilite l’identification des composés présents dans les
échantillons complexes.
• Analyse en temps réel : Certains couplages CL-SM permettent une analyse en temps réel
des composés séparés par la chromatographie liquide, offrant ainsi une efficacité et une
rapidité accrues.

❖ Inconvénients des couplages CL-SM :

• Complexité de l’instrumentation : Les couplages CL-SM nécessitent une instrumentation

complexe, ce qui peut rendre l’installation et la maintenance plus complexes.
• Sensibilité aux interférences : Les couplages CL-SM peuvent être sensibles aux
interférences provenant de composés co-éluant avec l’analyte d’intérêt, ce qui peut affecter
la précision des résultats.
• Coût élevé : Les équipements spécialisés nécessaires pour les couplages CL-SM peuvent
être coûteux, tout comme les consommables associés.
• Complexité de l’analyse des données : L’analyse des données générées par les couplages
CL-SM peut être complexe en raison de la quantité importante d’informations obtenues,
nécessitant une expertise approfondie.

5
 3. Types de polluants pouvant être analysés par le couplage CPL-SM

Le couplage entre la chromatographie liquide (CL) et la spectrométrie de masse (SM)

permet d’analyser différents types de polluants parmi lesquels :

➢ Polluants organiques : Les polluants organiques tels que les pesticides (par exemple, les
insecticides, les herbicides), les composés pharmaceutiques, les produits chimiques
industriels, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les composés
organochlorés et les composés organophosphorés peuvent être analysés par le couplage
CL-SM.

➢ Polluants inorganiques : Les polluants inorganiques tels que les métaux lourds (par
exemple, le plomb, le mercure, le cadmium), les composés métalliques et les ions
métalliques peuvent être analysés par le couplage CL-SM.

IV. APPLICATIONS (étude de cas)

1. Cas d’un échantillon d’eau

Cas pratique de la démarche à suivre pour l’analyse d’un échantillon d’eau par couplage
CL-SM en ligne :

✓ Préparation de l’échantillon : Collecter un échantillon d’eau à analyser. Si nécessaire,

effectuer une étape de prétraitement, telle que la filtration pour éliminer les particules
en suspension, ou une extraction pour concentrer les composés d’intérêt.

✓ Préparation de la solution d’échantillon : Diluer l’échantillon d’eau avec un solvant

approprié pour obtenir une solution d’échantillon compatible avec la chromatographie
liquide. S’assurer que la concentration de l’échantillon est adaptée à la sensibilité de
détection du système CL-SM.

✓ Configuration du système CL-SM : Préparer le système CL-SM en ligne en connectant

la colonne de chromatographie liquide au spectromètre de masse. S’assurer que toutes

6
 les connexions sont étanches et que le débit de l’éluant est compatible avec la colonne
et le spectromètre de masse.

✓ Sélection de la colonne de chromatographie liquide : Choisir une colonne de

chromatographie liquide adaptée à l’objectif d’analyse. La sélection de la colonne se
base sur les propriétés des composés à détecter, comme leur polarité, leur taille
moléculaire, etc.

✓ Étalonnage et vérification du système : Avant de commencer l’analyse de l’échantillon,

effectuer un étalonnage du système en utilisant des composés de référence appropriés.
Vérifier les performances du système, tels que la répétabilité, la sensibilité, la linéarité,
etc.

✓ Injection de l’échantillon : Injecter la solution d’échantillon dans le système CL-SM en

ligne. Le volume d’injection dépendra de la sensibilité de détection requise et des limites
de concentration des composés dans l’échantillon.

✓ Chromatographie liquide : L’échantillon injecté est séparé sur la colonne de

chromatographie liquide en fonction des interactions entre les composés et la phase
stationnaire. Contrôler les conditions chromatographiques telles que la composition de
l’éluant, le débit et le gradient de concentration si nécessaire.

✓ Interface et ionisation : Les composés séparés par la chromatographie liquide atteignent

l’interface entre la colonne de chromatographie liquide et le spectromètre de masse. À
ce stade, les composés sont ionisés à l’aide d’une technique d’ionisation appropriée,
telle que l’ionisation électrospray (ESI) ou l’ionisation chimique à pression
atmosphérique (APCI).

7
 ✓ Spectrométrie de masse : Les ions générés sont introduits dans le spectromètre de masse,
où ils sont séparés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) et détectés. Les
spectres de masse fournissent des informations sur les masses moléculaires et les motifs
de fragmentation des composés présents dans l’échantillon d’eau.

✓ Acquisition et traitement des données : Tout au long de l’analyse, les données

chromatographiques et spectrométriques sont acquises simultanément. Les signaux
chromatographiques représentant l’intensité des pics chromatographiques et les spectres
de masse sont enregistrés en fonction du temps. Les données sont ensuite traitées à l’aide
de logiciels spécialisés pour l’identification des composés, la quantification et
l’interprétation des résultats.

✓ Interprétation des résultats : Analysez et interprétez les résultats obtenus à partir des
données chromatographiques et spectrométriques. Identifiez les composés présents dans
l’échantillon d’eau, déterminez leurs concentrations et évaluez les éventuelles
contaminations ou polluants.

2. Cas d’un échantillon de sol

Cas pratique d’analyse d’un échantillon de sol par le couplage CL-SM en ligne, avec les
étapes détaillées de la méthode :

✓ Préparation de l’échantillon de sol : Collectez un échantillon représentatif de sol à

analyser. Si nécessaire, effectuez une étape de prétraitement, telle que le séchage, le
tamisage ou l’extraction pour éliminer les impuretés indésirables ou concentrer les
composés d’intérêt.
✓ Extraction des composés : Pour extraire les composés du sol, choisissez une méthode
d’extraction appropriée en fonction des propriétés des composés et du sol. Des méthodes
courantes incluent l’extraction par solvant, l’extraction en phase solide (SPE) ou
l’extraction assistée par ultrasons (UAE).

8
✓ Préparation de la solution d’échantillon : Après l’extraction, préparez une solution
d’échantillon en dissolvant les composés extraits dans un solvant compatible avec la
chromatographie liquide. Assurez-vous que la concentration de l’échantillon est adaptée
à la sensibilité de détection du système CL-SM.

✓ Configuration du système CL-SM : Préparez le système CL-SM en ligne en connectant

la colonne de chromatographie liquide au spectromètre de masse. Vérifiez que toutes
les connexions sont étanches et que le débit de l’éluant est compatible avec la colonne
et le spectromètre de masse.

✓ Sélection de la colonne de chromatographie liquide : Choisissez une colonne de

chromatographie liquide adaptée à votre objectif d’analyse. La sélection de la colonne
dépendra des propriétés des composés que vous souhaitez détecter, tels que leur polarité,
leur taille moléculaire, etc.

✓ Étalonnage et vérification du système : Avant de commencer l’analyse de l’échantillon,

effectuez un étalonnage du système en utilisant des composés de référence appropriés.
Vérifiez les performances du système, telles que la répétabilité, la sensibilité, la
linéarité, etc.

✓ Injection de l’échantillon : Injectez la solution d’échantillon préparée dans le système

CL-SM en ligne. Le volume d’injection dépendra de la sensibilité de détection requise
et des limites de concentration des composés dans l’échantillon.

✓ Chromatographie liquide : L’échantillon injecté est séparé sur la colonne de

chromatographie liquide en fonction des interactions entre les composés et la phase
stationnaire. Contrôlez les conditions chromatographiques, telles que la composition de
l’éluant, le débit et le gradient de concentration si nécessaire.

9
✓ Interface et ionisation : Les composés séparés par la chromatographie liquide atteignent
l’interface entre la colonne de chromatographie liquide et le spectromètre de masse. À
ce stade, les composés sont ionisés à l’aide d’une technique d’ionisation appropriée,
telle que l’ionisation électrospray (ESI) ou l’ionisation chimique à pression
atmosphérique (APCI).

✓ Spectrométrie de masse : Les ions générés sont introduits dans le spectromètre de masse,
où ils sont séparés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) et détectés. Les
spectres de masse fournissent des informations sur les masses moléculaires et les motifs
de fragmentation des composés présents dans l’échantillon de sol.

✓ Acquisition et traitement des données : Tout au long de l’analyse, les données

chromatographiques et spectrométriques sont acquises simultanément. Les signaux
chromatographiques représentant l’intensité des pics chromatographiques et les spectres
de masse sont enregistrés en fonction du temps. Les données sont ensuite traitées à l’aide
de logiciels spécialisés pour l’identification des composés, la quantification et
l’interprétation des résultats.

✓ Interprétation des résultats : Analysez et interprétez les résultats obtenus à partir des
données chromatographiques et spectrométriques. Identifiez les composés présents dans
l’échantillon de sol, déterminez leurs concentrations et évaluez les éventuelles
contaminations ou polluants.

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 CONCLUSION

En définitive, le couplage LC-SM (chromatographie liquide-spectrométrie de masse) est

une méthode puissante et polyvalente pour l’analyse des échantillons. Cette technique permet
une séparation efficace des composés dans un échantillon, suivie d’une détection précise et
spécifique des composés individuels à l’aide de la spectrométrie de masse. Il offre de nombreux
avantages, tels que la sensibilité élevée, la sélectivité accrue, la capacité d’analyser une large
gamme de composés, et la possibilité d’identifier et de quantifier les composés inconnus dans
les échantillons. Il est largement utilisé dans de nombreux domaines, tels que l’analyse
environnementale, l’analyse pharmaceutique, l’analyse alimentaire et bien d’autres. Son
utilisation continue d’évoluer et de contribuer à de nouvelles découvertes et applications dans
divers domaines scientifiques et industriels.

11
REFERENCES

www.istep.upmc.fr/fr/recherche/equipements_du_laboratoire/spectrometre.html
Snyder L. R., Kirkland J. J., Dolan D. G. (2010) Introduction to Modern Liquid
Chromatography. 3rd ed. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 912 p.
www.farm.ucl.ac.be/tpao/tpintegres/HPLC/documents/chapitre4
theory.labster.com/liquid-chromatography-fr

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 QUESTIONNAIRES ET REPONSES

1) Pourquoi le couplage ou quel est l’intérêt du couplage CPL-SM ?

La chromatographie est une méthode séparative des différents constituants d’un
mélange. La coupler, après séparation, à une autre méthode d’investigation comme la
spectrométrie de masse permet d’adopter une seconde dimension analytique, c’est-à-dire une
analyse plus précise et complète des échantillons.

2) Quels sont les types de couplage CPL-SM ?

➢ Couplage direct LC-SM
➢ Couplage LC-MS en ligne
➢ Couplage LC-MS hors ligne
3) Quels sont les avantages du couplage CPL-SM ?
Ce couplage a plusieurs avantages dont les principaux sont les suivants :
➢ Sensibilité élevée
➢ Sélectivité accrue
➢ Résolution améliorée
➢ Analyse en temps réel
4) Quels sont les inconvénients du couplage CPL-SM ?
Comme inconvénients nous pouvons citer :
➢ Complexité de l’instrumentation
➢ Sensibilité aux interférences
➢ Coût élevé
➢ Complexité de l’analyse des données
5) Quel est le but de la CPL ?
Le but est de séparer les différents composants d'un échantillon. Cette séparation se
produit en fonction des interactions chimiques ou physiques entre l'échantillon et les phases
mobiles et stationnaires.

6) Quel est le principe de la CPL ?

Le principe est reposé sur la séparation de composés entraînés par un liquide (phase
mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube (colonne
chromatographique), soit fixé sur une surface inerte. La séparation s'opère suivant les
interactions chimiques ou physiques des analytes avec la phase mobile ainsi qu'avec la phase
stationnaire.

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7) Quel est le but de la SM ?
Le but de la spectroscopie de masse est la mesure de la masse de la molécule et des ions
résultant de sa fragmentation, d'où :
- Proposition(s) de structure(s)
- Identification de substances inconnues
- Dosage de substances connues

8) Quel est le principe de la SM ?

Consiste à séparer et à détecter des ions formés dans une source d’ionisation ou dans
une chambre de collision puis à mesurer le rapport de leurs masses par rapport à leurs charges
(m/z). Ces ions proviennent de la molécule à analyser.

9) Quel type de matrices peut-on appliquer le couplage CPL-SM ?

Pour le moment, seuls les échantillons liquide et solide sont analysés par couplage de
CPL-SM en fonction de la méthode d’ionisation utilisée.

10) Quels types de polluant recherchés ?

Les types de polluants recherchés sont :
➢ Polluants organiques : pesticides, composés pharmaceutiques, produits chimiques
industriels, HAP, composés organochlorés, composés organophosphorés ;
➢ Polluants inorganiques : métaux lourds, composés métalliques, ions métalliques.

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