Iso 7218

NM ISO 7218
Norme Marocaine 2014

Indice de classement NM 08.0.101
Microbiologie des aliments
Exigences générales et recommandations
Norme Marocaine homologuée

Par décision du Directeur de l’Institut Marocain de Normalisation
N° 3711-14 du 17 Octobre 2014, publié au B.O N° 6310 du 20 Novembre
2014.
La présente norme annule et remplace la norme NM ISO 7218 homologuée en

2008.
Correspondance
La présente norme reprend intégralement la norme ISO 7218/2013 et son
amendement A1/2013.
Modifications
Examinée et adoptée par la commission de normalisation des méthodes d’analyse et

d’échantillonnage des denrées alimentaires (029)
Editée et diffusée par l’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR)
© IMANOR 2014 ICS : 07.100.30

Accordé sous licence par IMANOR à Lab2a
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2014
Indice de classement NM 08.0.101
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Microbiologie des aliments — Exigences générales et

recommandations
AMENDEMENT 1
Pages 1 et 2, Article 2
Supprimer l'ISO 8261. Elle a été remplacée par l'ISO 6887-5 [déjà incluse dans «ISO 6887 (toutes les
parties)»].
Supprimer les références «ISO 835 (toutes les parties)», «ISO 8655-1», «ISO/TS 11333 (toutes les parties)»
et «ISO 16140» et ajouter les références suivantes.
ISO 835, Verrerie de laboratoire — Pipettes graduées
ISO 8655 (toutes les parties), Appareils volumétriques à piston
ISO/TS 11133 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la
production des milieux de culture
ISO 16140-2, Microbiologie des aliments — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole pour la
validation de méthodes alternatives (brevetées) par rapport à une méthode de référence
Pages 7 à 32, Articles 5 et 6
Supprimer le texte existant et ajouter ce qui suit.
5 Appareillage et matériel
5.1 Généralités
Conformément à la bonne pratique de laboratoire, il est recommandé que tous les appareils et matériel soient propres et
en bon état de fonctionnement. Avant utilisation, il est recommandé de vérifier que le matériel est adapté à la finalité
prévue et de contrôler ses performances lors de son utilisation, le cas échéant.
Si nécessaire, il est recommandé d'étalonner le matériel et les dispositifs de surveillance à l'aide d'étalons nationaux
identifiés et de procéder au réétalonnage et à toutes vérifications intermédiaires avec des modes opératoires et des
résultats documentés.
Il est recommandé de vérifier et d'entretenir régulièrement le matériel afin de garantir son aptitude à l'emploi et la
sécurité. Il est recommandé de contrôler le matériel en fonction des conditions d'utilisation et de l'exactitude exigée par
les résultats.
Dans la plupart des cas, la fréquence d'étalonnage et de vérification de chaque pièce d'équipement n'est pas
mentionnée dans la présente Norme internationale, étant donné que cette fréquence doit être déterminée par
chaque laboratoire en fonction du type d'équipement, du niveau d'activité du laboratoire, ainsi que des
instructions du fabricant. Dans certains cas, et lorsqu'elle est considérée comme essentielle, la fréquence a
été spécifiée.
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L'appareillage et le matériel doivent être construits et installés de sorte à faciliter leur utilisation, entretien,
nettoyage, décontamination et étalonnage.
Toutes les incertitudes de mesure données dans le présent article correspondent à l'appareillage et à
l'équipement concernés, et non pas à l'ensemble de la méthode d'analyse.
Dans l'ensemble de cet article, des recommandations pour l'exactitude de l'appareillage de mesure sont
données. Celles-ci sont basées sur l’erreur pratique tolérée recommandée pour démontrer le contrôle
approprié du matériel de routine. L'exactitude indiquée est liée à l'incertitude métrologique du dispositif (se
référer au Guide ISO/CEI 99).
Pour le matériel possédant un contrôle de la température, vérifier la stabilité et l'homogénéité de la

température avant l'utilisation initiale et après toute réparation ou modification qui pourrait avoir un effet sur le
contrôle de la température.
5.2 Hottes de sécurité
5.2.1 Description
Une hotte de sécurité est un poste de travail à écoulement d'air laminaire horizontal ou vertical conçu pour
retirer de l'air la poussière et les autres particules, tels que les micro-organismes.
Le nombre maximal admissible de particules de dimension supérieure ou égale à 0,5 µm par mètre cube
correspond à la classe d'empoussièrement d'une hotte de sécurité. Pour les hottes utilisées en microbiologie
alimentaire, le nombre de particules ne doit pas dépasser 4 000 par mètre cube.
Les hottes utilisées dans les laboratoires de microbiologie alimentaire sont de quatre types.
a) Les hottes de sécurité biologique de classe I sont des hottes ouvertes sur le devant avec évacuation de
l'air, destinées à la protection de l'opérateur et de l'environnement mais qui ne protègent pas le produit
d'une contamination par l'environnement. Les aérosols potentiellement infectés sont contenus dans la
hotte et retenus sur le filtre par impaction. Généralement, l'air filtré est évacué dans l'atmosphère; si ce
n'est pas le cas, l'air doit passer à travers deux filtres HEPA (haute efficacité pour les particules de l’air)
montés en série. Lorsque les travaux impliquent des agents pathogènes appartenant au groupe de
risque 3, il est déconseillé d'utiliser ces hottes, en raison des difficultés à assurer la protection de
l'opérateur.
b) Les hottes de sécurité biologique de classe II protègent le produit, l'opérateur et l'environnement. Elles
font recirculer une quantité d'air filtré, évacuent une quantité d'air dans l'atmosphère qui est remplacée
par de l'air entrant par l'ouverture de travail, ce qui assure la protection de l'opérateur. Elles conviennent
pour un travail effectué avec des agents pathogènes des groupes de risque 2 et 3.
c) Les hottes à flux d'air laminaire horizontal protègent le travail de la contamination, mais expulsent tout
aérosol généré en direction du visage de l'opérateur. Par conséquent, elles ne conviennent pas à la
manipulation de cultures ensemencées ou à la préparation de cultures tissulaires.
d) Les hottes à flux d'air laminaire vertical protègent le produit en utilisant le flux d'air laminaire vertical
traversant le filtre HEPA. Elles protègent également l'opérateur grâce à la recirculation de l'air à l'intérieur.
Elles sont particulièrement indiquées pour créer un environnement aseptique approprié à la manipulation
de produits stériles et pour la protection de l'opérateur lors de la manipulation de poudres.
Utiliser des hottes de sécurité pour tout travail impliquant la manipulation d'agents pathogènes et de poudres
contaminées, si cela est requis par les réglementations nationales.
L'utilisation d'un brûleur à gaz ou d'un incinérateur à fil n'est pas recommandée dans les hottes de sécurité. Si nécessaire,
il est recommandé que le brûleur à gaz produise une petite flamme pour ne pas perturber le flux d'air. L'utilisation de
matériel à usage unique (anses, pipettes, etc.) constitue une alternative appropriée.
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5.2.2 Utilisation
Utiliser des hottes de sécurité adaptées aux conditions d'utilisation et aux conditions environnementales
propres au laboratoire.
Il est recommandé d'utiliser le moins de matériel possible à l'intérieur de la hotte.
Dans la mesure du possible, placer tous les éléments nécessaires à l'intérieur de la hotte avant de
commencer le travail, afin de réduire le plus possible les mouvements de bras à l'intérieur et à l'extérieur de
l'ouverture de travail. Placer le matériel et les accessoires de sorte à réduire le plus possible les perturbations
du flux d'air au niveau de l'ouverture de travail.
Il est recommandé que les opérateurs reçoivent une formation adaptée à l'utilisation correcte des hottes afin de garantir
leur sécurité et l'intégrité du produit ou de la culture.
5.2.3 Nettoyage et désinfection
Nettoyer et désinfecter la zone de travail après utilisation à l'aide d'un désinfectant approprié et non corrosif
selon les instructions du fabricant. Vérifier régulièrement les grilles de protection des préfiltres, le cas échéant,
et les nettoyer avec un tissu imprégné d'un désinfectant.
En ce qui concerne les hottes à flux laminaire, il est recommandé d'aspirer régulièrement la face du filtre en prenant soin
de ne pas endommager le matériau filtrant.
Il est recommandé de fumiger les hottes de sécurité avant de procéder au changement ou à l'entretien du filtre.
Après nettoyage des hottes, des lampes à ultraviolets (UV) peuvent être utilisées pour la désinfection. Il est recommandé
de nettoyer et de remplacer régulièrement les lampes UV, conformément aux instructions du fabricant. Si elles sont
utilisées, il est recommandé de les nettoyer régulièrement afin d'éliminer toute poussière et saleté susceptibles de bloquer
l'efficacité de la lumière UV à détruire les micro-organismes. Il est recommandé de vérifier l'intensité de la lumière
ultraviolette lorsque la hotte est contrôlée pour assurer que l'émission de lumière est conforme aux instructions du
fabricant.
Voir Référence [17].
5.2.4 Entretien et contrôle
Contrôler l'efficacité d'une hotte de sécurité lors de sa réception puis à intervalles réguliers, selon les
recommandations du fabricant, par une personne qualifiée ou certifiée et après toute réparation ou
modification. Il est recommandé de contrôler l'efficacité après un déplacement.
Il est recommandé de vérifier périodiquement l'absence de contaminations microbiennes par des contrôles de la surface
de la zone de travail et des parois de la hotte.
Il est recommandé de procéder à une vérification périodique du taux de micro-organismes présents dans l'air pendant le
fonctionnement des filtres en utilisant l'équipement approprié. Par exemple, exposer plusieurs boîtes de Petri ouvertes
contenant un milieu gélosé non sélectif (par exemple PCA) pendant 30 min dans chaque hotte. D'autres méthodes
peuvent également être utilisées.
5.3 Balances et diluteurs gravimétriques
5.3.1 Utilisation et incertitude de mesure
Les balances sont principalement utilisées pour peser la prise d'essai de l'échantillon à analyser et les
composants des milieux de culture et des réactifs. De plus, elles peuvent être utilisées pour peser la quantité
de diluant nécessaire.

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Les diluteurs gravimétriques sont des instruments électroniques, constitués d'une balance et d'un répartiteur
de liquide programmable. Ils sont utilisés pendant la préparation des suspensions mères des échantillons et
fonctionnent en ajoutant du diluant à une prise d’essai selon un rapport défini. La prise d’essai est pesée
selon l’erreur tolérée spécifiée par l'application et le diluteur est réglé pour délivrer suffisamment de diluant
pour le rapport requis (par exemple 9 à 1 pour les dilutions décimales). Voir l'ISO 6887-1.
Un laboratoire de microbiologie alimentaire doit être équipé de balances adaptées en portée et en incertitude
de mesure aux différents produits à peser.
Sauf spécification contraire, il est recommandé que la résolution de la balance permette une erreur de lecture tolérée de
1 %, mais elle doit être suffisante pour permettre une erreur maximale tolérée de 5 % sur la masse.
EXEMPLE Pour peser 10 g, il est recommandé que la balance permette une lecture à 0,1 g près.
Pour peser 1 g, il est recommandé que la balance permette une lecture à 0,01 g près.
Poser le matériel sur un support horizontal stable, ajusté si nécessaire de sorte à garantir une position plane
et à le protéger des vibrations et des courants d'air.
Il est recommandé de nettoyer et de désinfecter le matériel après utilisation ou à la suite d'un renversement de matières en
cours de pesée, à l'aide d'un désinfectant non corrosif approprié.
5.3.3 Vérification des performances et étalonnage
5.3.3.1 Étalonnage
L'étalonnage doit être vérifié sur l'ensemble du domaine de travail par une personne qualifiée à une fréquence
définie en fonction de l'utilisation.
5.3.3.2 Vérification
Les performances du système de pesage doivent être régulièrement vérifiées avec des masses de contrôle et
à l’intérieur de la plage d'utilisation, par une personne qualifiée, durant l'utilisation et après le nettoyage.
NOTE Les masses de contrôle peuvent également être vérifiées immédiatement après l'étalonnage de la balance.
5.4 Homogénéisateurs, mélangeurs et mixeurs
5.4.1 Description
Cet appareillage est utilisé pour préparer la suspension mère à partir de l'échantillon pour essai.
Il est possible d'utiliser l'un des appareils suivants:
⎯ un mélangeur de type péristaltique avec des sacs stériles et comportant éventuellement un variateur de vitesse et un
minuteur; ou
NOTE Le Stomacher® est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
⎯ un homogénéisateur de type rotatif (blender), dont la vitesse théorique est comprise entre 8 000 r/min
et 45 000 r/min, équipé de bols stérilisables munis d'un couvercle; ou
⎯ un homogénéisateur par vibrations avec des sacs stériles; ou

NOTE Le Pulsifier® est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.

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⎯ un autre système d'homogénéisation d'efficacité équivalente.

Dans certains cas, le mélange manuel peut être réalisé en utilisant des billes de verre stériles de diamètre approprié
(environ 6 mm; voir l'ISO 6887-2 à l'ISO 6887-5).
5.4.2 Utilisation
La durée habituelle de fonctionnement d'un homogénéisateur péristaltique est comprise entre 1 min et 3 min
lors d'un essai (voir l'ISO 6887-2 à l'ISO 6887-5 pour des aliments spécifiques).
Ne pas utiliser ce type d'appareil pour certains produits alimentaires, tels que:
⎯ les produits risquant d'entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues, dures ou
sèches);
⎯ les produits difficiles à homogénéiser de par leur texture (par exemple saucisson sec).
L'homogénéisateur rotatif doit fonctionner pendant une durée telle que le nombre total de tours soit compris
entre 15 000 r/min et 20 000 r/min inclus. Même avec l'homogénéisateur le plus lent, cette durée ne doit pas
dépasser 2,5 min.
Il est possible d'utiliser l'homogénéisateur par vibrations pour la plupart des produits alimentaires, y compris les produits
durs ou secs. La durée de fonctionnement habituelle est comprise entre 0,5 min et 1 min. Si des micro-organismes sont
susceptibles d'être présents au cœur de structures cohésives, il est recommandé de découper l'échantillon en petits
morceaux avant de le traiter.
Les billes de verre peuvent être utilisées pour la préparation, par agitation, des suspensions mères de certains produits
visqueux ou épais, notamment certains produits laitiers (voir les normes spécifiques).
Nettoyer et désinfecter régulièrement les homogénéisateurs péristaltiques et les homogénéisateurs par

vibrations, ainsi qu'à la suite de tout renversement de matière ou de toute fuite des sacs.
En ce qui concerne les homogénéisateurs rotatifs, nettoyer et stériliser les bols en verre ou en métal après
chaque utilisation.
5.4.4 Entretien
Contrôler et entretenir le matériel conformément aux instructions du fabricant.
5.5 pH-mètre
5.5.1 Description
Un pH-mètre est utilisé pour mesurer la différence de potentiel, à une température déterminée, entre une
électrode de mesure et une électrode de référence, toutes deux étant introduites dans le produit. Il doit
permettre une lecture à 0,01 unité pH près, pour être en mesure de réaliser des mesurages avec une erreur
tolérée de ± 0,1 unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de compensation de température soit
manuel, soit automatique.
NOTE L'électrode de mesure et l'électrode de référence sont généralement réunies en un système d'électrodes combinées.
5.5.2 Utilisation
Un pH-mètre sert à mesurer la valeur du pH des milieux de culture et des réactifs pour vérifier si un
ajustement de cette valeur est nécessaire durant la préparation et fait office de contrôle qualité après la
stérilisation.

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Il peut également servir à mesurer la valeur du pH des échantillons et des suspensions échantillons. L'utilisation d'un pH-
mètre est mentionnée dans la norme spécifique du produit à analyser qui spécifie les conditions de la détermination de la
valeur du pH et de l'ajustement de la valeur du pH.
Ajuster le pH-mètre conformément aux indications du manuel du fabricant en vue de procéder à la mesure de
la valeur du pH à une température normalisée, par exemple 25 °C. Relever la valeur du pH après stabilisation.
Enregistrer la valeur à la seconde décimale près.
NOTE La lecture peut être considérée comme stable lorsque la valeur du pH mesuré sur une période de 5 s ne varie pas de plus
de 0,02 unité pH. En utilisant des électrodes en bon état, l'équilibre est normalement atteint dans les 30 s.
5.5.3 Étalonnage et vérification
5.5.3.1 Étalonnage
Étalonner le pH-mètre selon les instructions du fabricant, avec au moins deux, et de préférence trois,
solutions tampons étalon au moins chaque jour avant utilisation. Définir les erreurs maximales tolérées pour
ces lectures, qui doivent être plus strictes que l’erreur tolérée en utilisation générale.
Il est recommandé que les solutions étalons soient raccordées et la valeur de leur pH doit être spécifiée à la
seconde décimale près, à la température de mesure (en général pH 7,00 et pH 4,00 et/ou pH 9,00 à 25 °C,
conformément aux instructions du fabricant). Les solutions étalons utilisées doivent encadrer la valeur du pH
à mesurer.
5.5.3.2 Vérification
Après l'étalonnage du pH-mètre avec les deux solutions tampons étalon raccordées, il est recommandé d'utiliser une
troisième solution tampon étalon pour réaliser une lecture de vérification (en mode «lecture») pour démontrer la
fonctionnalité du pH-mètre.
Si les lectures se trouvent en dehors des erreurs maximales tolérées, régler le pH-mètre conformément aux
instructions du fabricant. Ce réglage doit être suivi d'un autre étalonnage et d'un autre contrôle.
5.5.4 Entretien
Vérifier et entretenir les électrodes selon les instructions du fabricant. Il est nécessaire, en particulier, de
surveiller régulièrement
⎯ le vieillissement et l'encrassement des électrodes; et
⎯ le temps de réponse et la stabilité.
Rincer les électrodes avec de l'eau distillée ou déionisée après chaque utilisation. Pour prévenir
l'encrassement et le vieillissement des électrodes, les nettoyer soigneusement et régulièrement,
conformément aux instructions du fabricant.
Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant.
5.6 Autoclave
5.6.1 Description
Un autoclave permet d'obtenir une température en vapeur saturée dans la chambre.
Il est recommandé que l'autoclave soit muni
⎯ d'au moins une soupape de sécurité;

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⎯ d'un robinet de purge;
⎯ d'un dispositif de régulation permettant le maintien de la température dans la chambre à ± 3 °C de la température

prévue (pour tenir compte de l'incertitude de mesure associée au thermocouple de mesure); et
⎯ d'une sonde thermique ou d'un thermocouple enregistreur.
Il est recommandé également qu'il soit muni d'un minuteur et d'un thermomètre enregistreur.
5.6.2 Utilisation
Avec la stérilisation à la vapeur, tout l'air est expulsé avant la montée en pression. Si l'autoclave n'est pas
muni d'un dispositif d'évacuation automatique, il est nécessaire de le purger de son air jusqu'à émission d'un
jet continu de vapeur.
Pour la stérilisation des milieux de culture, la vapeur saturée dans la chambre doit être à une température
d'au moins 121 °C ± 3 °C ou à la température spécifiée par les instructions du fabricant ou de production ou
spécifiée dans la méthode d'essai.
Pour la destruction des micro-organismes cultivés et la décontamination des milieux de culture après
utilisation, la vapeur saturée dans la chambre doit être à une température d’au moins 121 °C ± 3 °C.
Au cours d'un même cycle de stérilisation, l'autoclave doit être utilisé soit pour stériliser le matériel propre
(et/ou les milieux de culture), soit pour décontaminer le matériel usagé (et/ou les milieux de culture utilisés),
mais pas les deux en même temps.
Il est préférable d'utiliser des autoclaves séparés pour ces deux processus. Après l'autoclavage, il est recommandé de
laisser refroidir tous les matériels et équipements avant de les retirer de l'autoclave.
Pour des raisons de sécurité, ne pas retirer le contenu tant que la température est supérieure à environ 80 °C.
5.6.3 Entretien
Nettoyer régulièrement la chambre, le filtre de vidange et les joints d'étanchéité de la porte. Vérifier l'intégrité
du joint d'étanchéité de la porte. Effectuer des opérations de vidange et de détartrage régulièrement, si
nécessaire. Suivre les recommandations du fabricant.
5.6.4 Vérification
L'autoclave doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôlé par du
personnel compétent selon les instructions du fabricant.
Maintenir les instruments de surveillance en bon état de fonctionnement et les vérifier par des étalonnages et
des contrôles réguliers.
Il est recommandé que la validation initiale comprenne des études de performance pour chaque cycle de fonctionnement
et chaque configuration de charge utilisée dans la pratique. Il est recommandé de répéter ce processus après toute
réparation ou modification significative. Il est recommandé de placer un nombre suffisant de sondes thermiques dans la
charge pour démontrer une pénétration de la chaleur adéquate en tous points de la charge. Il est recommandé que la
validation et la revalidation prennent en compte la pertinence des durées de mise en température et de refroidissement
ainsi que de la température de stérilisation.
Pour chaque charge, il est recommandé de placer au moins un indicateur du traitement thermique au centre de la charge
pour vérifier la montée en température lorsqu'il n'existe aucun enregistrement permettant d'effectuer la traçabilité de
l'efficacité du processus.

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5.7 Préparateur de milieux de culture
5.7.1 Description
Un préparateur de milieux de culture est principalement conçu pour la stérilisation de volumes importants de
milieux (> 1 l). Il est constitué d'un récipient pour la mise en température, d'une chemise d'eau et d'un
agitateur continu. Le matériel doit également être muni d'une jauge de température, d'un manomètre, d'un
minuteur et d'une soupape de sécurité.
De plus, il est recommandé que cet appareil soit muni d'un verrou de sécurité empêchant l'ouverture tant qu'une
température < 80 °C n'est pas atteinte.
5.7.2 Utilisation
Toujours suivre les instructions du fabricant.

L'ensemble du processus de production a lieu au sein de l'appareil. Une fois que tous les ingrédients sont
ajoutés, ils sont dissous par agitation et chauffage, puis stérilisés.
5.7.3 Entretien
Laver et rincer soigneusement le préparateur avec de l'eau purifiée après chaque lot de milieux de culture.
5.7.4 Vérification
Le préparateur doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôlé par le
Maintenir les instruments de surveillance en bon état de fonctionnement et les vérifier par des étalonnages et
des contrôles réguliers.
et chaque type de charge utilisé dans la pratique. Il est recommandé de répéter ce processus après toute réparation ou
modification significative. Il est possible d'utiliser deux sondes thermiques, l'une étant placée à proximité de la sonde de
contrôle et l'autre étant éloignée de cette dernière, pour démontrer un chauffage uniforme.
Il est recommandé de vérifier la température et la durée de chaque cycle.
5.8 Étuve
5.8.1 Description
Une étuve consiste en une chambre calorifugée qui permet de maintenir une température stable et
uniformément répartie dans la limite des erreurs maximales de température tolérées, spécifiées dans la
méthode d'essai.
5.8.2 Utilisation
Les étuves doivent être équipées d'un système de régulation permettant de maintenir la température ou
d'autres paramètres uniformes et stables dans l'ensemble de leur volume utile. Définir le volume utile de sorte
à garantir l'uniformité et la stabilité de ces paramètres.
Si la température ambiante est proche de, ou supérieure à celle de l'étuve, il est nécessaire de munir la
chambre d'un système de refroidissement.
Il est recommandé de protéger les parois de l'étuve de la lumière solaire.

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Dans la mesure du possible, il est recommandé de ne pas remplir complètement l'étuve en une seule opération car le
temps de stabilisation de la température des milieux de culture sera long, quel que soit le type d'étuve utilisé (convection
d'air forcé ou autre). Éviter de laisser les portes de l'étuve ouvertes de manière prolongée.
Lors du chargement des étuves, il est recommandé de veiller à la circulation de l'air (voir 10.2.5).
Nettoyer et désinfecter régulièrement les parois intérieures et extérieures de l'étuve et, au besoin,
dépoussiérer le système de ventilation.
5.8.4 Vérification
Vérifier, dans l'ensemble du volume utile de l'étuve, la stabilité et l'homogénéité de la température, à la (aux)
température(s) de fonctionnement, en utilisant simultanément plusieurs thermomètres ou thermocouples,
ayant une exactitude connue et une plage de mesure suffisante.
Utiliser ces informations pour définir l'amplitude acceptable de températures de travail de l'étuve et la position
optimale du thermomètre ou du thermocouple enregistreur utilisé pour contrôler les températures de travail.
Par exemple, pour atteindre une température cible de (37 ± 1) °C quand les données de cartographie de l'étuve montrent
une amplitude de 36,8 °C à 37,3 °C dans l'incubateur, il est recommandé de réduire alors l'amplitude de températures de
travail de 36,2 °C à 37,7 °C dans le but d'assurer que toutes les parties de l'étuve sont à la température cible de 37 °C.
Il est recommandé de répéter ce processus après chaque réparation ou modification significative.
Il est recommandé de contrôler la température de travail, par exemple avec un ou plusieurs thermomètres à minima-
maxima ou thermocouples enregistreurs.
Contrôler la température de l'étuve au minimum tous les jours de travail. À cet effet, chaque étuve doit
contenir au moins un appareil de mesure pouvant être immergé dans du glycérol (ou système équivalent). D'autres
systèmes de vérification de performances équivalentes peuvent également être utilisés.
5.9 Réfrigérateur, chambre froide
5.9.1 Description
Il s'agit d'enceintes permettant de maintenir une conservation au froid. La température doit être de (3 ± 2) °C
(erreur maximale tolérée) pour la conservation des échantillons alimentaires à analyser, sauf pour des
applications particulières. Dans le cadre d'autres utilisations, la température, sauf spécification contraire, doit
être de (5 ± 3) °C.
5.9.2 Utilisation
Pour éviter toute contamination croisée, utiliser des enceintes, ou au moins des récipients, distinct(e)s, pour
séparer physiquement et conserver
⎯ des milieux de culture non ensemencés et des réactifs;
⎯ des échantillons pour essai; et
⎯ des cultures de micro-organismes et des milieux incubés.
Charger les réfrigérateurs, appareils frigorifiques et chambres froides en veillant à maintenir une circulation
d'air appropriée et à réduire au minimum le risque de contamination croisée.

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5.9.3 Vérification
Vérifier la température de chacune des enceintes chaque jour de travail à l'aide d'un thermomètre étalonné ou
d'une sonde placée à demeure. L'exactitude requise pour ce dispositif de contrôle de la température dépend
de l'objectif d'utilisation.
5.9.4 Entretien et nettoyage
Effectuer les opérations d'entretien suivantes à intervalles réguliers pour garantir un bon fonctionnement:
⎯ le dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes;
⎯ le dégivrage;
⎯ le nettoyage et la désinfection de l'intérieur des enceintes.
5.10 Congélateur et surgélateur
5.10.1 Description
Un congélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation en froid négatif. La température,
sauf spécification contraire, doit être inférieure à −15 °C, de préférence inférieure à −18 °C pour les
échantillons alimentaires.
Un surgélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation surgelée. La température, sauf
spécification contraire, doit être inférieure à −70 °C.
5.10.2 Utilisation
5.10.2.1 Congélateur
Il est nécessaire de disposer d'enceintes, ou au moins de récipients, distinct(e)s pour séparer physiquement
et conserver
⎯ certains réactifs non ensemencés;
⎯ des échantillons pour analyse; et
⎯ des cultures de micro-organismes.
Charger le congélateur de manière à maintenir une température suffisamment basse et cela particulièrement
lorsque sont introduits des produits non congelés.
5.10.2.2 Surgélateur
Sa principale utilisation est la conservation de micro-organismes, de cultures de référence et/ou de travail et

des réactifs.
Charger le surgélateur de manière à maintenir une température suffisamment basse et à éviter toute
contamination croisée entre les micro-organismes et les réactifs.
5.10.3 Vérification
Vérifier la température de chacune des enceintes régulièrement à l'aide d'un dispositif de surveillance de la
température appropriée.

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5.10.4 Entretien
Effectuer régulièrement les opérations d'entretien suivantes:
⎯ le dépoussiérage des ailettes et des plaques d'échange thermique externes (si accessibles);
⎯ le dégivrage;
5.11 Bain thermostaté
5.11.1 Description
Un bain thermostaté, qui est une cuve remplie de liquide (eau, éthylène glycol, etc.), avec ou sans couvercle
ou autre dispositif permettant de limiter l'évaporation, est utilisé pour maintenir une température spécifiée. Le
réglage de la température est souvent plus précis qu'avec une étuve à air, ce qui permet d'atteindre une
erreur maximale tolérée de ± 0,5 °C ou mieux. Les températures de travail et les erreurs maximales tolérées
requises sont stipulées dans chaque application ou méthode normalisée spécifique. Un système de
refroidissement est nécessaire pour maintenir une température proche de la température ambiante ou
inférieure à celle-ci.
5.11.2 Utilisation
Les principales utilisations sont les suivantes:
⎯ l'incubation à une température constante des milieux de culture ensemencés;
⎯ le maintien en surfusion des milieux gélosés stériles pendant la préparation des milieux;
⎯ la mise en température des milieux gélosés stériles en surfusion pour une utilisation dans le cadre de
méthodes normalisées spécifiques;
⎯ la préparation des suspensions mères des échantillons ou de solutions à une température contrôlée;
⎯ le traitement thermique des suspensions mères des échantillons à une température contrôlée (par
exemple la pasteurisation).
Lorsqu'un réglage précis de la température est requis, le bain doit être équipé d'une pompe à circulation d'eau
et d'un système de réglage automatique de la température. Aucune agitation du liquide ne doit provoquer de
projection de gouttes.
Les bains dotés de couvercles conviennent mieux à une utilisation nécessitant un réglage précis de la température ou
impliquant une température élevée. Il est recommandé d'utiliser des couvercles inclinés qui permettent l'élimination des
condensats.
Pour l'incubation des milieux ensemencés, maintenir le niveau de liquide de sorte que la partie supérieure du
milieu d'essai se situe au moins à 2 cm au-dessous du niveau de liquide durant l'incubation.
Lorsque d'autres récipients sont placés dans les bains, il est recommandé que le niveau de leurs contenus soit inférieur à
celui du liquide.
La profondeur d'immersion doit empêcher l'entrée d'eau par l'orifice des récipients.
Des dispositifs permettant de maintenir la stabilité des récipients peuvent être requis, par exemple des supports.
Il est recommandé de sécher l'ensemble des récipients une fois retirés du bain et avant toute utilisation ultérieure.

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Vérifier la stabilité et l'homogénéité de la température dans l'ensemble du bain avant la première utilisation et
après toute réparation ou modification ayant une incidence sur le réglage de la température.
Contrôler chaque bain avec un thermomètre, un thermocouple ou un dispositif d'enregistrement de la

température étalonné ayant une incertitude minimale de mesure compatible (voir 5.28.2), et qui soit
indépendant du système de réglage automatique de la température.
NOTE Un affichage numérique peut également être utilisé à condition que sa précision et sa résolution soient vérifiées.
Contrôler la température du bain lors de chaque utilisation et au moins une fois par jour pendant les périodes
d'incubation prolongées.
5.11.4 Entretien
Il est recommandé de remplir les bains thermostatés de liquide selon les recommandations du fabricant. Il est
recommandé d'utiliser de préférence de l'eau distillée ou déionisée pour l'incubation des cultures.
Vérifier régulièrement le niveau de liquide pour garantir un fonctionnement correct du bain et une immersion
satisfaisante des récipients dans le bain. Le niveau de liquide doit toujours couvrir les éléments chauffants.
Il est recommandé de régulièrement vider, nettoyer, désinfecter et remplir de nouveau les bains et à une fréquence
dépendant de l'utilisation, ou après un renversement.
5.12 Matériels produisant de la vapeur, y compris les bains d'eau bouillante
5.12.1 Description
Les matériels produisant de la vapeur et les bains d'eau bouillante sont constitués d'un élément chauffant
entouré d'eau placé dans un récipient doté d'un couvercle bien ajusté. Dans un matériel produisant de la
vapeur, l'élément chauffant crée de la vapeur à la pression atmosphérique; dans un bain d'eau bouillante, il
chauffe l'eau au point d'ébullition ou à une température voisine, avec ou sans production de vapeur.
5.12.2 Utilisation
⎯ la fusion des milieux gélosés;
⎯ la préparation des milieux thermolabiles;
⎯ la limitation de la contamination du petit matériel après chaque utilisation.
Le niveau d'eau du récipient doit être raisonnable et adéquat pour garantir en permanence la couverture des
éléments chauffants.
Un autoclave doté d'un dispositif de production de vapeur indépendant peut également être utilisé.
5.12.3 Entretien
Maintenir propres les matériels produisant de la vapeur et les bains d'eau bouillante.
Si besoin est, il est recommandé d'effectuer régulièrement des opérations de détartrage à une fréquence adaptée à la
dureté de l'eau du réseau de distribution.

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5.13 Four à stériliser
5.13.1 Description
Un four à stériliser est une enceinte permettant de maintenir une température comprise entre 160 °C et
180 °C, en vue de détruire les micro-organismes par chaleur sèche.
5.13.2 Utilisation
Seuls les matériels robustes en métal ou en verre doivent être stérilisés au four à stériliser; ne pas utiliser ce
dernier pour les éléments en matière plastique ou en caoutchouc.
Avant de les stériliser dans le four, nettoyer la verrerie et les matériels en métal.
Si la verrerie graduée est stérilisée dans le four à stériliser, vérifier régulièrement l'exactitude des volumes
marqués.
La répartition de la température dans l'enceinte doit être homogène. Le four doit être équipé d'un thermostat
et d'un thermomètre ou d'un dispositif d'enregistrement de la température d'exactitude appropriée.
Il est recommandé qu'il soit muni d'un indicateur de durée, d'un programmateur ou d'un minuteur.
Une fois la température de fonctionnement atteinte, la procédure de stérilisation doit durer au moins 1 h
à (170 ± 10) °C ou à une combinaison durée/température équivalente.
Après la stérilisation, il est recommandé de laisser refroidir la verrerie dans le four avant de la retirer afin d'éviter toute
fêlure.
Vérifier la stabilité et l'homogénéité de la température dans l'ensemble du four avant la première utilisation et
après toute réparation ou modification qui pourrait avoir une incidence sur le réglage de la température.
Le four doit être équipé d'un thermomètre, d'un thermocouple ou d'un dispositif d'enregistrement de la
température étalonnés, de précision appropriée et indépendant du système de réglage automatique de la
température. Le dispositif de surveillance doit au moins avoir une résolution de 1 °C, à la température de
traitement utilisée.
Il est recommandé de contrôler et d'enregistrer la température du four lors de chaque utilisation.
5.13.4 Entretien
Nettoyer les surfaces internes lorsque cela est requis.
5.14 Four à micro-ondes
5.14.1 Description
Un four à micro-ondes est un appareil permettant de chauffer des éléments par l'utilisation de l'énergie à
micro-ondes à la pression atmosphérique.
5.14.2 Utilisation
Utiliser uniquement le matériel disponible actuellement pour chauffer des liquides ou fondre des milieux de
culture gélosés.

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AVERTISSEMENT — Ne pas chauffer les milieux complexes contenant des composants

thermosensibles dans un four à micro-ondes, à moins qu'il n'ait été vérifié que ce mode de chauffe est
sans incidence sur les performances du milieu. Aucune évaluation de l'efficacité des micro-ondes
pour la stérilisation des milieux de culture n'a encore été effectuée. En conséquence, les fours à
micro-ondes ne doivent pas être utilisés à cet effet.
Le four doit pouvoir chauffer les liquides et les milieux de culture de façon contrôlée par un cycle d'émissions
micro-ondes. La répartition des micro-ondes doit être homogène afin d'éviter les points de surchauffe. Les
fours munis d'un plateau tournant ou d'un répartiteur des micro-ondes permettent d'obtenir une meilleure
répartition de la chaleur.
Ne pas utiliser de matériel en métal, y compris les fermetures. Avant de procéder au chauffage, retirer les
capsules ou les bouchons des flacons.
Le chauffage pendant des périodes prolongées à des puissances nominales faibles peut permettre d'obtenir une meilleure
AVERTISSEMENT — Manipuler avec précaution les éléments chauffés. Le contenu bouillant des
flacons peut entraîner des brûlures. Les flacons risquent d'exploser.
Pour la fusion d’un milieu gélosé, il est recommandé de faire fonctionner le four à faible puissance (par exemple cycle de
dégivrage) et d'utiliser de l'eau comme source de froid (par exemple de 50 ml à 100 ml d'eau dans un bécher pour micro-
ondes) pour faciliter le réglage du processus de chauffage.
Un temps de repos d'au moins 5 min est recommandé après le chauffage et avant le retrait des éléments du four à micro-
ondes.
Des temps de chauffage et des niveaux de puissance appropriés doivent être définis avant la mise en service
pour les différents volumes de liquides et les milieux de culture régulièrement manipulés afin de garantir des
performances optimales et d'éviter la surchauffe de produits sensibles.
5.14.4 Entretien
Nettoyer immédiatement le four lors de tout renversement de matières; le nettoyer également à intervalles
réguliers en fonction de l'utilisation.
Il est recommandé de contrôler l'intégrité des joints d'étanchéité de la porte du four et de vérifier régulièrement le four
pour toute fuite de rayonnement avec une sonde ou un dispositif équivalent conformément aux instructions du fabricant.
5.15 Lave-verrerie
5.15.1 Description
Les lave-verrerie de laboratoire sont des appareils contrôlés électroniquement, conçus pour le lavage de la
verrerie de laboratoire courante, qui peuvent être programmés pour différents cycles de lavage et de rinçage
(par exemple à l'eau distillée ou déionisée, ou à l'acide).
Les appareils de lavage des pipettes en verre sont des lave-verrerie spéciaux conçus pour le lavage des
embouchures de pipettes étroites.
5.15.2 Utilisation
De nombreux types de lave-verrerie sont disponibles. D'une manière générale, ils doivent être installés et
utilisés conformément aux instructions du fabricant.

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Vérifier l'efficacité du lavage par examen visuel et, dans les applications critiques, effectuer des essais pour
garantir que la verrerie est exempte de substances inhibitrices.
Il est possible de vérifier la présence de résidus alcalins ou acides en utilisant un système permettant une mesure
universelle de la valeur de pH; il est recommandé d'obtenir une gamme de valeur de pH comprise entre 6,5 et 7,3.
5.15.4 Entretien
Programmer un entretien régulier conforme aux spécifications du fabricant à une fréquence appropriée.
Un entretien plus fréquent peut être nécessaire pour le matériel utilisé de façon intensive ou dans les régions où l'eau est
dure.
5.16 Microscope optique
5.16.1 Description
Il existe différents types de microscopes: monoculaires, binoculaires, à écran, avec caméra, à fluorescence,
etc., avec une source lumineuse interne ou externe. Les objectifs avec un agrandissement variant de ×10
(lentilles sèches) à environ ×100 (immersion dans l'huile avec tourelle à ressort) sont utilisés pour les
examens bactériologiques afin d'obtenir un agrandissement compris entre ×100 et ×1 000. La microscopie en
contraste de phase et sur fond noir sont également très précieuses pour les examens à l'état humide.
5.16.2 Utilisation
Régler l'optique du microscope conformément aux instructions du fabricant. L'axe optique de la lumière de
l'ampoule à haute intensité doit passer par le centre du condenseur inférieur, de la lame et de l'objectif en
direction de l'oculaire afin d'éliminer les aberrations sphériques et chromatiques.
5.16.3 Entretien
Suivre les instructions du fabricant en ce qui concerne l'entreposage, le nettoyage et l'entretien. Éviter la
formation de condensation en cas d'humidité élevée car cela peut conduire à la détérioration de la qualité des
lentilles.
Retirer quotidiennement, ou après chaque utilisation, l'huile des objectifs à immersion et des pièces reliées en
utilisant du papier Joseph. Utiliser un solvant recommandé par le fabricant. Retirer régulièrement de l'oculaire
la graisse causée par les cils.
Les systèmes optiques peuvent facilement être endommagés, c'est pourquoi un entretien, de préférence réalisé par le
fabricant, est souhaitable.
5.17 Brûleur à gaz ou incinérateur à fil
5.17.1 Description
Les brûleurs à gaz (Bunsen) produisent une flamme nue étroite et sont alimentés par du gaz de ville ou en
bouteille. Le niveau de chaleur est réglé en variant la quantité d'air mélangé au gaz.
Un brûleur à gaz ou électronique est principalement utilisé pour stériliser les anses en métal ou les fils droits
en les portant à incandescence et pour stériliser à la flamme d'autres petits éléments de matériel résistants.

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5.17.2 Utilisation
Il est préférable d'utiliser l'incinérateur à fil pour la stérilisation des anses en métal ou des fils droits lors de la
manipulation de bactéries pathogènes, car il empêche les projections et permet d'éviter le risque de contamination croisée.
Les brûleurs à gaz peuvent produire une chaleur importante et des turbulences dans l'air du laboratoire.
Il est possible d'utiliser des matériels à usage unique pour pouvoir travailler aseptiquement sans brûleur à gaz.
Il est recommandé d'éviter l'utilisation des brûleurs à gaz dans les hottes de sécurité car ils peuvent perturber de façon
inacceptable le flux d'air laminaire. Dans ce cas, l'utilisation de matériel stérile à usage unique est recommandée.
5.17.3 Entretien
Nettoyer et désinfecter régulièrement les brûleurs et les protections des incinérateurs à fil, particulièrement en
cas de renversement de cultures microbiennes sur les appareils.
5.18 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs
5.18.1 Description
Un répartiteur est un instrument ou appareil permettant de distribuer les milieux de culture et réactifs dans les
tubes, les flacons ou les boîtes de Petri. La gamme de ces appareils s'étend des simples éprouvettes
graduées, des pipettes ou des seringues manuelles, en passant par les seringues automatiques et les
pompes péristaltiques, jusqu'aux dispositifs électroniques programmables, à distribution automatique variable.
5.18.2 Utilisation
Le matériel propre utilisé pour la répartition des milieux de culture et des réactifs doit être exempt de
substances inhibitrices. Utiliser un tuyau différent pour chacun des milieux sélectifs de manière à réduire le
plus possible le lessivage/transfert de substances inhibitrices envers les micro-organismes.
Si la répartition aseptique de milieux de culture et de réactifs stériles est requise, toutes les parties de
l'appareil en contact avec le produit à répartir doivent être stériles.
L’erreur maximale tolérée sur le volume délivré par le répartiteur de milieux de culture ne doit pas dépasser
± 5 % du volume identifié.
L’erreur maximale tolérée pour la répartition des volumes mesurés de diluants utilisés pour préparer les
dilutions décimales doit être ± 2 %.
Contrôler les volumes répartis avant toute utilisation, puis régulièrement, conformément à un protocole
documenté, et toujours après tout ajustement ayant une incidence sur le volume délivré. Des détails sont
indiqués dans l'ISO 835 et l'ISO 8655.
5.18.4 Nettoyage et entretien
Nettoyer la surface extérieure du répartiteur après chaque utilisation. Laver et rincer soigneusement toutes les
parties du répartiteur entrant en contact avec le produit, et les stériliser si l'utilisation pour la répartition de
liquide stérile l'exige. Ne pas utiliser de désinfectants utilisés sur les surfaces entrant en contact avec le
produit à répartir car ils peuvent conférer des propriétés inhibitrices au produit.
Tous les répartiteurs automatiques doivent être maintenus en parfait état grâce à un entretien régulier
conforme aux instructions du fabricant.

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5.19 Agitateur vortex
5.19.1 Description
Cet instrument facilite l'homogénéisation de milieux liquides (par exemple les dilutions décimales et les
échantillons pour essai de liquides) ou la mise en suspension de cellules bactériennes dans un liquide.
Le mélange est obtenu par application d'un mouvement de rotation excentrée du contenu du tube ou du
contenant (vortex).
5.19.2 Utilisation
Appuyer la base du tube ou du récipient dans lequel est placé le liquide à mélanger contre la tête de
l'agitateur. La vitesse de mélange est réglée en variant la vitesse du moteur ou par l'angle de contact avec la
tête de l'agitateur.
Il est recommandé que l'opérateur garantisse qu'aucun débordement ne se produise pendant le mélange en ajustant la
vitesse, si nécessaire, et en tenant le tube environ au tiers supérieur de sa longueur afin de pouvoir mieux contrôler le tube
et limiter la montée de liquide.
Il est recommandé de prendre les précautions appropriées pour réduire le plus possible la libération d'aérosols à
l'ouverture des contenants après l'agitation par vortex.
Un mélange adéquat est mis en évidence par l'apparition d'un tourbillon dans la profondeur du liquide pendant
l'opération de mélange.
5.19.4 Entretien
Maintenir le matériel en parfait état de propreté. En cas de renversement de matière, décontaminer le matériel
à l'aide d'un désinfectant de laboratoire approprié.
5.20 Dispositif de comptage des colonies
5.20.1 Description
Les dispositifs manuels de comptage des colonies utilisent un dispositif de comptage activé par pression. Ils
fournissent habituellement une indication sonore du comptage et sont dotés d'un affichage numérique pour la
lecture du comptage global. Il peut s'agir de simples compteurs en forme de stylo ou également de dispositifs
constitués d'une platine lumineuse avec une grille étalonnée pour la boîte et d'un écran agrandisseur pour
faciliter la détection des colonies. Les compteurs électroniques automatisés, comprenant les analyseurs
d'images, associent un appareillage à un système informatisé incluant l'utilisation d'une caméra et d'un
moniteur.
5.20.2 Utilisation
Suivre les instructions du fabricant. Ajuster la sensibilité des compteurs automatisés pour garantir le
comptage de toutes les colonies cibles. Les compteurs de colonies électroniques automatisés nécessitent
également une programmation séparée lorsqu'ils sont utilisés avec divers types de géloses et de matrices,
ainsi que pour les comptages en surface ou en profondeur, pour permettre une distinction adéquate des
colonies cibles.
Il est recommandé d'effectuer des contrôles manuellement et à intervalles réguliers pour garantir l'obtention de
comptages précis à l'aide du compteur de colonies.

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Il est recommandé, en outre, de vérifier les compteurs de colonies automatisés chaque jour d'utilisation à l'aide d'une
boîte d'étalonnage contenant un nombre connu de particules ou de colonies dénombrables.
5.20.4 Entretien
Maintenir le matériel en parfait état de propreté et exempt de poussière; éviter de rayer les surfaces qui
constituent un élément essentiel du comptage. Programmer un entretien régulier des compteurs électroniques
comprenant des analyseurs d'images, conformément aux spécifications du fabricant, à une fréquence
appropriée.
5.21 Matériel pour culture en atmosphère modifiée
5.21.1 Description
Il peut s'agir d'une jarre à fermeture étanche ou de tout autre appareillage approprié permettant d'obtenir et de maintenir
des conditions d'atmosphère modifiée (par exemple anaérobiose) pendant toute la durée de l'incubation du milieu de
culture. D'autres systèmes de performances équivalentes, tels que les chambres anaérobies, peuvent également être
utilisés.
Suivre les instructions du fabricant pour l'installation et l'entretien.
5.21.2 Utilisation
La composition de l'atmosphère requise peut être obtenue par addition d'un mélange gazeux (par exemple d'une bouteille
de gaz) après évacuation de l'air de la jarre, par déplacement de l'atmosphère dans une hotte ou par tout autre moyen
approprié (par exemple les systèmes gazeux disponibles dans le commerce).
En règle générale, l'incubation anaérobie nécessite une atmosphère contenant moins de 1 % (fraction
volumique) d'oxygène, entre 9 % et 13 % (fraction volumique) de dioxyde de carbone; l'incubation
microaérobie (capnaérobie) nécessite une atmosphère contenant entre 5 % et 7 % (fraction volumique)
d'oxygène et environ 10 % (fraction volumique) de dioxyde de carbone.
Ces conditions peuvent nécessiter des modifications en fonction des exigences du micro-organisme spécifique.
Placer un indicateur biologique ou chimique permettant de contrôler la nature de l'atmosphère dans chaque
enceinte pendant chaque utilisation. La croissance de la souche de contrôle ou un changement de couleur de
l'indicateur chimique vérifie que les conditions d'incubation appropriées sont obtenues.
5.21.4 Entretien
Si un système catalytique est employé, le régénérer régulièrement selon les instructions du fabricant. Si des
soupapes sont employées, les nettoyer et les lubrifier pour en garantir le bon fonctionnement et les remplacer
si nécessaire.
Nettoyer et désinfecter le matériel régulièrement.
5.22 Centrifugeuse
5.22.1 Description
Les centrifugeuses sont des dispositifs mécaniques ou contrôlés électroniquement, utilisant la force centrifuge
pour séparer les particules en suspension, y compris les micro-organismes présents dans les fluides.

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5.22.2 Utilisation
Dans certaines applications, la concentration des micro-organismes cibles est obtenue par centrifugation
d'échantillons liquides. Le dépôt ainsi créé peut être remis en suspension dans un liquide et être soumis à un
examen complémentaire.
Prendre les précautions nécessaires pour éviter la création d'aérosols et la contamination croisée par un
fonctionnement correct du matériel et l’utilisation de tubes ou de pots à centrifuger étanches et stériles.
Lorsque la vitesse de centrifugation est critique ou spécifiée dans l'application, il est recommandé de vérifier
régulièrement l'indicateur de vitesse ou les réglages à l'aide d'un tachymètre étalonné et indépendant, et après toute
réparation ou modification significative.
5.22.4 Entretien
Nettoyer et désinfecter régulièrement les centrifugeuses et après tout renversement de cultures microbiennes
ou d'échantillons potentiellement contaminés.
Il est recommandé d'entretenir régulièrement les centrifugeuses.
5.23 Plaque chauffante et chauffe-ballons
5.23.1 Description
Les plaques chauffantes et les chauffe-ballons sont des dispositifs de chauffage à commande thermostatique.
Certaines plaques chauffantes et certains chauffe-ballons comprennent des systèmes d'agitation magnétique.
5.23.2 Utilisation
Les plaques chauffantes et les chauffe-ballons équipés de systèmes d'agitation mécanique sont utilisés pour
chauffer des volumes relativement importants de liquide comme les milieux.
Pour la préparation d'un milieu, ne pas utiliser de plaques chauffantes ni de chauffe-ballons sans systèmes
d'agitation.
5.23.3 Entretien
Nettoyer tout renversement dès que l'installation est froide.
5.24 Ensemenceur spiral
5.24.1 Description
L'ensemenceur spiral est un dispositif qui répartit un volume prédéterminé de liquide sur la surface d'une boîte
de Petri gélosée disposée sur une table en rotation. Le stylet distributeur se déplace du centre vers la
périphérie de la boîte et distribue le volume sous la forme d'une spirale d'Archimède. Le volume réparti décroît
au fur et à mesure du déplacement du stylet du centre vers la périphérie de la boîte, de sorte qu'une relation
inverse existe entre le volume déposé et le rayon de la spirale. Le volume d'échantillon réparti dans chaque
secteur est connu et constant. Pour permettre le chargement et la répartition de liquides, une pompe à vide,
un piston motorisé si l'instrument est équipé d’une micro-seringue à usage unique ou un système équivalent
est requis(e).

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5.24.2 Utilisation
Ce matériel est utilisé pour répartir un échantillon liquide, un broyat d'échantillon ou une dilution sur une boîte
gélosée appropriée en vue d'un comptage de colonies. Après incubation, les colonies se développent le long
des lignes où le liquide a été déposé. Le nombre de colonies dans un secteur connu est compté en utilisant
une grille de comptage fournie avec l'appareil.
Le système de répartition doit être désinfecté puis rincé à l'eau stérile distillée ou déionisée, avant et après
utilisation, et entre chaque échantillon. La désinfection peut être réalisée par rinçage, par exemple avec une solution
contenant entre 0,5 % et 1 % (fraction massique) de chlore libre.
Un appareil qui fonctionne avec un principe différent (par exemple micro-seringues à usage unique actionnée
par un piston) doit être utilisé conformément aux instructions du fabricant.
La surface des boîtes gélosées à utiliser avec l'ensemenceur spiral doit être plane et ne contenir aucune bulle d'air.
Les boîtes ne doivent pas contenir d'humidité excessive en surface pour assurer la formation de colonies bien
séparées.
Les colmatages peuvent être évités en laissant déposer les éventuelles particules avant de charger la suspension de
l'échantillon et en utilisant une portion de surnageant liquide. Il est également possible d'utiliser des sachets pour
malaxeurs à filtres intégrés.
S'assurer que la boîte de Petri est centrée sur le plateau tournant.
La forme de la répartition doit être vérifiée quotidiennement en distribuant de l'encre lavable. La spirale doit
être plus dense vers le centre de la boîte, où débute le dépôt, et doit devenir régulièrement de moins en
moins dense jusqu'au point de retrait du stylet. La spirale doit être complète et sans cassure. La portion non
inoculée de la boîte doit être centrée et présenter un diamètre d'environ 2,0 cm. La position du stylet au début
et à la fin de l'ensemencement doit être vérifiée en même temps à l'aide des marques sur le plateau tournant.
Si la forme n'est pas correcte, il est recommandé de découper le stylet conformément aux instructions du fabricant. Pour
vérifier que l'angle formé entre la pointe du stylet et la surface de la gélose est correct, il est recommandé de réaliser un
contrôle en utilisant un dispositif d'aspiration permettant de maintenir une lamelle couvre-objets contre l'ouverture du
stylet. Il est recommandé que la lamelle couvre-objets soit parallèle à la surface de la boîte.
La stérilité de l'ensemenceur spiral doit être vérifiée en distribuant de l'eau stérile pour chaque série
d'échantillons analysés.
Un contrôle gravimétrique du volume réparti doit être réalisé régulièrement en utilisant de l'eau distillée.
L’erreur maximale admissible tolérée pour la masse attendue du volume réparti doit être de ± 5 %.
5.24.4 Entretien
Il est recommandé d'éliminer immédiatement tout renversement et de nettoyer régulièrement le matériel.
Il est recommandé d'entretenir et de vérifier l'équipement selon l'utilisation qui en est faite.
5.25 Distillateurs, déionisateurs et osmoseurs
5.25.1 Description
Ces appareils sont utilisés pour produire de l'eau distillée ou déionisée/déminéralisée présentant la qualité
requise (voir l'ISO 11133) pour la préparation des milieux de culture microbiologiques ou des réactifs et pour
d'autres applications de laboratoire.

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5.25.2 Utilisation
Installer, mettre en service et utiliser le matériel conformément aux instructions du fabricant, en tenant compte
de l'emplacement de l'alimentation d'eau, de l'évacuation des eaux usées et de l'alimentation électrique du
laboratoire.
L'eau doit être contrôlée régulièrement ou au moment de son utilisation, après une période de stockage, pour
garantir une conductivité satisfaisante. Elle doit être inférieure ou égale à 50 µS/cm (équivalent à une
résistivité ≥ 20 000 Ω·cm) pour la préparation des milieux et des réactifs.
Si l'eau est stockée avant d'être utilisée ou si elle est produite par un échangeur d'ions, il est recommandé de procéder à
des contrôles de contamination microbienne appropriés, conformément à l'ISO 11133.
5.25.4 Entretien
Il est recommandé de nettoyer et de détartrer les distillateurs avec de l'acide, par exemple 5 % à 10 % d'acide citrique, à
une fréquence adaptée à la dureté de l'eau du réseau de distribution et de les rincer soigneusement avec de l'eau fraîche
pour éliminer l'acide résiduel. Il est recommandé d'entretenir les déionisateurs et les osmoseurs conformément aux
instructions du fabricant.
5.26 Minuteurs et minuteries
5.26.1 Description
Les minuteurs et minuteries intégrés sont des instruments qui permettent de déterminer des durées correctes
et sont utilisés pour de nombreuses applications de laboratoire où la durée est spécifiée et critique.
5.26.2 Utilisation
Les minuteurs de poche ou de paillasse, analogiques et numériques, utilisés pour contrôler la durée des
opérations de laboratoire (par exemple application de colorant sur des films biologiques, homogénéisation
d'échantillons), doivent être en parfait état de fonctionnement et capables d'atteindre l'exactitude requise.
Utiliser les minuteurs intégrés au matériel de laboratoire (par exemple autoclaves, centrifugeuses,
homogénéisateurs) conformément aux instructions du fabricant. Ces minuteurs doivent être capables
d'atteindre l'exactitude requise en fonction de la criticité de l'application.
Vérifier régulièrement tous les minuteurs utilisés au cours d'opérations de laboratoire où la durée est décisive
pour le résultat, par rapport au signal horaire national et après toute réparation significative.
5.26.4 Entretien
Nettoyer les minuteurs et en vérifier le fonctionnement régulièrement.
Il est recommandé de contrôler les minuteries intégrées dans le cadre de la procédure d'entretien de l'instrument.

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5.27 Pipettes et pipetteurs
5.27.1 Description
Les pipettes sont des dispositifs en verre ou à usage unique utilisées pour distribuer des volumes de produits
liquides ou visqueux; les pipettes graduées distribuent des volumes mesurés avec une exactitude qui dépend
des spécifications.
Les pipetteurs automatiques (mécaniques) dotés d'embouts en plastique sont des dispositifs qui permettent
de répartir des volumes de liquide fixes ou ajustables sous l'action d'un piston manuel ou électrique.
5.27.2 Utilisation
Mettre au rebut les pipettes endommagées ou cassées.
Il est recommandé que les pipettes Pasteur ou graduées stériles et les embouts de pipetteurs soient munis d'un bouchon en
coton non absorbant pour empêcher la contamination lors de la manipulation de cultures microbiennes.
Les poires/auxiliaires de pipetage utilisés pour les pipettes Pasteur ou graduées et les embouts des pipetteurs
doivent être de dimension correcte pour empêcher les fuites et garantir un fonctionnement efficace.
Des détails supplémentaires sont indiqués dans l'ISO 7712[51].
Vérifier les pipettes graduées pour confirmer la distribution de volumes corrects si le fabricant ne déclare pas
leur exactitude (justesse et fidélité).
L'étalonnage des pipettes ou pipetteurs est décrit dans l'ISO 835 et l'ISO 8655, en particulier dans
l'ISO 8655-2.
Soumettre à essai les nouveaux pipetteurs avant utilisation et à des intervalles réguliers en fonction de la
fréquence et de la nature d'utilisation, pour confirmer qu’ils respectent l’erreur maximale tolérée. Il est
recommandé que celle-ci se trouve dans la limite de 2 % pour la répartition de volumes de dilution décimale et
des inoculats (pour améliorer la fidélité et réduire l'incertitude du résultat d'essai final, une erreur maximale
admissible tolérée de ± 2 % est préférable) ou 5 % pour les autres applications. Effectuer des contrôles
gravimétriques intermédiaires à l'eau distillée ou déionisée pour s'assurer que les volumes répartis demeurent
dans l’erreur maximale tolérée.
5.27.4 Entretien
Après chaque utilisation, décontaminer et nettoyer/stériliser les pipettes réutilisables ainsi que les pipetteurs
automatiques de façon appropriée.
Si les molettes et les pistons des pipetteurs automatiques sont contaminés en cours d'utilisation, les démonter
pour les décontaminer et les nettoyer. Après réassemblage, les étalonner. Si cette opération ne peut pas être
effectuée dans le laboratoire, renvoyer les pipetteurs au fabricant pour qu'ils soient assemblés et étalonnés.
5.28 Thermomètres et dispositifs de surveillance de la température, incluant les

enregistreurs automatiques
5.28.1 Description
Les thermomètres sont des instruments à mercure ou à alcool utilisés pour contrôler la température dans le
cadre des activités de laboratoire.

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Les autres dispositifs de surveillance de la température comprennent les thermomètres à résistance de

platine et les instruments tels que les thermocouples, qui fournissent un enregistrement graphique, sur papier
ou de manière électronique, des températures rapportées au temps.
Les thermomètres de référence et autres dispositifs de surveillance de la température doivent être étalonnés
selon les étalons nationaux ou internationaux. Ils doivent être utilisés uniquement à titre de référence et ne
doivent pas être utilisés pour la surveillance systématique.
Les thermomètres de travail et autres dispositifs d'enregistrement de la température doivent être étalonnés
pour permettre la traçabilité jusqu'aux étalons nationaux ou internationaux.
NOTE Les dispositifs d'exactitude adéquate et conformes à la spécification internationale ou nationale appropriée peuvent
également être utilisés comme thermomètres de travail après vérification de leurs performances.
5.28.2 Utilisation
Les thermomètres et autres dispositifs de surveillance de la température doivent avoir une résolution adéquate
pour mesurer la température dans l’erreur maximale tolérée spécifiée, en fonction de la criticité de l'application.
Il est recommandé que la résolution du dispositif de surveillance de la température soit au moins quatre fois inférieure à
l'étendue de l’erreur maximale tolérée requise. Par exemple, pour une erreur maximale tolérée de ± 1 °C, il est
recommandé que la résolution soit d'au moins 0,2 °C; pour une erreur maximale tolérée de ± 0,5 °C, il est recommandé
que la résolution soit d'au moins 0,1 °C.
Il est recommandé que l'incertitude de mesure de l'étalonnage du thermomètre de référence soit également prise en
compte lors de la détermination de la température de fonctionnement.
Il est recommandé que les thermomètres ou thermocouples disposés dans les étuves à air soient fixés dans des récipients
appropriés remplis de glycérol, d'huile de paraffine ou de polypropylène glycol pour éviter une perte de chaleur à
l'ouverture de la porte et permettre une lecture stable. Utiliser des thermomètres à immersion partielle en immergeant
uniquement le réservoir ou utiliser des moyens équivalents pour assurer la stabilité.
Il est recommandé que les thermomètres disposés dans des bains d'eau soient immergés dans l'eau conformément à la
spécification déterminée; par exemple il est recommandé d'immerger les thermomètres à immersion partielle en
respectant la profondeur spécifiée pour ce thermomètre, généralement 76 mm ou 100 mm.
Ne pas utiliser de thermomètres dont la colonne de mercure ou d'alcool est fractionnée.
Les thermomètres à mercure sont fragiles et, s'il existe un risque de casse, il est recommandé de les placer dans des étuis
protecteurs n'interférant pas avec les mesures de température.
AVERTISSEMENT — Le mercure est dangereux pour la santé. Éliminer tout renversement
conformément aux réglementations nationales.
Les thermomètres de référence doivent être étalonnés sur l'ensemble du domaine de travail par rapport aux
étalons nationaux ou internationaux traçables avant leur première utilisation et au moins une fois tous les
5 ans. L'étalonnage intermédiaire sur un point unique (par exemple au point de congélation) doit être effectué
pour vérifier les performances.
Les thermocouples de référence doivent être entièrement étalonnés et raccordés aux étalons nationaux ou
internationaux avant leur première utilisation, contrôlés régulièrement et à une fréquence définie par le
laboratoire, conformément aux instructions du fabricant. Des contrôles intermédiaires par rapport à un
thermomètre de référence doivent être effectués pour vérifier les performances.
Les autres dispositifs de surveillance de la température (tels que des récepteurs d'onde radio) doivent être
étalonnés par rapport aux étalons nationaux ou internationaux traçables et conformément aux instructions du
fabricant.
Il est recommandé de vérifier les thermomètres et thermocouples de travail au point de congélation et/ou par rapport à un
thermomètre de référence dans la gamme de températures de travail.

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5.28.4 Entretien
Maintenir les thermomètres et thermocouples en parfait état de fonctionnement et de propreté.
Maintenir les autres dispositifs de surveillance de la température conformément aux instructions du fabricant.
5.29 Séparateur immunomagnétique
5.29.1 Description
Ce matériel est utilisé pour la séparation et la concentration de micro-organismes cibles dans des cultures
liquides à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps appropriés.
Les séparateurs manuels sont constitués d'un mélangeur rotatif développant une vitesse de rotation comprise
entre 12 r/min et 20 r/min et d'un concentrateur de particules doté d'une barre magnétique amovible.
Les séparateurs automatisés utilisent des rangées (analogues à des peignes) de bâtonnets magnétiques et
des portoirs à tubes. Les particules magnétiques sont déplacées de tube en tube et l’appareil permet la
séparation complète comprenant les étapes de lavage réalisées automatiquement dans un environnement
confiné.
5.29.2 Utilisation et vérification
Suivre les instructions d'utilisation du fabricant et celles indiquées dans les normes spécifiques (par exemple
E. coli O157).
Pour les systèmes manuels, vérifier la vitesse de rotation du mélangeur.
En ce qui concerne les systèmes manuels et automatisés, vérifier que le système est en mesure d'isoler de
faibles niveaux de micro-organisme cible avant son utilisation systématique.
Il est important d'évaluer le risque de contamination croisée pendant les procédures de séparation manuelle
et de prendre les mesures appropriées pour éviter que cela ne se produise.
5.29.3 Entretien
5.30 Système de filtration
Le système de filtration à utiliser doit être tel que décrit dans l'ISO 8199.
5.31 Autres matériels et logiciels
D'autres matériels et leurs logiciels doivent permettre d'obtenir l'exactitude requise et doivent être conformes
aux spécifications applicables aux essais concernés. Des programmes d'étalonnage si possible, et des
contrôles doivent être établis pour des quantités ou des valeurs clés lorsque ces propriétés ont une incidence
significative sur le résultat. Avant d'utiliser régulièrement le matériel, l’étalonner, si possible, et vérifier celui-ci
pour établir sa conformité avec les exigences du laboratoire et avec les spécifications des normes concernées.
Vérifier l'obtention de résultats corrects à la suite de toute configuration ou modification des logiciels effectuée
dans le laboratoire.

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6 Préparation de la verrerie et du matériel
6.1 Préparation
La verrerie et le matériel utilisé en microbiologie doivent être adéquats, utilisés correctement et préparés de
façon à garantir leur propreté et/ou leur stérilité jusqu'au moment de l'utilisation. De l'eau de qualité de
laboratoire conformément à l'ISO 3696[50] doit être utilisée pour rincer la verrerie réutilisable après son lavage.
Il est possible de vérifier la présence de résidus alcalins ou acides en utilisant un système permettant une mesure
universelle de la valeur de pH; il est recommandé d'obtenir une gamme de valeur de pH comprise entre 6,5 et 7,3.
Il est recommandé que la verrerie et le matériel soient conçus pour empêcher ou limiter le contact entre l'opérateur et le
matériel contaminé.
Il est recommandé que les tubes et flacons soient bouchés par des moyens appropriés. Si nécessaire, il est recommandé
que la verrerie à stériliser soit placée dans des récipients spéciaux (par exemple pour les pipettes) ou enveloppée dans un
matériau approprié (papier spécial, papier aluminium, etc.). Il est recommandé que la verrerie vide stérilisée à l'autoclave
laisse pénétrer la vapeur; dans le cas contraire, la stérilisation ne sera pas effective.
6.2 Stérilisation ou décontamination
6.2.1 Généralités
Il est recommandé d'enregistrer la température et la durée de stérilisation ou de décontamination. Il est possible d'utiliser
des indicateurs de stérilisation pour distinguer les matériels stérilisés des matériels non stérilisés.
6.2.2 Stérilisation par chaleur sèche
Chauffer la verrerie, etc., dans un four à stériliser pendant au moins 1 h à une température de 170 °C ± 10 °C
ou tout barème équivalent.
6.2.3 Stérilisation par chaleur humide (vapeur)
La vapeur humide sous pression constitue la méthode de stérilisation la plus efficace pour la verrerie et les
matériels de laboratoire. La température de la chambre de l'autoclave doit atteindre 121 °C ± 3 °C pendant au
moins 15 min (voir 5.6).
6.2.4 Décontamination à l'aide de composés chimiques
Utiliser des composés chimiques (par exemple produits à base de chlore, alcools, composés d'ammonium
quaternaires) à des concentrations et à des temps de contact appropriés.
S'assurer que les résidus chimiques n'affectent pas la revivification des micro-organismes.
6.3 Matériel à usage unique
Le matériel à usage unique peut être utilisé à la place du matériel réutilisable (verrerie, boîtes de Petri, pipettes, flacons,
tubes, anses, étaleurs, etc.), à condition que les spécifications soient similaires.
Il est alors conseillé de s'assurer que le matériel proposé convient pour l'utilisation en microbiologie (en particulier en
matière de stérilité) et que le matériel ne contient aucune substance susceptible d'inhiber la croissance des micro-
organismes (voir l'ISO 9998).
6.4 Stockage de la verrerie et du matériel
Stocker la verrerie et le matériel propres à l'abri de la poussière dans des conditions assurant le maintien de
leur propreté.

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6.5 Gestion de la verrerie et du matériel stériles
Stocker la verrerie et le matériel dans des conditions assurant le maintien de leur stérilité. Stocker le matériel
à usage unique conformément aux instructions du fabricant, sans détérioration de l'emballage. Stocker le
matériel préparé au laboratoire dans de bonnes conditions de propreté.
Lors de la stérilisation du matériel destiné à la microbiologie, apposer une date limite d'utilisation (ou une date
de fabrication) sur chaque conditionnement.
6.6 Décontamination et désinfection
6.6.1 Décontamination du matériel à usage unique
Décontaminer les instruments à usage unique avant leur élimination dans le laboratoire ou les faire éliminer par un sous-
traitant spécialisé.
Outre les méthodes décrites dans le présent paragraphe, il est possible de procéder à l'incinération du
matériel. Si un incinérateur est disponible dans les locaux, la décontamination et l'élimination peuvent être
effectuées en une seule opération.
6.6.2 Décontamination de la verrerie et du matériel avant leur utilisation
En règle générale, il est recommandé de procéder à la décontamination par stérilisation du matériel par chaleur humide
(voir 6.2.3) ou chaleur sèche (voir 6.2.2).
Dans certaines situations (par exemple échantillonnage sur le terrain), la décontamination chimique peut être appropriée.
Après un tel traitement, s’assurer que les résidus chimiques n’affectent pas la revivification des micro-organismes.
6.6.3 Décontamination de la verrerie et du matériel après utilisation
Il est recommandé de placer les matériels à décontaminer et à éliminer dans des contenants, par exemple des sacs en
plastique pour autoclave. L'autoclavage est la méthode à utiliser de préférence pour tous les processus de
décontamination (pendant au moins 30 min à 121 °C ± 3 °C). Il est recommandé d'effectuer le chargement de l'autoclave
de manière à faciliter la pénétration de la chaleur dans la charge (par exemple ne pas suremballer), ne pas visser
complètement les capuchons/couvercles et ouvrir les sacs.
Il est possible d'utiliser d'autres méthodes que l'autoclavage si la réglementation nationale l'autorise.
Avant de les laver, passer à l'autoclave tous les matériels ayant été en contact avec les cultures de micro-
organismes (milieux de culture solides ou liquides), y compris les contenants réutilisables.
Pendant l'analyse, il est possible de procéder à la décontamination par immersion dans une dilution fraîchement préparée
de solution désinfectante, pour le matériel de petite taille résistant à la corrosion (par exemple les pipettes).
Utiliser les pipettes Pasteur une seule fois. Des détails supplémentaires sont indiqués dans l'ISO 7712[51].
La plupart des désinfectants (voir Annexe A) sont toxiques. Porter des gants et des lunettes de sécurité lors
de la manipulation de désinfectant concentré.
L'autoclavage avant incinération doit être réalisé pour les matériaux contaminés par des micro-organismes
appartenant à la catégorie de risque 3 et pour leurs contenants.
6.7 Gestion des déchets
L'élimination correcte des matériaux contaminés n'a pas d'incidence directe sur la qualité des essais des
échantillons, à moins qu'elle ne donne lieu à un risque de contamination croisée, mais elle fait partie d'une
bonne pratique du laboratoire.

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Il est recommandé que l'élimination soit conforme aux réglementations nationales relatives à l'environnement, à la santé
ou à la sécurité.
Il est recommandé d'établir un système d'identification et de séparation des matériaux contaminés et de leurs contenants
pour
⎯ les déchets non contaminés (par exemple les échantillons de produits alimentaires non cultivés) pouvant être
éliminés avec les déchets généraux;
⎯ les instruments piquants ou tranchants, scalpels, aiguilles, lames, verres brisés;
⎯ le matériel contaminé recyclable destiné à l'autoclavage et au recyclage;
⎯ le matériel contaminé destiné à l'autoclavage et à l'élimination, ou à l'élimination uniquement une fois incinéré
(cependant voir ci-dessous les exigences spéciales pour les micro-organismes appartenant à la catégorie de risque 3).
6.8 Lavage
Ne laver le matériel réutilisable qu'après sa décontamination. Après lavage, rincer tout le matériel à l'eau
déionisée.
Pour faciliter les opérations de nettoyage, des matériels spécialisés peuvent être utilisés (par exemple laveurs de pipettes,
lave-vaisselle, cuves à ultrasons).
Après lavage, rinser tout le matériel à l’eau déionisée et s’assurer que les résidus n’affectent pas la
revivification des micro-organismes. Des rinçages ou des contrôles supplémentaires peuvent être requis afin
d’établir que le matériel est adéquatement exempt de résidus.
Page 32, Article 7
Supprimer «à l'ISO/TS 11133-1 et à l'ISO/TS 11133-2», ajouter «à l'ISO 11133».
Page 33, 8.2, alinéa 7
Supprimer «et l'ISO 8261».
Page 34, 8.4, alinéa 2, troisième tiret
Supprimer «l'ISO 6887-4 ou l'ISO 8261», ajouter «l'ISO 6887-5».
Page 34, 8.5.1
Supprimer «ou l'ISO 8261».
Page 36, 9.2.1
Supprimer «ou l'ISO 8261».

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Page 36, 9.2.2.2, alinéa 2; page 57, 14.2
Supprimer «à l'ISO 16140», ajouter «à l'ISO 16140-2»
Pages 36 à 52, Article 10
Supprimer le texte existant et ajouter le texte suivant. Le texte souligné a été modifié.
10 Dénombrement
10.1 Généralités
Lors du contrôle de la qualité microbiologique et/ou de la sécurité microbiologique des aliments pour la
consommation humaine et des aliments pour animaux, il n'est pas suffisant de connaître quels sont les micro-
organismes présents. Dans la plupart des cas, la quantité dans laquelle ils sont présents est également un
facteur important, d'où la nécessité de les dénombrer. Pour ce faire, il existe plusieurs manières de procéder: par
exemple par examen direct (microscopie), en ensemençant des milieux solides ou liquides, par cytométrie en flux, par
PCR en temps réel, etc. La présente Norme internationale ne traite cependant que du dénombrement sur milieux
solides et liquides.
Le dénombrement sur milieux solides se base sur la capacité qu'ont de nombreux micro-organismes à
produire des colonies dans ou sur des milieux gélosés pouvant être détectées à l'œil nu ou à l'aide d'une
simple loupe.
Si la matrice contient un niveau élevé de particules interférentes, il convient tout d'abord de séparer ces dernières par
sédimentation ou à l'aide de sacs-filtres.
Si l'on s'attend à ce que le niveau de bactéries soit très faible (moins de 10 colonies dans ou sur une boîte à la dilution la
plus faible), il est recommandé de procéder au dénombrement à l'aide de milieux liquides (par exemple NPP) pour
améliorer la fiabilité statistique des résultats (voir les Annexes B et C). La concentration par filtration, immunoséparation
ou centrifugation peut être également utilisée.
10.2 Dénombrement sur milieu solide
Il est recommandé d'étiqueter les boîtes de Petri avec le numéro d'échantillon, la dilution, la date et toute autre
information utile.
Il est recommandé de sélectionner les dilutions pour garantir que les boîtes contenant le nombre approprié de colonies
sont obtenues (voir 10.3.1) et pour remédier aux éventuelles propriétés inhibitrices.
Pour le transfert de chaque dilution, utiliser une pipette stérile différente, à moins de procéder par ordre
décroissant.
NOTE Le présent paragraphe concerne le cas général des dilutions à 10−1, mais d'autres formes de dilutions sont autorisées (par
exemple dilutions 1 5 ou 1 2).
10.2.2 Nombre de boîtes de Petri par dilution
Pour les méthodes de dénombrement en microbiologie des aliments, une boîte par dilution doit être utilisée si
au moins deux dilutions successives sont utilisées. Deux boîtes par dilution peuvent également être utilisées pour
améliorer la fiabilité.

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Si une seule dilution est utilisée, alors deux boîtes pour cette dilution doivent être utilisées conformément à
l'Annexe D pour améliorer la fiabilité des résultats.
Pour les laboratoires qui ne fonctionnent pas selon les principes d'assurance de la qualité, deux boîtes par
dilution doivent être utilisées conformément à l'Annexe D pour améliorer la fiabilité des résultats.
10.2.3 Techniques de dénombrement en profondeur
Prélever les volumes définis de la dilution à examiner, en touchant l'embout de la pipette avec la paroi du tube
afin d'ôter les surplus de liquide adhérant à l'extérieur de cet embout. Soulever suffisamment le couvercle de
la boîte de Petri stérile pour y insérer la pipette, puis délivrer le contenu.
Après avoir ôté du bain d'eau thermostaté le milieu gélosé refroidi, sécher le flacon avec un chiffon propre afin
d'éviter que l'eau ne contamine les boîtes. En versant, éviter de répandre le milieu à l'extérieur du récipient ou
dans le couvercle de la boîte. Pour éviter la contamination des milieux, tenir le flacon en position quasi
horizontale. Éviter également de poser le flacon entre les étapes du coulage.
Verser le milieu gélosé fondu à une température comprise entre 44 °C et 47 °C dans chaque boîte de
Petri (généralement, de 18 ml à 20 ml de gélose dans des boîtes de Petri de 90 mm, et de 45 ml à 50 ml dans des boîtes
de Petri de 140 mm, afin d'obtenir au moins 3 mm d'épaisseur) dans les 15 min de l'ensemencement (pour éviter
l'agrégation des colonies). Éviter de verser le milieu directement sur l'inoculum. Mélanger immédiatement et
soigneusement le milieu en surfusion et l'inoculum, de façon à obtenir une répartition homogène des micro-
organismes dans le milieu, par exemple en déplaçant doucement la boîte d'avant en arrière, d'un côté à
l'autre et dans un sens circulaire. Laisser refroidir et se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface
fraîche et horizontale (le temps de solidification de la gélose ne doit pas dépasser 10 min).
Lorsque, dans le produit à examiner, la présence de micro-organismes donnant des colonies envahissantes
est suspectée (par exemple Proteus spp.), couler sur les boîtes solidifiées une seconde couche de gélose non
nutritive ou identique à celle du milieu de culture utilisé dans l'essai (généralement 5 ml de gélose dans des boîtes
de Petri de 90 mm), afin de limiter voire d'inhiber l'envahissement par ces micro-organismes.
10.2.4 Ensemencement en surface
10.2.4.1 Généralités
Les méthodes d'ensemencement conçues pour produire uniquement des colonies en surface dans les boîtes
gélosées présentent certains avantages par rapport à la méthode dans la masse. La morphologie des
colonies en surface est facile à observer, ce qui augmente la capacité de l'analyste à distinguer les différents
types de colonies.
Les micro-organismes n'étant pas exposés à la chaleur du milieu gélosé en surfusion, il est donc possible d'obtenir des
résultats de dénombrement plus importants.
Utiliser des boîtes précoulées, contenant un milieu gélosé d'au moins 3 mm d'épaisseur, de niveau constant,
ne contenant aucune bulle d'air ni humidité en surface.
Afin de favoriser une répartition uniforme, il est recommandé de sécher la surface de la gélose solidifiée conformément à
l'ISO 11133 ou comme spécifié dans la Norme internationale applicable pour que l'inoculum soit absorbé en 15 min.
10.2.4.2 Étalement/méthode à l'étaleur
À l'aide d'une pipette stérile, transférer l'inoculum (habituellement 0,1 ml ou 0,5 ml) de l'échantillon liquide
pour essai, ou de la suspension mère s'il s'agit d'autres échantillons, dans la boîte gélosée (respectivement
d'un diamètre de 90 mm ou de 140 mm). Répéter cette étape pour la dilution décimale suivante (les colonies
à dénombrer seront alors présentes à l'étape 10−1 s'il s'agit d'un échantillon liquide et 10−2 s'il s'agit d'un autre
échantillon) puis, le cas échéant, répéter l'opération pour des dilutions décimales supplémentaires.
La limite de dénombrement peut être diminuée d'un facteur de 10 en ensemençant 1,0 ml de l'échantillon pour
essai s'il s'agit de liquide, ou 1,0 ml de la suspension mère pour les autres produits, sur la surface d'une

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grande boîte de gélose (140 mm) ou sur la surface de trois petites boîtes de gélose (90 mm). Dans chaque
cas, si une seule dilution est utilisée, doubler les boîtes pour cette dilution en utilisant deux grandes boîtes ou
six petites boîtes.
À l'aide d'un étaleur en verre, en plastique ou en acier (composé, par exemple, d'une tige en verre en forme
de crosse de hockey, d'un diamètre d'environ 3,5 mm et longue d'environ 20 cm, coudée à environ 3 cm de
l'extrémité et aplatie aux extrémités par chauffage), répartir uniformément l'inoculum aussi rapidement que
possible sur la surface gélosée, sans toucher les parois de la boîte de Petri. Laisser sécher les boîtes, avec
les couvercles en place, pendant environ 15 min à température ambiante.
Dans certains cas (indiqués dans la Norme internationale applicable), l'inoculum peut être déposé sur une membrane
avant d'être réparti comme décrit précédemment.
10.2.4.3 Méthodes spirales
10.2.4.3.1 Généralités
La méthode spirale pour la détermination du niveau de micro-organismes a été soumise à des essais interlaboratoires sur
du lait, des produits laitiers et d'autres produits alimentaires.
Le matériel utilisé — l'ensemenceur spiral — est décrit en 5.24.
10.2.4.3.2 Préparation de la boîte gélosée
Pour la préparation des boîtes gélosées, il est recommandé d'utiliser un répartiteur automatique avec un système de
distribution stérile afin de garantir que les boîtes ont une épaisseur régulière, ne contiennent aucune bulle d'air et sont
stériles.
Verser la même quantité de gélose dans toutes les boîtes, de sorte que la même hauteur de gélose soit
présentée à la pointe du stylet de l'ensemenceur spiral, afin de maintenir l'angle de contact.
Sécher les boîtes (voir l’ISO 11133) avant utilisation et s'assurer qu'aucune gouttelette d'eau n'est visible à la
surface du milieu.
10.2.4.3.3 Mode opératoire d'ensemencement et comptage
Décontaminer la pointe du stylet et le tuyau flexible en faisant passer une solution d'hypochlorite de sodium
(voir 5.24.4) puis de l'eau stérile dans le système avant de faire passer l'échantillon liquide dans le stylet.
Sinon, remplacer la micro-seringue à usage unique dans l'appareil qui en utilise.
Placer une boîte de Petri précoulée sur le plateau tournant et abaisser le stylet. L'échantillon est déposé de
façon différentielle lorsque la pointe du stylet parcourt la surface de la boîte gélosée en rotation. Ôter la boîte
ensemencée et déplacer le stylet à sa position de départ. Décontaminer le stylet ou remplacer la micro-
seringue et le/la remplir pour l'ensemencement d'une autre boîte.
Laisser sécher les boîtes, avec les couvercles en place, pendant environ 15 min à température ambiante, puis
incuber (voir 10.2.5).
Après incubation, centrer la grille de comptage de l'ensemenceur spiral. Utiliser la règle de comptage de 20
pour déterminer le nombre de colonies. Choisir un secteur et commencer le comptage des colonies depuis le
bord extérieur du premier segment vers le centre, jusqu'à ce que 20 colonies aient été comptées. Continuer
par le comptage des colonies restantes dans le segment qui contient la vingtième colonie. Compter une zone
correspondante du côté opposé de la boîte et diviser le nombre de colonies comptées des deux côtés par le
volume d'échantillon déposé dans ces deux zones. Les volumes d'échantillon associés à chaque portion de la
grille de comptage sont indiqués dans le manuel d'utilisation fourni avec chaque ensemenceur spiral.

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10.2.5 Incubation
Sauf spécification contraire dans les normes spécifiques, retourner les boîtes après leur ensemencement et
les placer rapidement dans l'étuve réglée à la température appropriée. Si une déshydratation excessive se
produit (par exemple à 55 °C ou dans le cas d'une forte circulation d'air), envelopper les boîtes, sans les
serrer, dans des sacs en matière plastique, avant l'incubation, ou utiliser tout système similaire d'efficacité
équivalente.
Pendant la période d'incubation, de légères variations de température sont inévitables et tolérées, par exemple au moment
de charger ou de décharger l'étuve, mais il est important que ces périodes soient réduites le plus possible. Il est
recommandé de contrôler la durée de ces variations pour s'assurer qu'elles n'ont pas d'effet significatif sur le résultat.
Il peut être utile parfois, pour le fonctionnement du laboratoire, de réfrigérer les boîtes ensemencées avant
l'incubation pendant une durée maximale de 24 h. Dans ce cas, le laboratoire doit s'assurer que cette pratique
est sans incidence sur le nombre de colonies obtenues.
Généralement, il est recommandé que les piles ne dépassent pas six boîtes de Petri pour l'incubation en aérobiose et
qu'elles soient séparées l'une de l'autre et des parois de l'incubateur par une distance d'au moins 25 mm. Toutefois, des
piles plus hautes et moins espacées peuvent être tolérées pour les étuves équipées de systèmes de circulation de l'air; dans
ce cas, il est recommandé de s'assurer de l'homogénéité de la répartition de la température.
Après incubation, il est normalement recommandé d'examiner les boîtes immédiatement. Elles peuvent cependant être
conservées, sauf spécification contraire dans les normes spécifiques, jusqu'à 48 h au réfrigérateur. La conservation en
réfrigérateur peut être tolérée uniquement s'il a été démontré que cela n'a aucune incidence sur le dénombrement,
l'apparence ou la confirmation ultérieure des colonies. Pour certains milieux contenant des indicateurs colorés, il est
recommandé de laisser les boîtes réfrigérées s'équilibrer à température ambiante avant leur examen, pour s'assurer de la
récupération correcte de la couleur.
10.3 Calcul et expression des résultats sur milieu solide
10.3.1 Comptage des colonies
Après la période d'incubation mentionnée dans la norme spécifique, procéder au comptage des colonies
(colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies caractéristiques présumées) pour chaque boîte
contenant jusqu'à et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique).
Dans le cas du comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées, la description des
colonies doit être celle indiquée dans la norme spécifique.
Dans certains cas, les colonies peuvent être difficiles à compter (par exemple en présence de micro-
organismes envahissants). Considérer les colonies envahissantes comme des colonies uniques. Si moins
d'un quart de la boîte est envahi, compter les colonies sur la partie non affectée de la boîte et calculer par
extrapolation le nombre théorique de colonies correspondant à la boîte entière. Si plus d'un quart de la boîte
est envahi, ne pas procéder au comptage. Considérer une chaîne de colonies comme une unité formant
colonie.
NOTE Il peut être utile, dans certains cas, de prévoir des boîtes ensemencées supplémentaires, qui sont conservées
à (3 ± 2) °C pour les comparer, lors du comptage, avec les boîtes ensemencées incubées, afin de ne pas confondre les
particules du produit examiné avec les colonies. Pour pouvoir faire la différence entre les particules du produit et les
colonies, une loupe binoculaire peut également être utilisée.
Différents modes de calcul définis en 10.3.2, à l'Annexe B et à l'Annexe D tiennent compte des cas
particuliers et fournissent des informations sur les intervalles de confiance.
Les différents modes de calcul doivent tenir compte des boîtes ne contenant aucune colonie, lorsque celles-ci
ont été retenues, car elles sont significatives lors du calcul d’une moyenne pondérée.
Dans le cas de l'utilisation d'un ensemenceur spiral, le comptage des colonies est décrit en 10.2.4.3.3.

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10.3.2 Expression des résultats
10.3.2.1.1 Dans le présent paragraphe, les cas traités correspondent aux cas généraux:
⎯ ensemencement d'une boîte de Petri d'un diamètre de 90 mm par dilution et au moins deux dilutions
successives sont réalisées;
⎯ nombre maximal dénombrable pour la totalité des colonies présentes: 300 par boîte;
⎯ nombre maximal de l'ensemble des colonies (caractéristiques et non caractéristiques) présentes dans
une boîte dans le cas de comptage de colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: de
préférence 300 par boîte;
⎯ nombre maximal dénombrable pour les colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: 150 par
boîte;
⎯ nombre de colonies caractéristiques présumées ensemencées pour identification ou confirmation (voir

10.3.2.3) à partir de chaque boîte retenue: en général 5.
Ces nombres sont définis dans les normes spécifiques. Pour les micro-organismes produisant de grandes
colonies, le nombre maximal de colonies dans une boîte est spécifié dans la norme spécifique.
En cas d'utilisation de boîtes d'un diamètre autre que 90 mm, le nombre maximal de colonies doit être
augmenté ou diminué proportionnellement à la surface des boîtes (ou des membranes).
EXEMPLE
⎯ Pour les boîtes ensemencées dans la masse de 55 mm de diamètre, le nombre maximal de colonies dénombrables
doit être 110 (équivalent à un nombre total de 300 ufc sur une boîte de Petri de 90 mm).
⎯ Pour les boîtes de 140 mm de diamètre, le nombre maximal de colonies dénombrables doit être de 730 (équivalent à
un nombre total de 300 ufc sur une boîte de Petri de 90 mm).
10.3.2.1.2 Les modes de calcul définis ci-après prennent en compte les cas apparaissant le plus
fréquemment lorsque les essais sont réalisés conformément à la bonne pratique de laboratoire. De rares cas
particuliers peuvent apparaître (par exemple un rapport très différent de celui du facteur de dilution entre les
boîtes de deux dilutions successives); il est alors nécessaire que les résultats de comptage obtenus soient
examinés, interprétés ou éventuellement rejetés par un microbiologiste qualifié.
10.3.2.2 Mode de calcul: cas général (comptage des colonies en totalité ou des colonies
caractéristiques)
Pour qu'un résultat soit valable, on estime en général qu'il est nécessaire de compter les colonies sur au
moins une boîte contenant au moins 10 colonies [colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies
répondant aux critères d'identification (voir 10.3.2.3)].
Calculer le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai, en tant que moyenne
pondérée à partir de deux dilutions successives, à l'aide de la Formule (1):
N=
∑C (1)
V × 1,1× d
où
ΣC est la somme des colonies comptées sur les 2 boîtes retenues de deux dilutions successives et
dont au moins une contient au moins 10 colonies;
V est le volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en millilitres;

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d est la dilution correspondant à la première dilution retenue [d = 1 pour un produit liquide non dilué
(échantillon pour essai)].
Si plus d'une dilution est utilisée, on s'attend à ce que le rapport entre le comptage des colonies de la dilution d2 et le
comptage des colonies de la dilution d1 soit égal à 10 %. Il convient que les limites supérieure et inférieure soient
spécifiées par le laboratoire pour le comptage des colonies de la dilution d2. Ces limites peuvent être celles proposées
dans l'ISO 14461-2[42], par exemple. Lorsque ces limites ne sont pas suivies, il convient d'interpréter les résultats avec
précaution.
EXEMPLE Si le comptage des colonies de la dilution d1 est de 250, il convient que le comptage des colonies de la
dilution d2 ne soit pas inférieur à 13 (5,2 %) et pas supérieur à 39 (15,6 %). Voir l'ISO 14461-2[42].
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour cela, si le troisième chiffre est inférieur à 5, ne pas
modifier le chiffre précédent; si le troisième chiffre est supérieur ou égal à 5, augmenter le chiffre précédent
d'une unité.
Exprimer le résultat comme, de préférence, un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
appropriée de 10, ou un nombre entier avec deux chiffres significatifs.
Exprimer le résultat comme le nombre N de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits).
EXEMPLE Un comptage a donné les résultats suivants:

−2
⎯ à la première dilution retenue (10 ): 168 colonies;
−3
⎯ à la deuxième dilution retenue (10 ): 14 colonies.
N=
∑C =
168 + 14
=
182
= 16 545
V × 1,1× d −2 0,011
1× 1,1× 10
4
En arrondissant le résultat tel que spécifié ci-dessus, le nombre de micro-organismes est de 17 000 ou 1,7 × 10 par
millilitre ou par gramme de produit.
10.3.2.3 Mode de calcul: cas après identification (/confirmation)
Lorsque la méthode utilisée nécessite une identification (/confirmation), un nombre déterminé A (en général 5)
de colonies caractéristiques présumées est identifié (/confirmé) à partir de chacune des boîtes retenues pour
le comptage des colonies. Après identification (/confirmation), calculer, pour chacune des boîtes, le nombre a
de colonies répondant aux critères d'identification (/confirmation), à l'aide de Formule (2):
b
a= ×C (2)
A
où
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification (/ de confirmation) parmi les A
colonies identifiées;
C est le nombre total de colonies caractéristiques présumées comptées sur la boîte.
Arrondir les résultats calculés au nombre entier le plus proche. Pour cela, si le premier chiffre après la virgule
est inférieur à 5, le chiffre précédent n'est pas modifié; si le premier chiffre après la virgule est supérieur ou
égal à 5, le chiffre précédent est augmenté d'une unité.
Calculer le nombre N, NE ou N ′ de micro-organismes identifiés ou confirmés présents dans l'échantillon pour

essai, en remplaçant ΣC par Σa dans la formule indiquée en 10.3.2.2 ou en remplaçant C par a dans les
formules indiquées en 10.3.2.4.1 et 10.3.2.5.3. Arrondir les résultats comme spécifié en 10.3.2.2.
Exprimer le résultat tel que spécifié respectivement en 10.3.2.2, 10.3.2.4.1 et 10.3.2.5.3.

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à la première dilution retenue (10− ): 66 colonies;

3
⎯
à la deuxième dilution retenue (10− ): 4 colonies.

4
⎯
Des colonies sélectionnées ont été soumises aux essais d’identification (/ de confirmation):
⎯ des 66 colonies, 8 colonies ont été soumises à essai, dont 6 ont répondu aux critères; d'où a = 50;
⎯ des 4 colonies, les 4 ont toutes répondu aux critères; d'où a = 4.
N=
∑a =
50 + 4
=
54
= 49 090
V × 1,1× d 1× 1,1× 10 −3 1,1× 10 −3
4
En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre de micro-organismes est de 49 000 ou 4,9 × 10 par
10.3.2.4 Mode de calcul: estimation des petits nombres
10.3.2.4.1 Cas d'une boîte (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution)
contenant moins de 10 colonies
Les comptages compris entre 10 et la limite supérieure de chaque méthode correspondent à l'étendue de
fidélité optimale. La fidélité diminue rapidement lorsque le nombre de colonies diminue au-dessous de 10.
Toutefois, selon la finalité de l'essai, une limite inférieure de détermination peut être définie comme
ci-dessous pour un nombre inférieur à 10.
Conformément à l'ISO/TR 13843[40], la définition de la limite de détermination est: «concentration de

particules moyenne la plus faible x par prise analytique, lorsque l'incertitude type relative prévue est égale à
une valeur spécifiée (RSD)». Le terme «coefficient de variation» est maintenant préféré à RSD. Le coefficient
de variation, CV, est calculé en divisant l'estimation de l'écart-type s d’une population, obtenue à partir d'un
échantillon de cette population, par la moyenne x de cet échantillon. Par conséquent, CV = s / x .
Dans le cas d'une distribution de Poisson, x est calculé à l’aide de la Formule (3):
1
x= (3)
CV2
Si un CV de 50 % est défini comme étant la limite acceptable de fidélité relative (ce qui paraît être raisonnable
en microbiologie), la limite inférieure de détermination sera le nombre de colonies donné par:
1
x= =4
0,50 2
Ainsi, il est recommandé de traiter les résultats fondés sur les comptages inférieurs à quatre comme une simple détection
de la présence de micro-organismes.
En résumé:
Si la boîte contient moins de 10 colonies, mais au moins 4, calculer le résultat à l'aide de la formule:
C
NE =
V ×d
et l'exprimer comme le nombre estimé NE de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits).
NOTE L'expression «nombre estimé» signifie une estimation moins précise de la valeur vraie.

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Si le total est compris entre 3 et 1, la fidélité des résultats est si faible que l'on doit exprimer le résultat comme
suit:
«Le micro-organisme est présent, mais avec moins de 4/Vd par gramme ou par ml».
10.3.2.4.2 Cas d'une boîte (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution) ne
contenant aucune colonie
Si la boîte contenant l'échantillon pour essai (produits liquides), ou la suspension mère (autres produits) ou la
première dilution ensemencée ou retenue, ne contient aucune colonie, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/Vd micro-organismes par millilitre» (produits liquides) ou
«moins de 1/Vd micro-organismes par gramme» (autres produits)
où
d est le taux de dilution de la suspension mère ou de la première dilution ensemencée ou retenue

0
[d = 10 = 1 pour un produit liquide non dilué (échantillon pour essai)];
V est le volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en millilitres.
10.3.2.4.3 Cas particuliers
10.3.2.4.3.1 Généralités
Ces cas concernent le comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées à confirmer.
10.3.2.4.3.2 Cas 1
Si le nombre de colonies caractéristiques ou non caractéristiques dans la boîte contenant une première
dilution d1 est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), avec des colonies
caractéristiques visibles ou des colonies identifiées/confirmées et si la boîte contenant la dilution suivante d2
contient moins de 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), et aucune colonie
caractéristique ou identifiée/confirmée n'est visible, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/V2d2 et plus de 1/V1d1 micro-organismes par millilitre» (produits liquides) ou
«moins de 1/V2d2 et plus de 1/V1d1 micro-organismes par gramme» (autres produits)
où
d1 et d2 sont les taux de dilution correspondant aux dilutions d1 et d2;
V1 est le volume de l'inoculum utilisé dans la boîte de la première dilution d1, en millilitres;
V2 est le volume de l'inoculum utilisé dans la boîte de la dilution ultérieure d2, en millilitres.
à la première dilution retenue (10− ): plus de 300 colonies sur la boîte, avec des colonies caractéristiques ou
2
⎯
identifiées/confirmées présentes;
à la deuxième dilution retenue (10− ): 33 colonies, sans colonie caractéristique ou identifiée/confirmée présente.
3
⎯
Le résultat, exprimé en micro-organismes, est moins de 1 000 et plus de 100 par millilitre ou par gramme de produit.

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10.3.2.4.3.3 Cas 2
dilution d1 est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), ne comprenant
aucune colonie caractéristique visible ou identifiée/confirmée et si la boîte contenant la dilution suivante d2
contient jusqu'à et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), et aucune
colonie caractéristique ou identifiée/confirmée n'est visible, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/V2d2 micro-organismes par millilitre» (produits liquides); ou
«moins de 1/V2d2 micro-organismes par gramme» (autres produits)
où
d2 est le taux de dilution correspondant à la dilution d2;
V2 est le volume de l'inoculum utilisé dans la boîte de la dilution ultérieure d2, en millilitres;
à la première dilution retenue (10− ): plus de 300 colonies sur la boîte, sans colonie caractéristique ou
2
⎯
à la deuxième dilution retenue (10− ): 33 colonies, sans colonie caractéristique ou identifiée/confirmée présente;
3
⎯
Le résultat, exprimé en micro-organismes, est inférieur à 1 000 par millilitre ou par gramme de produit.
10.3.2.5 Mode de calcul: cas particuliers
NOTE 1 Certains exemples ne sont pas conformes aux règles indiquées en 10.3.2.2 qui spécifiaient les limites
supérieure et inférieure du comptage des colonies de la dilution d2 par rapport aux résultats de la dilution d1. S'il n'est pas
possible ou approprié de répéter l'analyse, les résultats peuvent être calculés et exprimés comme indiqué en 10.3.2.2,
mais la fidélité est inférieure à celle de la situation normale et il convient que cela soit indiqué dans le rapport d'essai.
NOTE 2 Toutes les explications et tous les exemples concernent le cas où une boîte de Petri par dilution est utilisée.
Pour le cas où deux boîtes par dilution sont utilisées, voir l'Annexe D.
NOTE 3 Les limites inférieures du comptage des colonies de la dilution d2 proposées dans les exemples sont tirés de
l'ISO 14461-2[42].
NOTE 4 Il convient d'adapter les chiffres de l'intervalle de confiance au nombre maximal spécifié pour le comptage des
colonies.
10.3.2.5.1 Si le nombre de colonies comptées (colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies

caractéristiques présumées) est supérieur au nombre maximal comptable (300 ou tout autre nombre indiqué
dans la norme spécifique) pour la boîte contenant la première dilution d1, avec un nombre de colonies
(colonies en totalité, colonies caractéristiques ou répondant à des critères d'identification) inférieur à 10 (limite
de l'estimation des petits nombres) pour la boîte contenant la dilution suivante d2, exprimer les résultats
comme suit:
NOTE Les éléments figurant dans ce paragraphe sont donnés à titre d'exemple.
a) Si le nombre de colonies pour la boîte contenant la dilution d1 est compris dans l'intervalle [nombre
maximal comptable + 1, limite supérieure de l'intervalle de confiance du nombre maximal comptable] (par
exemple 301-334) (Annexe B) et que le comptage des colonies de la dilution d2 est au moins égal à la
limite inférieure spécifiée en 10.3.2.2, utiliser la méthode de calcul pour les cas généraux (voir 10.3.2.2).

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EXEMPLE 1 Un comptage (dans le cas d'un nombre maximal fixé à 300 pour le comptage des colonies) a donné les
résultats suivants:
à la première dilution retenue (10− ): 310 colonies (comptage inférieur à 334, limite supérieure de l'intervalle de
2
⎯
confiance pour 300);
à la deuxième dilution retenue (10− ): 8 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies à la dilution (10− )
3 3
⎯
est de 18 colonies, obtenue à partir des 310 colonies de la dilution (10− ).
2
Le résultat de ce comptage de colonies n'est pas acceptable.
à la première dilution retenue (10− ): 160 colonies (comptage inférieur à 174, limite supérieure de l'intervalle de
2
⎯
confiance pour 150);
3 3
⎯
est de 7 colonies, obtenue à partir des 160 colonies de la dilution 10− .
2
Utiliser le mode de calcul pour les cas généraux (10.3.2.2) à partir des boîtes contenant les deux dilutions retenues.
b) Si le nombre de colonies pour la boîte de la dilution d1 est supérieur à la limite supérieure de l'intervalle
de confiance du nombre maximal comptable (par exemple 334) et que le comptage des colonies de la
dilution d2 est au moins égal à la limite inférieure spécifiée en 10.3.2.2 et calculée à partir de la limite
supérieure de l'intervalle de confiance du nombre maximal comptable, ne retenir que le résultat du
comptage de la dilution d2 puis calculer un nombre estimé (voir 10.3.2.4.1).
EXEMPLE 1 Un comptage (dans le cas d’un nombre maximal fixé à 300 pour le comptage des colonies) a donné les
à la première dilution retenue (10− ): plus de 334 colonies dans la boîte;

2
⎯
3 3
⎯
2

2
⎯
3 3
⎯
2
Établir un nombre estimé sur la base des colonies comptées dans la boîte de la dilution 10− (voir 10.3.2.4.1).
3

2
⎯
3 3
⎯
2
Le résultat de ce comptage n'est pas acceptable.

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10.3.2.5.2 Lorsque le comptage des colonies (colonies en totalité, caractéristiques ou caractéristiques

présumées) de chacune des boîtes pour toutes les dilutions ensemencées donne un nombre supérieur à 300
(ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), reporter le résultat comme suit:
«plus de 300/Vd» (cas de colonies en totalité ou caractéristiques); ou
«plus de (300/Vd) × (b/A)» (cas de colonies confirmées), exprimé en micro-organismes par millilitre
(produits liquides) ou en micro-organismes par gramme (autres produits)
où
d est la dilution correspondant à la dernière dilution ensemencée;
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification parmi les A colonies ensemencées.
10.3.2.5.3 Lorsque seule la boîte de la dernière dilution ensemencée peut être comptée et contient plus
de 10 et moins de 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique) colonies (colonies en totalité,
caractéristiques ou caractéristiques présumées), calculer le nombre N′ de micro-organismes présents en
utilisant la Formule (4):
c
N' = (4)
Vd
où
c est le nombre de colonies comptées dans la boîte;
d est la dilution correspondant à la dilution retenue.
Arrondir les résultats comme spécifié en 10.3.2.2.
Exprimer le résultat comme le nombre N' de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits).
à la dernière dilution ensemencée (10− ): 120 colonies.

4
⎯
120
Par conséquent N ' = = 1 200 000
1× 10 −4
6
En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre N’ de micro-organismes est de 1 200 000 ou 1,2 × 10
par millilitre ou par gramme de produit.
10.3.2.6 Mesure de l'incertitude
Voir l'ISO/TS 19036 relatif aux méthodes quantitatives.

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10.4 Dénombrement des levures et moisissures
Il est recommandé généralement de toujours dénombrer les levures et moisissures soit par la technique dans la masse, qui
permet un dénombrement plus aisé, soit par la technique d'ensemencement en surface, avec laquelle les cellules sont
soumises à une exposition optimale à l'oxygène atmosphérique et qui évite le stress thermique de la gélose en surfusion.
Il est recommandé de sécher les boîtes gélosées précoulées avant de les ensemencer (voir l'ISO 11133).
Certaines levures et moisissures peuvent être pathogènes ou peuvent provoquer des réactions allergiques, parfois même
chez des personnes en bonne santé. C'est pourquoi, il est important d'être raisonnablement prudent en travaillant avec les
champignons. Idéalement, il est recommandé de conserver les boîtes dans une étuve, et non dans une pièce ouverte. Il est
recommandé d'ouvrir les boîtes le moins possible, normalement uniquement dans un objectif critique tel que la
préparation d'une lame pour un examen au microscope. Il est recommandé de refroidir les aiguilles traitées à la flamme
avant d'effectuer des repiquages, afin d'éviter la dispersion de conidies et d'autres cellules. Il est recommandé de
désinfecter les plans de travail et les étuves régulièrement.
Étant donné que tout mouvement peut entraîner un relargage de conidies ou de spores de moisissures pouvant provoquer
le développement de colonies satellites susceptibles de fausser les résultats en donnant une surestimation de la population,
il est recommandé d'incuber les boîtes de Petri en position non retournées et stables, jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour
le comptage.
10.4.2 Comptage des colonies pour les levures et moisissures
Les boîtes contenant de 10 à 150 colonies sont généralement comptées. Si la mycoflore est essentiellement
composée de moisissures, sélectionner des boîtes parmi celles contenant la population la plus faible; si elle
est essentiellement composée de levures, il est possible de sélectionner des boîtes atteignant la limite
supérieure pour le comptage.
S'il existe un doute sur l'identité des colonies, examiner les états frais ou les colorations des cellules d'au
moins 5 colonies par échantillon afin de confirmer l'absence de bactéries.
10.5 Dénombrement en milieu liquide
10.5.1 Principe
Les prises d'essai sont ensemencées dans un milieu liquide, conçu pour favoriser la croissance d'un micro-
organisme ou d'un groupe particulier de micro-organismes, et, le plus souvent, pour inhiber la prolifération
d'autres types de micro-organismes.
Pour déterminer s'il y a eu croissance des micro-organismes recherchés, il existe différents critères, tels que
l'apparition de turbidité, la production de gaz, les changements de couleur, et l'isolement des micro-
organismes sur un milieu de culture gélosé sélectif avec une atmosphère et une température d'incubation
déterminées. La composition des milieux de culture et les critères permettant de distinguer un résultat positif
d'un résultat négatif sont définis dans les normes afférentes.
En utilisant cette approche, seule une valeur qualitative peut être attribuée à chaque prise d'essai, c'est-à-dire
un résultat positif ou négatif. Pour obtenir une estimation de la quantité de micro-organismes présente, il est
nécessaire d'examiner les diverses prises d'essai, la suspension mère et les différentes dilutions et d'utiliser
des procédures statistiques pour déterminer le nombre le plus probable (NPP).
Si le NPP est utilisé pour l'analyse des échantillons solides (y compris les poudres), une seule prise d'essai
doit être prélevée pour préparer la suspension mère. À partir de cette suspension mère, il est recommandé d'utiliser
des aliquotes pour les examens.

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10.5.2 Ensemencement
Si un milieu de culture sélectif est utilisé, il est recommandé que l'ajout de la prise d'essai ne réduise pas ses propriétés
sélectives (ce qui permettrait la croissance de micro-organismes autres que les micro-organismes recherchés). Dans la
plupart des normes, la compatibilité d'une matrice spécifique avec le milieu liquide est décrite dans le domaine
d'application. Il est recommandé cependant de prendre des précautions pour certaines matrices telles que les épices, le
cacao, le bouillon, etc., car elles contiennent des substances inhibant la croissance, nécessitant l'ajout de composés
neutralisants, l'application de taux de dilution plus importants, une centrifugation, une filtration ou une séparation
immunomagnétique pour séparer les micro-organismes cibles de la matrice, même si ce n'est pas toujours spécifié dans
les normes correspondantes. L'incompatibilité peut également être due à la composition biologique de la matrice: les
échantillons environnementaux fortement contaminés, les produits fermentés ou les produits contenant des bactéries
probiotiques représentent manifestement un défi plus important pour la microbiologie analytique que pour les
échantillons qui ne contiennent qu'un petit nombre de micro-organismes. Pour ces matrices qui posent problème, il est
recommandé d'effectuer des expériences de contamination artificielle avec des micro-organismes représentatifs, pour
valider que la méthode est bien compatible avec la matrice.
10.5.2.2 Mode opératoire
Sauf indication contraire dans les normes correspondantes, des volumes de prise d'essai inférieurs ou égaux
à 1 ml sont normalement ajoutés à cinq à dix fois le volume du milieu à concentration simple. Les prises
d'essai comprises entre 1 ml et 100 ml sont normalement ajoutées à un volume égal de milieu double
concentration.
Pour les volumes supérieurs à 100 ml, un milieu plus concentré peut être utilisé. Pour des besoins spécifiques, les milieux
déshydratés stériles peuvent être dissous dans l'échantillon froid (ou préchauffé à 30 °C) pour l'analyse.
Sauf spécification contraire, il est recommandé que le laps de temps entre la préparation de la suspension mère d'un
échantillon et l'ensemencement du dernier tube, des microplaques ou du flacon, soit inférieur à 30 min.
10.5.3 Choix du système d'ensemencement
Le principe de la méthode NPP est la dilution d'un échantillon à un niveau tel que les inoculats contiennent, la
plupart du temps mais pas toujours, des micro-organismes cibles viables. Le «résultat», c'est-à-dire le nombre
d'inoculats produisant une croissance à chaque dilution, permettra une estimation de la concentration initiale
des bactéries dans l'échantillon. Afin d'obtenir des estimations sur une large gamme de concentrations
possibles, les microbiologistes utilisent des dilutions en série en incubant plusieurs tubes (ou boîte, etc.) à
chaque dilution. Le NPP de micro-organismes présents dans l'échantillon initial, ainsi que la fidélité de l'estimation,
peuvent être calculés par des procédures statistiques, sur la base des nombres de tubes positifs et négatifs observés après
incubation.
Choisir parmi les différentes configurations de NPP disponibles, selon
⎯ le nombre escompté de micro-organismes dans l'échantillon examiné;
⎯ les exigences réglementaires;
⎯ la fidélité requise; et
⎯ toute autre considération pratique.
L'incertitude de mesure dépend du nombre de prises d'essai positives observées dans des conditions
similaires, tout comme l'incertitude de mesure d'un dénombrement de colonies dépend du nombre de colonies
sur une boîte. L'incertitude de mesure varie en fonction de la racine carrée du nombre de tubes utilisés, car la
fidélité augmente avec l'augmentation du nombre de répétition des essais; mais il est nécessaire de multiplier
le nombre de tubes par quatre pour diviser par deux l'incertitude de mesure. L'incertitude de mesure relative
est élevée lorsque les systèmes ne comportent qu'un petit nombre de tubes par dilution.

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En fonction de leur taille, les prises d'essai peuvent être ensemencées dans des tubes ou des flacons contenant la quantité
requise de milieu liquide. Pour les prises d'essai de petite taille, des microplaques peuvent également être utilisées.
10.5.3.1 Système de dilution simple
Lorsque la concentration prévue en micro-organismes est faible ou peu variable, le système

d'ensemencement le plus approprié est une seule série de prises d'essai égales. Lorsque le rapport attendu
entre le nombre maximal et minimal de micro-organismes est inférieur à environ 25, il est prévu au moins dix
prises d'essai parallèles pour fournir des informations utiles; avec 50 tubes en parallèle, le rapport est limité à
200. Si la concentration réelle est proche de l'extrême des valeurs NPP possibles, alors la chance que tous
les tubes montrent une croissance ou une absence de croissance est probablement trop élevée. Des
exemples de dilution unique des NPP sont fournis dans les Tableaux C.1 à C.4.
10.5.3.2 Système de dilution multiple
Lorsque la concentration des micro-organismes dans l'échantillon est inconnue ou présumée très variable, il
peut être nécessaire d'ensemencer des séries de tubes à partir de différentes dilutions. Ensemencer un
nombre suffisant de dilutions afin de garantir un système obtenant des résultats positifs et négatifs. Le
nombre de dilutions à utiliser dépend également de la méthode de calcul utilisée pour estimer la valeur NPP.
S'il est nécessaire d'utiliser les tables NPP, alors les configurations des systèmes sont limitées à celles
disponibles dans les tables. Si des programmes informatiques sont utilisés, le nombre de dilutions et de tubes
parallèles n'est pas limité, ce qui est important pour l'utilisation de nouveaux kits commerciaux d'analyse
utilisant le NPP.
10.5.3.3 Système de dilution symétrique
Le système NPP symétrique le plus fréquemment appliqué utilise trois ou cinq tubes parallèles par dilution. La
fidélité de ce système avec un petit nombre de tubes par dilution est très faible. Les résultats à partir d'un
système à trois tubes donnent à peine plus qu'un ordre de grandeur de la concentration. Pour une plus grande
fidélité, il est recommandé de choisir cinq tubes parallèles ou plus. Des exemples de NPP à trois tubes, à cinq tubes
et à dix tubes sont fournis dans les Tableaux C.5, C.6 et C.7, respectivement.
10.5.3.4 Système de dilution asymétrique
Les systèmes de dilution asymétrique ont différents nombres de tubes à différents niveaux de dilution et il
convient de ne les utiliser que pour estimer le nombre de micro-organismes présents dans une gamme bien définie (voir
par exemple l'ISO 8199). Un tube peut parfois être perdu ou brisé, ce qui conduit à un système asymétrique.
Toutefois, certains kits commerciaux d'essai sont basés sur des systèmes asymétriques. Il est recommandé
d'évaluer les données issues de ces systèmes à l'aide d'un logiciel informatique approprié (voir 10.5.6.3).
10.5.4 Incubation
Incuber les tubes, flacons ou bouteilles ensemencés dans une étuve ou un bain d'eau. Les microplaques sont
placées dans une étuve.
Choisir la durée et la température d'incubation après s'être référé à une méthode normalisée spécifique,
puisque ces paramètres sont fonction du micro-organisme ou du groupe de micro-organismes recherché.
Certains micro-organismes peuvent nécessiter une procédure d'incubation en deux étapes et/ou une étape de confirmation.
Pour des informations détaillées, consulter les normes spécifiques, mais noter que cela peut ajouter un degré de
complication supplémentaire à la déduction des valeurs NPP (voir Référence [52]).
10.5.5 Interprétation des résultats
Les critères permettant de distinguer les résultats positifs des résultats négatifs varient en fonction de chaque
micro-organisme ou groupe de micro-organismes et sont définis dans les normes correspondantes. En
utilisant ces critères, compter et enregistrer le nombre de résultats positifs obtenus avec toutes les prises
d'essai provenant de l'échantillon.

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10.5.6 Détermination des valeurs NPP
Il existe trois méthodes différentes de détermination de la valeur NPP: le calcul avec des formules
mathématiques, la consultation des tables NPP ou l'utilisation de programmes informatiques spécifiques.
Étant donné que ces méthodes sont basées sur des considérations statistiques identiques, elles ont une
validité équivalente. Ces trois méthodes sont détaillées ci-dessous.
10.5.6.1 Formules mathématiques
10.5.6.1.1 Formule approximative pour tous les cas
Les valeurs NPP approximatives (M) pour tout nombre de dilutions et de tubes parallèles peuvent être
dérivées de l'application de la Formule (5):
Zp
M /g= (5)
ms m t
où
Zp est le nombre de tubes positifs;
ms est la masse totale, en grammes, de l'échantillon dans tous les tubes présentant une réaction
négative;
mt est la masse totale, en grammes, de l'échantillon dans tous les tubes.
EXEMPLE (tiré de la Référence [53])
À supposer que l'on soumet à essai 10 prises d'essai de chacune 0,1 g, 0,01 g et 0,001 g et que l'on trouve 10, 4 et
2 résultats positifs, alors pour les réponses fractionnaires uniquement (c'est-à-dire 4 et 2,) le nombre total de tubes positifs
est Zp = 6. La masse totale soumise à essai est mt = 10 × 0,01 + 10 × 0,001 = 0,11 g; et la masse totale dans les tubes
négatifs est ms = 6 × 0,01 + 8 × 0,001 = 0,068.
6 6 6
M /g= = = = 69, 4
0,068 × 0,11 0,007 5 0,086 5
Ce résultat est comparable à la valeur tabulée pour 10 − 4 − 2, qui correspond à un NPP par gramme de 70.
10.5.6.1.2 Solution «exacte» pour une série de tubes
La valeur NPP (M) d'une seule série de tubes est dérivée de la Formule (6):
1 ⎡S⎤
M /g=− ln (6)
m ⎢⎣ N ⎥⎦
où
m est la masse, en grammes, de l'échantillon dans chaque tube de la série;
ln est le logarithme népérien;
N est le nombre de tubes de la série;
S est le nombre de tubes présentant une réaction négative.

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10.5.6.1.3 Estimation de la fidélité des essais avec dilutions simples
Les limites de confiance à 95 % de l'estimation NPP peuvent être calculées approximativement à partir du
NPP dérivé et de l'écart-type de log10 M en utilisant la méthode de la Référence [55], telle que décrite dans la
Référence [53] — voir également la Référence [52].
NOTE Selon l’ISO 80000-2:2009[57], Article 12, le symbole des logarithmes décimaux est «lg». Toutefois, dans la
présente Norme internationale, le symbole «log10», largement utilisé dans la communauté des laboratoires de
microbiologie des aliments, est préféré.
L'erreur type du NPP ( s lo

n g M
) est calculée en utilisant la Formule (7):
10
1 − exp ( − Mm )
s lo
n = (7)
2,303 × Mm G exp ( − Mm )
g M
10
où
M est le NPP;
m est la masse de l'inoculum par tube;
G est le nombre de tubes montrant une croissance et exp est le facteur exponentiel.
L'approximation normale des limites de confiance est donnée par M ± 1,96 × s lo

n g10 M
.
EXEMPLE
À supposer que 0,1 g d'échantillon (m) a été ensemencé dans chacun des n = 20 tubes et que l'on a G = 4 résultats
positifs (il y a donc 16 résultats négatifs). La valeur NPP (M) par gramme est donnée par
1 ⎛S ⎞ 1 ⎛ 16 ⎞
M =− ln ⎜ ⎟ = − × ln ⎜ ⎟ = −10 × ln ( 0,8 ) = 2,23
m ⎝N⎠ 0,1 ⎝ 20 ⎠
et l'erreur type s n par

lo g10 M
1 − exp ( − Mm )
slo
n =
2,303 × Mm G exp ( − Mm )
g M
10
1 − exp ( −0,223 )
=
2,303 × 0,223 4 × exp ( −0,223 )
=
(1 − 0,80 ) =
0,20
= 0,22
0,513 6 × 3,2 0,918 7
n
Maintenant, log10 M = 0,35 et l'approximation normale des limites de confiance est donnée par
M ± 1,96 × s lo
n g M 10
n
La limite inférieure de log10 M est 0,35 – (1,96 × 0,22) = 0,35 – 0,43 = –0,08.
n
La limite supérieure de log10 M est 0,35 + 0,43 = 0,78.
Donc, la limite inférieure de M est antilog10(–0,08) = 0,82 et la limite supérieure de M est antilog10(0,78) = 6,1.

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Toutefois, il n'est pas nécessaire de réaliser ces calculs manuellement, car ils peuvent être déterminés à l'aide du
calculateur de NPP (10.5.6.3).
10.5.6.1.4 Estimation de la fidélité des essais avec dilutions multiples symétriques
Le logarithme décimal de l'écart-type d'un système NPP symétrique avec dilutions multiples peut être obtenu
par la Formule (8) d'approximation de Cochran (Référence [28]):
log10 f
s = 0,58 (8)
N
où
s est l'écart-type du logarithme décimal du NPP;
f est le facteur de dilution entre dilutions consécutives (la plupart du temps 10);
N est le nombre de tubes par dilution.
Les limites supérieure et inférieure de confiance à 95 % peuvent être estimées respectivement en multipliant et en
divisant l'estimation NPP par l'antilogarithme de 2s. Cette opération tend à surestimer la limite de confiance supérieure.
Une estimation plus précise peut être obtenue en utilisant le calculateur de NPP (10.5.6.3).
10.5.6.2 Tables NPP
10.5.6.2.1 Tables pour les systèmes de dilution simple
Les Tableaux C.1 à C.4 présentent les valeurs NPP et les limites de confiance à 95 % par prise d'essai pour
10, 15, 20 et 25 tubes parallèles (chaque tube est ensemencé avec le même volume d'une dilution simple).
Pour exprimer le résultat par masse de référence de l'échantillon (ou par volume pour les échantillons
liquides), multiplier le NPP et les valeurs de limite à 95 % par le rapport de la masse de référence sur la
masse de la prise d'essai. Ne pas multiplier l'incertitude type logarithmique. En microbiologie des aliments, la
masse de référence est généralement de 1 g. La masse de la prise d'essai correspond à la quantité
d'échantillon (en grammes) présente dans le volume utilisé pour ensemencer les tubes, par exemple 0,1 g si
1 ml de broyat 10−1 a été utilisé.
EXEMPLE (Référence [30])
Vingt tubes d'un bouillon double concentration ont été ensemencés avec 5 ml d'aliquotes d'un échantillon dilué au dixième
(0,1 g/ml). Après l'incubation, une croissance est visible dans 16 de ces tubes. Quelle était le NPP de bactéries (micro-
organismes par gramme) dans l'échantillon ?
Le Tableau B.3 indique 1,61 comme NPP de micro-organismes par tube, avec une limite inférieure à 95 % et une limite
supérieure à 95 % de 0,93 et 2,77.
Chaque tube reçoit une prise d'essai de 5 ml, qui correspond à 0,5 g de l'échantillon. Ainsi, le NPP de micro-organismes
(M) dans 1 g d'échantillon est donné par:
1,61
M = g = 3,22 g
0,5
avec les limites de confiance à 95 % comprises entre, pour la limite à 2,5 % inférieure:
0,93
g = 1,9 g
0,5

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et, pour la limite à 97,5 % supérieure:
2,77
g = 5,5 g
0,5
10.5.6.2.2 Tables pour les systèmes de dilution multiple: trois dilutions successives
Avec des systèmes symétriques, il est d'usage courant d'utiliser trois dilutions successives avec trois
(Tableau C.5) ou cinq (Tableau C.6) ou 10 réplicats (Tableau C.7). Enregistrer le nombre de résultats positifs
pour chaque série de tubes et, à partir de la table NPP correspondante utilisée pour le système
d'ensemencement, relever le NPP de micro-organismes présents dans le volume de référence de l'échantillon.
Ces tables révisées donnent également le logarithme décimal du NPP, son écart-type, s (log M ) , les limites
10
inférieure et supérieure de confiance de l'intervalle de confiance à 95 % approximatif ainsi qu'une «valeur de
rareté» et une «catégorie de rareté». La «valeur de rareté» (basée sur le travail de Blodgett, Références [52]
à [54]) fournit une approche plus simple pour évaluer la probabilité qu'un résultat observé soit obtenu dans un
essai.
Certaines combinaisons de tubes positifs sont davantage susceptibles de se produire que d'autres; par
exemple, une combinaison de résultats positifs 0 − 0 − 3 est moins probable de se produire qu'une
combinaison de 3 − 2 − 1. Pour quantifier cette probabilité, l'indice de rareté a été calculé comme le rapport de
deux valeurs de probabilité:
L (µˆ )
r=
L0 (µˆ )
où
L ( µ̂ ) est la probabilité du résultat observé, x1, x2 ... xk, de l'essai de dilution en série;
L0 ( µˆ ) est la probabilité si le résultat était plus probable à une concentration µ égale à l'estimation µ̂
de la concentration µ.
Les détails complets du mode opératoire de calcul des fonctions de probabilité sont données dans la
Référence [56].
L'indice de rareté est une valeur comprise entre 0 et 1. Il est égal à 1 si le résultat de l'essai de dilution en
série est le plus probablement une concentration égale au NPP estimé. S'il est proche de 0, le résultat de
l'essai de dilution en série est très peu probable pour une concentration égale au NPP estimé. En suivant
l'approche de la Référence [27], on utilise trois catégories de rareté:
Catégorie 1: la valeur NPP serait très susceptible de se produire si sa valeur de rareté se trouve dans la
gamme de 0,05 à 1,00, 0,05 ≤ n ≤ 1,00; c'est-à-dire que ce résultat serait susceptible de se produire par
hasard dans 95 % des cas.
Catégorie 2: on s'attendrait à ce que la valeur NPP ne se produise que rarement si sa valeur de rareté se
trouve dans la gamme de 0,01 à 0,05, 0,01 ≤ n ≤ 0,05; ce résultat serait susceptible de se produire par
hasard avec une fréquence inférieure à 5 %.
Catégorie 3: on s'attendrait à ce que la valeur NPP se produise extrêmement rarement si sa valeur de

rareté se trouve dans la gamme de 0 à 0,01, 0 ≤ n ≤ 0,01; c'est-à-dire qu'il serait escompté que ce
résultat se produise par hasard moins d'une fois sur 100 essais.
Les tableaux indiquent seulement les combinaisons de résultats dans les catégories 1 et 2.

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Dans les cas où plus de trois dilutions sont faites, il est impératif d'utiliser toutes les valeurs de données mesurées. Il n'est
pas scientifiquement correct de «choisir» une combinaison de valeurs sur le postulat que ces valeurs sont plus «correctes»
que les autres combinaisons. Il convient d'enregistrer les résultats de toutes les combinaisons possibles de tubes positifs et
d'utiliser le calculateur de NPP (10.5.6.3) pour dériver les valeurs NPP.
10.5.6.3 Programmes informatiques
Les programmes utilisés pour déterminer les valeurs NPP doivent identifier les combinaisons de tubes
improbables, car ces combinaisons peuvent refléter un problème lié à la réalisation de l'essai microbiologique
(voir 10.5.6.2.2 concernant les combinaisons de tubes improbables et l'utilisation des tables NPP). Plusieurs
programmes informatiques sont disponibles pour estimer les valeurs NPP en utilisant une feuille de calcul
Excel® (voir Note), mais nombre d'entre eux ne sont pas capables d'évaluer si des combinaisons de tubes
improbables ont été saisies dans le programme et différentes approches ont été utilisées pour estimer les
limites de confiance.
Un nouveau logiciel à utiliser dans Excel® (voir Note) capable de gérer jusqu'à 10 niveaux de dilutions en
série a été élaboré. Le programme a été utilisé pour dériver les estimations NPP et leurs paramètres
présentés dans les Tableaux révisés C.5, C.6 et C.7. Il est fortement recommandé d'utiliser ce programme
plutôt que d'autres, car les résultats de toute combinaison spécifique de résultats dérivés avec 3 dilutions
seront les mêmes que ceux des tableaux publiés. Les détails des calculs sont décrits dans la Référence [55]
et le logiciel peut être téléchargé gratuitement à partir de
http://standards.iso.org/iso/7218/
Si la feuille de calcul Excel® souligne qu'une combinaison de tubes est improbable, il convient de ne pas
rapporter la valeur NPP associée.
NOTE Excel® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Microsoft. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
Pages 60 à 66, Annexe B
Supprimer le texte existant et ajouter les Annexes B à D, qui commencent à la page suivante. La nouvelle
Annexe C remplace l’ancienne Annexe B.

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Annexe B
(informative)
Intervalles de confiance pour la technique de comptage des colonies
B.1 Intervalles de confiance pour la technique de comptage des colonies

Pour évaluer la validité des résultats et éviter des interprétations trop strictes, il est nécessaire d'estimer
l'incertitude de mesure, ou si elle n'est pas disponible, d'estimer l'intervalle de confiance qui caractérise la
répartition statistique des micro- organismes dans l'échantillon.
Lorsque la valeur de l'incertitude de mesure n'est pas disponible, l'intervalle de confiance δ qui caractérise la
dispersion microbienne, peut être calculé à l'aide de la Formule (B.1) (avec une probabilité de 95 %):
δ =⎢
⎡
∑ C ± 1,96 ∑ C ⎤⎥ 1 (B.1)
⎢ B B ⎥d
⎣⎢ ⎦⎥
où
B = V(n1 + 0,1n2)
dans laquelle
n1 est le nombre de boîtes retenues à la première dilution;
n2 est le nombre de boîtes retenues à la seconde dilution;
d est la dilution correspondant à la première dilution retenue;
ΣC est la somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues à partir de deux dilutions
successives.
EXEMPLE 1
Un dénombrement a donné les résultats suivants (système avec une boîte par dilution):
À la première dilution retenue (10− ): 215 colonies;

2
⎯
À la deuxième dilution retenue (10− ): 14 colonies.

3
⎯
∑C 215 + 14 229
N= = = = 20 818
⎣ ( ⎦)
V × ⎡ n1 + 0,1× n 2 ⎤ × d 1× ⎡⎣1 + ( 0,1× 1) ⎤⎦ × 10
−2 0,011
En arrondissant le résultat tel que spécifié dans le texte principal, le nombre de micro-organismes est de 21 000 ou
4
2,1 × 10 par millilitre ou par gramme de produit.

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
4
Avec N = 2,1 × 10 par gramme, pour 229 colonies comptées, l'intervalle de confiance δ est:
⎡ 229 1,96 229 ⎤ 1

δ =⎢ ± ⎥ × −2
⎣⎢ 1,1 1,1 ⎦⎥ 10
δ = (208,18 ± 26,96) × 102
Les limites de l'intervalle de confiance sont donc:
δ1 = 1,8 × 104 et δ 2 = 2,4 × 104
EXEMPLE 2
Un dénombrement a donné les résultats suivants (système avec deux boîtes par dilution):
À la première dilution retenue (10− ): 168 colonies et 215 colonies;

2
⎯
À la deuxième dilution retenue (10− ): 14 colonies et 25 colonies.

3
⎯
∑C 168 + 215 + 14 + 25 422

N= = = = 19 182
V × ⎡⎣ n1 + ( 0,1× n2 ) ⎤⎦ × d 1× ⎡2 + ( 0,1× 2 ) ⎤ × 10 −2 0,022
⎣ ⎦
En arrondissant le résultat tel que spécifié dans le texte principal, le nombre de micro-organismes est de 19 000 ou
4
1,9 × 10 par millilitre ou par gramme de produit.
4
Avec N = 1,9 × 10 par gramme, pour 422 colonies comptées, l'intervalle de confiance δ est:
⎡ 422 1,96 422 ⎤ 1

δ =⎢ ± ⎥ × −2
⎣⎢ 2,2 2,2 ⎦⎥ 10
δ = (191,82 ± 18,30) × 102
Les limites de l'intervalle de confiance sont donc:
δ1 = 1,7 × 104 et δ 2 = 2,1× 104
Le Tableau B.1 donne la moyenne pondérée et les intervalles de confiance δ pour les nombres pertinents de colonies.
Tableau B.1 — Moyennes pondérées et intervalles de confiance δ

pour les nombres pertinents de colonies
Système Système
Moyenne pondérée du nombre de colonies «1 boîte par dilution» «2 boîtes par dilution»
comptées sur deux dilutions successives
Intervalle de confiance δ Intervalle de confiance δ
300 268 à 332 277 à 323
150 127 à 173 134 à 166
100 81 à 119 87 à 113
30 20 à 40 23 à 37
15 7 à 22 10 à 20
10 4 à 16 6 à 14
7 Non applicable 3 à 10

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B.2 Cas particuliers des petits nombres

Les intervalles de confiance sont indiqués dans les Tableaux B.2 à B.5.
Tableau B.2 — Intervalles de confiance pour le dénombrement avec le système «une boîte par
dilution», cas des petits nombres comptés sur une seule boîte
Limites de confiance à un niveau de confiance

Limite de confiance,
Nombre de coloniea approximatif de 95 %b
pourcentage
Limite inférieure Limite supérieure
1 <1 3 ± 196
2 <1 5 ± 139
3 <1 6 ± 113
4 <1 8 ± 98
5 <1 9 ± 88
6 1 11 ± 80
7 2 12 ± 74
8 2 14 ± 69
9 3 15 ± 65
10 4 16 ± 62
11 4 18 ± 59
12 5 19 ± 57
13 6 20 ± 54
14 7 21 ± 52
15 7 23 ± 51
a Nombre de colonies comptées sur une boîte de Petri à une dilution.
b Comparé au nombre de micro-organismes calculé et en supposant que le comptage est réalisé sur une seule boîte à une dilution.
Tableau B.3 — Intervalles de confiance pour le dénombrement avec le système «une boîte par
dilution», cas des petits nombres comptés sur les deux boîtes uniques de deux dilutions
Limites de confiance à un niveau de

Nombre de Nombre de micro- confiance approximatif de 95 %c Limites de confiance,
coloniesa organismesb pourcentage
1 NDd ND ND ND
2 ND ND ND ND
3 ND ND ND ND
4 ND ND ND ND
5 ND ND ND ND
6 ND ND ND ND
7 ND ND ND ND
8 ND ND ND ND
9 ND ND ND ND
10 9 3 15 ± 62
11 10 4 16 ± 59
12 11 5 17 ± 57
13 12 5 18 ± 54
14 13 6 19 ± 52
15 14 7 21 ± 51
a Nombre de colonies comptées sur une boîte de Petri à deux dilutions successives.
b Moyenne pondérée à partir de deux boîtes de Petri.
c Comparé au nombre de micro-organismes calculé et en supposant que le comptage est réalisé sur une seule boîte à deux dilutions.
d Non disponible: la moyenne pondérée ne peut pas être calculée.

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Tableau B.4 — Intervalles de confiance pour le dénombrement avec le système «deux boîtes par
dilution», cas des petits nombres comptés sur deux boîtes à une dilution
Nombre de Nombre de micro- Limites de confiance à un niveau de Limites de confiance,

coloniesa organismesb confiance approximatif de 95 %c pourcentage
1 1 <1 1 ± 196
2 1 <1 2 ± 139
3 2 <1 3 ± 113
4 2 <1 4 ± 98
5 3 <1 5 ± 88
6 3 <1 5 ± 80
7 4 <1 6 ± 74
8 4 1 7 ± 69
9 5 2 7 ± 65
10 5 2 8 ± 62
11 6 2 9 ± 59
12 6 3 9 ± 57
13 7 3 10 ± 54
14 7 3 11 ± 52
15 8 4 11 ± 51
16 8 4 12 ± 49
17 9 4 13 ± 48
18 9 5 13 ± 46
19 10 5 14 ± 45
20 10 6 14 ± 44
21 11 6 15 ± 43
22 11 6 16 ± 42
23 12 7 16 ± 41
24 12 7 17 ± 40
25 13 8 17 ± 39
26 13 8 18 ± 38
27 14 8 19 ± 38
28 14 9 19 ± 37
29 15 9 20 ± 36
30 15 10 20 ± 36
a Nombre de colonies comptées sur deux boîtes de Petri à une dilution.
b Moyenne arithmétique à partir de deux boîtes de Petri.
c Comparé au nombre de micro-organismes calculé et en supposant que le comptage est réalisé sur deux boîtes d’une seule
dilution.

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Tableau B.5 — Intervalles de confiance pour le dénombrement avec le système «deux boîtes par
dilution», cas des petits nombres comptés sur deux boîtes à deux dilutions
Limites de confiance à un niveau de

Nombre de Nombre de micro- confiance approximatif de 95 %c Limites de confiance,
coloniesa organismesb pourcentage
inférieure supérieure
1 NDd ND ND ND
2 ND ND ND ND
3 ND ND ND ND
4 ND ND ND ND
5 ND ND ND ND
6 ND ND ND ND
7 ND ND ND ND
8 ND ND ND ND
9 ND ND ND ND
10 ND ND ND ND
11 ND ND ND ND
12 5 2 9 ± 57
13 6 3 9 ± 54
14 6 3 10 ± 52
15 7 3 10 ± 51
16 7 4 11 ± 49
17 8 4 11 ± 48
18 8 4 12 ± 46
19 9 5 13 ± 45
20 9 5 13 ± 44
21 10 5 14 ± 43
22 10 6 14 ± 42
23 10 6 15 ± 41
24 11 7 15 ± 40
25 11 7 16 ± 39
26 12 7 16 ± 38
27 12 8 17 ± 38
28 13 8 17 ± 37
29 13 8 18 ± 36
30 14 9 19 ± 36
a Nombre de colonies comptées sur deux boîtes de Petri à deux dilutions successives.
b Moyenne pondérée à partir de quatre boîtes de Petri.
c Comparé au nombre de micro-organismes calculé et en supposant que le comptage est réalisé sur deux boîtes à deux dilutions.
d Non disponible: la moyenne pondérée ne peut pas être calculée.

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Annexe C
(normative)
Détermination du nombre le plus probable
Tableau C.1 — Valeurs NPP par prise d'essai et limites de confiance à 95 % calculées pour une série
de 10 tubes selon la Référence [29]
Série de 10 tubes
Nombre de
tubes NPP Incertitude type Limites à 95 %
positifs /ml ou /g de log10M inférieure supérieure
1 0,11 0,435 0,02 0,75
2 0,22 0,308 0,06 0,89
3 0,36 0,252 0,11 1,11
4 0,51 0,220 0,19 1,38
5 0,69 0,198 0,28 1,69
6 0,92 0,184 0,40 2,10
7 1,20 0,174 0,55 2,64
8 1,61 0,171 0,75 3,48
9 2,30 0,179 1,03 5,16
Série de 15 tubes
Nombre de
1 0,07 0,434 0,01 0,49
2 0,14 0,307 0,04 0,57
3 0,22 0,251 0,07 0,69
4 0,31 0,218 0,12 0,83
5 0,41 0,196 0,17 0,98
6 0,51 0,179 0,23 1,15
7 0,63 0,167 0,30 1,33
8 0,76 0,157 0,37 1,55
9 0,92 0,150 0,47 1,80
10 1,10 0,144 0,57 2,11
11 1,32 0,141 0,70 2,49
12 1,61 0,139 0,86 3,02
13 2,01 0,142 1,06 3,82
14 2,71 0,155 1,35 5,45

2017FA00916 Le 06/12/2017
Série de 20 tubes
Nombre de
1 0,05 0,434 0,01 0,36

2 0,11 0,307 0,03 0,42
3 0,16 0,251 0,05 0,50
4 0,22 0,218 0,08 0,60
5 0,29 0,195 0,12 0,69
6 0,36 0,178 0,16 0,80
7 0,43 0,165 0,20 0,91
8 0,51 0,155 0,25 1,03
9 0,59 0,147 0,31 1,16
10 0,69 0,140 0,37 1,30
11 0,80 0,134 0,44 1,46
12 0,92 0,130 0,51 1,65
13 1,05 0,126 0,59 1,85
14 1,20 0,123 0,69 2,10
15 1,39 0,121 0,80 2,40
16 1,61 0,121 0,93 2,77
17 1,90 0,122 1,09 3,29
18 2,30 0,127 1,30 4,08
19 3,00 0,141 1,58 5,67

2017FA00916 Le 06/12/2017
ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Série de 25 tubes
Nombre de
1 0,04 0,434 0,01 0,29

2 0,08 0,307 0,02 0,33
3 0,13 0,251 0,04 0,40
4 0,17 0,217 0,07 0,47
5 0,22 0,195 0,09 0,54
6 0,27 0,178 0,12 0,61
7 0,33 0,165 0,16 0,69
8 0,39 0,154 0,19 0,77
9 0,45 0,146 0,23 0,86
10 0,51 0,139 0,27 0,96
11 0,58 0,133 0,32 1,06
12 0,65 0,128 0,37 1,16
13 0,73 0,123 0,42 1,28
14 0,82 0,119 0,48 1,41
15 0,92 0,116 0,54 1,55
16 1,02 0,113 0,61 1,70
17 1,14 0,111 0,69 1,88
18 1,27 0,109 0,78 2,09
19 1,43 0,108 0,88 2,33
20 1,61 0,108 0,99 2,62
21 1,83 0,109 1,12 2,99
22 2,12 0,111 1,29 3,50
23 2,53 0,117 1,49 4,28
24 3,22 0,123 1,77 5,85

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau C.5 — Valeurs NPP par gramme d'échantillon et limites de confiance à 95 %

(lorsque trois prises d'essai de 1 g, trois de 0,1 g et trois de 0,01 g sont utilisées) (Référence [56])
Nombre de résultats positifs pour NPP log10M Écart-type Limites de confiance à Indice de Catégorie
le volume d'inoculum, ml ou g /ml ou /g de log10M 95 % rareté de rareté
1,00 0,10 0,01 inférieure supérieure
0 0 0 0 NDa NDa 0 1,1 1,00 1

0 1 0 0,31 –0,51 0,43 0,04 2,3 0,09 1
1 0 0 0,36 –0,44 0,44 0,05 2,7 1,00 1
1 0 1 0,72 –0,14 0,31 0,17 3,0 0,02 2
1 1 0 0,74 –0,13 0,31 0,18 3,1 0,21 1
1 2 0 1,1 0,04 0,26 0,35 3,7 0,02 2
2 0 0 0,92 –0,04 0,32 0,21 4,0 1,00 1
2 0 1 1,4 0,15 0,27 0,42 4,9 0,04 2
2 1 0 1,5 0,18 0,27 0,43 5,0 0,43 1
2 1 1 2,0 0,30 0,24 0,70 6,0 0,02 2
2 2 0 2,1 0,32 0,24 0,71 6,2 0,07 1
3 0 0 2,3 0,36 0,31 0,55 9,7 1,00 1
3 0 1 3,9 0,59 0,31 0,93 16 0,08 1
3 1 0 4,3 0,63 0,33 0,95 19 1,00 1
3 1 1 7,5 0,88 0,30 1,9 30 0,21 1
3 1 2 12 1,1 0,26 3,6 37 0,02 2
3 2 0 9,3 0,97 0,32 2,2 40 1,00 1
3 2 1 15 1,2 0,27 4,4 51 0,42 1
3 2 2 22 1,3 0,24 7,2 64 0,07 1
3 3 0 24 1,4 0,32 5,6 100 1,00 1
3 3 1 46 1,7 0,34 9,6 220 1,00 1
3 3 2 110 2,0 0,32 25 490 1,00 1
3 3 3 ∞ NDa NDa 36 ∞ 1,00 1

a ND = non disponible.

2017FA00916 Le 06/12/2017
ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Tableau C.6 — Valeurs NPP par gramme d'échantillon et limites de confiance à 95 %

(lorsque cinq prises d'essai de 1 g, cinq de 0,1 g et cinq de 0,01 g sont utilisées) (Référence [56])
Nombre de résultats positifs pour NPP log10M Écart-type Limites de confiance Indice de Catégorie
le volume d’inoculum, ml ou g /ml ou /g de log10M à 95 % rareté
1 0,1 0,01 inférieure supérieure
0 0 0 0 ND ND 0 0,66 1 1
0 1 0 0,18 –0,74 0,43 0,02 1,34 0,09 1
1 0 0 0,20 –0,70 0,44 0,03 1,47 1,00 1
1 0 1 0,40 –0,40 0,31 0,10 1,65 0,02 2
1 1 0 0,40 –0,39 0,31 0,10 1,66 0,21 1
1 2 0 0,61 –0,21 0,25 0,19 1,96 0,02 2
2 0 0 0,45 –0,35 0,31 0,11 1,86 1,00 1
2 0 1 0,68 –0,17 0,25 0,21 2,18 0,03 2
2 1 0 0,68 –0,16 0,25 0,21 2,2 0,35 1
2 1 1 0,92 –0,04 0,22 0,33 2,55 0,02 2
2 2 0 0,93 –0,03 0,22 0,34 2,58 0,06 1
3 0 0 0,78 –0,11 0,26 0,24 2,54 1,00 1
3 0 1 1,1 0,03 0,23 0,38 2,97 0,05 1
3 1 0 1,1 0,03 0,23 0,38 3,02 0,57 1
3 1 1 1,4 0,14 0,20 0,54 3,48 0,03 2
3 2 0 1,4 0,14 0,20 0,54 3,53 0,15 1
3 2 1 1,7 0,23 0,19 0,72 4,02 0,13 2
3 3 0 1,7 0,24 0,19 0,73 4,09 0,03 2
4 0 0 1,3 0,11 0,23 0,44 3,72 1,00 1
4 0 1 1,7 0,22 0,21 0,63 4,4 0,08 1
4 1 0 1,7 0,23 0,21 0,63 4,5 0,92 1
4 1 1 2,1 0,33 0,20 0,85 5,28 0,07 1
4 2 0 2,2 0,33 0,20 0,86 5,41 0,31 1
4 2 1 2,6 0,42 0,19 1,1 6,31 0,03 2
4 3 0 2,7 0,43 0,19 1,1 6,5 0,07 1
4 4 0 3,4 0,53 0,18 1,5 7,8 0,01 2
5 0 0 2,3 0,36 0,24 0,76 7,0 0,77 1
5 0 1 3,1 0,50 0,24 1,1 9,4 0,09 1
5 1 0 3,3 0,52 0,24 1,1 10 1,00 1
5 1 1 4,6 0,66 0,25 1,5 14 0,20 1
5 1 2 6,3 0,80 0,24 2,1 19 0,02 2
5 2 0 4,9 0,69 0,26 1,5 16 1,00 1
5 2 1 7,0 0,85 0,25 2,3 22 0,36 1
5 2 2 9,4 0,97 0,22 3,4 26 0,06 1

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau C.6 (Suite)
Nombre de résultats positifs pour NPP log10M Écart-type Limites de confiance Indice de Catégorie
le volume d’inoculum, ml ou g /ml ou /g de log10M à 95 % rareté
5 3 0 7,9 0,90 0,25 2,5 25 1,00 1

5 3 1 11 1,0 0,23 3,9 31 0,57 1
5 3 2 14 1,1 0,20 5,5 36 0,15 1
5 3 3 18 1,2 0,19 7,4 42 0,03 2
5 4 0 13 1,1 0,23 4,5 38 1,00 1
5 4 1 17 1,2 0,21 6,5 46 0,94 1
5 4 2 22 1,3 0,20 8,8 56 0,30 1
5 4 3 28 1,4 0,19 11,5 67 0,07 1
5 4 4 35 1,5 0,18 14,8 81 0,01 2
5 5 0 24 1,4 0,24 7,79 74 0,74 1
5 5 1 35 1,5 0,25 10,9 111 1,00 1
5 5 2 54 1,7 0,27 15,7 187 1,00 1
5 5 3 92 2,0 0,26 28 301 1,00 1
5 5 4 160 2,2 0,24 53 489 1,00 1
5 5 5 ∞ ND ND 65 ∞ 1,00 1
ND = non disponible.
Tableau C.7 — Valeurs NPP par gramme d’échantillon et limites de confiance à 95 %

(lorsque dix prises d’essai de 1 g, dix de 0,1 g et dix de 0,01 g sont utilisées) (Référence [56])
le volume d’inoculum, ml ou g /ml ou /g de log10M 95 % rareté
0 0 0 0 ND ND 0 0,33 1,00 1
0 1 0 0,09 –1 0,43 0,012 0,67 0,09 1
1 0 0 0,09 –1 0,43 0,013 0,7 0,99 1
1 0 1 0,19 –0,72 0,31 0,046 0,78 0,02 2
1 1 0 0,19 –0,72 0,31 0,046 0,78 0,19 1
1 2 0 0,29 –0,54 0,25 0,09 0,91 0,03 2
2 0 0 0,2 –0,7 0,31 0,048 0,82 0,99 1
2 0 1 0,3 –0,52 0,25 0,094 0,95 0,03 2
2 1 0 0,3 –0,52 0,25 0,094 0,95 0,30 1
2 1 1 0,4 –0,4 0,22 0,15 1,1 0,01 2
2 2 0 0,4 –0,4 0,22 0,15 1,1 0,06 1
3 0 0 0,32 –0,5 0,25 0,099 1 0,99 1
3 0 1 0,42 –0,38 0,22 0,15 1,2 0,04 2
3 1 0 0,42 –0,37 0,22 0,15 1,2 0,43 1

2017FA00916 Le 06/12/2017
ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Tableau C.7 (Suite)
3 1 1 0,53 –0,27 0,2 0,22 1,3 0,02 2

3 2 0 0,53 –0,27 0,2 0,22 1,3 0,11 1
3 3 0 0,65 –0,19 0,18 0,28 1,5 0,02 2
4 0 0 0,45 –0,35 0,22 0,16 1,2 0,99 1
4 0 1 0,56 –0,25 0,2 0,23 1,4 0,06 1
4 1 0 0,56 –0,25 0,2 0,23 1,4 0,58 1
4 1 1 0,68 –0,17 0,18 0,3 1,6 0,04 2
4 2 0 0,68 –0,16 0,18 0,3 1,6 0,19 1
4 2 1 0,8 –0,096 0,17 0,37 1,7 0,02 2
4 3 0 0,81 –0,094 0,17 0,37 1,7 0,05 2
5 0 0 0,6 –0,22 0,2 0,24 1,5 0,98 1
5 0 1 0,72 –0,14 0,18 0,31 1,7 0,07 1
5 1 0 0,73 –0,14 0,18 0,32 1,7 0,75 1
5 1 1 0,85 –0,068 0,17 0,39 1,8 0,07 1
5 2 0 0,86 –0,066 0,17 0,4 1,9 0,32 1
5 2 1 0,99 –0,0047 0,16 0,48 2 0,03 2
5 3 0 1 –0,0021 0,16 0,48 2,1 0,09 1
5 4 0 1,1 0,055 0,15 0,57 2,3 0,02 2
6 0 0 0,78 –0,11 0,18 0,34 1,8 0,98 1
6 0 1 0,92 –0,038 0,17 0,42 2 0,09 1
6 1 0 0,92 –0,035 0,17 0,42 2 0,97 1
6 1 1 1,1 0,027 0,16 0,51 2,2 0,10 1
6 2 0 1,1 0,03 0,16 0,51 2,2 0,46 1
6 2 1 1,2 0,085 0,15 0,61 2,4 0,05 1
6 3 0 1,2 0,088 0,15 0,61 2,5 0,15 1
6 3 1 1,4 0,14 0,14 0,71 2,7 0,02 2
6 4 0 1,4 0,14 0,14 0,71 2,7 0,04 2
7 0 0 1 –0,0018 0,17 0,45 2,2 0,93 1
7 0 1 1,1 0,062 0,16 0,55 2,4 0,09 1
7 1 0 1,2 0,065 0,16 0,55 2,4 1,00 1
7 1 1 1,3 0,12 0,15 0,65 2,7 0,13 1
7 2 0 1,3 0,13 0,15 0,66 2,7 0,61 1
7 2 1 1,5 0,18 0,15 0,77 3 0,08 1
7 3 0 1,5 0,18 0,15 0,77 3 0,24 1

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau C.7 (Suite)
7 3 1 1,7 0,23 0,14 0,89 3,2 0,04 2

7 4 0 1,7 0,23 0,14 0,89 3,3 0,08 1
7 4 1 1,9 0,28 0,14 1 3,5 0,01 2
7 5 0 1,9 0,28 0,14 1 3,6 0,02 2
8 0 0 1,3 0,11 0,16 0,6 2,7 0,71 1
8 0 1 1,5 0,17 0,16 0,71 3 0,09 1
8 1 0 1,5 0,17 0,16 0,72 3 1,00 1
8 1 1 1,7 0,22 0,15 0,84 3,3 0,17 1
8 1 2 1,9 0,27 0,14 0,97 3,7 0,01 2
8 2 0 1,7 0,23 0,15 0,84 3,4 0,83 1
8 2 1 1,9 0,28 0,15 0,97 3,7 0,14 1
8 2 2 2,1 0,33 0,14 1,1 4 0,01 2
8 3 0 1,9 0,28 0,15 0,98 3,7 0,42 1
8 3 1 2,1 0,33 0,14 1,1 4,1 0,08 1
8 4 0 2,2 0,33 0,14 1,1 4,1 0,16 1
8 4 1 2,4 0,38 0,14 1,3 4,5 0,04 2
8 5 0 2,4 0,38 0,14 1,3 4,6 0,05 2
8 5 1 2,7 0,43 0,13 1,4 5 0,01 2
8 6 0 2,7 0,43 0,13 1,5 5 0,01 2
9 0 0 1,7 0,22 0,16 0,79 3,5 0,53 1
9 0 1 1,9 0,28 0,16 0,93 3,9 0,09 1
9 1 0 1,9 0,29 0,16 0,94 4 1,00 1
9 1 1 2,2 0,34 0,15 1,1 4,4 0,20 1
9 1 2 2,5 0,39 0,15 1,2 4,9 0,02 2
9 2 0 2,2 0,35 0,15 1,1 4,5 1,00 1
9 2 1 2,5 0,4 0,15 1,3 5 0,22 1
9 2 2 2,8 0,45 0,15 1,4 5,5 0,02 2
9 3 0 2,5 0,41 0,15 1,3 5,1 0,66 1
9 3 1 2,9 0,46 0,15 1,5 5,6 0,16 1
9 3 2 3,2 0,51 0,14 1,7 6,3 0,02 2
9 4 0 2,9 0,46 0,15 1,5 5,8 0,31 1
9 4 1 3,3 0,51 0,15 1,7 6,4 0,09 1
9 4 2 3,7 0,56 0,14 1,9 7,1 0,01 2

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
Tableau C.7 (Suite)
9 5 0 3,3 0,52 0,15 1,7 6,5 0,12 1

9 5 1 3,7 0,57 0,14 1,9 7,2 0,04 2
9 6 0 3,8 0,58 0,15 2 7,4 0,04 2
9 6 1 4,3 0,63 0,14 2,2 8,2 0,02 2
9 7 0 4,3 0,64 0,14 2,2 8,4 0,01 2
10 0 0 2,3 0,36 0,17 1,1 5,1 0,3 1
10 0 1 2,7 0,43 0,17 1,2 5,9 0,06 1
10 1 0 2,8 0,44 0,17 1,3 6 0,70 1
10 1 1 3,2 0,51 0,17 1,5 7 0,19 1
10 1 2 3,8 0,58 0,17 1,7 8,3 0,03 2
10 2 0 3,3 0,52 0,17 1,5 7,3 0,96 1
10 2 1 3,9 0,59 0,17 1,7 8,6 0,31 1
10 2 2 4,6 0,66 0,17 2 10 0,06 1
10 3 0 4 0,60 0,18 1,8 9 1,00 1
10 3 1 4,7 0,68 0,18 2,1 11 0,46 1
10 3 2 5,6 0,75 0,18 2,5 13 0,11 1
10 3 3 6,6 0,82 0,17 3 15 0,02 2
10 4 0 4,9 0,69 0,18 2,1 11 1,00 1
10 4 1 5,9 0,77 0,18 2,6 13 0,61 1
10 4 2 7 0,84 0,17 3,2 16 0,19 1
10 4 3 8,2 0,91 0,16 3,8 17 0,05 2
10 5 0 6,2 0,79 0,18 2,7 14 1,00 1
10 5 1 7,4 0,87 0,18 3,3 17 0,77 1
10 5 2 8,7 0,94 0,17 4,1 19 0,32 1
10 5 3 10 1 0,16 4,9 21 0,09 1
10 5 4 12 1,1 0,15 5,8 23 0,02 2
10 6 0 7,9 0,9 0,18 3,5 18 1,00 1
10 6 1 9,4 0,97 0,17 4,3 20 0,98 1
10 6 2 11 1 0,16 5,2 23 0,46 1
10 6 3 12 1,1 0,15 6,2 25 0,15 1
10 6 4 14 1,1 0,14 7,2 27 0,04 2
10 7 0 10 1 0,17 4,6 22 0,94 1
10 7 1 12 1,1 0,16 5,6 25 1,00 1

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Tableau C.7 (Suite)
10 7 2 14 1,1 0,15 6,7 28 0,6 1

10 7 3 15 1,2 0,15 7,9 30 0,24 1
10 7 4 17 1,2 0,14 9,1 33 0,08 1
10 7 5 19 1,3 0,14 10 36 0,02 2
10 8 0 13 1,1 0,16 6,1 28 0,72 1
10 8 1 15 1,2 0,16 7,3 31 1,00 1
10 8 2 17 1,2 0,15 8,6 35 0,83 1
10 8 3 20 1,3 0,15 10 38 0,42 1
10 8 4 22 1,3 0,14 12 42 0,16 1
10 8 5 25 1,4 0,14 13 47 0,05 2
10 9 0 17 1,2 0,16 8 36 0,54 1
10 9 1 20 1,3 0,16 9,6 41 1,00 1
10 9 2 23 1,4 0,15 11 46 1,00 1
10 9 3 26 1,4 0,15 13 53 0,62 1
10 9 4 30 1,5 0,15 15 60 0,3 1
10 9 5 35 1,5 0,15 17 69 0,12 1
10 9 6 40 1,6 0,15 20 78 0,04 2
10 9 7 46 1,7 0,15 23 90 0,01 2
10 10 0 24 1,4 0,17 11 53 0,30 1
10 10 1 29 1,5 0,17 13 64 0,67 1
10 10 2 35 1,5 0,18 15 79 0,90 1
10 10 3 43 1,6 0,18 18 100 1,00 1
10 10 4 54 1,7 0,19 23 130 1,00 1
10 10 5 70 1,8 0,19 29 170 1,00 1
10 10 6 92 2 0,18 40 210 1,00 1
10 10 7 120 2,1 0,17 54 270 1,00 1
10 10 8 160 2,2 0,17 73 350 1,00 1
10 10 9 230 2,4 0,18 100 520 1,00 1
10 10 10 ∞ ND ND 120 ∞ 1,00 1
ND = non disponible.

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Annexe D
(normative)
Comptage des colonies avec deux boîtes par dilution
D.1 Introduction
La présente annexe spécifie les cas de calcul et l'expression des résultats pour le dénombrement avec deux
boîtes par dilution.
Toutes les exigences et recommandations spécifiées en 10.3 sont applicables.
Seuls les éléments différents et ceux nécessaires à la compréhension sont décrits dans cette annexe.
D.2 Comptage des colonies

Les exigences et recommandations de 10.3.1 et 10.3.2.1.1 sont applicables.
(colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies caractéristiques présumées) pour chaque boîte
contenant jusqu'à et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique).
Dans le présent paragraphe, les cas traités correspondent aux cas généraux suivants:
⎯ ensemencement d'une boîte de Petri d'un diamètre de 90 mm par dilution et réalisation d’au moins deux
dilutions successives;
⎯ nombre maximal dénombrable pour la totalité des colonies présentes: 300 par boîte;
une boîte dans le cas de comptage de colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: de
préférence 300 par boîte;
⎯ nombre maximal dénombrable pour les colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: 150 par
boîte;
⎯ nombre de colonies caractéristiques présumées ensemencées pour identification ou confirmation (voir

D.4) à partir de chaque boîte retenue: en général 5.
Ces nombres seront définis dans les normes spécifiques.
Les modes de calcul définis dans ce qui suit prennent en compte les cas apparaissant le plus fréquemment
lorsque les essais sont réalisés conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Des cas particuliers
peuvent parfois apparaître (par exemple différence importante en termes de nombre de colonies entre deux
boîtes de la même dilution ou de rapport des facteurs de dilution utilisés pour deux dilutions successives); il
est alors nécessaire que les résultats de comptage obtenus soient examinés et interprétés par un
microbiologiste qualifié, et éventuellement rejetés.

2017FA00916 Le 06/12/2017
D.3 Mode de calcul: Cas général (comptage des colonies en totalité ou des colonies
caractéristiques)
moins une boîte contenant au moins 10 colonies [colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies
répondant aux critères d'identification ou de confirmation (D.4)].
Si 2 boîtes de Petri par dilution sont utilisées, il convient que le rapport entre le comptage de colonies de la première
boîte et le comptage des colonies de la seconde boîte soit égal à un.
Il est recommandé que le laboratoire spécifie les limites pour le comptage des colonies de la seconde boîte.
Ces limites peuvent être celles décrites dans l'ISO 14461-2[42].

Lorsque ces limites ne sont pas respectées, le résultat doit être interprété avec précaution.
EXEMPLE 1 Si le comptage des colonies de la première boîte, avec le comptage le plus élevé, est de 250, il convient
que le comptage des colonies de la seconde boîte, avec le plus petit comptage, ne soit pas inférieur à 196 (voir
l'ISO 14461-2[42]).
La recommandation sur le rapport entre le comptage des colonies des dilutions d1 et d2 est applicable
(10.3.2.2).
Calculer le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai, en tant que la moyenne
pondérée à partir de deux dilutions successives, à l'aide de la Formule (D.1):
N=
∑C (D.1)
V × ⎡⎣ n1 + ( 0,1× n 2 ) ⎤⎦ × d
où
ΣC est la somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues à deux dilutions successives
et dont au moins une contient au moins 10 colonies;
n1 est le nombre de boîtes retenues à la première dilution;
n2 est le nombre de boîtes retenues à la seconde dilution;
d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue [d = 1 pour un produit liquide
non dilué (échantillon pour essai)].
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour cela, si le troisième chiffre est inférieur à 5, ne pas
modifier le chiffre précédent; si le troisième chiffre est supérieur ou égal à 5, augmenter le chiffre précédent
d'une unité.
Retenir comme résultat un nombre compris de préférence entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
appropriée de 10, ou un nombre entier avec 2 chiffres significatifs.
Exprimer le résultat comme suit:
⎯ nombre N de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits).
EXEMPLE 2 Un comptage a donné les résultats suivants:
à la première dilution (10− ) retenue: 168 et 215 colonies;

2
⎯
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 14 et 25 colonies.

3
⎯
N=
∑C =
168 + 215 + 14 + 25
=
422
= 19 182
V × ⎣⎡ n1 + ( 0,1× n 2 ) ⎤⎦ × d 1× ⎣⎡2 + ( 0,1× 2 ) ⎤⎦ × 10 −2 0,022

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
4
En arrondissant le résultat tel que spécifié auparavant, le nombre de micro-organismes est de 19 000 ou 1,9 × 10 par
D.4 Mode de calcul: Cas après identification (/confirmation)

Dans le cas où la méthode utilisée nécessite une identification (/confirmation), un nombre déterminé, A (en
général 5), de colonies caractéristiques présumées est ensemencé à partir de chacune des boîtes retenues
pour le comptage des colonies. Après identification (/confirmation), calculer, pour chacune des boîtes, le
nombre, a, de colonies répondant aux critères d'identification (/ de confirmation), à l'aide de la Formule (D.2):
b
a= ×C (D.2)
A
où
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification (/ de confirmation) parmi les
colonies ensemencées, A;
C est le nombre total de colonies caractéristiques présumées comptées sur la boîte.
Arrondir à un nombre entier de colonies. Pour cela, si le premier chiffre après la virgule est inférieur à 5, le
chiffre précédent n'est pas modifié; si le premier chiffre après la virgule est supérieur ou égal à 5, le chiffre
précédent est augmenté d'une unité.
Calculer le nombre N, NE ou N′ de micro-organismes identifiés (/confirmés) présents dans l'échantillon pour

essai, en remplaçant ΣC par Σa en utilisant les formules indiquées en D.3, D.5.1 et D.7.3, respectivement.
Arrondir le résultat comme spécifié en D.3.
Exprimer le résultat comme recommandé en D.3, D.5.1 et D.7.3, respectivement.
à la première dilution (10− ) retenue: 66 et 80 colonies;

3
⎯
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 4 et 7 colonies.

4
⎯
Des colonies sélectionnées ont été soumises aux essais d’identification:
⎯ des 66 colonies: 8 colonies soumises à essai, dont 6 ont répondu aux critères; d'où a = 50;
⎯ des 4 colonies: les 4 ont toutes répondu aux critères; d'où a = 4.
N=
∑a =
50 + 53 + 6 + 4
=
113
= 51 364
V × ⎣⎡ n1 + ( 0,1× n 2 ) ⎦⎤ × d 1× ⎣2 + ( 0,1× 2 ) ⎦ × 10
⎡ ⎤ −3 0,002 2
4
En arrondissant le résultat tel que spécifié en D.3, le nombre de micro-organismes est de 51 000 ou 5,1 × 10 par millilitre
ou par gramme de produit.

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D.5 Mode de calcul: Comptages estimés
D.5.1 Cas de deux boîtes (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution)
Les exigences et recommandations de 10.3.2.4.1 concernant la limite inférieure de détermination sont
applicables.
Si chacune des deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension
mère (autres produits) ou de la première dilution ensemencée ou retenue, contient moins de 10 colonies
(colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies répondant aux critères d'identification ou de
confirmation), et l'ensemble des deux boîtes contient au moins 4 colonies, calculer le nombre estimé NE de
micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai en tant que moyenne arithmétique des colonies
comptées sur les deux boîtes à l'aide de la Formule (D.3):
NE =
∑C (D.3)
Vnd
où
ΣC est la somme des colonies comptées sur les deux boîtes;
n est le nombre de boîtes retenues (dans ce cas, n = 2);
[d = 1 pour un produit liquide non dilué (échantillon pour essai)].
⎯ nombre estimé NE de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits).
à la première dilution (10− ) retenue, 8 et 9 colonies ont été comptées

2
⎯
8+9 17
NE = = = 850
1× 2 × 10 −2 0,02
2
En arrondissant le résultat tel que spécifié en D.3, le nombre estimé NE de micro-organismes est de 850 ou 8,5 × 10 par
D.5.2 Cas de deux boîtes (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution)
ne contenant aucune colonie
Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère (autres
produits) ou de la première dilution ensemencée ou retenue, ne contiennent aucune colonie, exprimer le
résultat comme suit:
moins de 1/Vd micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits);
où

[d = 1 pour un produit liquide non dilué (échantillon pour essai), d = 0,1 lorsqu'une dilution de 10−1 est
utilisée, etc.].

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013(F)
D.6 Cas particuliers (comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques

présumées)
D.6.1 Si le nombre de toutes les colonies caractéristiques et non caractéristiques, pour les deux boîtes
d'une première dilution d1, est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), avec
des colonies caractéristiques visibles ou des colonies confirmées et si, pour les deux boîtes de la dilution d2
suivante contenant jusqu'à et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique),
aucune colonie caractéristique ou confirmée n'est visible, exprimer le résultat comme suit:
moins de 1/V2d2 et plus de 1/V1d1 micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits);
où
V1 et V2 sont les volumes de l'inoculum appliqué à chaque boîte pour chaque dilution d1 et d2, en
millilitres;
d1 et d2 sont les taux de dilution correspondant aux dilutions d1 et d2.
à la première dilution (10− ) retenue: plus de 300 colonies dans chacune des deux boîtes, avec des colonies
2
⎯
caractéristiques ou confirmées présentes;
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 33 et 35 colonies, sans colonie caractéristique ou confirmée présente.
3
⎯
D.6.2 Si, pour les deux boîtes d'une première dilution d1, le nombre de toutes les colonies caractéristiques
et non caractéristiques est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), sans
colonie caractéristique visible ou sans colonie confirmée et si, pour les deux boîtes de la dilution d2 suivante
contenant jusqu'à et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), aucune
colonie caractéristique ou confirmée n'est visible, exprimer le résultat comme suit:
moins de 1/V2d2 micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits);
où
V2 est le volume de l'inoculum utilisé dans chaque boîte de la dilution ultérieure d2, en millilitres;
d2 est le taux de dilution correspondant à la dilution d2.
à la première dilution (10− ) retenue: plus de 300 colonies dans chacune des deux boîtes, sans colonie
2
⎯
caractéristiques ou confirmées présentes;
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 33 et 35 colonies, sans colonie caractéristique ou confirmée présente.
3
⎯
D.7 Mode de calcul: Cas particuliers

Les exigences et recommandations de 10.3.2.5 sont applicables.

2017FA00916 Le 06/12/2017
D.7.1 Si le nombre de colonies comptées (colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies

caractéristiques présumées) est supérieur au nombre maximal dénombrable (300 ou tout autre nombre
indiqué dans la norme spécifique) pour les deux boîtes d'une première dilution d1, avec un nombre de
colonies (colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies répondant aux critères d'identification)
inférieur à 10 (limite des petits nombres) pour les deux boîtes de la dilution d2 suivante, exprimer les résultats
comme suit:
NOTE Les éléments figurant dans le présent paragraphe sont donnés à titre d'exemple.
a) Si le nombre de colonies pour les deux boîtes de la dilution d1 est compris dans l'intervalle [nombre
maximal comptable plus 1, limite supérieure de l'intervalle de confiance du nombre maximal comptable]
(par exemple 301 à 334) (Annexe B) et que le comptage des colonies de la dilution d2 est au moins égal
à la limite inférieure spécifiée en 10.3.2.2, utiliser la méthode de calcul pour les cas généraux (voir D.3).
à la première dilution retenue (10− ): 310 et 322 colonies (comptage inférieur à 324, limite supérieure de l'intervalle
2
⎯
de confiance pour 300);
à la deuxième dilution retenue (10− ): 8 et 12 colonies. Les limites inférieures pour le comptage des colonies à la
3
⎯
dilution (10− ) sont de 18 et 19 colonies, obtenues à partir des 310 et 322 colonies de la dilution (10− ).
3 2
à la première dilution retenue (10− ): 151 et 160 colonies (comptage inférieur à 167, limite supérieure de l'intervalle
2
⎯
de confiance pour 150);
à la deuxième dilution retenue (10− ): 8 et 9 colonies — les limites inférieures pour le comptage des colonies à la
3
⎯
dilution (10− ) sont de 6 et 7 colonies, obtenues à partir des 151 et 160 colonies de la dilution 10− .
3 2
Utiliser le mode de calcul pour les cas généraux (D.3) pour les boîtes contenant les deux dilutions retenues.
b) Si le nombre de colonies pour la boîte de la dilution d1 est supérieur à la limite supérieure de l'intervalle de
confiance du nombre maximal comptable (par exemple 334) et que le comptage des colonies de la
dilution d2 pour les 2 boîtes est supérieur à la limite inférieure spécifiée en 10.3.2.2 et calculée à partir de
la limite supérieure de l'intervalle de confiance du nombre maximal comptable, ne retenir que le résultat
du comptage de la dilution d2 puis établir un nombre estimé (D.5.1).
à la première dilution retenue (10− ): plus de 324 colonies dans chacune des deux boîtes;
2
⎯
à la deuxième dilution retenue (10− ): 7 et 9 colonies — La limite inférieure pour le comptage des colonies à la
3
⎯
dilution (10−3) est de 19 colonies, obtenue à partir des 324 colonies de la dilution 10−2.
à la première dilution (10− ) retenue: plus de 167 colonies dans les deux boîtes;
2
⎯
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 8 et 9 colonies — la limite inférieure pour le comptage des colonies à la
3
⎯
dilution (10−3) est de 8 colonies, obtenue à partir des 167 colonies de la dilution 10−2.

2017FA00916 Le 06/12/2017
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Établir un comptage estimé sur la base des colonies comptées dans les deux boîtes de la dilution 10− (D.5.1).
3
à la première dilution (10− ) retenue: plus de 167 colonies dans les deux boîtes;
2
⎯
à la deuxième dilution (10− ) retenue: 5 et 7 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies à la dilution
3
⎯
(10− ) est de 8 colonies, obtenue à partir des 167 colonies de la dilution 10− .
3 2
D.7.2 Lorsque le comptage des colonies (colonies en totalité, caractéristiques ou caractéristiques

présumées) de chacune des boîtes pour toutes les dilutions ensemencées donne un nombre supérieur à 300
(ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), reporter le résultat comme suit:
«plus de 300/Vd» (cas de colonies en totalité ou caractéristiques); ou

«plus de (300/Vd) ¯ (b/A)» (cas de colonies confirmées), exprimé en micro-organismes par millilitre
(produits liquides) ou en micro-organismes par gramme (autres produits)
où
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification parmi les A colonies ensemencées.
D.7.3 Dans le cas où seules les deux boîtes de la dernière dilution ensemencée peuvent être comptées et
contiennent jusqu'à et y compris 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique) colonies
(colonies en totalité, caractéristiques ou caractéristiques présumées), calculer le nombre N ' de micro-
organismes présents dans l'échantillon pour essai en tant que moyenne arithmétique des colonies comptées
sur les deux boîtes, à l'aide de la Formule (D.4):
N' =
∑C (D.4)
Vnd
où
ΣC est la somme des colonies comptées sur les deux boîtes, et dont au moins une contient au
moins 10 colonies;
n est le nombre de boîtes retenues (dans ce cas, n = 2);
d est le facteur de dilution correspondant à la dilution retenue.
⎯ nombre N ' de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits).
à la dernière dilution (10− ) ensemencée: 120 et 130 colonies

4
⎯
120 + 130 250

N'= −4
= = 1 250 000
1× 2 × 10 0,000 2

2017FA00916 Le 06/12/2017
En arrondissant le résultat tel que spécifié en D.3, le nombre N′ de micro-organismes est de 1 300 000 ou 1,3 × 106 par
Page 67, Bibliographie
Mettre à jour la Référence [17] comme suit.
[17] WHO. Laboratory biosafety manual, 3rd edition. Geneva: World Health Organization, 2004. 184 p.
Disponible à l'adresse (consulté le 2013-01-24) :
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/en/Biosafety7.pdf
Ajouter les références suivantes.
[50] ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
[51] ISO 7712, Verrerie de laboratoire — Pipettes Pasteur à usage unique
[52] BLODGETT R.J. Serial dilution with a confirmation step. Food Microbiol. 2005, 22, pp. 547–552
[53] BLODGETT R.J. Appendix 2: Most probable number from serial dilutions. In: Bacterial analytical
manual online. Silver Spring, MD: US Food and Drug Administration, 2010. Available (viewed
2013-02-04) at:
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualB
AM/ucm109656.htm
[54] GARTHRIGHT W.E., BLODGETT R.J. FDA’s preferred MPN methods for standard, large or unusual
tests, with a spreadsheet. Food Microbiol. 2003, 20, pp. 439–445
[55] HALDANE J.B.S. Sampling errors in the determination of bacterial or virus density by the dilution
method. J. Hygiene 1939, 39, pp. 289–293
[56] JARVIS B., W ILRICH. C., W ILRICH P.T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers,
their standard deviations, confidence bounds and rarity values. J Appl. Microbiol. 2010, 109, pp.
1660–1667
[57] ISO 80000-2:2009, Grandeurs et unités — Partie 2: Signes et symboles mathématiques à

employer dans les sciences de la nature et dans la technique

2017FA00916 Le 06/12/2017
Licence pour utilisateur unique, copie et mise en réseau interdites. ISO 7218:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos...................................................................................................................................................... v
Introduction ....................................................................................................................................................... vi
1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1
2 Références normatives ........................................................................................................................ 1
3 Locaux ................................................................................................................................................... 2
3.1 Généralités ............................................................................................................................................ 2
3.2 .Considérations de sécurité................................................................................................................. 2
3.3 Conception du laboratoire ................................................................................................................... 3
3.4 Locaux du laboratoire .......................................................................................................................... 3
3.5 Implantation et aménagement des locaux ......................................................................................... 4
3.6 Nettoyage et désinfection .................................................................................................................... 5
4 Personnel............................................................................................................................................... 6
4.1 Généralités ............................................................................................................................................ 6
4.2 Compétence .......................................................................................................................................... 6
4.3 Vérification de la compétence actuelle du personnel....................................................................... 6
4.4 Hygiène .................................................................................................................................................. 6
5 Appareillage et matériel ....................................................................................................................... 7
5.1 Généralités ............................................................................................................................................ 7
5.2 Hottes de sécurité................................................................................................................................. 7
5.3 Balances et diluteurs gravimétriques................................................................................................. 9
5.4 Homogénéisateur, mélangeur et mixeurs .......................................................................................... 9
5.5 pH-mètre .............................................................................................................................................. 10
5.6 Autoclave............................................................................................................................................. 11
5.7 Préparateur de milieux de culture..................................................................................................... 13
5.8 Étuve .................................................................................................................................................... 13
5.9 Réfrigérateur, chambre froide ........................................................................................................... 14
5.10 Congélateur et surgélateur ................................................................................................................ 15
5.11 Bain thermostaté................................................................................................................................. 16
5.12 Matériels produisant de la vapeur, y compris les bains d'eau bouillante .................................... 17
5.13 Four à stériliser ................................................................................................................................... 18
5.14 Four à micro-ondes ............................................................................................................................ 18
5.15 Lave-verrerie ....................................................................................................................................... 19
5.16 Microscope optique ............................................................................................................................ 20
5.17 Brûleur à gaz ou incinérateur à fil..................................................................................................... 20
5.18 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs .............................................................................. 21
5.19 Agitateur vortex .................................................................................................................................. 22
5.20 Dispositif de comptage des colonies ............................................................................................... 22
5.21 Matériel pour culture en atmosphère modifiée................................................................................ 23
5.22 Centrifugeuse...................................................................................................................................... 23
5.23 Plaque chauffante et chauffe-ballons ............................................................................................... 24
5.24 Ensemenceur spiral............................................................................................................................ 24
5.25 Distillateurs, déionisateurs et osmoseurs ....................................................................................... 25
5.26 Minuteurs et minuteries ..................................................................................................................... 26
5.27 Pipettes et pipetteurs ......................................................................................................................... 26
5.28 Thermomètres et dispositifs de surveillance de la température, incluant les enregistreurs
automatiques....................................................................................................................................... 27
5.29 Séparateur immunomagnétique........................................................................................................ 29
5.30 Système de filtration........................................................................................................................... 29
5.31 Autres matériels et logiciels .............................................................................................................. 29
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2017FA00916 Le 06/12/2017
ISO 7218:2007(F) Licence pour utilisateur unique, copie et mise en réseau interdites.
6 Préparation de la verrerie et du matériel .......................................................................................... 29

6.1 Préparation .......................................................................................................................................... 29
6.2 Stérilisation/décontamination............................................................................................................ 30
6.3 Matériel à usage unique ..................................................................................................................... 30
6.4 Stockage de la verrerie et du matériel .............................................................................................. 30
6.5 Gestion de la verrerie et du matériel stériles ................................................................................... 30
6.6 Utilisation de la décontamination et de la désinfection.................................................................. 30
6.7 Gestion des déchets ........................................................................................................................... 31
6.8 Lavage .................................................................................................................................................. 32
7 Préparation et stérilisation des milieux de culture.......................................................................... 32
8 Échantillons pour le laboratoire ........................................................................................................ 32
8.1 Prélèvement ......................................................................................................................................... 32
8.2 Transport.............................................................................................................................................. 32
8.3 Réception ............................................................................................................................................. 33
8.4 Stockage .............................................................................................................................................. 34
8.5 Prise d'essai ........................................................................................................................................ 34
9 Examen................................................................................................................................................. 34
9.1 Précautions hygiéniques pendant l'analyse .................................................................................... 34
9.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions....................................................................... 36
10 Dénombrement .................................................................................................................................... 37
10.1 Généralités........................................................................................................................................... 37
10.2 Dénombrement sur milieu solide ...................................................................................................... 37
10.3 Calcul et expression des résultats sur milieu solide ...................................................................... 40
10.4 Dénombrement des levures et moisissures..................................................................................... 46
10.5 Dénombrement en milieu liquide ...................................................................................................... 46
11 Méthode de détection (méthode qualitative).................................................................................... 52
11.1 Généralités........................................................................................................................................... 52
11.2 Principe ................................................................................................................................................ 53
11.3 Mesure de l'incertitude ....................................................................................................................... 53
12 Méthodes de confirmation ................................................................................................................. 53
12.1 Généralités........................................................................................................................................... 53
12.2 Préparation d'une culture pure .......................................................................................................... 53
12.3 Coloration de Gram (technique de Hucker modifiée)...................................................................... 53
12.4 Utilisation de galeries biochimiques pour l'identification .............................................................. 55
12.5 Utilisation de sondes nucléiques pour l'identification.................................................................... 55
12.6 Méthodes sérologiques ...................................................................................................................... 56
13 Rapport d'essai ................................................................................................................................... 57
14 Validation des méthodes microbiologiques..................................................................................... 57
14.1 Validation des méthodes de référence ............................................................................................. 57
14.2 Validation des méthodes alternatives............................................................................................... 57
14.3 Validation des méthodes d'analyse internes ................................................................................... 57
15 Assurance qualité des résultats/contrôle de la qualité des performances .................................. 57
15.1 Contrôle interne de la qualité............................................................................................................. 57
15.2 Souches de référence......................................................................................................................... 58
15.3 Évaluation externe de la qualité (essai d'aptitude).......................................................................... 58
Annexe A (informative) Propriétés de certains désinfectants ................................................................... 59
Annexe B (normative) Détermination du nombre le plus probable (NPP) ................................................ 60
Bibliographie .................................................................................................................................................... 67
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 7218 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales.
Cette troisième édition annule et remplace le deuxième édition (ISO 7218:1996), qui a fait l'objet d'une
révision technique. Elle incorpore également l'Amendement ISO 7218:1996/Amd.1:2001.
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2017FA00916 Le 06/12/2017
Introduction
Lorsque des examens microbiologiques sont effectués, il est particulièrement important
⎯ d'isoler ou de dénombrer seulement les micro-organismes présents dans les échantillons, et
⎯ que les micro-organismes ne contaminent pas l'environnement.
Pour cela, il est nécessaire de veiller à l'hygiène du personnel et d'utiliser des techniques de travail qui
assurent, autant que possible, l'absence de contamination par l'environnement de l'essai.
Puisqu'il n'est possible de donner dans la présente Norme internationale que quelques exemples des
précautions à prendre pendant les examens microbiologiques, une connaissance approfondie des techniques
microbiologiques et des micro-organismes en question est essentielle. Il est important que les examens soient
conduits avec le plus de précision possible, qu'ils comprennent les aspects liés au contrôle et à
l'enregistrement pouvant avoir une incidence sur les résultats ainsi que sur le calcul du nombre de micro-
organismes et de l'incertitude de mesure des résultats.
En dernier ressort, c'est au responsable du laboratoire de juger de la sécurité des manipulations et de la

bonne pratique de laboratoire.
De nombreuses manipulations peuvent, par exemple, entraîner involontairement des contaminations croisées
et il est recommandé que l'analyste vérifie toujours la fiabilité des résultats donnés par la méthode.
Afin d'exécuter les examens de façon correcte, il est nécessaire de prendre certaines précautions lors de la
construction et de l'installation du laboratoire.
Certaines précautions sont à prendre, non seulement pour des raisons d'hygiène, mais également pour
assurer une bonne reproductibilité des résultats. Il n'est pas possible de spécifier toutes les précautions à
prendre selon les circonstances, mais au moins la présente Norme internationale décrit-elle les mesures
principales à prendre lors de la préparation, de la stérilisation et de la conservation des milieux et de
l’utilisation du matériel.
Si les recommandations indiquées dans la présente Norme internationale sont suivies, elles contribueront
également à la protection de la santé et de la sécurité du personnel. Pour de plus amples informations à ce
sujet, consulter la littérature mentionnée dans la Bibliographie.
Afin de distinguer les recommandations dans la présente Norme internationale, celles-ci ont été imprimées
dans une fonte différente (Times New Roman).
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2017FA00916 Le 06/12/2017
NORME INTERNATIONALE ISO 7218:2007(F)
Microbiologie des aliments — Exigences générales et

recommandations
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie des exigences générales et des recommandations/options visant
trois utilisations principales:
⎯ l'application des normes élaborées par l'ISO TC 34/SC 9 ou l'ISO TC 34/SC 5 pour la détection ou le
dénombrement des micro-organismes, nommées ci-après «normes spécifiques»;
⎯ la bonne pratique de laboratoire pour les laboratoires de microbiologie alimentaire (la présente Norme
internationale ne vise pas à les détailler, des manuels sont disponibles à cet effet);
⎯ les recommandations relatives à l'accréditation des laboratoires de microbiologie alimentaire (la présente
Norme internationale décrit les exigences techniques conformes à l'Annexe B de l'ISO/CEI 17025:2005
relative à l'accréditation d'un laboratoire de microbiologie par les organismes nationaux).
Les exigences de la présente Norme internationale prennent le pas sur les exigences correspondantes des
normes spécifiques existantes.
Des instructions supplémentaires concernant les examens de biologie moléculaire sont spécifiées
dans l'ISO 22174.
La présente Norme internationale couvre l'examen pour les bactéries, les levures et les moisissures et peut
être utilisée si elle est complétée par des recommandations spécifiques sur les prions, les parasites et les
virus. La présente Norme internationale ne traite pas de l'examen des toxines ou autres métabolites (par
exemple les amines) provenant de micro-organismes.
La présente Norme internationale s'applique à la microbiologie des aliments, des aliments pour animaux, à
l'environnement de production d'aliments et à l'environnement de production primaire.
L'objet de la présente Norme internationale est d'aider à garantir la validité des examens microbiologiques
des aliments, à s'assurer que les méthodes générales utilisées pour effectuer ces examens sont les mêmes
dans tous les laboratoires, à participer ainsi à l'obtention de résultats homogènes dans les différents
laboratoires et à contribuer à la sécurité du personnel de laboratoire, en prévenant les risques d'infection.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 835 (toutes les parties), Verrerie de laboratoire — Pipettes graduées
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 8199, Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture

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ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 8655-1, Appareils volumétriques à piston — Partie 1: Définitions, exigences générales et

recommandations pour l'utilisateur
ISO/TS 11133 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production
des milieux de culture
ISO 16140, Microbiologie des aliments — Protocole pour la validation des méthodes alternatives
ISO/TS 19036, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour l'estimation de l'incertitude de mesure
pour les déterminations quantitatives
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Locaux
3.1 Généralités
Le présent article décrit les exigences générales, par exemple le principe de conception et d'organisation,
relatives à l'aménagement du laboratoire de microbiologie.
Les examens des échantillons de la production primaire (spécialement pour la réception et la préparation des
échantillons) doivent être séparés des examens des autres échantillons afin de réduire les risques de
contaminations croisées.
3.2 .Considérations de sécurité
La conception du laboratoire doit être conforme aux exigences en matière de sécurité qui dépendent du type
de micro-organisme. À cet effet, les micro-organismes sont répartis en quatre catégories de risque:
⎯ Catégorie de risque 1 (aucun risque ou risque très faible pour l'individu et la collectivité).
Micro-organisme dont la probabilité de causer une maladie chez l'homme et l'animal est faible.
⎯ Catégorie de risque 2 (risque modéré pour l'individu et faible pour la collectivité).
Agent pathogène pouvant provoquer une maladie chez l'homme ou l'animal, mais présentant un faible
risque pour le personnel de laboratoire, la collectivité ou l'environnement. Il peut présenter un danger
sérieux pour le personnel de laboratoire exposé à celui-ci, mais il existe un traitement efficace et des
mesures de prophylaxie. Le risque de propagation de l'infection est limité.
⎯ Catégorie de risque 3 (risque élevé pour l'individu et faible pour la collectivité).
Agent pathogène provoquant généralement des maladies graves chez l'homme ou l'animal, mais qui
normalement ne se propage pas d'un individu infecté à un autre. Il existe un traitement efficace et des
mesures de prophylaxie.
⎯ Catégorie de risque 4 (risque élevé pour l'individu et la collectivité).
Agent pathogène provoquant généralement des maladies graves chez l'homme ou l'animal et pouvant se
transmettre facilement d'un individu à l'autre, directement ou indirectement. Il n'existe généralement pas
de traitement efficace, ni de mesures de prophylaxie.

2017FA00916 Le 06/12/2017
AVERTISSEMENT — Se référer aux réglementations nationales définissant en particulier la catégorie

de risque des micro-organismes présents dans le pays concerné.
3.3 Conception du laboratoire
Les lignes directrices relatives à l'aménagement du laboratoire décrites ci-après portent sur les examens
visant à détecter les micro-organismes appartenant aux catégories de risque 1, 2 et 3.
Il est recommandé de noter que des mesures de sécurité supplémentaires peuvent être nécessaires en fonction de la
législation en vigueur.
3.4 Locaux du laboratoire
Le laboratoire comprend les zones dédiées à la manipulation des échantillons et aux essais (voir 3.4.2) et les
zones à usage général (voir 3.4.3). Elles doivent être séparées.
3.4.2 Locaux dédiés à la manipulation des échantillons et aux essais
On considère comme étant de la bonne pratique de disposer de locaux séparés ou de zones clairement identifiées, pour
réaliser les manipulations suivantes:
⎯ la réception et le stockage des échantillons;
⎯ la préparation des échantillons, en particulier dans le cas des matières premières (par exemple les produits en poudre
contenant un nombre élevé de micro-organismes);
⎯ l'examen des échantillons (à partir de la suspension mère), y compris l'incubation des micro-organismes;
⎯ la manipulation d'agents présumés pathogènes;
⎯ le stockage des souches de référence et de souches d'autres micro-organismes;
⎯ la préparation et la stérilisation des milieux de culture et du matériel;
⎯ le stockage des milieux de culture et des réactifs;
⎯ le contrôle de la stérilité des produits alimentaires;
⎯ la décontamination;
⎯ le nettoyage de la verrerie et des autres matériels;
⎯ le stockage des produits chimiques dangereux, de préférence dans des sorbonnes, des armoires, des salles ou des
bâtiments spécifiques.
3.4.3 Locaux généraux
Sont considérés dans cette catégorie les locaux suivants:
⎯ les accès, les couloirs, les escaliers, les monte-charges ou les ascenseurs;
⎯ les locaux administratifs (par exemple secrétariat, bureaux, salles de documentation, etc.);
⎯ les vestiaires et les sanitaires;
⎯ les salles d'archive;

2017FA00916 Le 06/12/2017
⎯ les magasins;
⎯ les salles de repos.
3.5 Implantation et aménagement des locaux
3.5.1 Objectifs
L’objectif est de s’assurer que l'environnement dans lequel les examens microbiologiques sont effectués
n’affecte pas la fiabilité des essais.
Agencer les locaux de façon à éviter les risques de contamination croisée. Pour atteindre cet objectif, il faut,
par exemple:
a) construire le laboratoire en appliquant le principe de la «marche en avant»;
b) exécuter les modes opératoires de façon séquentielle, en prenant les précautions appropriées permettant
de garantir l'intégrité de l'essai et de l'échantillon (par exemple en utilisant des conteneurs étanches);
c) séparer les activités dans le temps ou l'espace.
Éviter les conditions extrêmes telles que l'excès de température, de poussière, d'humidité, de vapeur, de bruit,
de vibration, etc.
Il est recommandé que la surface soit suffisante pour maintenir les zones de travail propres et en ordre. Il est recommandé
que la surface requise soit adaptée au volume des analyses réalisées et à l'organisation générale interne du laboratoire. Il
est recommandé enfin que la surface soit conforme aux réglementations nationales, le cas échéant.
3.5.2 Aménagement
Il est recommandé que les locaux d'essai soient conçus et équipés comme suit, de façon à réduire le risque de
contamination par la poussière et donc par les micro-organismes (pour les micro-organismes de classe 3, se référer aux
réglementations nationales).
a) Il est recommandé que les murs, les plafonds et les sols soient lisses, faciles à nettoyer, résistants aux produits
détergents et aux désinfectants utilisés dans les laboratoires.
b) Il est recommandé que les sols soient antidérapants.
c) À moins d'être hermétiquement enfermées, il est recommandé que les conduites de fluides en hauteur ne traversent
pas les locaux; il est recommandé que toutes les structures en hauteur soient recouvertes ou facilement accessibles
pour permettre un nettoyage régulier.
d) Il est recommandé que les fenêtres et les portes puissent être fermées lors des essais afin de réduire le plus possible
tout courant d'air; d'autre part, il est recommandé que leur conception permette d'éviter les nids à poussière en
facilitant leur nettoyage. Il est recommandé que la température ambiante (comprise entre 18 °C et 27 °C) et la
qualité de l'air (teneur en micro-organismes, taux d'empoussièrement, etc.) soient compatibles avec la conduite des
essais. À cet effet, il est recommandé d'installer un système de ventilation à filtre pour l'air aspiré et l'air évacué.
e) Il est recommandé d'installer un système d'extraction approprié afin d'éviter toute exposition à la poussière résultant
de la manipulation des milieux de culture déshydratés et des échantillons pulvérulents ou en poudres.
f) Quand des essais sont à réaliser en atmosphère très peu contaminée, il est recommandé que le local soit
spécialement équipé dúne hotte à flux dáir laminaire et/ou dúne hotte de sécurité.
g) Le cas échéant, il est recommandé de protéger l'environnement du laboratoire des effets nocifs des rayonnements
solaires en utilisant des fermetures ou des panneaux en verre traité prévus à cet effet. Il est déconseillé d'utiliser des
stores à l'intérieur, ceux-ci pouvant s'avérer difficiles à nettoyer et devenir une source de poussières.

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3.5.3 Autres points
Il est recommandé de prendre en compte les éléments suivants:
⎯ alimentation en eau; considérer la qualité de l'eau en fonction de l'utilisation qui en est faite;
⎯ électricité;
⎯ gaz (de ville ou en bouteille);
⎯ éclairage suffisant dans toutes les parties du laboratoire;
⎯ il est recommandé que les paillasses et le mobilier de laboratoire soient constitués de matériaux lisses, imperméables,
faciles à nettoyer et à désinfecter;
⎯ il est recommandé que les mobiliers de laboratoire soient conçus pour faciliter le nettoyage des sols (par exemple
meubles mobiles);
⎯ il est recommandé de ne conserver aucun meuble, document ou élément autre que ceux strictement nécessaires aux
activités d'essai dans la zone dédiée aux essais;
⎯ il est recommandé que des équipements de stockage soient disponibles pour le rangement des documents utilisés
lors de la manipulation des échantillons, des milieux de culture, des réactifs, etc.;
⎯ pour le lavage des mains, il est recommandé d'installer des lavabos dans chaque salle de laboratoire, et, le cas
échéant, dans les locaux généraux, de préférence près de la porte;
⎯ il est recommandé de prévoir un autoclave pour la destruction des déchets et des milieux de culture contaminés; à
moins de disposer d'un système approprié d'élimination des déchets contaminés destinés à être incinérés;
⎯ il est recommandé que les systèmes de sécurité comprennent des installations de secours en cas d'incendie,
d'accident électrique ainsi qu'une douche d'urgence et un équipement pour le lavage des yeux;
⎯ il est recommandé de prévoir du matériel de premier secours.
3.6 Nettoyage et désinfection
Il est recommandé de vérifier les éléments suivants.
a) Il est recommandé d'entretenir et de réparer régulièrement les sols, les murs, les plafonds, les paillasses, les
mobiliers de laboratoire ainsi que les points où ils sont en contact ou se rejoignent, afin d'éviter l'apparition de
fissures pouvant constituer une source de contamination.
b) Il est recommandé de procéder régulièrement au nettoyage et à la désinfection des locaux afin de les maintenir dans
un état compatible avec la réalisation des essais. Il est recommandé que les surfaces contaminées ou potentiellement
contaminées soient décontaminées à l'aide d'un désinfectant connu pour son action bactéricide et fongicide.
NOTE 1 Les salles et le matériel peuvent être décontaminés par fumigation à l'aide de formaldéhyde en phase vapeur, si cela est
autorisé par les réglementations nationales.
c) Il est recommandé d'entretenir régulièrement les systèmes de ventilation et leurs filtres, et de changer ces derniers
autant que nécessaire.
d) Il est recommandé de contrôler régulièrement la qualité microbiologique des surfaces de travail du laboratoire, des
surfaces en contact avec le personnel et de l'air (la fréquence dépend des résultats de l'essai précédent).
e) La contamination des surfaces peut être estimée par application directe d'une boîte de contact dont la gélose contient
des agents neutralisants contre les désinfectants (tels que la lécithine, le thiosulfate de sodium). La qualité de l'air
peut être examinée par exposition pendant 15 min d'une boîte de Petri ouverte contenant un milieu de culture gélosé

2017FA00916 Le 06/12/2017
non sélectif (par exemple «plate count agar» — PCA) ou un milieu de culture gélosé sélectif approprié pour le
micro-organisme cible cherché (par exemple moisissures).
NOTE 2 D'autres méthodes peuvent également être utilisées pour estimer la contamination des surfaces et de l'air.
Voir l'ISO 18593.
4 Personnel
4.1 Généralités
Les exigences générales relatives aux compétences du personnel du laboratoire sont décrites dans l'ISO/CEI 17025.
4.2 Compétence
Des critères objectifs doivent être définis pour l'évaluation des compétences appropriées à chaque méthode
ou technique, dès l'origine et par la suite.
Les compétences peuvent être établies dans le laboratoire par le biais d'un contrôle qualité interne (voir 15.1.2).
NOTE L'une des méthodes permettant de rechercher la cause de performances insuffisantes (pipetage, défaut d'homogénéité de
la suspension mère, comptage, etc.) dans le cas de dénombrements par comptage des colonies est indiquée dans l'ISO 14461-1.
4.3 Vérification de la compétence actuelle du personnel
Il est recommandé que la compétence actuelle du personnel soit évaluée régulièrement par rapport à des paramètres
objectifs. Cela comprend la participation à des programmes internes de management de la qualité, à des essais d'aptitude
(se référer au Guide ISO/CEI 43-1), l'utilisation de matériaux de référence ou la réalisation d'essais d'auto-évaluation
pour le dénombrement des micro-organismes tel que décrit dans l'ISO 14461-2.
4.4 Hygiène
Dans le domaine de l'hygiène du personnel, les précautions suivantes doivent être prises pour éviter la
contamination des échantillons et des milieux de culture, et pour éviter des risques d'infection du personnel.
a) Porter des vêtements de laboratoire correctement fermés, propres et en bon état, réalisés dans un tissu
limitant les risques d'inflammabilité. Ces vêtements ne doivent pas être portés hors des locaux d'essai et,
éventuellement, des vestiaires.
b) Porter des protections pour les cheveux et la barbe, si nécessaire pour l'intégrité de l'échantillon.
c) Garder des ongles propres et, de préférence, courts.
d) Se laver soigneusement les mains à l'eau tiède, distribuée de préférence par un robinet à commande non
manuelle avant et après les examens microbiologiques et immédiatement après chaque passage aux
toilettes. Utiliser un savon liquide ou solide, éventuellement un désinfectant, délivré de préférence par un
distributeur maintenu en bon état de propreté. Pour se sécher les mains, utiliser des serviettes en papier
ou en tissu à usage unique. Ces précautions sont valables tant pour les employés du laboratoire que
pour les visiteurs.
e) Pendant le travail avec des échantillons, des cultures ou des milieux contaminés, et pendant les
ensemencements, éviter de parler, de tousser, etc.;
f) Les personnes présentant des infections de la peau ou des maladies doivent prendre des précautions
particulières si les micro-organismes de ces infections ou maladies sont susceptibles de contaminer les
échantillons et risquent de fausser les résultats.

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g) Ne pas manger ni boire dans le laboratoire et ne pas placer d'aliments destinés à la consommation
personnelle dans les réfrigérateurs et les congélateurs du laboratoire.
h) Le pipetage à la bouche est à proscrire.
5 Appareillage et matériel
5.1 Généralités
Conformément à la bonne pratique de laboratoire, il est recommandé que tous les appareils et matériel soient propres et
en bon état de fonctionnement. Avant utilisation, il est recommandé de vérifier que le matériel est adapté à la finalité
prévue et de contrôler ses performances lors de son utilisation, le cas échéant.
Si nécessaire, il est recommandé d'étalonner le matériel et les dispositifs de surveillance à l'aide d'étalons nationaux
identifiés et de procéder au réétalonnage et à toutes vérifications intermédiaires avec des modes opératoires et des
résultats documentés.
Il est recommandé de vérifier et d'entretenir régulièrement le matériel afin de garantir son aptitude à l'emploi et la
sécurité. Il est recommandé de contrôler le matériel en fonction des conditions d'utilisation et de l'exactitude exigée par
les résultats.
Dans la plupart des cas, la fréquence d'étalonnage et de vérification de chaque pièce d'équipement n'est pas
mentionnée dans la présente Norme internationale, étant donné que cette fréquence doit être déterminée par
chaque laboratoire en fonction du type d'équipement, du niveau d'activité du laboratoire, ainsi que des
instructions du fabricant. Dans certains cas, et lorsqu'elle est considérée comme essentielle, la fréquence a
été spécifiée.
L'appareillage et le matériel doivent être construits et installés de sorte à faciliter leur utilisation, entretien,
nettoyage, décontamination et étalonnage.
Toutes les incertitudes de mesure données dans le présent chapitre correspondent à l'appareillage et à
l'équipement concernés, et non pas à l'ensemble de la méthode d'analyse.
Dans tout ce chapitre, des recommandations pour l'exactitude de la mesure de l'appareillage de mesure sont
données. Celles-ci sont basées sur la tolérance pratique recommandée pour démontrer le contrôle approprié
du matériel de routine. L'exactitude indiquée est liée à l'incertitude métrologique du dispositif (se référer au
Guide ISO 99).
Pour le matériel possédant un contrôle de la température, vérifier la stabilité et l’homogénéité de la

température avant l’utilisation initiale et après n'importe quelle réparation ou modification qui pourrait avoir un
effet sur le contrôle de la température.
5.2 Hottes de sécurité
5.2.1 Description
Une hotte de sécurité est un poste de travail à écoulement d'air laminaire horizontal ou vertical conçu pour
retirer de l'air la poussière et les autres particules, tels que les micro-organismes.
Le nombre maximal admissible de particules de dimension supérieure ou égale à 0,5 µm par mètre cube
correspond à la classe d'empoussièrement d'une hotte de sécurité. Pour les hottes utilisées en microbiologie
alimentaire, le nombre de particules ne doit pas dépasser 4 000 par mètre cube.
Les hottes utilisées dans les laboratoires de microbiologie alimentaire sont de quatre types.
a) Les hottes de sécurité de classe I sont des hottes ouvertes sur le devant avec évacuation de l'air,
destinées à la protection de l'opérateur et de l'environnement mais qui ne protègent pas le produit d'une

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contamination par l'environnement de l'essai. Les aérosols potentiellement infectés sont contenus dans la
hotte et retenus sur le filtre par impaction. Généralement, l'air filtré est évacué dans l'atmosphère; si ce
n'est pas le cas, l'air doit passer à travers deux filtres HEPA montés en série. Lorsque les travaux
impliquent des agents pathogènes appartenant au groupe de risque 3, il est déconseillé d'utiliser ces
hottes, en raison des difficultés à assurer la protection de l'opérateur.
b) Les hottes de sécurité de classe II protègent le produit, l'opérateur et l'environnement. Elles font recirculer
une quantité d'air filtré, évacuent une quantité d'air dans l'atmosphère qui est remplacée par de l'air
entrant par l'ouverture de travail, ce qui assure la protection de l'opérateur. Elles conviennent pour un
travail effectué avec des agents pathogènes du groupe de risque 3.
c) Les hottes à flux d'air laminaire horizontal protègent le travail de la contamination, mais expulsent tout
aérosol généré en direction du visage de l'opérateur. Par conséquent, elles ne conviennent pas à la
manipulation de cultures ensemencées ou à la préparation de cultures tissulaires.
d) Les hottes à flux d'air laminaire vertical protègent le produit en utilisant le flux d'air laminaire vertical
traversant le filtre HEPA. Elles protègent également l'opérateur grâce à la recirculation de l'air à l'intérieur.
Elles sont particulièrement indiquées pour créer un environnement aseptique approprié à la manipulation
de produits stériles et pour la protection de l'opérateur lors de la manipulation de poudres.
Utiliser des hottes de sécurité pour tout travail impliquant la manipulation d'agents pathogènes et de poudres
contaminées, si cela est requis par les réglementations nationales.
L'utilisation d'un brûleur à gaz ou d'un incinérateur à fil n'est pas recommandée dans les hottes de sécurité. Si nécessaire,
il est recommandé que le brûleur à gaz produise une petite flamme pour ne pas perturber le flux d'air. L'utilisation de
matériel à usage unique (anses, pipettes, etc.) constitue une alternative appropriée.
5.2.2 Utilisation
Il est recommandé d'utiliser le moins de matériel possible à l'intérieur de la hotte.
Dans la mesure du possible, placer tous les éléments nécessaires à l'intérieur de la hotte avant de
commencer le travail, afin de réduire le plus possible les mouvements de bras à l'intérieur et à l'extérieur de
l'ouverture de travail. Placer le matériel et les accessoires de sorte à réduire le plus possible les perturbations
du flux d'air au niveau de l'ouverture de travail.
Il est recommandé que les opérateurs reçoivent une formation adaptée à l'utilisation correcte des hottes afin de garantir
leur sécurité et l'intégrité du produit ou de la culture.
Nettoyer et désinfecter la zone de travail après utilisation à l'aide d'un désinfectant approprié et non corrosif
selon les instructions du fabricant. Vérifier régulièrement les grilles de protection des préfiltres et les nettoyer
avec un tissu imprégné d'un désinfectant.
En ce qui concerne les hottes à flux laminaire, il est recommandé d'aspirer régulièrement la face du filtre en prenant soin
de ne pas endommager le matériau filtrant.
Il est recommandé de fumiger les hottes de sécurité avant de procéder au changement ou à l'entretien du filtre.
Après nettoyage des hottes, des lampes UV peuvent être utilisées pour la désinfection. Il est recommandé de nettoyer et
de remplacer régulièrement les lampes UV, conformément aux instructions du fabricant.
5.2.4 Entretien et contrôle
Utiliser des hottes de sécurité adaptées aux conditions d'utilisation et aux conditions environnementales
propres au laboratoire.

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Contrôler l'efficacité d'une hotte de sécurité lors de sa réception puis à intervalles réguliers, selon les
recommandations du fabricant, par une personne qualifiée et après toute réparation ou modification.
Il est recommandé de vérifier périodiquement l'absence de contaminations microbiennes par des contrôles de la surface
de la zone de travail et des parois de la hotte.
Il est recommandé de procéder à une vérification périodique du taux de micro-organismes présents dans l'air pendant le
fonctionnement des filtres en utilisant l'équipement habituel. Par exemple, exposer plusieurs boîtes de Petri ouvertes
contenant un milieu gélosé non sélectif (par exemple PCA) pendant 30 min dans chaque hotte. D'autres méthodes
5.3 Balances et diluteurs gravimétriques
5.3.1 Utilisation et incertitude de mesure
Les balances sont principalement utilisées pour peser la prise d'essai de l'échantillon à analyser et les
composants des milieux de culture et des réactifs. De plus, il est possible de les utiliser pour peser le volume
de diluant nécessaire.
Les diluteurs gravimétriques sont des instruments électroniques, constitués d'une balance et d'un répartiteur
de liquide programmable. Ils sont utilisés pendant la préparation des suspensions mères des échantillons et
fonctionnent en ajoutant du diluant à une prise d'essai selon un rapport défini. La prise d'essai est pesée
selon la tolérance spécifiée pour l'application et le diluteur est réglé pour délivrer suffisamment de diluant pour
le rapport requis (par exemple, 9 à 1 pour les dilutions décimales).
Un laboratoire de microbiologie alimentaire doit être équipé de balances adaptées en portée et en incertitude
de mesure aux différents produits à peser.
Sauf spécification contraire, il est recommandé que les erreurs maximales tolérées soient de 1 % ou mieux, lors de la
pesée des échantillons.
Poser le matériel sur un support horizontal stable, ajusté si nécessaire de sorte à garantir une position plane
et à le protéger des vibrations et des courants d'air.
Il est recommandé de nettoyer et de désinfecter le matériel après utilisation ou à la suite d'un déversement de matières en
cours de pesée, à l'aide d'un désinfectant non corrosif approprié.
5.3.3 Vérification des performances et étalonnage
Les performances du système de pesage doivent être régulièrement vérifiées durant l'utilisation et après le
nettoyage, avec des masses de contrôle, par une personne qualifiée. L'étalonnage doit être vérifié sur
l'ensemble du domaine de travail par une personne qualifiée à une fréquence définie en fonction de
l'utilisation.
Il est également recommandé de vérifier les masses de contrôle immédiatement après l'étalonnage de la balance.
5.4 Homogénéisateur, mélangeur et mixeurs
5.4.1 Description
Cet appareil est utilisé pour préparer la suspension mère à partir de l'échantillon pour essai des produits
non liquides.
Il est possible d'utiliser l'un des appareils suivants:

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⎯ un mélangeur de type péristaltique (stomacher) avec des sacs stériles et comportant éventuellement un variateur de
vitesse et un minuteur; ou
⎯ un homogénéisateur de type rotatif (blender), dont la vitesse théorique est comprise entre 8 000 r/min
et 45 000 r/min, équipé de bols en verre ou en métal stérilisables et munis d'un couvercle; ou
⎯ un homogénéisateur par vibrations (pulsifier) avec des sacs stériles; ou
⎯ un autre système d'homogénéisation d'efficacité équivalente.
Dans certains cas, le mélange manuel peut être réalisé en utilisant des billes de verre stériles de diamètre approprié
(environ 6 mm; voir l'ISO 6887-2 à l'ISO 6887-4 et l'ISO 8261).
5.4.2 Utilisation
La durée habituelle de fonctionnement d'un homogénéisateur péristaltique est comprise entre 1 min et 3 min
lors d’un essai (voir l'ISO 6887-2 à l'ISO 6887-4 et l'ISO 8261 pour des aliments spécifiques).
Ne pas utiliser ce type d'appareil pour certains produits alimentaires, tels que:
⎯ les produits risquant d'entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues, dures ou
sèches);
⎯ les produits difficiles à homogénéiser de par leur texture (par exemple saucisson sec).
L'homogénéisateur rotatif doit fonctionner pendant une durée telle que le nombre total de tours soit compris
entre 15 000 r/m et 20 000 r/m inclus. Même avec l'homogénéisateur le plus lent, cette durée ne doit pas
dépasser 2,5 min.
Il est possible d'utiliser l'homogénéisateur par vibrations pour la plupart des produits alimentaires, y compris les produits
durs ou secs. La durée de fonctionnement habituelle est comprise entre 0,5 min et 1 min. S'il est probable que des
organismes soient présents au cœur de structures cohésives, il est recommandé de découper l'échantillon en petits
morceaux avant de le traiter.
Les billes de verre peuvent être utilisées pour la préparation, par agitation, des suspensions mères de certains produits
visqueux ou épais, notamment certains produits laitiers (voir les normes spécifiques).
Nettoyer et désinfecter régulièrement les homogénéisateurs péristaltiques et les homogénéisateurs par

vibrations, ainsi qu'à la suite de tout déversement de matière ou de toute fuite des sacs.
En ce qui concerne les homogénéisateurs rotatifs, nettoyer et stériliser les bols en verre ou en métal après
chaque utilisation.
5.4.4 Entretien
5.5 pH-mètre
5.5.1 Description
Un pH-mètre est utilisé pour mesurer la différence de potentiel, à une température déterminée, entre une
électrode de mesure et une électrode de référence, toutes deux étant introduites dans le produit. Il doit être
capable de réaliser des mesurages à une précision de ± 0,05 unité pH, et sa résolution doit être de
0,01 unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de compensation de température soit manuel, soit
automatique.

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NOTE L'électrode de mesure et l'électrode de référence sont généralement réunies en un système d'électrodes combinées.
5.5.2 Utilisation
Un pH-mètre sert à mesurer la valeur du pH des milieux de culture et de réactifs pour vérifier si un ajustement
de cette valeur est nécessaire durant la préparation et fait office de contrôle qualité après la stérilisation.
Il peut également servir à mesurer la valeur du pH des échantillons et des suspensions échantillons. L'utilisation d'un pH-
mètre est mentionnée dans la norme spécifique du produit à analyser qui précise les conditions de la détermination de la
valeur du pH et de l'ajustement de la valeur du pH.
Ajuster le pH-mètre conformément aux indications du manuel du fabricant en vue de procéder à la mesure de
la valeur du pH à une température standard, par exemple 25 °C. Relever la valeur du pH après stabilisation.
Enregistrer la valeur à la seconde décimale près.
NOTE La lecture peut être considérée comme stable lorsque la valeur du pH mesuré sur une période de 5 s ne varie pas de plus
de 0,02 unité pH. En utilisant des électrodes en bon état, l'équilibre est normalement atteint dans les 30 s.
5.5.3 Vérification et calibrage
Vérifier le pH-mètre selon les instructions du fabricant, avec au moins deux, et de préférence trois, solutions
tampon étalon au moins chaque jour avant utilisation. Définir les erreurs maximales tolérées pour cette
vérification, en fonction de l'utilisation.
La valeur du pH des solutions étalon doit être spécifié à la seconde décimale près, à la température de
mesure (en général pH 7,00 et pH 4,00 et/ou pH 9,00 à 25 °C, conformément aux instructions du fabricant).
Les solutions étalon utilisées doivent encadrer la valeur du pH à mesurer.
Après la vérification du pH-mètre avec les deux solutions tampon standard traçables, le pH peut être vérifié par
l'utilisation d'une troisième solution tampon, à savoir une solution tampon de contrôle, par exemple pH 5 ou 8.
Lorsque les vérifications donnent un résultat supérieur au seuil d'erreur maximale tolérée, calibrer le pH-mètre
L'opération de calibrage peut être suivie d'un étalonnage permettant d'estimer l'incertitude de mesure du pH-mètre.
5.5.4 Entretien
Vérifier et entretenir les électrodes selon les instructions du fabricant. Il est nécessaire, en particulier, de
surveiller régulièrement
⎯ le vieillissement et l'encrassement des électrodes, et
⎯ le temps de réponse et la stabilité.
Rincer les électrodes avec de l'eau distillée ou déionisée après chaque utilisation. Pour tenir compte de
l'encrassement et du vieillissement des électrodes, les nettoyer soigneusement et régulièrement,
Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant.
5.6 Autoclave
5.6.1 Description
Un autoclave permet d'obtenir une température en vapeur saturée dans la chambre, et qui est utilisé pour la
destruction des micro-organismes.

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Il est recommandé que l'autoclave soit muni
⎯ d'au moins une soupape de sécurité,
⎯ d'un robinet de purge,
⎯ d'un dispositif de régulation permettant le maintien de la température dans la chambre à ± 3 °C de la température

prévue (pour tenir compte de l'incertitude de mesure associée au thermocouple de mesure), et
⎯ d'une sonde thermique ou d'un thermocouple enregistreur.
Il est recommandé également qu'il soit muni d'un minuteur et d'un thermomètre enregistreur.
5.6.2 Utilisation
Avec la stérilisation à la vapeur, tout l'air est expulsé avant la montée en pression. Si l'autoclave n'est pas
muni d'un dispositif d'évacuation automatique, il est nécessaire de le purger de son air jusqu'à émission d'un
jet continu de vapeur.
Pour la destruction des micro-organismes, la vapeur saturée dans la chambre doit être à une température
d’au moins 121 °C.
Au cours d'un même cycle de stérilisation, l'autoclave doit être utilisé soit pour stériliser le matériel propre
(et/ou les milieux de culture), soit pour décontaminer le matériel usagé (et/ou les milieux de culture utilisés),
mais pas les deux en même temps.
Il est préférable d'utiliser des autoclaves séparés pour ces deux processus. Après l'autoclavage, il est recommandé de
laisser refroidir tous les matériels et équipements avant de les retirer de l'autoclave.
Pour des raisons de sécurité, ne pas retirer le contenu tant que la température est supérieure à environ 80 °C.
5.6.3 Entretien
Nettoyer régulièrement la chambre, le filtre de vidange et les joints d'étanchéité de la porte. Vérifier l'intégrité
du joint d’étanchéité de la porte. Effectuer des opérations de vidange et de détartrage régulièrement, si
nécessaire. Suivre les instructions du fabricant.
5.6.4 Étalonnage et vérification
L'autoclave doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôlé par du
Maintenir les instruments de surveillance en parfait état de fonctionnement et les vérifier régulièrement.
et chaque configuration de charge utilisée dans la pratique. Il est recommandé de répéter ce processus après toute
réparation ou modification significative. Il est recommandé de placer un nombre suffisant de sondes thermiques dans la
charge pour démontrer une pénétration de la chaleur adéquate en tous points de la charge. Il est recommandé que la
validation et la revalidation prennent en compte la pertinence des durées de mise en température et de refroidissement
ainsi que de la température de stérilisation.
Pour chaque charge, il est recommandé de placer au moins un indicateur du traitement thermique au centre de la charge
pour vérifier la montée en température lorsqu'il n'existe aucun enregistrement permettant d'effectuer la traçabilité de
l'efficacité du processus.

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5.7 Préparateur de milieux de culture
5.7.1 Description
Un préparateur de milieux de culture est principalement conçu pour la stérilisation de volumes importants de
milieux (> 1 litre). Il est constitué d'un récipient pour la mise en température, d'une chemise d'eau et d'un
agitateur continu. Le matériel doit également être muni d'une jauge de température, d'un manomètre, d'un
minuteur et d'une soupape de sécurité.
De plus, il est recommandé que cet appareil soit muni d'un verrou de sécurité empêchant l'ouverture tant qu'une
température < 80 °C n'est pas atteinte.
5.7.2 Utilisation
Toujours suivre les instructions du fabricant.
L'ensemble du processus de production a lieu au sein de l'appareil; une fois que tous les ingrédients sont
ajoutés, ils sont dissous par agitation et chauffage, puis stérilisés.
5.7.3 Entretien
Laver et rincer soigneusement le préparateur avec de l'eau purifiée après chaque lot de milieux de culture.
5.7.4 Vérification
Le préparateur doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôlé par le
Maintenir les instruments de surveillance en parfait état de fonctionnement et vérifier leur performance
régulièrement.
et chaque type de charge utilisé dans la pratique. Il est recommandé de répéter ce processus après toute réparation ou
modification significative. Il est possible d'utiliser deux sondes thermiques, l'une étant placée à proximité de la sonde de
contrôle et l'autre étant éloignée de cette dernière, pour démontrer un chauffage uniforme.
Il est recommandé de vérifier la température et la durée de chaque cycle.
5.8 Étuve
5.8.1 Description
Une étuve consiste en une chambre calorifugée qui permet de maintenir une température stable et
uniformément répartie dans la limite des erreurs maximales de température tolérées, spécifiées dans la
méthode d'essai.
5.8.2 Utilisation
Les étuves doivent être équipées d'un système de régulation permettant de maintenir la température ou
d'autres paramètres uniformes et stables dans l'ensemble de leur volume utile. Définir le volume utile de sorte
à garantir l'uniformité et la stabilité de ces paramètres.
Si la température ambiante est proche de (ou supérieure à) celle de l'étuve, il est nécessaire de munir la
chambre d'un système de refroidissement.
Il est recommandé de protéger les parois de l'étuve de la lumière solaire.

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Dans la mesure du possible, il est recommandé de ne pas remplir complètement l'étuve en une seule opération car le
temps de stabilisation de la température des milieux de culture sera long, quel que soit le type d'étuve utilisé (convection
d'air forcé ou autre). Éviter de laisser les portes de l'étuve ouvertes de manière prolongée.
Lors du chargement des étuves, il est recommandé de veiller à la circulation de l'air (voir 10.2.4).
Nettoyer et désinfecter régulièrement les parois intérieures et extérieures de l'étuve et, au besoin,
dépoussiérer le système de ventilation.
5.8.4 Vérification
Vérifier, dans l'ensemble du volume utile de l'étuve, la stabilité et l'homogénéité de la température, à la (aux)
température(s) de fonctionnement, en utilisant simultanément plusieurs thermomètres ou thermocouples,
ayant une exactitude reconnue et une plage suffisante.
Utiliser ces informations pour définir l’amplitude acceptable de températures de travail de l’incubateur et la
position optimale du thermomètre utilisé pour contrôler les températures de travail.
Par exemple, pour atteindre une température cible de 37 °C ± 1 °C quand les données de cartographie de l’étuve montrent
une amplitude de 36,8 °C à 37,3 °C dans l’incubateur, alors l’amplitude de températures de travail est à établir de 36,2 °C
à 37,7 °C dans le but d’assurer que toutes les parties de l’incubateur sont à la température cible de 37 °C.
Il est recommandé de répéter ce processus après toute réparation ou modification significative.
Il est recommandé de contrôler la température de travail, par exemple avec un ou plusieurs thermomètres à minima-
maxima ou thermocouples enregistreurs.
Le thermomètre ou le thermocouple enregistreur, utilisé pour le contrôle de routine de l’incubateur doit être
fixé à une position définie à partir des données de cartographie de l’incubateur comme assurant la
température cible.
Contrôler la température de l'étuve au minimum tous les jours de travail. À cet effet, chaque étuve doit
contenir au moins un appareil de mesure dont le réservoir peut être immergé dans du glycérol (ou système
équivalent) contenu dans un flacon fermé.
D'autres systèmes de vérification de performances équivalentes peuvent également être utilisés.
5.9 Réfrigérateur, chambre froide
5.9.1 Description
Il s'agit d'enceintes permettant de maintenir une conservation au froid. La température doit être de 3 °C ± 2 °C
(erreurs maximales tolérées) pour la conservation des échantillons alimentaires à analyser, sauf pour des
applications particulières. Dans le cadre d'autres utilisations, la température, sauf spécification contraire, doit
être de 5 °C ± 3 °C.
5.9.2 Utilisation
Pour éviter toute contamination croisée, utiliser des enceintes, ou au moins des conteneurs distinct(e)s, pour
séparer physiquement et conserver
⎯ des milieux de culture non ensemencés et des réactifs,
⎯ échantillons pour essai, et
⎯ des cultures de micro-organismes et des milieux incubés.

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Charger les réfrigérateurs, appareils frigorifiques et chambres froides en veillant à maintenir une circulation
d'air appropriée et à réduire au minimum le risque de contamination croisée.
5.9.3 Vérification
Vérifier la température de chacune des enceintes chaque jour de travail à l'aide d'un thermomètre étalonné ou
d'une sonde placée à demeure. L'exactitude requise pour ce dispositif de contrôle de la température dépend
de l'objectif d'utilisation.
5.9.4 Entretien et nettoyage
Effectuer les opérations d'entretien suivantes à intervalles réguliers pour garantir un bon fonctionnement:
⎯ le dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes;
⎯ le dégivrage;
5.10 Congélateur et surgélateur
5.10.1 Description
Un congélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation en froid négatif. La température,
sauf spécification contraire, doit être inférieure à −15 °C, de préférence inférieure à −18 °C pour les
échantillons alimentaires.
Un surgélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation surgelée. La température, sauf
spécification contraire, doit être inférieure à −70 °C.
5.10.2 Utilisation
5.10.2.1 Congélateur
Il est nécessaire de disposer d'enceintes, ou au moins de conteneurs, différent(e)s pour séparer

physiquement et conserver
⎯ certains réactifs non ensemencés,
⎯ des échantillons pour analyse, et
⎯ des cultures de micro-organismes.
Charger le congélateur de manière à maintenir une température suffisamment basse et cela particulièrement
lorsque sont introduits des produits non congelés.
5.10.2.2 Surgélateur
Sa principale utilisation est la conservation de micro-organismes, de cultures de référence et/ou de travail et

des réactifs.
Charger le surgélateur de manière à maintenir une température suffisamment basse et à éviter toute
contamination croisée entre les micro-organismes et les réactifs.

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Vérifier la température de chacune des enceintes régulièrement à l'aide d'un dispositif de surveillance de la
température appropriée.
5.10.4 Entretien
Effectuer régulièrement les opérations d'entretien suivantes:
⎯ le dépoussiérage des ailettes et des plaques d'échange thermique externes (si accessibles);
⎯ le dégivrage;
5.11 Bain thermostaté
5.11.1 Description
Un bain thermostaté, qui est une cuve remplie de liquide (eau, éthylène glycol, etc.), avec ou sans couvercle
ou autre dispositif permettant de limiter l'évaporation, est nécessaire pour maintenir une température spécifiée.
Le réglage de la température est souvent plus précis qu'avec une étuve à air, ce qui permet d'atteindre une
erreur maximale tolérée de ± 0,5 °C ou mieux. Les températures de travail et les erreurs maximales tolérées
requises sont stipulées dans chaque application ou méthode spécifique. Un système de refroidissement est
nécessaire pour maintenir une température proche de la température ambiante ou inférieure à celle-ci.
5.11.2 Utilisation
⎯ l'incubation à une température constante des milieux de culture ensemencés;
⎯ le maintien en surfusion des milieux gélosés stériles pendant la préparation des milieux;
⎯ la mise en température des milieux gélosés stériles en surfusion pour une utilisation dans le cadre de
méthodes spécifiques;
⎯ la préparation des suspensions mères des échantillons ou de solutions à une température contrôlée;
⎯ le traitement thermique des suspensions mères des échantillons à une température contrôlée (par
exemple la pasteurisation).
Lorsqu'un réglage précis de la température est requis, le bain doit être équipé d'une pompe à circulation d'eau
et d'un système de réglage automatique de la température. Aucune agitation du liquide ne doit provoquer de
projection de gouttes.
Les bains dotés de couvercles conviennent mieux à une utilisation nécessitant un réglage précis de la température ou
impliquant une température élevée. Il est recommandé d'utiliser des couvercles inclinés qui permettent l'élimination des
condensats.
Pour l'incubation des milieux ensemencés, maintenir le niveau de liquide de sorte que la partie supérieure du
milieu d'essai se situe au moins à 20 mm au-dessous du niveau de liquide durant l'incubation.
Lorsque d'autres récipients sont placés dans les bains, il est recommandé que le niveau de leurs contenus soit inférieur à
celui du liquide.
La profondeur d'immersion doit empêcher l'entrée d'eau par l’orifice des récipients.

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Des dispositifs permettant de maintenir la stabilité des récipients peuvent être requis, par exemple des supports.
Il est recommandé de sécher l'ensemble des conteneurs une fois retirés du bain et avant toute utilisation ultérieure.
Vérifier la stabilité et l'homogénéité de la température dans l'ensemble du bain avant la première utilisation et
après toute réparation ou modification ayant une incidence sur le réglage de la température.
Contrôler chaque bain avec un thermomètre, un thermocouple ou un dispositif d'enregistrement de la

température étalonné ayant une incertitude minimale de mesure compatible (voir 5.28.2), et qui soit
indépendant du système de réglage automatique de la température.
Un affichage numérique peut également être utilisé à condition que sa précision et sa résolution soient vérifiées.
Contrôler la température du bain lors de chaque utilisation et au moins une fois par jour pendant les périodes
d'incubation prolongée.
5.11.4 Entretien
Il est recommandé de remplir les bains thermostatés de liquide selon les recommandations du fabricant. Il est
recommandé d'utiliser de préférence de l'eau distillée ou déionisée pour l'incubation des cultures.
Vérifier régulièrement le niveau de liquide pour garantir un fonctionnement correct du bain et une immersion
satisfaisante des conteneurs dans le bain. Le niveau de liquide doit toujours couvrir les éléments chauffants.
Il est recommandé de régulièrement vider, nettoyer, désinfecter et remplir de nouveau les bains et à une fréquence
dépendant de l'utilisation, ou après un déversement.
5.12 Matériels produisant de la vapeur, y compris les bains d'eau bouillante
5.12.1 Description
Les matériels produisant de la vapeur et les bains d'eau bouillante sont constitués d'un élément chauffant
entouré d'eau placé dans un récipient doté d'un couvercle bien ajusté. Dans un matériel produisant de la
vapeur, l'élément chauffant crée de la vapeur à la pression atmosphérique; dans un bain d'eau bouillante, il
chauffe l'eau au point d'ébullition ou à une température voisine, avec ou sans production de vapeur.
5.12.2 Utilisation
⎯ la fusion des milieux gélosés;
⎯ la préparation des milieux thermolabiles;
⎯ la limitation de la contamination du petit matériel après chaque utilisation.
Le niveau d'eau du récipient doit être raisonnable et adéquat pour garantir en permanence la couverture des
éléments chauffants.
Un autoclave doté d'un dispositif de production de vapeur indépendant peut également être utilisé.
5.12.3 Entretien
Maintenir propres les matériels produisant de la vapeur et les bains d'eau bouillante.

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Si besoin est, il est recommandé d'effectuer régulièrement des opérations de détartrage à une fréquence adaptée à la
dureté de l'eau locale.
5.13 Four à stériliser
5.13.1 Description
Un four à stériliser est une enceinte permettant de maintenir une température comprise entre 160 °C et
180 °C, en vue de détruire les micro-organismes par chaleur sèche.
5.13.2 Utilisation
Seuls les matériels robustes en métal ou en verre doivent être stérilisés au four à stériliser; ne pas utiliser ce
dernier pour les éléments en matière plastique ou en caoutchouc.
Avant stérilisation, nettoyer la verrerie et les matériels en métal stérilisés dans le four.
Si la verrerie graduée est stérilisée dans le four à stériliser, vérifier régulièrement l'exactitude des volumes
marqués.
La répartition de la température dans l'enceinte doit être homogène. Le four doit être équipé d'un thermostat
et d'un thermomètre ou d'un dispositif d'enregistrement de la température d'exactitude appropriée.
Il est recommandé qu'il soit muni d'un indicateur de durée, d'un programmateur ou d'un minuteur.
Une fois la température de fonctionnement atteinte, la procédure de stérilisation doit durer au moins 1 h
à 170 °C ou à une combinaison durée/température équivalente.
Après la stérilisation, il est recommandé de laisser refroidir la verrerie dans le four avant de la retirer afin d'éviter toute
fêlure.
Vérifier la stabilité et l'homogénéité de la température dans l'ensemble du four avant la première utilisation et
après toute réparation ou modification qui pourrait avoir une incidence sur le réglage de la température.
Le four doit être équipé d'un thermomètre, d'un thermocouple ou d'un dispositif d'enregistrement de la
température de précision appropriée et indépendant du système de réglage automatique de la température.
Le dispositif de surveillance doit au moins avoir une résolution de 1 °C, à la température de traitement utilisée.
Il est recommandé de contrôler et d'enregistrer la température du four lors de chaque utilisation.
5.13.4 Entretien
Nettoyer les surfaces internes lorsque cela est requis.
5.14 Four à micro-ondes
5.14.1 Description
Un four à micro-ondes est un appareil permettant de chauffer des éléments par l'utilisation de l'énergie à
micro-ondes à la pression atmosphérique.
5.14.2 Utilisation
Utiliser uniquement le matériel disponible actuellement pour chauffer des liquides ou fondre des milieux de
culture gélosés.

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AVERTISSEMENT — Ne pas chauffer les milieux complexes contenant des composants

thermosensibles dans un four à micro-ondes, à moins qu'il n'ait été vérifié que ce mode de chauffe est
sans incidence sur les performances du milieu. Aucune évaluation de l'efficacité des micro-ondes
pour la stérilisation des milieux de culture n'a encore été effectuée. En conséquence, les fours à
micro-ondes ne doivent pas être utilisés à cet effet.
Le four doit pouvoir chauffer les liquides et les milieux de culture de façon contrôlée par un cycle d'émissions
micro-ondes. La répartition des micro-ondes doit être homogène afin d'éviter les points de surchauffe. Les
fours munis d'un plateau tournant ou d'un répartiteur des micro-ondes permettent d'obtenir une meilleure
Ne pas utiliser de matériel en métal, y compris les fermetures. Avant de procéder au chauffage, retirer les
capsules ou les bouchons des flacons.
Le chauffage pendant des périodes prolongées à des puissances nominales faibles peut permettre d'obtenir une meilleure
AVERTISSEMENT — Manipuler avec précaution les éléments chauffés. Le contenu bouillant des
flacons peut entraîner des brûlures. Les flacons risquent d'exploser.
Lors de la fusion du milieu gélosé, il est recommandé de faire fonctionner le four à faible puissance (par exemple cycle
de dégivrage) et d'utiliser de l'eau comme source de froid (par exemple de 50 ml à 100 ml d'eau dans un bécher pour
micro-ondes) pour faciliter le réglage du processus de chauffage.
Un temps de repos d'au moins 5 min est recommandé après le chauffage et avant le retrait des éléments du four à micro-
ondes.
Des temps de chauffage et des niveaux de puissance appropriés doivent être définis avant la mise en service
pour les différents volumes de liquides et les milieux de culture régulièrement manipulés afin de garantir des
performances optimales et d'éviter la surchauffe de produits sensibles.
5.14.4 Entretien
Nettoyer immédiatement le four lors de tout déversement de matières; le nettoyer également à intervalles
réguliers en fonction de l'utilisation.
Il est recommandé de contrôler l'intégrité des joints d'étanchéité de la porte des fours et de vérifier régulièrement le four
pour tout rayonnement de fuite.
5.15 Lave-verrerie
5.15.1 Description
Les lave-verrerie de laboratoire sont des appareils contrôlés électroniquement, conçus pour le lavage de la
verrerie de laboratoire courante, qui peuvent être programmés pour différents cycles de lavage et de rinçage
(par exemple à l'eau distillée ou déionisée, ou à l'acide).
Les appareils de lavage des pipettes en verre sont des lave-verrerie spéciaux conçus pour le lavage des
embouchures de pipettes étroites.
5.15.2 Utilisation
De nombreux types de lave-verrerie sont disponibles. D'une manière générale, ils doivent être installés et
utilisés conformément aux instructions du fabricant.

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Vérifier l'efficacité du lavage par examen visuel et, dans les applications critiques, effectuer des essais pour
garantir que la verrerie est exempte de substances inhibitrices.
Il est possible de vérifier la présence de résidus alcalins ou acides en utilisant un système permettant une mesure de la
valeur de pH; il est recommandé d'obtenir une gamme de valeur de pH comprise entre 6,5 et 7,3.
5.15.4 Entretien
Programmer un entretien régulier conforme aux spécifications du fabricant à une fréquence appropriée.
Un entretien plus fréquent peut être nécessaire pour le matériel utilisé de façon intensive ou dans les régions où l'eau est
dure.
5.16 Microscope optique
5.16.1 Description
Il existe différents types de microscopes: monoculaires, binoculaires, à écran, avec caméra, à fluorescence,
etc., avec une source lumineuse interne ou externe. Les objectifs avec un agrandissement variant de ×10
(lentilles sèches) à environ ×100 (immersion dans l'huile avec tourelle à ressort) sont utilisés pour les
examens bactériologiques afin d'obtenir un agrandissement compris entre ×100 et ×1 000. La microscopie en
contraste de phase est également très précieuse pour les examens à l'état humide.
5.16.2 Utilisation
Régler l'optique du microscope conformément aux instructions du fabricant. L'axe optique de la lumière de
l'ampoule à haute intensité doit passer par le centre du condenseur inférieur, de la lame et de l'objectif en
direction de l'oculaire afin d'éliminer les aberrations sphériques et chromatiques.
5.16.3 Entretien
Suivre les instructions du fabricant en ce qui concerne l'entreposage, le nettoyage et l'entretien. Éviter la
formation de condensation en cas d'humidité élevée car cela peut conduire à la détérioration de la qualité des
lentilles.
Retirer quotidiennement, ou après chaque utilisation, l'huile des objectifs à immersion et des pièces reliées en
utilisant du papier Joseph. Utiliser un solvant recommandé par le fabricant. Retirer régulièrement de l'oculaire
la graisse causée par les cils.
Les systèmes optiques peuvent facilement être endommagés, c'est pourquoi un entretien, de préférence réalisé par le
fabricant, est souhaitable.
5.17 Brûleur à gaz ou incinérateur à fil
5.17.1 Description
Les brûleurs à gaz (Bunsen) produisent une flamme nue étroite et sont alimentés par du gaz de ville ou en
bouteille. Le niveau de chaleur est réglé en variant la quantité d'air mélangé au gaz.
Les incinérateurs à fil fonctionnent au gaz ou à l'électricité et sont utilisés pour porter à incandescence, sans
les enflammer, les anses ou les fils rectilignes employés pour la manipulation des cultures, en vue de leur
stérilisation.

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5.17.2 Utilisation
Un brûleur à gaz est principalement utilisé pour stériliser les anses en métal ou les fils droits en les portant à
incandescence et pour stériliser à la flamme d'autres petits éléments de matériel résistants.
Il est préférable d'utiliser l'incinérateur à fil pour la stérilisation des anses en métal ou des fils droits lors de la
manipulation de bactéries pathogènes, car il empêche les projections et permet d'éviter le risque de
contamination croisée.
Les brûleurs à gaz peuvent produire une chaleur importante et de la turbulence de l'air dans le laboratoire.
Il est possible d'utiliser des matériels à usage unique pour pouvoir travailler aseptiquement sans brûleur à gaz.
Il est recommandé d'éviter l'utilisation des brûleurs à gaz dans les hottes de sécurité car ils peuvent perturber de façon
inacceptable le flux d'air laminaire. Dans ce cas, l'utilisation de matériel stérile à usage unique est recommandée.
5.17.3 Entretien
Nettoyer et désinfecter régulièrement les brûleurs et les protections des incinérateurs à fil, particulièrement en
cas de déversement de cultures microbiennes sur les appareils.
5.18 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs
5.18.1 Description
Un répartiteur est un instrument ou appareil permettant de distribuer les milieux de culture et réactifs dans les
tubes, les flacons ou les boîtes de Petri. La gamme de ces appareils s'étend des simples éprouvettes
graduées, des pipettes ou des seringues manuelles, en passant par les seringues automatiques et les
pompes péristaltiques, jusqu'aux dispositifs électroniques programmables, à distribution automatique variable.
5.18.2 Utilisation
Le matériel propre utilisé pour la répartition des milieux de culture et des réactifs doit être exempt de
substances inhibitrices. Utiliser un tuyau différent pour chacun des milieux sélectifs de manière à réduire le
plus possible le lessivage/transfert de substances inhibitrices envers les micro-organismes.
Si la répartition aseptique de milieux de culture et de réactifs stériles est requise, toutes les parties de
l'appareil en contact avec le produit à répartir doivent être stériles.
L'incertitude de mesure de l'instrument ou de l'appareil doit être adaptée aux erreurs maximales tolérées du
volume à répartir qui ne doivent habituellement pas dépasser ± 5 %. Les erreurs maximales tolérées dans la
mesure des volumes de diluants utilisés pour préparer les dilutions décimales sont de ± 2 %.
Contrôler les volumes répartis avant toute utilisation, puis régulièrement, conformément à un protocole
documenté, et toujours après tout ajustement ayant une incidence sur le volume délivré.
5.18.4 Nettoyage et entretien
Nettoyer la surface extérieure du répartiteur après chaque utilisation. Laver et rincer soigneusement toutes les
parties du répartiteur entrant en contact avec le produit, et les stériliser si l'utilisation pour la répartition de
liquide stérile l'exige. Ne pas utiliser de désinfectants utilisés sur les surfaces entrant en contact avec le
produit à répartir car ils peuvent conférer des propriétés inhibitrices au produit.
Tous les répartiteurs automatiques doivent être maintenus en parfait état grâce à un entretien régulier
conforme aux instructions du fabricant.

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5.19 Agitateur vortex
5.19.1 Description
Cet instrument facilite l'homogénéisation de milieux liquides (par exemple les dilutions décimales et les
échantillons pour essai de liquides) ou la mise en suspension de cellules bactériennes dans un liquide.
Le mélange est obtenu par application d'un mouvement de rotation excentrée du contenu du tube ou du
contenant (vortex).
5.19.2 Utilisation
Appuyer la base du tube ou du conteneur dans lequel est placé le liquide à mélanger contre la tête de
l'agitateur. La vitesse de mélange est réglée en variant la vitesse du moteur ou par l'angle de contact avec la
tête de l'agitateur.
Il est recommandé que l'opérateur garantisse qu'aucun débordement ne se produise pendant le mélange en ajustant la
vitesse, si nécessaire, et en tenant le tube environ au tiers supérieur de sa longueur afin de pouvoir mieux contrôler le tube
et de limiter la montée de liquide.
Il est recommandé de prendre les précautions appropriées pour réduire le plus possible la libération d'aérosols à
l'ouverture des contenants après l'agitation par vortex.
Un mélange adéquat est mis en évidence par l'apparition d'un tourbillon dans la profondeur du liquide pendant
l'opération de mélange.
5.19.4 Entretien
Maintenir le matériel en parfait état de propreté. En cas de déversement de matière, décontaminer le matériel
à l'aide d'un désinfectant de laboratoire approprié.
5.20 Dispositif de comptage des colonies
5.20.1 Description
Les dispositifs manuels de comptage des colonies utilisent un dispositif de comptage activé par pression. Ils
fournissent habituellement une indication sonore du comptage et sont dotés d'un affichage numérique pour la
lecture du comptage global. Il peut s'agir de simples compteurs en forme de stylo ou également de dispositifs
constitués d'une platine lumineuse avec une grille étalonnée pour la boîte et d'un écran agrandisseur pour
faciliter la détection des colonies. Les compteurs électroniques automatisés, comprenant les analyseurs
d'images, associent un appareillage à un système informatisé incluant l'utilisation d'une caméra et d'un
moniteur.
5.20.2 Utilisation
Suivre les instructions du fabricant. Ajuster la sensibilité des compteurs automatisés pour garantir le
comptage de toutes les colonies cibles. Les compteurs de colonies électroniques automatisés nécessitent
également une programmation séparée lorsqu'ils sont utilisés avec divers types de géloses et de matrices,
ainsi que pour les comptages en surface ou en profondeur, pour permettre une distinction adéquate des
colonies cibles.
Il est recommandé d'effectuer des contrôles manuellement et à intervalles réguliers pour garantir l'obtention de
comptages précis à l'aide du compteur de colonies.

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Il est recommandé, en outre, de vérifier les compteurs de colonies automatisés chaque jour d'utilisation à l'aide d'une
boîte d'étalonnage contenant un nombre connu de particules ou de colonies dénombrables.
5.20.4 Entretien
Maintenir le matériel en parfait état de propreté et exempt de poussière; éviter de rayer les surfaces qui
constituent un élément essentiel du comptage. Programmer un entretien régulier des compteurs électroniques
comprenant des analyseurs d'images, conformément aux spécifications du fabricant, à une fréquence
appropriée.
5.21 Matériel pour culture en atmosphère modifiée
5.21.1 Description
Il peut s'agir d'une jarre à fermeture étanche ou de tout autre appareillage approprié permettant d'obtenir et de maintenir
des conditions d'atmosphère modifiée (par exemple anaérobiose) pendant toute la durée de l'incubation du milieu de
culture. D'autres systèmes de performances équivalentes, tels que les chambres anaérobies, peuvent également être
utilisés.
Suivre les instructions du fabricant pour l'installation et l'entretien.
5.21.2 Utilisation
La composition de l'atmosphère requise peut être obtenue par addition d'un mélange gazeux (par exemple d'une bouteille
de gaz) après évacuation de l'air de la jarre, par déplacement de l'atmosphère dans la hotte ou par tout autre moyen
approprié (par exemple les systèmes gazeux disponibles dans le commerce).
En règle générale, l'incubation anaérobie nécessite une atmosphère contenant moins de 1 % d'oxygène,
entre 9 % et 13 % de dioxyde de carbone; l'incubation microaérobie (capnaérobie) nécessite une atmosphère
contenant entre 5 % et 7 % d'oxygène et environ 10 % de dioxyde de carbone.
Ces conditions peuvent nécessiter des modifications en fonction des exigences du micro-organisme spécifique.
Placer un indicateur biologique ou chimique permettant de contrôler la nature de l'atmosphère dans chaque
enceinte pendant chaque utilisation. La croissance de la souche de contrôle ou un changement de couleur de
l'indicateur chimique vérifie que les conditions d'incubation appropriées sont obtenues.
5.21.4 Entretien
Si un système catalytique est employé, le régénérer régulièrement selon les instructions du fabricant. Si des
soupapes sont employées, les nettoyer et les lubrifier pour en garantir le bon fonctionnement et les remplacer
si nécessaire.
Nettoyer et désinfecter le matériel régulièrement.
5.22 Centrifugeuse
5.22.1 Description
Les centrifugeuses sont des dispositifs mécaniques ou contrôlés électroniquement, utilisant la force centrifuge
pour séparer les particules en suspension, y compris les micro-organismes présents dans les fluides.

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5.22.2 Utilisation
La concentration d'organismes cibles, dans certaines applications est obtenue par centrifugation
d'échantillons liquides. Le dépôt ainsi créé peut être remis en suspension dans le liquide et être soumis à un
examen complémentaire.
Prendre les précautions nécessaires pour éviter la création d'aérosols et la contamination croisée par un
fonctionnement correct du matériel et utilisation de tubes ou de pots à centrifuger étanches et stériles.
Lorsque la vitesse de centrifugation est critique ou spécifiée dans l'application, il est recommandé de vérifier
régulièrement l'indicateur de vitesse ou les réglages à l'aide d'un tachymètre étalonné et indépendant, et après toute
réparation ou modification significative.
5.22.4 Entretien
Nettoyer et désinfecter régulièrement les centrifugeuses et après tout déversement de cultures microbiennes
ou d'échantillons potentiellement contaminés.
Il est recommandé d'entretenir régulièrement les centrifugeuses.
5.23 Plaque chauffante et chauffe-ballons
5.23.1 Description
Les plaques chauffantes et les chauffe-ballons sont des dispositifs de chauffage à commande thermostatique.
Certaines plaques chauffantes et certains chauffe-ballons comprennent des systèmes d'agitation magnétique.
5.23.2 Utilisation
Les plaques chauffantes et les chauffe-ballons équipés de systèmes d'agitation mécanique sont utilisés pour
chauffer des volumes relativement importants de liquide comme les milieux.
Pour la préparation d'un milieu, ne pas utiliser de plaques chauffantes ni de chauffe-ballons sans systèmes
d'agitation.
5.23.3 Entretien
Nettoyer tout déversement dès que l'installation est froide.
5.24 Ensemenceur spiral
5.24.1 Description
L'ensemenceur spiral est un dispositif qui répartit un volume prédéterminé de liquide sur la surface d'une boîte
de Petri gélosée disposée sur une table en rotation. L'arbre distributeur se déplace du centre vers la
périphérie de la boîte et distribue le volume sous la forme d'une spirale d'Archimède. Le volume réparti décroît
au fur et à mesure du déplacement du stylet du centre vers la périphérie de la boîte, de sorte qu'une relation
inverse existe entre le volume déposé et le rayon de la spirale. Le volume d'échantillon réparti dans chaque
secteur est connu et constant. Une pompe à vide est requise pour permettre le chargement et la répartition de
liquides.
5.24.2 Utilisation
Ce matériel est utilisé pour répartir un échantillon liquide, un broyat d'échantillon ou une dilution sur une boîte
gélosée appropriée en vue d'un comptage de colonies. Après incubation, les colonies se développent le long

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des lignes où le liquide a été déposé. Le nombre de colonies dans un secteur connu est compté en utilisant
une grille de comptage fournie avec l'appareil.
La surface des boîtes gélosées à utiliser avec l'ensemenceur spiral doit être plane et ne contenir aucune bulle
d'air.
Il est recommandé de présécher les boîtes avant de les utiliser pour éviter l'excès d'humidité.
Il est recommandé de désinfecter le système de répartition et de le rincer à l'eau stérile avant chaque échantillon et après
utilisation.
Vérifier quotidiennement l'angle de la pointe du stylet en utilisant le dispositif d'aspiration pour maintenir une
lamelle couvre-objets contre l'ouverture du stylet. Il convient que la lamelle couvre-objets soit parallèle et à
1 mm de la surface de la gélose.
Il est recommandé de vérifier la forme de la répartition en distribuant de l'encre lavable. Il est recommandé que la spirale
soit plus dense vers le centre de la boîte, où débute le dépôt, et devienne régulièrement de moins en moins dense jusqu'au
point de retrait du stylet. Il est recommandé que la portion non inoculée de la boîte soit centrée et qu'elle présente un
diamètre d'environ 2,0 cm.
Il est recommandé d'effectuer quotidiennement un contrôle pour s'assurer que l'angle formé entre la pointe du stylet et la
surface de la gélose est correct. Pour ce faire, utiliser la lamelle couvre-objets et l'indicateur de niveau fournis avec
l'instrument.
Il est recommandé de vérifier la stérilité de l'ensemenceur spiral en distribuant de l'eau stérile pour chaque série
d'échantillons analysés.
Il est recommandé de procéder régulièrement à un contrôle gravimétrique du volume réparti en utilisant de l'eau distillée.
Il est recommandé que la masse obtenue corresponde à la masse attendue pour le volume réparti avec une erreur
maximale permise de ± 5 % au plus.
5.24.4 Entretien
Il est possible de désinfecter le tuyau distributeur et le stylet en les rinçant avec une solution contenant entre 0,5 % et 1 %
de chlore libre. Il est recommandé que cette opération soit suivie d'un rinçage à l'eau stérile distillée ou déionisée.
Les bouchages peuvent être évités en laissant déposer les éventuelles particules avant de charger la suspension
échantillon et en utilisant une portion de surnageant liquide.
Il est recommandé d'éliminer immédiatement tout déversement et de nettoyer régulièrement le matériel.
Il est recommandé d'entretenir et de vérifier l'équipement selon l'utilisation qui en est faite.
5.25 Distillateurs, déionisateurs et osmoseurs
5.25.1 Description
Ces appareils sont utilisés pour produire de l'eau distillée ou déionisée/déminéralisée présentant la qualité
requise (voir l'ISO/TS 11133) pour la préparation des milieux de culture microbiologiques ou des réactifs et
pour d'autres applications de laboratoire.
5.25.2 Utilisation
Installer, mettre en service et utiliser le matériel conformément aux instructions du fabricant, en tenant compte
de l'emplacement de l'alimentation d'eau, de l'évacuation des eaux usées et de l'alimentation électrique du
laboratoire.

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Il est nécessaire de vérifier l'eau régulièrement ou au moment de son utilisation, après une période de
stockage, pour garantir une conductivité satisfaisante; il faut qu'elle soit inférieure ou égale à 25 µS.cm−1
(équivalent à une résistivité égale ou supérieure à W 40 000 Ω.cm) pour la préparation des milieux et des
réactifs.
Si l'eau est stockée avant d'être utilisée ou si elle est produite par un échangeur d'ions, il est recommandé de procéder à
des contrôles de contamination microbienne appropriés conformément à l'ISO/TS 11133.
5.25.4 Entretien
Il est recommandé de nettoyer et de détartrer les distillateurs à une fréquence adaptée à la dureté de l'eau. Il est
recommandé d'entretenir les déionisateurs et les osmoseurs conformément aux instructions du fabricant.
5.26 Minuteurs et minuteries
5.26.1 Description
Les minuteurs et minuteries intégrés sont des instruments qui permettent de déterminer des durées correctes
et sont utilisés pour de nombreuses applications de laboratoire où la durée est spécifiée et critique.
5.26.2 Utilisation
Les minuteurs de poche ou de paillasse, analogiques et numériques, utilisés pour contrôler la durée des
opérations de laboratoire (par exemple application de colorant sur des films biologiques, homogénéisation
d'échantillons, etc.), doivent être en parfait état de fonctionnement et capables d'atteindre l’exactitude requise.
Utiliser les minuteurs intégrés au matériel de laboratoire (par exemple autoclaves, centrifugeuses,
homogénéisateurs, etc.) conformément aux instructions du fabricant. Ces minuteurs doivent être capables
d'atteindre l'exactitude requise.
Vérifier régulièrement tous les minuteurs utilisés au cours d'opérations de laboratoire où la durée est décisive
pour le résultat, par rapport au signal horaire national et après toute réparation significative.
5.26.4 Entretien
Nettoyer les minuteurs et en vérifier le fonctionnement régulièrement.
Il est recommandé de contrôler les minuteries intégrées dans le cadre de la procédure d'entretien de l'instrument.
5.27 Pipettes et pipetteurs
5.27.1 Description
Les pipettes sont des dispositifs en verre ou à usage unique utilisées pour distribuer des volumes de produits
liquides ou visqueux; les pipettes graduées distribuent des volumes mesurés avec une exactitude qui dépend
des spécifications.
Les pipetteurs automatiques (mécaniques) dotés d'embouts en plastique sont des dispositifs qui permettent
de répartir des volumes de liquide fixes ou ajustables sous l'action d'un piston manuel ou électrique.

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5.27.2 Utilisation
Mettre au rebut les pipettes endommagées ou cassées.
Il est recommandé que les pipettes Pasteur ou graduées stériles et les embouts de pipetteurs soient munis d'un bouchon en
coton non absorbant pour empêcher la contamination lors de la manipulation de cultures microbiennes.
Ne pas effectuer de pipetage à la bouche dans les laboratoires de microbiologie, sauf pour les liquides non
contaminés.
Les poires/auxiliaires de pipetage utilisés pour les pipettes Pasteur ou graduées et les embouts des pipetteurs
doivent être de dimension correcte pour empêcher les fuites et garantir un fonctionnement efficace.
Vérifier les pipettes graduées pour confirmer la distribution de volumes corrects si le fabricant ne certifie pas
leur exactitude (justesse et fidélité).
L'étalonnage des pipettes/pipetteurs est décrit dans l'ISO 835 (toutes les parties) et l'ISO 8655-1.
Avant utilisation, les nouveaux pipetteurs doivent être soumis à un essai de conformité et respecter les
erreurs maximales tolérées spécifiées dans l'ISO 8655-1, et ces contrôles doivent être renouvelés à
intervalles réguliers dépendant de la fréquence et du type d'utilisation. Effectuer des contrôles gravimétriques
intermédiaires à l'eau distillée ou déionisée pour s'assurer que les volumes répartis demeurent dans les
erreurs maximales tolérées définies.
Vérifier les nouveaux lots de pipettes graduées.
5.27.4 Entretien
Après chaque utilisation, décontaminer et nettoyer/stériliser les pipettes réutilisables ainsi que les pipetteurs
automatiques de façon appropriée.
Si les molettes et les pistons des pipetteurs automatiques sont contaminés en cours d'utilisation, les démonter
pour les décontaminer et les nettoyer. Après assemblage, les étalonner. Si cette opération ne peut pas être
effectuée dans le laboratoire, renvoyer les pipetteurs au fabricant pour qu'ils soient assemblés et étalonnés.
5.28 Thermomètres et dispositifs de surveillance de la température, incluant

les enregistreurs automatiques
5.28.1 Description
Les thermomètres sont des instruments à mercure ou à alcool utilisés pour contrôler la température dans le
cadre des activités de laboratoire.
Les autres dispositifs de surveillance de la température comprennent les thermomètres à résistance de

platine et les instruments tels que les thermocouples, qui fournissent un enregistrement graphique, sur papier
ou de manière électronique, des températures rapportées au temps.
Les thermomètres de référence et autres dispositifs de surveillance de la température doivent être étalonnés
selon les étalons nationaux ou internationaux et certifiés comme tels. Ils doivent être utilisés uniquement à
titre de référence et ne doivent pas être utilisés pour la surveillance systématique.
Les thermomètres de travail et autres dispositifs d'enregistrement de la température doivent être étalonnés
pour permettre la traçabilité jusqu'aux étalons nationaux ou internationaux.
Les dispositifs d'exactitude adéquate et conformes à la spécification internationale ou nationale appropriée peuvent
également être utilisés comme thermomètres de travail après vérification de leurs performances.

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5.28.2 Utilisation
Les thermomètres et autres dispositifs de surveillance de la température doivent pouvoir mesurer la

température requise pour une application dans les limites des erreurs maximales tolérées.
Il est recommandé que l'incertitude de mesure des dispositifs de surveillance de la température soit quatre fois inférieure
à l'étendue des erreurs maximales tolérées demandée. Par exemple, pour des erreurs maximales tolérées cibles de ± 1 °C,
il est recommandé que l'incertitude de mesure soit de ± 0,25 °C. Pour des erreurs maximales tolérées cibles de ± 0,5 °C, il
est recommandé que l'incertitude de mesure soit de ± 0,125 °C. Il est recommandé que l'incertitude de mesure de
l'étalonnage du thermomètre de référence soit également prise en compte lors de la détermination de la température de
fonctionnement.
Il est recommandé que les thermomètres ou thermocouples disposés dans les étuves à air soient fixés dans des conteneurs
appropriés remplis de glycérol, d'huile de paraffine ou de polypropylène-glycol pour éviter une perte de chaleur à
l'ouverture de la porte et permettre une lecture stable.
Utiliser des thermomètres à immersion totale en immergeant uniquement le réservoir.
Il est recommandé que les thermomètres disposés dans des bains d'eau soient immergés dans l'eau conformément à la
spécification déterminée; par exemple il est recommandé d'immerger les thermomètres à immersion partielle en
respectant la profondeur spécifiée pour ce thermomètre: 76 mm ou 100 mm, par exemple.
Ne pas utiliser de thermomètres dont la colonne de mercure ou d'alcool est cassée.
Les thermomètres à mercure sont fragiles et, s'il existe un risque de casse, il est recommandé de les placer dans des étuis
protecteurs n'interférant pas avec les mesures de température.
AVERTISSEMENT — Le mercure est dangereux pour la santé. Éliminer tout déversement

conformément aux réglementations nationales.
Les thermomètres de référence doivent être étalonnés sur l’ensemble du domaine de travail par rapport aux
étalons nationaux ou internationaux traçables avant leur première utilisation et au moins une fois tous les
5 ans. L'étalonnage intermédiaire sur un point unique (par exemple au point de congélation) doit être effectué
pour vérifier les performances.
Les thermocouples de référence doivent être complètement étalonnés, avant leur première utilisation et
conformément aux instructions du fabricant, par rapport à des étalons nationaux ou internationaux traçables.
Des contrôles intermédiaires par rapport à un thermomètre de référence doivent être effectués pour vérifier
les performances.
D'autres dispositifs de surveillance de la température (tels que des récepteurs d'onde radio) doivent être
étalonnés par rapport aux étalons nationaux ou internationaux traçables et conformément aux instructions du
fabricant.
Il est recommandé de vérifier les thermomètres et thermocouples de travail au point de congélation et/ou par rapport à un
thermomètre de référence dans la gamme de températures de travail.
5.28.4 Entretien
Maintenir les thermomètres et thermocouples en parfait état de fonctionnement et de propreté.
Maintenir les autres dispositifs de surveillance de la température conformément aux instructions du fabricant.

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5.29 Séparateur immunomagnétique
5.29.1 Description
Ce matériel est utilisé pour la séparation et la concentration de micro-organismes cibles dans des cultures
liquides à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps appropriés.
Les séparateurs manuels sont constitués d'un mélangeur rotatif développant une vitesse de rotation comprise
entre 12 r/min et 20 r/min et d'un concentrateur de particules doté d'une barre magnétique amovible.
Les séparateurs automatisés utilisent des rangées (analogues à des peignes) de bâtonnets magnétiques et
des portoirs à tubes. Les particules magnétiques sont déplacées de tube en tube et permettent la séparation
complète comprenant les étapes de lavage réalisées automatiquement dans un environnement confiné.
5.29.2 Utilisation et vérification
Suivre les instructions d'utilisation du fabricant et celles indiquées dans les normes spécifiques (par exemple
E. coli O157).
Pour les systèmes manuels, vérifier la vitesse de rotation du mélangeur.
En ce qui concerne les systèmes manuels et automatisés, vérifier que le système est en mesure d'isoler de
faibles niveaux de micro-organisme cible avant son utilisation systématique.
Il est important d'évaluer le risque de contamination croisée pendant les procédures de séparation manuelle
et de prendre les mesures appropriées pour éviter que cela ne se produise.
5.29.3 Entretien
5.30 Système de filtration
Le système de filtration à utiliser doit être tel que décrit dans l'ISO 8199.
5.31 Autres matériels et logiciels
D'autres matériels et leurs logiciels doivent permettre d'obtenir l'exactitude requise et doivent être conformes
aux spécifications applicables aux essais concernés. Des programmes d'étalonnage doivent être établis pour
des quantités ou des valeurs clés lorsque ces propriétés ont une incidence significative sur le résultat. Avant
d'utiliser régulièrement le matériel, étalonner ou vérifier celui-ci pour établir sa conformité avec les exigences
du laboratoire et avec les spécifications des normes concernées. Vérifier l'obtention de résultats corrects à la
suite de toute configuration ou modification des logiciels effectuée dans le laboratoire.
6 Préparation de la verrerie et du matériel
6.1 Préparation
La verrerie et le matériel utilisé en microbiologie doivent être adéquats, utilisés correctement et préparés de
façon à garantir leur propreté et/ou leur stérilité jusqu'au moment de l'utilisation.
Il est recommandé que la verrerie et le matériel soient conçus pour empêcher ou limiter le contact entre l'opérateur et le
matériel contaminé.
Il est recommandé que les tubes et flacons soient bouchés par des moyens appropriés. Si nécessaire, il est recommandé
que la verrerie à stériliser soit placée dans des conteneurs spéciaux (par exemple pipettes) ou enveloppée dans un
matériau approprié (papier spécial, papier aluminium, etc.). Il est recommandé que la verrerie vide stérilisée à l'autoclave
laisse pénétrer la vapeur; dans le cas contraire, la stérilisation ne sera pas effective.

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6.2 Stérilisation/décontamination
Il est recommandé d'enregistrer la température et la durée de stérilisation/décontamination. Il est possible d'utiliser des
indicateurs de stérilisation pour distinguer les matériels stérilisés des matériels non stérilisés.
6.2.2 Stérilisation par chaleur sèche
Chauffer la verrerie, etc., dans un four à stériliser pendant au moins 1 h à une température de 170 °C ou tout
barème équivalent.
6.2.3 Stérilisation par chaleur humide (vapeur)
La vapeur humide sous pression constitue la méthode de stérilisation la plus efficace pour la verrerie et les
matériels de laboratoire. La température de la chambre de l'autoclave doit atteindre 121 °C pendant au
moins 15 min (voir en 5.6).
6.2.4 Décontamination à l'aide de composés chimiques
Utilisation de composés chimiques (par exemple produits à base de chlore, alcools, composés d'ammonium
quaternaires, etc.) à des concentrations et des temps de contact appropriés.
S'assurer que les résidus chimiques n'affecteront pas la revivification des micro-organismes.
6.3 Matériel à usage unique
Le matériel à usage unique peut être utilisé à la place du matériel réutilisable (verrerie, boîtes de Petri, pipettes, flacons,
tubes, anses, étaleurs, etc.), à condition que les spécifications soient similaires.
Il est alors conseillé de s'assurer que le matériel proposé convient pour l'utilisation en microbiologie (en particulier en
matière de stérilité) et que le matériel ne contient aucune substance susceptible d'inhiber la croissance des micro-
organismes (voir l'ISO 9998).
6.4 Stockage de la verrerie et du matériel
Stocker la verrerie et le matériel propres à l'abri de la poussière dans des conditions assurant le maintien de
leur propreté.
6.5 Gestion de la verrerie et du matériel stériles
Stocker la verrerie et le matériel dans des conditions assurant le maintien de leur stérilité. Stocker le matériel
à usage unique conformément aux instructions du fabricant, sans détérioration de l'emballage. Stocker le
matériel préparé au laboratoire dans de bonnes conditions de propreté.
Lors de la stérilisation du matériel destiné à la microbiologie, apposer une date limite d'utilisation (ou une date
de fabrication) sur chaque conditionnement.
6.6 Utilisation de la décontamination et de la désinfection
6.6.1 Décontamination du matériel à usage unique
Décontaminer les instruments à usage unique avant leur élimination.
Outre les méthodes décrites dans le présent paragraphe, il est possible de procéder à l'incinération du matériel. Si un
incinérateur est disponible dans les locaux, la décontamination et l'élimination peuvent être effectuées en une seule
opération.

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6.6.2 Décontamination de la verrerie et du matériel avant leur utilisation
En règle générale, il est recommandé de procéder à la stérilisation du matériel par chaleur humide (voir 6.2.3) ou chaleur
sèche (voir 6.2.2).
Dans certaines situations (par exemple échantillonnage sur le terrain), la décontamination chimique peut être appropriée.
Après un tel traitement, il est recommandé que le matériel ne contienne aucune substance inhibitrice.
6.6.3 Décontamination de la verrerie et du matériel après utilisation
Il est recommandé de placer les matériels à décontaminer et à éliminer dans des contenants, par exemple des sacs en
plastique pour autoclave. L'autoclavage est la méthode à utiliser de préférence pour tous les processus de
décontamination (pendant au moins 30 min à 121 °C). Il est recommandé d'effectuer le chargement de l'autoclave de
manière à faciliter la pénétration de la chaleur dans la charge (par exemple ne pas suremballer), ne pas visser
complètement les capuchons/couvercles et ouvrir les sacs.
Il est possible d'utiliser d'autres méthodes que l'autoclavage si la réglementation nationale l'autorise.
Avant de les laver, passer à l'autoclave tous les matériels ayant été en contact avec les cultures
microbiologiques (milieux de culture solides ou liquides), y compris les contenants réutilisables.
Pendant l'analyse, il est possible de procéder à la décontamination par immersion dans une dilution fraîchement préparée
de solution désinfectante, pour le matériel de petite taille résistant à la corrosion (par exemple les pipettes).
Les pipettes Pasteur ne doivent être utilisées qu’une seule fois..
La plupart des désinfectants (voir Annexe A) sont toxiques. Porter des gants et des lunettes de sécurité lors
de la manipulation de désinfectant concentré.
6.7 Gestion des déchets
L'élimination correcte des matériaux contaminés n'a pas d'incidence directe sur la qualité de l'analyse des
échantillons, mais elle fait partie d'une bonne gestion du laboratoire.
Il est recommandé que l'élimination soit conforme aux réglementations nationales relatives à l'environnement, à la santé
ou à la sécurité.
Il est recommandé d'établir un système d'identification et de séparation des matériaux contaminés et de leurs contenants
pour
⎯ les déchets non contaminés (par exemple les échantillons de produits alimentaires non cultivés) pouvant être
éliminés avec les déchets généraux),
⎯ les scalpels, aiguilles, lames, verres brisés,
⎯ le matériel contaminé recyclable destiné à l'autoclavage et au recyclage, et
⎯ le matériel contaminé destiné à l'autoclavage et à l'élimination, ou à l'élimination uniquement une fois incinéré
(cependant voir ci-dessous les exigences spéciales pour les micro-organismes appartenant à la catégorie de risque 3).
Il est recommandé d'incinérer les matériaux contaminés et leurs contenants conformément aux réglementations nationales
relatives à l'environnement, à la santé ou à la sécurité.
L'autoclavage avant incinération doit être réalisé pour les matériaux contaminés par des micro-organismes
appartenant à la catégorie de risque 3 et pour leurs contenants.

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6.8 Lavage
Ne laver le matériel réutilisable qu'après sa décontamination. Après lavage, rincer tout le matériel à l'eau
déionisée.
Pour faciliter les opérations de nettoyage, des matériels spécialisés peuvent être utilisés (par exemple laveurs de pipettes,
lave-vaisselle, cuves à ultrasons, etc.).
Après lavage, le matériel réutilisable doit être exempt de tout résidu susceptible d'avoir une incidence sur la
croissance ultérieure de micro-organismes.
7 Préparation et stérilisation des milieux de culture

Préparer et stériliser les milieux de culture conformément à l'ISO/TS 11133-1 et à l'ISO/TS 11133-2.
8 Échantillons pour le laboratoire
8.1 Prélèvement
Bien qu'ils jouent un rôle déterminant dans l'interprétation des résultats, l'échantillonnage et les plans
d'échantillonnage ne sont pas traités dans la présente Norme internationale. Il est important que le laboratoire
reçoive un échantillon représentatif du lot de produit, non endommagé ou modifié lors du transport et du
stockage.
Il est recommandé que l'échantillon soit protégé contre une contamination provenant de l’environnement de l’échantillon
due à l'air, aux récipients pour échantillons, aux dispositifs de prélèvements et à une mauvaise manipulation. Il est
recommandé qu'un récipient pour échantillons ne soit pas rempli à plus des trois quarts de sa capacité afin d'éviter une
fuite et de permettre un mélange correct de l'échantillon au laboratoire.
Identifier clairement et intégralement les échantillons et enregistrer les informations relatives à l'échantillon.
La température au moment de la collecte et de la réception est souvent utile au laboratoire pour l'interprétation des
résultats.
Il est recommandé de soumettre l'échantillon dans le récipient d'origine encore fermé.
Si le produit est volumineux ou placé dans un récipient trop grand pour le soumettre au laboratoire, en
transférer une partie de manière aseptique dans un récipient pour échantillon stérile.
Il est recommandé d'ouvrir le récipient stérile pour échantillon juste pendant le temps nécessaire pour y déposer
l'échantillon et de le refermer immédiatement après.
8.1.2 Plan d'échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la présente Norme internationale. Voir la Norme internationale
spécifique relative au produit concerné, si elle existe.
8.2 Transport
Le mode de transport des échantillons vers le laboratoire doit garantir que ceux-ci sont conservés dans des
conditions réduisant le plus possible toute modification du nombre de micro-organismes présents.

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Livrer les échantillons au laboratoire rapidement, dans les conditions les plus proches possible du stockage
original.
Il est recommandé d'emballer l'échantillon afin d'éviter toute casse ou déversement.
Il est recommandé que l'étiquette du produit indique si une réfrigération est nécessaire.
Les échantillons n'exigeant pas de réfrigération ou de congélation peuvent être emballés dans un récipient en utilisant un
matériau d’emballage approprié pour éviter toute casse.
Ne pas utiliser de morceaux de glace, car cela peut contaminer le produit si le récipient se brise ou fuit.
Sauf indication contraire dans des normes spécifiques (par exemple l'ISO 6887 et l'ISO 8261), les températures suivantes
sont recommandées durant le transport:
⎯ produits stables: température ambiante (inférieure à 40 °C);
⎯ produits congelés ou surgelés: inférieure à −15 °C, de préférence inférieure à −18 °C;
⎯ autres produits non stables à température ambiante: de 1 °C à 8 °C;
⎯ échantillons prélevés par écouvillonnage: voir l'ISO 18593 et l'ISO 17604.
Si aucune condition n'est spécifiée, il est recommandé que les parties concernées s'accordent sur la température et la
durée du transport.
8.3 Réception
Vérifier l'état des échantillons dès leur réception.
Si ceux-ci sont endommagés ou s'ils sont en quantité insuffisante, il est recommandé que le laboratoire refuse les
échantillons.
Dans certaines circonstances particulières, ils peuvent être analysés, après en avoir discuté avec le client et avoir obtenu
son accord.
Cependant le rapport d'essai doit comporter des réserves sur la validité des résultats.
Documenter les échantillons admis au laboratoire de manière à assurer leur suivi jusqu'à la rédaction du
rapport d'essai. L'identification et le codage des échantillons ainsi que les enregistrements doivent permettre
la traçabilité à toutes les étapes au sein du laboratoire.
Si nécessaire, il est recommandé de désinfecter la surface extérieure des récipients avec un désinfectant approprié.
Vérifier que les récipients pour échantillon ne présentent pas de défauts physiques visibles.
Noter les informations suivantes:
⎯ la date et l'heure de réception, si cela est pertinent;
⎯ les caractéristiques du prélèvement (date et heure du prélèvement si cela est pertinent et connu, état de
l'échantillon);
⎯ le nom et l'adresse du client.
Dès réception des échantillons périssables, enregistrer la température lors du transport ou la température
d'un échantillon témoin inclus à cette intention.

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Examiner les échantillons le plus rapidement possible après leur réception, de préférence sous 24 h ou
comme convenu entre les parties concernées.
Pour les produits rapidement périssables (tels que les mollusques), il est recommandé de commencer l'essai dans les 24 h
suivant le prélèvement. Pour les produits périssables (tels que le poisson, le lait cru), il est recommandé de commencer
l'essai dans les 36 h suivant le prélèvement.
Si les délais ci-dessus de mise en analyse ne peuvent être respectés, les échantillons peuvent être congelés à une
température inférieure à −15 °C, de préférence inférieure à –18 °C, à condition qu'il ait été démontré que la récupération
du (des) micro-organisme(s) cible(s) ne soit pas altérée de manière significative dans cette matrice.
8.4 Stockage
Stocker les échantillons en attente d'être examinés dans des conditions réduisant le plus possible toute
modification du nombre de micro-organismes présents.
Les températures de stockage suivantes sont recommandées:
⎯ produits stables: température ambiante (de 18 °C à 27 °C);
⎯ produits congelés ou surgelés: inférieure à −15 °C, de préférence inférieure à −18 °C;
⎯ autres produits non stables à température ambiante, notamment les produits alimentaires avariés: 3 °C ± 2 °C (voir
l'ISO 6887-2, l'ISO 6887-3, l'ISO 6887-4 ou l'ISO 8261);
⎯ échantillons prélevés par écouvillonnage: voir l'ISO 18593 et l'ISO 17604.
8.5 Prise d'essai
8.5.1 Règles spécifiques pour la prise d'essai
Pour les règles spécifiques à la prise d'essai et à la préparation du broyat et de la suspension mère, voir la
partie appropriée de l'ISO 6887 ou l'ISO 8261.
8.5.2 Conservation et destruction des échantillons pour laboratoire
Sauf cas particuliers, conserver les échantillons pour laboratoire jusqu'à ce que tous les résultats aient été
obtenus ou plus longtemps si nécessaire, en les conditionnant dans des récipients stériles (sachets en
matière plastique, par exemple) et en les remettant à la température de stockage d'origine.
Il est recommandé de congeler les produits périssables.
NOTE Dans la pratique, il n'est généralement pas accepté de soumettre un même échantillon à un nouvel essai, en raison des
changements pouvant survenir sur la flore microbienne.
9 Examen
9.1 Précautions hygiéniques pendant l'analyse
Pour éviter une contamination de l'environnement et des prises d'essai, manipuler les produits en poudre
(déshydratés) dans une pièce ou une zone séparée ou dans une hotte de sécurité.
Pour les échantillons ordinaires, essuyer, avant ouverture, la zone d'ouverture avec de l'alcool à 70 % (par
volume) (ou un produit équivalent) et laisser s'évaporer. Pour les emballages stériles, immerger la zone à
ouvrir dans une solution contenant du chlore libre de 100 ppm à 200 ppm (ou un autre agent stérilisant

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approprié) pendant au moins 10 min, afin de détruire les micro-organismes susceptibles de contaminer
l'échantillon.
Tout instrument servant à ouvrir un emballage et à enlever tout ou une partie de l'échantillon (ouvre-boîtes,
paire de ciseaux, cuillère, pince, pipette, etc.) doit être stérile.
Il est recommandé de nettoyer et d'essuyer la zone de travail environnante avec un désinfectant approprié avant de
commencer l'essai.
Il est recommandé de se laver les mains juste avant de commencer l'essai et pendant l'essai si les mains sont contaminées.
Il est recommandé que tous les instruments utilisés soient stériles et protégés de toute exposition à la contamination avant
et pendant leur utilisation.
Il est recommandé de placer tous les instruments et outils utilisés dans un conteneur approprié en vue de leur élimination
ou stérilisation ultérieure.
Prendre les précautions nécessaires pour travailler le plus possible dans des conditions aseptiques, par
exemple:
a) s'assurer que la zone de travail est propre, que toutes les sources potentielles de contamination sont
supprimées ou réduites le plus possible et de l'absence de courant d'air (portes et fenêtres fermées) et
éviter, durant l'examen, les allées et venues inutiles de personnels;
b) décontaminer la surface de travail avec un désinfectant approprié, avant et après le travail;
c) avant de commencer, s'assurer de la disponibilité de tout ce qui est nécessaire à la réalisation du travail
(et uniquement de celui-ci);
d) effectuer le travail sans attendre;
e) séparer les activités «propres» et «sales» dans le temps ou physiquement (cela est particulièrement
important pour des échantillons à haut risque tels que de la viande crue ou des œufs crus);
f) utiliser du matériel à usage unique;
g) si la totalité d'un sachet de pipettes jetables, de boîtes de Petri, etc., n'est pas utilisée au cours d'un
examen, s'assurer que le récipient est bien fermé après avoir prélevé le nombre approprié d'unités;
h) essuyer immédiatement tout écoulement à l'aide de tampons de coton ou de tout autre matériel approprié,
imprégnés d’alcool à 70 % (par volume) ou de tout autre désinfectant approprié 1), puis nettoyer et
désinfecter la surface de travail avant de continuer;
i) si cela est demandé par la réglementation nationale en vigueur, utiliser une hotte de sécurité pour la
manipulation de produits susceptibles de contenir des bactéries pathogènes;
j) en retirant les pipettes stériles du récipient, ne pas frotter la pointe sur les parties extérieures exposées
des pipettes restant dans le récipient, car de telles surfaces peuvent être contaminées;
k) ne pas essuyer ou frotter la pipette sur le rebord ou le col des flacons de dilution.
Les aérosols sont une cause importante de contamination de l'environnement et d'infection. Les aérosols
peuvent se créer, par exemple:
⎯ lors de l'ouverture des boîtes de Petri, tubes et flacons;
⎯ lors de l'utilisation d'agitateurs, de seringues, de centrifugeuses, etc.;
1) Pour l'utilisation d'un désinfectant autre que de l'alcool à 70 % (par volume), l'adaptation du temps de contact pour une
désinfection efficace, selon les instructions du fournisseur, est nécessaire.

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⎯ lorsque l'on vide les pipettes;
⎯ lors de la stérilisation d'anses ou de fils à ensemencer humides;
⎯ lors de l'ouverture d'ampoules contenant des cultures lyophilisées.
Il est donc nécessaire de réduire autant que possible leur formation.
Des précautions supplémentaires sont requises pour les méthodes moléculaires selon l'ISO 22174.
9.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions
Préparer la suspension mère et les dilutions conformément à la partie appropriée de l'ISO 6887 ou à
l'ISO 8261. Le laps de temps entre la fin de la préparation de la suspension mère et le moment où l'inoculum
entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières
mentionnées dans la Norme internationale spécifique.
Les étapes de préparation de la suspension mère et des dilutions peuvent être suivies d'une étape d'enrichissement décrite
dans les normes spécifiques.
9.2.2 Concentration
9.2.2.1 Centrifugation ou filtration sur membrane
Si l'on exige le dénombrement de petits nombres de micro-organismes, le dénombrement peut être amélioré, en termes de
sensibilité et de fidélité, par l'introduction d'une étape de concentration de la prise d'essai. Cette concentration peut être
réalisée par centrifugation ou filtration sur membrane.
En cas de centrifugation, remettre en suspension le culot dans un volume connu de diluant, afin de réaliser
l'analyse.
Pour chaque combinaison (produit alimentaire, micro-organisme) considérée, une étude (voir, par exemple, la
Référence [23]) préalable doit démontrer si l'ajout d'une étape de concentration est nécessaire et valide.
L'aptitude à la filtration de la suspension du produit alimentaire doit être évaluée.
Il est recommandé de vérifier les performances de la méthode complète en termes de sensibilité, de sélectivité, de
linéarité et de répétabilité. Lorsque les niveaux de contamination sont inconnus, il est recommandé de réaliser la méthode
normalisée (sans filtration) en parallèle.
9.2.2.2 Immunoséparation
Si un faible nombre de micro-organismes cibles est présent dans l'échantillon, leur séparation et leur concentration
peuvent être obtenues à l'aide de billes immunomagnétiques recouvertes d'anticorps appropriés.
Répartir directement les billes contenant les micro-organismes cibles capturés sur le milieu solide spécifique,
conformément aux normes applicables. Cependant, vérifier que les billes immunomagnétiques recouvertes
d'anticorps spécifiques utilisées pour la concentration sont appropriées, comme le montrent des études
d'évaluation publiées dans la littérature scientifique internationale, de préférence dans le domaine de la
microbiologie des aliments. Cette vérification est importante, particulièrement si cette méthode n'a pas été
validée conformément à l'ISO 16140.

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10 Dénombrement
10.1 Généralités
Lors du contrôle de la qualité microbiologique et/ou de la sécurité microbiologique des aliments et des
aliments pour animaux, il n'est pas suffisant de connaître quels sont les micro-organismes présents. Dans la
plupart des cas, la quantité dans laquelle ils sont présents est également un facteur important, d'où la
nécessité de les dénombrer. Pour ce faire, il existe plusieurs manières de procéder: par exemple par examen
direct (microscopie), en inoculant des milieux solides ou liquides, par cytométrie en flux, par PCR en temps
réel, etc. La présente Norme internationale ne traite cependant que du dénombrement sur milieux solides et
liquides.
Le dénombrement sur milieux solides se base sur la capacité qu'ont de nombreux micro-organismes à
produire des colonies dans ou sur des milieux gélosés pouvant être détectées à l'œil nu ou à l'aide d'une
simple loupe. Cependant, si la matrice contient des particules pouvant interférer avec la détection des
colonies, ou si le niveau de bactéries est très faible, ce principe ne peut être utilisé sans procéder, au
préalable, à la séparation des micro-organismes cibles de la matrice (par exemple par filtration,
immunoséparation, etc.). Dans de tels cas, le dénombrement en milieux liquides constitue souvent une
alternative acceptable.
10.2 Dénombrement sur milieu solide
Il est recommandé d'étiqueter la boîte de Petri avec le numéro d'échantillon, la dilution, la date et toute autre information
utile.
Il est recommandé de sélectionner les dilutions pour garantir que les boîtes contiennent le nombre approprié de colonies
(voir 10.3.1) et pour remédier aux éventuelles propriétés inhibitrices.
Pour le transfert de chaque dilution, utiliser une pipette stérile différente, à moins de procéder par ordre
décroissant.
10.2.2 Nombre de boîtes de Petri par dilution
Pour les méthodes de dénombrement en microbiologie des aliments, une boîte par dilution doit être utilisée
avec au moins deux dilutions successives, pour les laboratoires qui fonctionnent sous assurance qualité selon
les principes de l’ISO 17025. Si une seule dilution est réalisée ou si un laboratoire ne fonctionne pas sous
assurance qualité, alors deux boîtes par dilution doivent être utilisées selon l’ISO 8199.
10.2.3 Techniques dans la masse
Prélever les volumes définis de la dilution à examiner en veillant à ce que l'embout de la pipette soit au
contact de la paroi du tube afin d'ôter les surplus de liquide adhérant à l'extérieur. Soulever le couvercle de la
boîte de Petri stérile suffisamment pour y insérer la pipette, puis délivrer le contenu. Verser le milieu gélosé
fondu à une température comprise entre 44 °C et 47 °C dans chaque boîte de Petri 2). Éviter de verser le
milieu directement sur l'inoculum. Mélanger immédiatement et soigneusement le milieu en surfusion et
l'inoculum, de façon à obtenir une répartition homogène des micro-organismes dans le milieu. Laisser refroidir
et se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface fraîche et horizontale (le temps de solidification de
la gélose ne doit pas dépasser 10 min).
2) Généralement, de 18 ml à 20 ml de gélose dans des boîtes de Petri de 90 mm, afin d'obtenir au moins 3 mm d'épaisseur.

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Après avoir ôté du bain thermostaté d'eau le milieu gélosé refroidi, sécher le flacon avec un chiffon propre afin
d'éviter que l'eau ne contamine les boîtes. En versant, éviter de répandre le milieu à l'extérieur du récipient ou
dans le couvercle de la boîte.
Cela peut demander de tenir le flacon en position quasi horizontale ou de ne pas le poser entre les étapes du coulage.
Lorsque, dans le produit à examiner, la présence de micro-organismes à colonies envahissantes est

suspectée (par exemple Proteus spp.), couler sur les boîtes solidifiées une seconde couche de gélose non
nutritive ou identique à celle du milieu de culture utilisé dans l'essai 3 ), afin de limiter voire d'inhiber
l'envahissement par ces micro-organismes.
10.2.4 Ensemencement en surface
Les méthodes d'ensemencement conçues pour produire uniquement des colonies en surface dans les boîtes
gélosées présentent certains avantages par rapport à la méthode dans la masse. La morphologie des
colonies en surface est facile à observer, ce qui augmente la capacité de l'analyste à distinguer les différents
types de colonies.
Les micro-organismes n'étant pas exposés à la chaleur du milieu gélosé en surfusion, il est donc possible d'obtenir des
résultats de dénombrement plus importants.
Utiliser des boîtes précoulées, contenant un milieu gélosé d'au moins 3 mm d'épaisseur, de niveau constant,
ne contenant aucune bulle d'air ni humidité en surface.
Afin de favoriser une répartition uniforme, il est recommandé de sécher la surface de la gélose solidifiée conformément à
l'ISO/TS 11133 ou comme spécifié dans la Norme internationale applicable pour que l'inoculum soit absorbé en 15 min.
10.2.4.2 Étalement/méthode à l'étaleur
À l'aide d'une pipette stérile, transférer l'inoculum (habituellement 0,1 ml ou 0,5 ml) de l'échantillon liquide
pour essai, ou de la suspension mère s'il s'agit d'autres échantillons, dans la boîte gélosée (respectivement
d'un diamètre de 90 mm ou de 140 mm). Répéter cette étape pour la dilution décimale suivante (les colonies
à dénombrer seront alors présentes à l'étape 10−1 s'il s'agit d'un échantillon liquide et 10−2 s'il s'agit d'un autre
échantillon) puis, le cas échéant, répéter l'opération pour des dilutions décimales supplémentaires.
S'il est nécessaire de détecter un faible nombre de micro-organismes pour certains produits, la limite de détection peut
être augmentée d'un facteur 10 en analysant 1,0 ml de l'échantillon s'il s'agit de produits liquides ou 1,0 ml de la
suspension mère s'il s'agit d'autres produits. À cet effet, répartir 1,0 ml de l'inoculum soit sur la surface d'une grande boîte
de Petri (140 mm de diamètre), soit sur la surface de trois petites boîtes de Petri (diamètre 90 mm).
À l'aide d'un étaleur en verre, en plastique ou en acier (composé, par exemple, d'une tige en verre en forme
de crosse de hockey, d'un diamètre d'environ 3,5 mm et longue d'environ 20 cm, coudé à environ 3 cm de
l'extrémité et aplati aux extrémités par chauffage), répartir uniformément l'inoculum aussi rapidement que
possible sur la surface gélosée, sans toucher les parois de la boîte de Petri. Laisser sécher les boîtes, avec
les couvercles en place, pendant environ 15 min à température ambiante.
Dans certains cas (indiqués dans la Norme internationale applicable), l'inoculum peut être déposé sur une membrane
avant d'être réparti comme décrit précédemment.
3) Généralement, 5 ml de gélose dans des boîtes de Petri de 90 mm.

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10.2.4.3 Méthodes spirales
10.2.4.3.1 Généralités
La méthode spirale pour la détermination du niveau de micro-organismes a été soumise à essai interlaboratoires avec du
lait, des produits laitiers et d'autres produits alimentaires.
Le matériel utilisé — l'ensemenceur spiral — est décrit en 5.24.
10.2.4.3.2 Préparation de la boîte gélosée
Pour la préparation des boîtes gélosées, il est recommandé d'utiliser un répartiteur automatique avec un système de
distribution stérile afin de garantir que les boîtes sont de niveau constant.
Verser la même quantité de gélose dans toutes les boîtes, de sorte que la même hauteur de gélose soit
présentée à la pointe du stylet de l'ensemenceur spiral, afin de maintenir l'angle de contact.
Il est également possible d'utiliser des boîtes gélosées préparées dans le commerce.
10.2.4.3.3 Mode opératoire d'ensemencement et comptage
Décontaminer la pointe du stylet et le tuyau flexible en faisant passer une solution d'hypochlorite de sodium
(voir 5.24.4) puis de l'eau stérile dans le système avant de faire passer l'échantillon liquide dans le stylet.
Placer une boîte de Petri précoulée sur le plateau tournant et abaisser le stylet. L'échantillon est déposé de
façon différentielle lorsque la pointe du stylet parcourt la surface de la boîte gélosée en rotation. Ôter la boîte
ensemencée et retourner le stylet sur sa position de départ. Décontaminer le stylet et le remplir pour
l'ensemencement d'un autre échantillon.
Après incubation, centrer la grille de comptage de l'ensemenceur spiral. Utiliser la règle de comptage de 20
pour déterminer le nombre de colonies. Choisir un secteur et commencer le comptage des colonies depuis le
bord extérieur du premier segment vers le centre, jusqu'à ce que 20 colonies aient été comptées. Continuer
par le comptage des colonies restantes dans le segment qui contient la vingtième colonie. Compter une zone
correspondante du côté opposé de la boîte et diviser le nombre de colonies comptées des deux côtés par le
volume d'échantillon déposé dans ces deux zones. Les volumes d'échantillon associés à chaque portion de la
grille de comptage sont indiqués dans le manuel d'utilisation fourni avec chaque ensemenceur spiral.
10.2.5 Incubation
Sauf spécification contraire, retourner les boîtes immédiatement après leur ensemencement et les placer
rapidement dans l'étuve réglée à la température spécifiée. Si une déshydratation excessive se produit (par
exemple à 55 °C ou dans le cas d'une forte circulation d'air), envelopper les boîtes, sans les serrer, dans des
sacs en matière plastique, avant l'incubation, ou utiliser tout système similaire d'efficacité équivalente.
Pendant la période d'incubation, de légères variations de température sont inévitables et tolérées, par exemple au moment
de charger ou de décharger l'étuve, mais il est important que ces périodes soient réduites le plus possible. Il est
recommandé de contrôler la durée de ces variations pour s'assurer qu'elles n'auront pas d'effet significatif sur le résultat.
NOTE Il peut être utile, dans certains cas, de prévoir des boîtes ensemencées supplémentaires, qui seront conservées à
3 °C ± 2 °C, pour les comparer, lors du comptage, avec les boîtes ensemencées incubées, afin de ne pas confondre les particules du
produit examiné avec les colonies. Pour pouvoir faire la différence entre les particules du produit et les colonies, une loupe binoculaire
peut également être utilisée.
Dans certaines circonstances, pour l'organisation du travail dans les laboratoires, il peut être préférable de
réfrigérer les boîtes ensemencées pendant une durée maximale de 24 h avant l'incubation. Dans ce cas, le
laboratoire doit s'assurer que cette pratique est sans incidence sur le nombre de colonies obtenues.
Généralement, il est recommandé que les piles ne dépassent pas six boîtes de Petri pour l'incubation en aérobiose et
qu'elles soient séparées l'une de l'autre et des parois de l'incubateur par une distance d'au moins 25 mm. Toutefois, des

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piles plus hautes et moins espacées peuvent être tolérées pour les étuves équipées de systèmes de circulation de l'air; dans
ce cas, il est recommandé de s’assurer de l’homogénéité de la répartition de la température.
Après incubation, il est normalement recommandé d'examiner les boîtes immédiatement. Elles peuvent cependant être
conservées, sauf spécification contraire dans les normes spécifiques, jusqu'à 48 h au réfrigérateur. La conservation en
réfrigérateur pendant une plus longue période peut être tolérée uniquement s'il a été démontré que cela n'a aucune
incidence sur le dénombrement, l'apparence ou la confirmation ultérieure des colonies. Pour certains milieux contenant
des indicateurs colorés, il est recommandé de laisser les boîtes réfrigérées s'équilibrer à température ambiante avant leur
examen, pour s'assurer de la récupération correcte de la couleur.
10.3 Calcul et expression des résultats sur milieu solide
10.3.1 Dénombrement des colonies
(colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies présumées) pour chaque boîte contenant moins
de 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique).
Dans le cas du comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées, la description des
colonies doit être celle indiquée dans la norme spécifique.
Dans certains cas, les colonies peuvent être difficiles à compter (par exemple en présence de micro-
organismes envahissants). Considérer les colonies envahissantes comme des colonies uniques. Si moins
d'un quart de la boîte est envahi, compter les colonies sur la partie non affectée de la boîte et calculer le
nombre correspondant à la boîte entière. En déduire par extrapolation le nombre théorique qui devrait
correspondre à la boîte entière. Si plus d'un quart de la boîte est envahi, ne pas procéder au comptage.
Considérer également les colonies envahissantes sous forme de chaînes comme une seule colonie.
Les différents modes de calcul définis en 10.3.2 doivent tenir compte des boîtes ne contenant aucune colonie,
lorsque celles-ci ont été retenues.
Dans le cas de l'utilisation d'un ensemenceur spiral, le comptage des colonies est décrit en 10.2.4.3.3.
10.3.2.1.1 Dans le présent paragraphe, les cas traités correspondent aux cas généraux:
⎯ ensemencement d'une boîte de Petri d'un diamètre de 90 mm par dilution;
⎯ nombre maximal pour le comptage des colonies en totalité: 300 par boîte;
une boîte dans le cas de comptage de colonies caractéristiques ou présumées: de préférence 300 par
boîte;
⎯ nombre maximal pour le comptage des colonies caractéristiques ou présumées: 150 par boîte;
⎯ nombre de colonies présumées (10.3.2.3) repiquées pour identification ou confirmation à partir de chaque
boîte retenue: en général 5.
Ces nombres sont définis dans les normes spécifiques.
En cas d'utilisation de boîtes d'un diamètre autre que 90 mm, le nombre maximal de colonies doit être
augmenté ou diminué proportionnellement à la surface des boîtes (ou des membranes).

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10.3.2.1.2 Les modes de calcul définis ci-après prennent en compte les cas apparaissant le plus
fréquemment lorsque les essais sont réalisés conformément à la bonne pratique de laboratoire. De rares cas
particuliers peuvent apparaître (par exemple un rapport très différent de celui du facteur de dilution entre les
boîtes de deux dilutions successives); il est alors nécessaire que les résultats de comptage obtenus soient
examinés, interprétés ou éventuellement rejetés par un microbiologiste qualifié.
10.3.2.2 Mode de calcul: cas général (comptage des colonies en totalité ou des colonies
caractéristiques)
moins une boîte contenant au moins 10 colonies [colonies en totalité, colonies caractéristiques ou répondant
aux critères d'identification (voir 10.3.2.3)].
Calculer le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai, en tant que la moyenne
pondérée à partir de deux dilutions successives, à l'aide de l'Équation (1):
N=
∑C
(1)
V × 1,1× d
où
∑C est la somme des colonies comptées sur les 2 boîtes retenues de deux dilutions successives et
dont au moins une contient au moins 10 colonies;
d est la dilution correspondant à la première dilution retenue [d = 1 si le produit liquide ensemencé

directement (échantillon pour essai) est retenu].
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour cela, si le troisième chiffre est inférieur à 5, le
chiffre précédent n'est pas modifié; si le troisième chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est
augmenté d'une unité.
Exprimer, de préférence, le résultat comme un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
appropriée de 10, ou un nombre entier avec 2 chiffres significatifs.
Rapporter le résultat comme le nombre N de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits).
EXEMPLE Un dénombrement a permis d'obtenir les résultats suivants:
⎯ à la première dilution retenue (10−2): 168 colonies;
⎯ à la deuxième dilution retenue (10−3): 14 colonies.
∑C 168 +14 182

N= = = = 16 545
V ×1,1 × d 1 × 1,1× 10 −2 0, 011
En arrondissant le résultat tel que spécifié ci-dessus, le nombre de micro-organismes est de 17 000 ou 1,7 × 104 par millilitre ou par
gramme de produit.
10.3.2.3 Mode de calcul: cas après identification (/confirmation)
Lorsque la méthode utilisée nécessite une identification, un nombre déterminé, A (en général 5), de colonies
caractéristiques présumées qui sont identifiées à partir de chacune des boîtes retenues pour le comptage des
colonies. Après identification, calculer, pour chacune des boîtes, le nombre a de colonies répondant aux
critères d'identification, à l'aide de l'Équation 2:
b
a= ×C (2)
A

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où
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification parmi les colonies identifiées, A;
C est le nombre total de colonies caractéristiques présumées suspectes dénombrées sur la boîte.
Arrondir les résultats calculés au nombre entier le plus proche. Pour cela, si le premier chiffre après la virgule
est inférieur à 5, le chiffre précédent n'est pas modifié; si le premier chiffre après la virgule est supérieur ou
égal à 5, le chiffre précédent est augmenté d'une unité.
Calculer le nombre N de micro-organismes identifiés présents dans l'échantillon pour essai, en remplaçant ΣC
par Σa dans l'équation indiquée en 10.3.2.2.
Arrondir le résultat comme spécifié en 10.3.2.2;
Exprimer le résultat comme spécifié en 10.3.2.2.
⎯ à la première dilution retenue (10−3): 66 colonies;
⎯ à la deuxième dilution retenue (10−4): 4 colonies.
Des colonies sélectionnées ont été soumises à essai:
⎯ des 66 colonies, 8 colonies ont été soumises à essai, dont 6 ont répondu aux critères; d'où a = 50;
⎯ des 4 colonies, les 4 ont toutes répondu aux critères; d'où a = 4.
N=
∑a =
50 + 4
=
54
= 49 090
V × 1,1 × d 1 × 1,1 × 10 −3 1,1 × 10 −3
En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre de micro-organismes est de 49 000 ou 4,9 × 104 par millilitre ou par
gramme de produit.
10.3.2.4 Mode de calcul: petits nombres
10.3.2.4.1 Cas d'une boîte (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution)
Les dénombrements compris entre 10 et la limite supérieure (pratique) de chaque méthode correspondent à
l'étendue de fidélité optimale. La fidélité diminue rapidement lorsque le nombre de colonies diminue
au-dessous de 10. Selon la finalité de l'essai, une limite inférieure de détermination peut être définie comme
ci-dessous pour un nombre inférieur à 10.
Conformément à l'ISO/TR 13843, la définition de la limite de détermination est «concentration de particules

moyenne la plus faible x par prise analytique, lorsque l'incertitude type relative prévue est égale à une valeur
spécifiée (RSD)». RSD est l'écart-type relatif, qui est calculé en divisant l'estimation de l'écart-type s de la
population d'un échantillon par la moyenne x de cet échantillon. Au lieu de RSD, on utilise le symbole w pour
l'écart-type relatif. Ainsi w = s / x .
Dans le cas d'une distribution de Poisson, x est calculé par l'équation:

1
x= (3)
( w) 2

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Si w est défini à 50 % comme étant la limite acceptable de fidélité relative (ce qui paraît être raisonnable en
microbiologie), la limite inférieure de détermination sera le nombre de colonies:
1
x= =4
( 0,50 ) 2
Ainsi, il est recommandé de traiter les résultats fondés sur les dénombrements inférieurs à quatre comme une simple
détection de la présence de micro-organismes.
En résumé:
Si la boîte contient moins de 10 colonies, mais au moins 4, calculer le résultat comme spécifié pour les cas
généraux (10.3.2.2) et l'exprimer comme le nombre estimé x de micro-organismes par millilitre (produits
liquides) ou par gramme (autres produits).
Si le total est compris entre 3 et 1, la fidélité des résultats est si faible que l'on doit exprimer le résultat comme
suit :
«Le micro-organisme est présent, mais avec moins de (4 × d) micro-organismes par g ou ml».
10.3.2.4.2 Cas d'une boîte (échantillon pour essai ou suspension mère ou première dilution) ne
contenant aucune colonie
Si la boîte contenant l'échantillon pour essai (produits liquides), ou la suspension mère (autres produits) ou la
première dilution ensemencée ou retenue, ne contient aucune colonie, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/d micro-organismes par millilitre» (produits liquides) ou «moins de 1/d micro-organismes par
par gramme» (autres produits)»
où d est le taux de dilution de la suspension mère ou de la première dilution ensemencée ou retenue

(d = 100 = 1 lorsque l'échantillon pour essai de produit liquide directement ensemencé est retenu).
10.3.2.4.3 Cas particuliers
10.3.2.4.3.1 Généralités
Ces cas concernent le comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques à confirmer.
10.3.2.4.3.2 Cas 1
dilution d1 est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), avec des colonies
caractéristiques visibles ou des colonies identifiées/confirmées et si la boîte contenant la dilution suivante d2
caractéristique ou identifiée/confirmée n’est visible, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/d2 et plus de 1/d1 micro-organisme par millilitre» (produits liquides) ou «moins de 1/d2 et plus
de 1/d1 micro-organisme par gramme» (autres produits).
où d1 et d2 sont les facteurs de dilution correspondant aux dilutions d1 et d2.
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: plus de 300 colonies sur la boîte, avec des colonies caractéristiques ou
⎯ à la deuxième dilution (10−3) retenue: 33 colonies, sans colonie caractéristique ou identifiée/confirmée présente.

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10.3.2.4.3.3 Cas 2
dilution d1 est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), ne comprenant
aucune colonie caractéristique visible ou identifiée/confirmée et si la boîte contenant la dilution suivante d2
caractéristique ou identifiée/confirmée n'est visible, reporter le résultat comme suit:
«moins de 1/d2 micro-organisme par millilitre» (produits liquides) ou «moins de 1/d2 micro-organisme par
gramme» (autres produits)
où d2 est le taux de dilution correspondant à la dilution d2.
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: plus de 300 colonies sur la boîte, sans colonies caractéristiques ou identifiées/confirmées
présentes;
⎯ à la deuxième dilution (10−3) retenue: 33 colonies, sans colonies caractéristiques ou identifiées/confirmées présentes.
10.3.2.5 Mode de calcul: cas particuliers
10.3.2.5.1 Lorsque le nombre de colonies comptées (colonies totales, colonies caractéristiques ou colonies
caractéristiques présumées) est supérieur à 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique)
pour la boîte contenant la première dilution d1, avec un nombre de colonies (colonies totales, colonies
caractéristiques ou répondant à des critères d'identification) inférieur à 10 pour la boîte contenant la dilution
suivante d2:
⎯ si le nombre de colonies, pour la boîte contenant la dilution d1, est compris dans l'intervalle 334 à 300
(partie supérieure de l'intervalle de confiance d'une moyenne pondérée égale à 300), utiliser le mode de
calcul pour les cas généraux (voir 10.3.2.2);
⎯ si le nombre de colonies, pour la boîte contenant la dilution d1, est supérieur à 334 (limite supérieure de
l'intervalle de confiance pour une moyenne pondérée égale à 300), ne retenir que le résultat du comptage
de la dilution d2, puis calculer une estimation des petits nombres (voir 10.3.2.4), sauf en cas de nombre
maximal pour les comptages fixée à 300, si le second résultat est inférieur à 8 (limite inférieure de
l'intervalle de confiance pour une moyenne pondérée égale à 10), car l'écart entre les deux dilutions n'est
alors pas acceptable.
Les chiffres correspondant aux intervalles de confiance doivent être adaptés au nombre maximal indiqué pour
le comptage des colonies.
EXEMPLE 1 Un comptage a permis d'obtenir les résultats suivants:
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: 310 colonies;
⎯ à la deuxième dilution (10−3) retenue: 8 colonies.
Utiliser le mode de calcul pour les cas généraux pour les boîtes contenant les deux dilutions retenues.
EXEMPLE 2 Un comptage a permis d'obtenir les résultats suivants:
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: plus de 334 colonies dans la boîte;

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Consigner un comptage estimatif sur la base des colonies comptées dans la boîte de la dilution 10−3.
EXEMPLE 3 Un comptage (lorsque le nombre maximal est défini à 300 pour le comptage des colonies) a produit les résultats
suivants:
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: plus de 334 colonies dans la boîte;
Le résultat de ce comptage n'est pas acceptable.
EXEMPLE 4 Un comptage (lorsque le nombre maximal est défini à 150 pour le comptage des colonies) a produit les résultats
suivants:
⎯ à la première dilution (10−2) retenue: plus de 167 colonies dans la boîte (limite supérieure de l'intervalle de confiance avec une
moyenne pondérée égale à 150);
Consigner un comptage estimatif sur la base des colonies comptées dans la boîte de la dilution 10−3.
10.3.2.5.2 Lorsque le comptage des colonies (colonies totales, typiques ou présumées) de chacune des
boîtes pour toutes les dilutions ensemencées produit un nombre supérieur à 300 (ou tout autre nombre
indiqué dans la norme spécifique), reporter le résultat comme suit:
«plus de 300/d» (cas de colonies totales ou typiques) ou «plus de 300 × b/A × 1/d» (cas de colonies
confirmées) exprimé en micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou en micro-organismes par
gramme (autres produits)
où
b est le nombre de colonies répondant aux critères d'identification parmi les colonies présumées A.
10.3.2.5.3 Lorsque la boîte de la dernière dilution ensemencée contenant plus de 10 et moins de 300 (ou
tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique) colonies (colonies totales, typiques ou présumées),
calculer le nombre N′ de micro-organismes présents en utilisant l'Équation 4:
c
N' = (4)
V ×d
où
c est le nombre de colonies comptées dans la boîte;
d est la dilution correspondant à la dilution retenue.
Arrondir les résultats comme spécifié en 10.3.2.2
Exprimer le résultat comme le nombre N′ de micro-organismes par millilitre (produits liquides) ou par gramme
(autres produits).
EXEMPLE Un comptage a permis d'obtenir les résultats suivants:
⎯ à la dernière dilution (10−4) ensemencée: 120 colonies.

120
N' = = 1 200 000
−4
1×10

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En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre N′ de micro-organismes est de 1 200 000 ou 1,2 × 106 par millilitre
ou par gramme de produit.
10.3.2.6 Mesure de l'incertitude
Voir l'ISO/TS 19036 relatif aux déterminations quantitatives.
10.4 Dénombrement des levures et moisissures
Il est recommandé généralement de toujours dénombrer les levures et moisissures soit par la technique dans la masse, qui
permet un dénombrement plus aisé, soit par la technique d'ensemencement en surface, avec laquelle les cellules sont
soumises à une exposition optimale à l'oxygène atmosphérique et qui évite le stress thermique de la gélose en surfusion.
Il est recommandé de sécher les boîtes gélosées précoulées avant de les ensemencer (voir l'ISO/TS 11133).
Certaines levures et moisissures peuvent être pathogènes ou peuvent provoquer des réactions allergiques, parfois même
chez des personnes en bonne santé. C'est pourquoi, il est important d'être raisonnablement prudent en travaillant avec les
champignons. Idéalement, il est recommandé de conserver les boîtes dans une étuve, et non dans une pièce ouverte. Il est
recommandé d'ouvrir les boîtes le moins possible, normalement uniquement dans un objectif critique tel que la
préparation d'une lame pour un examen au microscope. Il est recommandé de refroidir les aiguilles traitées à la flamme
avant d'effectuer des repiquages, afin d'éviter la dispersion de conidies et d'autres cellules. Il est recommandé de
désinfecter les plans de travail et les étuves régulièrement.
Étant donné que tout mouvement peut entraîner un relargage de conidies ou de spores de moisissures pouvant provoquer
le développement de colonies satellites, susceptible de fausser les résultats en donnant une surestimation de la population,
il est recommandé d'incuber les boîtes de Petri en position non retournées et stables, jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour
le comptage.
10.4.2 Comptage des colonies pour les levures et moisissures
Les boîtes contenant de 10 à 150 colonies sont généralement comptées. Si la mycoflore est essentiellement
composée de moisissures, sélectionner des boîtes parmi celles contenant la population la plus faible; si elle
est essentiellement composée de levures, il est possible de sélectionner des boîtes atteignant la limite
supérieure pour le comptage.
S'il existe un doute sur l'identité des colonies, examiner les états frais ou les colorations des cellules d'au
moins 5 colonies par échantillon afin de confirmer l'absence de bactéries.
10.5 Dénombrement en milieu liquide
10.5.1 Principe
Les prises d'essai sont ensemencées dans un milieu liquide, conçu pour favoriser la croissance d'un micro-
organisme ou d'un groupe de micro-organismes particulier, et, le plus souvent, pour inhiber la prolifération
d'autres types de micro-organismes.
Pour déterminer s'il y a eu croissance des micro-organismes recherchés, il existe différents critères, tels que
l'apparition de turbidité, la production de gaz, les changements de couleur, l'isolement des micro-organismes
sur un milieu de culture gélosé sélectif, etc. La composition des milieux de culture et les critères permettant de
distinguer un résultat positif d'un résultat négatif sont définis dans les normes correspondantes.
En utilisant cette approche, seule une valeur qualitative peut être attribuée à chaque prise d'essai, c'est-à-dire
un résultat positif ou négatif. Pour obtenir une estimation de la quantité de micro-organismes présente, il est
nécessaire d'examiner les diverses prises d'essai et d'utiliser des procédures statistiques pour déterminer le
nombre le plus probable (NPP).

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10.5.2 Ensemencement
Si un milieu de culture sélectif est utilisé, il est recommandé que l'ajout de la prise d'essai ne réduise pas ses propriétés
sélectives (ce qui permettrait la croissance de micro-organismes autres que les micro-organismes recherchés). Dans la
plupart des normes, la compatibilité d'une matrice spécifique avec le milieu liquide est décrite dans le domaine
d'application. Il est recommandé cependant de prendre des précautions pour certaines matrices telles que les épices, le
cacao, le bouillon, etc., étant donné qu'elles contiennent des substances inhibant la croissance, nécessitant l'ajout de
composés neutralisants, l'application de taux de dilution plus importants, une centrifugation, une filtration ou une
séparation immunomagnétique pour séparer les micro-organismes cibles de la matrice, même si ce n’est pas toujours
spécifié dans les normes correspondantes. L'incompatibilité peut également être due à la composition biologique de la
matrice: les échantillons environnementaux fortement contaminés, les produits fermentés ou les produits contenant des
bactéries probiotiques représentent manifestement un défi plus important pour la microbiologie analytique que pour les
échantillons qui ne contiennent qu'un petit nombre de micro-organismes. Pour ces matrices qui posent problème, il est
recommandé d'effectuer des expériences de contamination artificielle avec des micro-organismes représentatifs, pour
vérifier que la méthode est bien compatible avec la matrice.
10.5.2.2 Mode opératoire
Sauf indication contraire dans les normes correspondantes, des volumes de prise d'essai inférieurs ou égaux
à 1 ml sont normalement ajoutés à cinq à dix fois le volume du milieu à concentration simple. Les prises
d'essai comprises entre 1 ml et 100 ml sont normalement ajoutées à un volume égal de milieu double
concentration.
Pour les volumes supérieurs à 100 ml, un milieu plus concentré peut être utilisé. Pour des besoins spécifiques, les milieux
déshydratés stériles peuvent être dissous dans l'échantillon froid (ou préchauffé à 30 °C) pour l'analyse.
Sauf spécification contraire, il est recommandé que le laps de temps entre la préparation de la première dilution d'un
échantillon et l'ensemencement du dernier tube, de la plaque multipuits ou du flacon, soit inférieur à 15 min.
Une nouvelle pipette stérile doit être utilisée pour chaque dilution.
10.5.3 Choix du système d'ensemencement
Le principe de la méthode NPP est la dilution d'un échantillon à un niveau tel que les inoculats contiennent, la plupart du
temps mais pas toujours, des micro-organismes viables. Le «résultat», c'est-à-dire le nombre d'inoculats produisant une
croissance à chaque dilution, permettra une estimation de la concentration initiale des bactéries dans l'échantillon. Afin
d'obtenir des estimations sur une large gamme de concentrations possibles, les microbiologistes utilisent des dilutions en
série en incubant plusieurs tubes (ou boîte, etc.) à chaque dilution. Le nombre le plus probable (NPP) de micro-
organismes présents dans l'échantillon initial, ainsi que la fidélité de l'estimation, peuvent être calculés par des procédures
statistiques, sur la base des nombres de tubes positifs et négatifs observés après incubation.
Choisir parmi les différentes configurations de NPP disponibles, selon
⎯ le nombre escompté de micro-organismes dans l'échantillon examiné,
⎯ les exigences réglementaires,
⎯ la fidélité requise, et
⎯ toute autre considération pratique.
L’incertitude de mesure dépend du nombre de prises d'essai positives observées dans des conditions
similaires, tout comme l’incertitude de mesure d'un dénombrement de colonies dépend du nombre de
colonies sur la boîte. L’incertitude de mesure augmente comme une fonction de la racine carrée du nombre
de tubes utilisés. Le nombre de tubes doit être multiplié par quatre pour diviser par deux l'incertitude de
mesure. L’incertitude de mesure des systèmes, comprenant un petit nombre de tubes par dilution, est faible.

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En fonction de leur taille, les prises d'essai peuvent être ensemencées dans des tubes ou des flacons
contenant la quantité requise de milieu liquide. Pour les prises d'essai de petite taille, des microplaques
10.5.3.1 Système de dilution simple
Lorsque la concentration prévue en micro-organismes est faible ou peu variable, le système

d'ensemencement le plus approprié est une seule série de prises d'essai égales. Lorsque le rapport attendu
entre le nombre maximal et minimal de micro-organismes est inférieur à environ 25, il est prévu dix prises
d'essai parallèles au moins; avec 50 tubes en parallèle, le rapport est limité à 200. Des exemples de dilution
unique des NPP sont fournis dans l'Annexe B, Tableaux B.1 à B.4.
10.5.3.2 Système de dilution multiple
Lorsque la concentration des micro-organismes dans l'échantillon est inconnue ou présumée très variable, il
peut être nécessaire d'ensemencer des séries de tubes à partir de différentes dilutions. Ensemencer un
nombre suffisant de dilutions afin de garantir un système obtenant des résultats positifs et négatifs. Le
nombre de dilutions dépend également de la méthode de calcul utilisée pour estimer la valeur NPP. S'il est
nécessaire d'utiliser les tables, alors les résultats de trois dilutions doivent être disponibles et les
configurations des systèmes sont limitées à celles disponibles dans les tables. Si des programmes
informatiques sont utilisés, le nombre de dilutions et de tubes parallèles n'est pas limité.
10.5.3.3 Système de dilution symétrique
Le système NPP symétrique le plus fréquemment appliqué utilise trois ou cinq tubes parallèles par dilution. La
fidélité de ce système diminue rapidement avec un petit nombre de tubes par dilution. Les résultats à partir
d'un système à trois tubes donnent à peine plus qu'un ordre de grandeur de la concentration. Pour une plus
grande fidélité, il est recommandé de choisir cinq tubes parallèles ou plus. Des exemples de NPP à trois
tubes et à cinq tubes sont fournis dans l'Annexe B, Tableaux B.5 et B.7, respectivement.
10.5.3.4 Système de dilution asymétrique
Dans les systèmes de dilution asymétrique, les différents niveaux de dilution n'ont pas le même nombre de
tubes. N'utiliser ces systèmes que pour estimer le nombre de micro-organismes présents à l'intérieur d'une
gamme bien définie. Des exemples sont fournis dans l'ISO 8199.
10.5.4 Incubation
Incuber les tubes, flacons ou bouteilles ensemencés dans une étuve ou un bain d'eau. Les microplaques sont
placées dans une étuve.
Choisir la durée et la température d'incubation après s'être référé à une méthode normalisée spécifique,
puisque ces paramètres sont fonction du micro-organisme ou du groupe de micro-organismes recherché.
Certains micro-organismes peuvent nécessiter une procédure d'incubation en deux étapes et/ou une étape de
confirmation. Pour des informations détaillées, consulter les normes spécifiques.

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10.5.5 Interprétation des résultats
Les critères permettant de distinguer les résultats positifs des résultats négatifs varient en fonction de chaque
micro-organisme ou groupe de micro-organismes et sont définis dans les normes correspondantes. En
utilisant ces critères, compter et enregistrer le nombre de résultats positifs obtenus avec toutes les prises
d'essai provenant de l’échantillon.
10.5.6 Détermination des valeurs NPP
Il existe trois méthodes différentes de détermination de la valeur NPP: le calcul avec des formules
mathématiques, la consultation des tables NPP ou l'utilisation de logiciels spécifiques. Étant donné que ces
méthodes sont basées sur des considérations statistiques identiques, elles ont une validité équivalente. Ces
trois méthodes sont détaillées ci-dessous.
10.5.6.1 Formules mathématiques
10.5.6.1.1 Formule approximative pour tous les cas
Les valeurs NPP approximatives pour tout nombre de dilutions et de tubes parallèles sont dérivées de
l'application de l'équation suivante (adaptée de la Référence [36]):
Z p × mr
NPP =
ms × m t
où
Zp est le nombre de tubes positifs;
mr est la masse de référence de l'échantillon, en grammes;
ms est la masse totale, en grammes, de l'échantillon dans tous les tubes présentant une réaction
négative;
mt est la masse totale, en grammes, de l'échantillon dans tous les tubes.
NPP est exprimé pour la masse de référence de l'échantillon, en grammes (généralement 1 g, parfois 100 g).
10.5.6.1.2 Solution «exacte» pour une série de tubes
La valeur NPP d'une seule série de tubes est dérivée de l'équation suivante:
mr ⎡ n ⎤
NPP = ln ⎢ ⎥
mm ⎣⎢ n − z p ⎥⎦
où
mm est la masse, en grammes, de l'échantillon dans chaque tube de la série;

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n est le nombre de tubes de la série;
zp est le nombre de tubes présentant une réaction positive.
10.5.6.1.3 Estimation de la fidélité des essais avec dilutions simples
Les limites de confiance à 95 % de l'estimation NPP peuvent être calculées approximativement en utilisant
l'équation:
⎡ ⎤
⎢ ⎥
m n
x = r ln ⎢ ⎥
mm ⎢ ⎥
⎢ z ± 2 z ( n − zn ) ⎥
⎢⎣ n n ⎥⎦
où
x est la limite de confiance à 95 % supérieure ou inférieure;
mm est la masse, en grammes, de l'échantillon dans chaque tube de la série;
n est le nombre de tubes de la série;
zn est le nombre de tubes présentant une réaction négative.
Le signe plus s'applique à la limite inférieure et le signe moins à la limite supérieure. L'approximation n'est pas
très bonne lorsque la majorité des tubes sont négatifs (stériles), mais elle s'améliore lorsque le nombre de
tubes positifs augmente.
10.5.6.1.4 Estimation de la fidélité des essais avec dilutions multiples symétriques
L'incertitude log10 d'un système NPP symétrique avec dilutions multiples peut être obtenue par la formule
d'approximation de Cochran [28]:
log10 f
SE = 0,58
n
où
SE est l'erreur type de log10NPP;
f est le facteur de dilution entre dilutions consécutives (la plupart du temps 10);
n est le nombre de tubes par dilution.
Les limites supérieures et inférieures de l'intervalle de confiance à 95 % peuvent être estimées

respectivement en multipliant et en divisant l'estimation NPP par l'antilogarithme de 2 × SE. Cette opération
tend à surestimer la limite de confiance supérieure.
10.5.6.2 Tables NPP
10.5.6.2.1 Tables pour les systèmes de dilution simple
Les Tableaux B.1 à B.4 (Annexe B) présentent les valeurs NPP et les intervalles de confiance à 95 % par
prise d'essai pour 10, 15, 20 et 25 tubes parallèles [chaque tube est ensemencé avec la même dilution
(simple)].

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Pour exprimer le résultat par masse de référence de l'échantillon (ou par volume pour les échantillons
liquides), multiplier le NPP et les valeurs de limite à 95 % par le rapport: (masse de référence)/(masse de la
prise d'essai). Ne pas multiplier l'incertitude type logarithmique. En microbiologie des aliments, la masse de
référence est généralement de 1 g. La masse de la prise d'essai correspond à la quantité d'échantillon (en
grammes) présente dans le volume utilisé pour ensemencer les tubes, par exemple 0,1 g si 1 ml de broyat
10−1 a été utilisé.
EXEMPLE (Référence [30])
Vingt tubes d'un bouillon double concentration ont été ensemencés avec 5 ml d'aliquotes d'un échantillon dilué au dixième (0,1 g/ml).
Après l'incubation, une croissance est visible dans 16 de ces tubes. Quelle était la concentration bactérienne la plus probable (micro-
organismes par gramme) de l'échantillon? Le Tableau B.3 indique 1,61 comme nombre le plus probable de micro-organismes par tube,
avec une limite inférieure à 95 % de 0,93 et une limite supérieure à 95 % de 2,77.
Chaque tube reçoit une prise d'essai de 5 ml, qui correspond à 0,5 g de l'échantillon. Ainsi, le nombre le plus probable de micro-
organismes dans 1 g d'échantillon est donné par:
1, 61
NPP = par gramme = 3,2 par gramme
0, 5
avec l'intervalle de confiance à 95 % compris entre
0, 93
Limite à 95 % inférieure = par gramme = 1,9 par gramme;
0, 5
2, 77
Limite à 95 % supérieure = par gramme = 5,5 par gramme.
0, 5
10.5.6.2.2 Tableaux pour les systèmes de dilution multiple − trois dilutions successives
Avec des systèmes symétriques, il est d'usage courant d'utiliser trois dilutions successives avec trois
(Tableau B.5) ou cinq (Tableau B.7) tubes à la même dilution. Enregistrer le nombre de résultats positifs pour
chaque série de tubes et, à partir de la table NPP correspondante utilisée pour le système d'ensemencement,
relever le nombre le plus probable de micro-organismes présents dans le volume de référence de l'échantillon.
Certaines combinaisons de tubes positifs sont davantage susceptibles de se produire que d'autres. Par
exemple, une combinaison de résultats positifs 0, 0, 3 est moins probable de se produire qu'une combinaison
de 3, 2, 1. Pour quantifier cette probabilité, toutes les combinaisons de résultats positifs ont été attribuées à
une catégorie, comprise entre 0 et 3. Un résultat de catégorie 1 est un résultat ayant une plus forte probabilité,
alors qu'un résultat de catégorie 3 est rare et ne peut être reproduit facilement. Les cas les plus défavorables
sont les résultats de la catégorie 0; les considérer avec la plus grande prudence. Si l'on suppose que les
résultats de l'analyse sont corrects, il est escompté que 95 % des combinaisons observées tombent dans la
catégorie 1, 4 % dans la catégorie 2, 0,9 % dans la catégorie 3 et seulement 0,1 % dans la catégorie 0. Les
catégories sont plus détaillées dans le Tableau B.6.
Dans le cas où plus de trois dilutions sont faites, la sélection de la «bonne» combinaison des trois dilutions
consécutives n'est pas toujours très évidente. Cependant, cela peut facilement être réalisé par
l'enregistrement de toutes les combinaisons possibles de tubes positifs et par la lecture de la catégorie
correspondante à partir du Tableau B.5.
Les règles suivantes s'appliquent:
1) Sélectionner la combinaison de trois dilutions consécutives ayant un profil de catégorie 1 pour

obtenir l'indice NPP. Si plusieurs combinaisons ayant un profil de catégorie 1 sont obtenues, utiliser
celle ayant le nombre le plus élevé de tubes positifs.
2) Si aucune combinaison de profil de catégorie 1 n'est disponible, en utiliser une ayant un profil de
catégorie 2. Si plusieurs combinaisons ayant un profil de catégorie 2 sont obtenues, utiliser celle
ayant le nombre le plus élevé de tubes positifs.

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3) Si aucune combinaison de profil de catégorie 2 n'est disponible, en utiliser une ayant un profil de
catégorie 3. Si plusieurs combinaisons ayant un profil de catégorie 3 sont obtenues, utiliser celle
ayant le nombre le plus élevé de tubes positifs.
Quelques exemples figurent dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Exemples de sélection de résultats positifs pour le calcul du NPP
NPP b
Nombre de tubes positifs obtenus à partir des trois tubes incubés
Échantillon Produits Autres
pour les quantités suivantes d'échantillon inoculées par tube a
liquides produits
(ml–1) (g–1)
Produits
10 ml 1 ml 10–1 ml 10–2 ml 10–3 ml
liquides:
Autres
1g 10–1 g 10–2 g 10–3 g 10–4 g
produits:
1 3 3 2 1 0 1,1 × 101 1,1 × 102

2 3 3 3 0 2,4 × 101 2,4 × 102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4 × 101
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4 × 101
5 2 2 0 1 0 2,1 × 10–1 2,1
a Souligné: combinaison sélectionnée.
b Calculé à partir de l'indice NPP (voir Tableau B.5).
10.5.6.3 Programmes informatiques
Les programmes informatiques les plus polyvalents n'imposent aucune restriction quant au nombre de
dilutions et de tubes à la même dilution ou quant à la symétrie du système NPP. L'analyseur d'essai NPP est
un programme libre basé sur un programme antérieur (voir Référence [29]).
À partir de l’indice NPP lu dans le Tableau B.5 [en fonction de la combinaison des trois (ou cinq) dilutions
consécutives retenues], déterminer le nombre le plus probable de micro-organismes dans le volume de
référence.
Exprimer les résultats comme le nombre le plus probable de micro-organismes (ou groupe spécifique de
micro-organismes) par gramme ou millilitre. Le volume ou la masse de référence peut être différent du g ou du ml
(par exemple 100 g ou 100 ml).
11 Méthode de détection (méthode qualitative)
11.1 Généralités
Une méthode de détection est une méthode qui permet de déterminer la présence ou l'absence de micro-
organismes particuliers définis dans une quantité déterminée de produit.

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11.2 Principe
Sauf indication contraire dans la Norme internationale applicable, mélanger (produits liquides) ou
homogénéiser (autres produits) une quantité P de produit à examiner avec 9 × P ml ou 9 × P g d'un bouillon
non sélectif et/ou sélectif.
Pour faciliter la récupération des micro-organismes stressés dans les aliments, les échantillons sont
habituellement préenrichis dans un bouillon non sélectif, suivi d'un enrichissement en bouillon sélectif puis
d'un isolement sur un milieu gélosé sélectif/différentiel. L'utilisation de deux bouillons d'enrichissement, ainsi
que de deux milieux gélosés sélectifs, ou plus, accroît la sensibilité de la méthode.
Après incubation, une anse de la culture obtenue est étalée sur la surface d'un milieu gélosé sélectif de façon
à obtenir des colonies isolées. Sauf indication contraire, la réfrigération des bouillons d'enrichissement
incubés peut être effectuée uniquement après évaluation de son incidence sur les résultats et uniquement si
cela est clairement stipulé dans le rapport d'essai.
Un nombre de colonies (en général, cinq par boîte gélosée) obtenues après incubation est ensuite identifié à
l'aide des techniques de confirmation appropriées.
Il est recommandé que la sélection des colonies pour confirmation couvre les types de colonie suspecte représentatifs.
11.3 Mesure de l'incertitude
Une réflexion sur l'estimation de l'incertitude de mesure pour les déterminations qualitatives est en cours au sein de
l'ISO/TC 34/SC 9.
12 Méthodes de confirmation
12.1 Généralités
Utiliser uniquement des cultures pures pour la confirmation biochimique et sérologique.
Les tests de confirmation de référence sont décrits dans les normes spécifiques. Alternativement aux essais biochimiques
décrits dans les normes spécifiques, les méthodes de confirmation décrites dans le présent article (galeries biochimiques,
sondes nucléiques) peuvent être utilisées dans les conditions spécifiées dans le présent article, sauf indication contraire
dans les normes spécifiques.
12.2 Préparation d'une culture pure
La préparation d'une culture pure commence par la sélection d'une colonie unique sur, ou dans, un milieu
gélosé. Isoler ensuite la colonie sélectionnée sur un milieu gélosé non sélectif. Après incubation, choisir une
colonie bien isolée pour les essais de confirmation consécutifs. Répéter l'opération si nécessaire.
Dans la mesure du possible, il est recommandé de réaliser les essais de confirmation en utilisant les cellules d'une seule
colonie. Si la concentration cellulaire présente dans une colonie est insuffisante, il est recommandé de procéder à une
subculture dans un milieu liquide ou sur la pente d'un milieu gélosé, après quoi, la subculture peut être utilisée pour les
essais à réaliser.
12.3 Coloration de Gram (technique de Hucker modifiée)
Cette coloration des cellules bactériennes permet à la fois de décrire la morphologie des bactéries et leur
classification en deux groupes en fonction de leur capacité ou non à retenir la coloration du cristal violet
(Gram positif) dans les conditions d'essai. Cette classification découle principalement de différences dans la

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structure des parois cellulaires des deux groupes et elle est corrélée avec d'autres différences importantes
entre les deux groupes.
L'utilisation d'une solution de KOH à 3 % constitue une alternative satisfaisante à la coloration de Gram. Une anse de
colonie bactérienne est émulsionnée dans 2 gouttes de solution de KOH. Les bactéries à Gram négatif produisent une
suspension très visqueuse et muqueuse en 30 s et un fil se forme lorsque l'anse est soulevée.
Il existe de nombreuses façons de procéder à une coloration de Gram, mais toutes suivent la séquence
ci-après.
12.3.2 Solutions
Les solutions disponibles dans le commerce peuvent être utilisées.
Dans ce cas, suivre les recommandations du fabricant.
12.3.2.2 Solution de cristal violet
12.3.2.2.1 Composition
Cristal violet 2,0 g

Éthanol (à 95 %) 20 ml
Oxalate d'ammonium (C2H8N2O4) 0,8 g
Eau 80 ml
12.3.2.2.2 Préparation
Dissoudre le cristal violet dans de l'éthanol et l'oxalate d'ammonium dans l'eau distillée. Mélanger les deux
solutions et laisser reposer le mélange 24 h avant utilisation.
12.3.2.3 Solution d'iode
Iode 1,0 g
Iodure de potassium (Kl) 2,0 g
Eau 100 ml
Dissoudre l'iodure de potassium dans 10 ml d'eau et ajouter l'iode par fractions. Après dissolution, compléter
à 100 ml dans une fiole jaugée.
12.3.2.4 Solution de safranine
Safranine 0,25 g
Éthanol (à 95 %) 10 ml
Eau 100 ml

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Dissoudre la safranine dans de l'éthanol, puis mélanger avec de l'eau distillée.
12.3.3 Technique de coloration
Après avoir fixé à la flamme le frottis bactérien, provenant d'une culture de 18 h à 24 h ou d'un bouillon trouble,
sur la lame de microscope, recouvrir le frottis avec le cristal violet. Laisser agir 1 min.
Rincer doucement la lame inclinée avec de l'eau pendant quelques secondes.
Recouvrir la lame avec la solution d'iode. Laisser agir 1 min.
Rincer doucement la lame inclinée avec de l'eau pendant quelques secondes.
Faire couler doucement et en continu un film d'éthanol (à 95 %) sur la lame inclinée pendant une durée
maximale de 30 s jusqu'à disparition de la couleur violette.
Rincer doucement la lame inclinée avec de l'eau pour éliminer l'éthanol. Recouvrir la lame avec la solution de
safranine pendant 10 s. Rincer doucement la lame inclinée avec de l'eau.
Sécher la lame.
12.3.4 Interprétation
Examiner la lame sous l'objectif à immersion de grande puissance du microscope. Les cellules bactériennes
qui apparaissent en bleu ou en violet sont dites à Gram positif (Gram +); celles qui sont de couleur rose foncé
à rouge sont dites à Gram négatif (Gram −).
Il est possible d'obtenir, pour une culture pure de certains germes bactériens, à la fois des cellules à Gram positif et à
Gram négatif dans un même champ microscopique.
NOTE Des cellules en amas peuvent donner une réponse non caractéristique.
12.4 Utilisation de galeries biochimiques pour l'identification
Les galeries biochimiques disponibles peuvent être utilisées pour l'identification de colonies isolées.
Cependant, il est recommandé que le laboratoire vérifie que les galeries conviennent, comme le montrent
des études d'évaluation publiées dans la littérature internationale, de préférence relative à la microbiologie
des aliments 4). Cette vérification est importante, particulièrement si les fabricants ne possèdent pas de
dossier de validation de ces galeries.
Il est recommandé que le laboratoire obtienne un certificat de contrôle pour chaque lot avec mention des souches de
contrôle.
Le fabricant doit également spécifier les souches témoins que le laboratoire peut utiliser pour vérifier le
maintien des performances des galeries.
Les galeries doivent comprendre au minimum les essais biochimiques décrits dans les normes spécifiques ou
être complétées par d'autres essais.
12.5 Utilisation de sondes nucléiques pour l'identification
Les sondes nucléiques actuellement disponibles peuvent être utilisées pour l'identification de colonies isolées.
4) Pour toutes les demandes d'informations, il convient de s'adresser au Centre de référence national, régional ou international,
indiqué pour chaque micro-organisme.

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Cependant, il faut vérifier que les sondes nucléiques utilisées pour la confirmation sont appropriées, comme le
montrent des études d'évaluation publiées dans la littérature internationale, de préférence relative à la
microbiologie des aliments (voir, par exemple, la Référence [23]). Cette vérification est importante,
particulièrement si les fabricants ne possèdent pas de dossier de validation de ces sondes..
contrôle.
Le fabricant doit également spécifier les souches témoins que le laboratoire peut utiliser pour vérifier le
maintien des performances des sondes.
12.6 Méthodes sérologiques
Lorsqu'une confirmation sérologique est nécessaire, l'effectuer après l'identification biochimique des colonies
isolées.
12.6.2 Essais d'agglutination sur lame
À la suite d'une réaction antigène-anticorps, les cellules bactériennes s'agglutinent et forment des masses
floconneuses ou granuleuses denses. Dans le cas des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae, la
réaction entre l'antigène «H» (c'est-à-dire flagellaire) et son antisérum homologue est suivie d'une
agglutination floconneuse, tandis que la réaction due à l'antigène «O» (antigène somatique) génère une
agglutination plus dense et granulaire.
Avant le test d'agglutination avec des antisérums, il est recommandé de réaliser un test d'agglutination dans une solution
de chlorure de sodium [3 % (par masse)]. Si les cellules bactériennes s'agglutinent, la souche est dite autoagglutinable et
ne devrait pas être agglutinée avec des antisérums.
Les antisérums disponibles dans le commerce sont de deux types: les antisérums polyvalents qui réagissent
à des micro-organismes d'un genre particulier ou à des groupes de sérotypes et qui conviennent pour une
sélection préliminaire, et les anticorps monoclonaux spécifiques utilisés pour l'identification d'un sérotype
particulier.
Il est recommandé que le laboratoire obtienne un certificat de contrôle pour chaque lot d'antisérums avec mention des
souches de contrôle.
Il faut vérifier que les essais d'agglutination sur lame soient appropriés, comme le montrent des études
d'évaluation publiées dans la littérature internationale, de préférence relative à la microbiologie des aliments 4).
Durant les tests, il est recommandé d'utiliser des témoins positifs et négatifs appropriés.
12.6.3 Test d'agglutination au latex
Une méthode plus rapide, disponible dans le commerce, utilise des particules de latex recouvertes d'anticorps
de groupe spécifique (par exemple Escherichia coli O157, voir la norme spécifique ISO 16654 ou
Staphylococcus aureus dans l'ISO 6888). L'antigène de l'extrait de culture est soumis à essai avec une
gamme de réactifs latex.
Cependant, il faut vérifier que les essais d'agglutination au latex soient appropriés, comme le montrent des
études d'évaluation publiées dans la littérature internationale, de préférence relative à la microbiologie des
aliments 4).
contrôle.
Durant les tests, il est recommandé d'utiliser les témoins positifs et négatifs appropriés pendant l'utilisation de réactifs

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13 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit spécifier la méthode utilisée, la température d'incubation, si nécessaire, et les résultats
obtenus. Il doit également mentionner tous les détails opératoires non spécifiés dans la présente Norme
internationale ou considérés comme facultatifs, ainsi que les détails relatifs à tout incident éventuel
susceptible d'avoir influencé les résultats.
Spécifier également dans le rapport d'essai si des essais supplémentaires doivent être réalisés par un
laboratoire de référence, ou si de tels essais sont disponibles, en indiquer les résultats.
Il est recommandé d'inclure dans le rapport d'essai toutes les informations nécessaires à l'identification complète de
l'échantillon. Il est également approprié d'inclure toutes les informations nécessaires à l'interprétation des résultats d'essai.
Si nécessaire, il est recommandé que l'incertitude de mesure, déterminée conformément à l'ISO/TS 19036, soit incluse
dans le rapport d'essai.
14 Validation des méthodes microbiologiques
14.1 Validation des méthodes de référence
Une réflexion sur la validation des méthodes de référence est en cours au sein de l'ISO/TC 34/SC 9.
14.2 Validation des méthodes alternatives.
Se référer à l'ISO 16140 pour le protocole technique pour la validation des méthodes alternatives par rapport
aux méthodes de référence.
14.3 Validation des méthodes d'analyse internes
Une réflexion sur la validation des méthodes d'analyse internes est en cours au sein de l'ISO/TC 34/SC 9.
15 Assurance qualité des résultats/contrôle de la qualité des performances
15.1 Contrôle interne de la qualité
15.1.1 Le contrôle de la qualité comprend l'ensemble des procédures mises en place par un laboratoire pour
l'évaluation permanente de son travail. L'objectif principal est de garantir la cohérence des résultats jour après
jour et leur conformité avec des critères définis.
15.1.2 Un programme de contrôles périodiques est nécessaire pour démontrer la maîtrise de la variabilité
(entre les analystes, entre les équipements ou entre les matériels). Tous les essais compris dans le domaine
d'activité du laboratoire doivent être couverts.
Ce programme peut regrouper:
⎯ l'utilisation d'échantillons artificiellement contaminés, avec des niveaux de contamination variables, incluant la flore
cible et la flore secondaire;
⎯ l'utilisation d'échantillons naturellement contaminés à partir d'une gamme de matrices;
⎯ l'utilisation de matériaux de référence (y compris matériaux pour programmes d'essais d'aptitude;
⎯ des répétitions d'essai;
⎯ l'évaluation répétée des résultats d'essai.

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L'intervalle entre ces contrôles dépend de la nature des essais effectués par le laboratoire et de la fréquence
à laquelle les essais sont effectués.
Dans la mesure du possible, il est recommandé que les essais intègrent des procédures de surveillance des performances.
15.1.3 Dans des cas spécifiques, un laboratoire peut n'effectuer que rarement un essai déterminé. Il est admis que dans
de tels cas, un programme interne de contrôle continu de la qualité peut être inapproprié et qu'un plan permettant de
démontrer que les performances sont satisfaisantes, exécuté parallèlement aux essais, peut mieux convenir.
15.2 Souches de référence
Se référer à l'ISO 11133 pour la maintenance des souches de référence.
15.3 Évaluation externe de la qualité (essai d'aptitude)
Il est recommandé que les laboratoires participent régulièrement à des programmes d'essais d'aptitude pertinents pour
leur domaine d'activité. Il est recommandé de privilégier les programmes d'essais d'aptitude qui utilisent des matrices
appropriées.
Il est recommandé que le laboratoire utilise l'évaluation externe de la qualité non seulement pour évaluer le biais du
laboratoire, mais aussi pour contrôler la validité de l'ensemble du système qualité.

Annexe A
(informative)
Propriétés de certains désinfectants
Tableau A.1 — Propriétés de certains désinfectants
© ISO 2007 – Tous droits réservés

Actifs contre Inactivés par Toxicité
Bactéries Virus Matériaux
Désinfectants Champi- Myco- Virus non Matériaux Eau Déter- Pou-
à Gram à Gram Spores lipi- Protéine synthé- Peau Yeux
gnons bactéries lipidiques naturels dure gent mons
positif négatif diques tiques
Hypochlorites + +++ +++ ++ ++ + + +++ + + + C + + +

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Alcools − +++ +++ +++ − + V + + + + − +
Formaldéhyde +++ +++ +++ +++ +++ a + + + + + + − + + +
Glutaraldéhyde +++ +++ +++ +++ +++ b + + NA + + + NA +++ +++ +++

Iodophores +++ +++ +++ +++ + + + +++ + + + A + + −
+++ bon;
++ passable;
+ léger;
− néant;
V dépend du virus;
C cationique;
A anionique;
NA non applicable.
a Au-dessus de 40 °C.
b Au-dessus de 20 °C.
Source: Référence [17].

ISO 7218:2007(F)
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2017FA00916 Le 06/12/2017
Annexe B
(normative)
Détermination du nombre le plus probable (NPP)
Tableau B.1 — Valeurs NPP par prise d'essai et limites de confiance à 95 % calculées pour une série
Série de 10 tubes
Nombre de
tubes Incertitude Limites à 95 %
positifs NPP type de log10
NPP inférieure inférieure
1 0,11 0,435 0,02 0,75

2 0,22 0,308 0,06 0,89
3 0,36 0,252 0,11 1,11
4 0,51 0,220 0,19 1,38
5 0,69 0,198 0,28 1,69
6 0,92 0,184 0,40 2,10
7 1,20 0,174 0,55 2,64
8 1,61 0,171 0,75 3,48
9 2,30 0,179 1,03 5,16
de 15 tubes selon selon la Référence [29]
Série de 15 tubes
Nombre de
NPP inférieure supérieure
1 0,07 0,434 0,01 0,49

2 0,14 0,307 0,04 0,57
3 0,22 0,251 0,07 0,69
4 0,31 0,218 0,12 0,83
5 0,41 0,196 0,17 0,98
6 0,51 0,179 0,23 1,15
7 0,63 0,167 0,30 1,33
8 0,76 0,157 0,37 1,55
9 0,92 0,150 0,47 1,80
10 1,10 0,144 0,57 2,11
11 1,32 0,141 0,70 2,49
12 1,61 0,139 0,86 3,02
13 2,01 0,142 1,06 3,82
14 2,71 0,155 1,35 5,45

2017FA00916 Le 06/12/2017
Série de 20 tubes
Nombre de
1 0,05 0,434 0,01 0,36

2 0,11 0,307 0,03 0,42
3 0,16 0,251 0,05 0,50
4 0,22 0,218 0,08 0,60
5 0,29 0,195 0,12 0,69
6 0,36 0,178 0,16 0,80
7 0,43 0,165 0,20 0,91
8 0,51 0,155 0,25 1,03
9 0,59 0,147 0,31 1,16
10 0,69 0,140 0,37 1,30
11 0,80 0,134 0,44 1,46
12 0,92 0,130 0,51 1,65
13 1,05 0,126 0,59 1,85
14 1,20 0,123 0,69 2,10
15 1,39 0,121 0,80 2,40
16 1,61 0,121 0,93 2,77
17 1,90 0,122 1,09 3,29
18 2,30 0,127 1,30 4,08
19 3,00 0,141 1,58 5,67

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de 25 tubes selon selon la Référence [29]
Série de 25 tubes
Nombre de
1 0,04 0,434 0,01 0,29

2 0,08 0,307 0,02 0,33
3 0,13 0,251 0,04 0,40
4 0,17 0,217 0,07 0,47
5 0,22 0,195 0,09 0,54
6 0,27 0,178 0,12 0,61
7 0,33 0,165 0,16 0,69
8 0,39 0,154 0,19 0,77
9 0,45 0,146 0,23 0,86
10 0,51 0,139 0,27 0,96
11 0,58 0,133 0,32 1,06
12 0,65 0,128 0,37 1,16
13 0,73 0,123 0,42 1,28
14 0,82 0,119 0,48 1,41
15 0,92 0,116 0,54 1,55
16 1,02 0,113 0,61 1,70
17 1,14 0,111 0,69 1,88
18 1,27 0,109 0,78 2,09
19 1,43 0,108 0,88 2,33
20 1,61 0,108 0,99 2,62
21 1,83 0,109 1,12 2,99
22 2,12 0,111 1,29 3,50
23 2,53 0,117 1,49 4,28
24 3,22 0,123 1,77 5,85

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau B.5 — Indices NPP et limites de confiance à 95 % lorsque trois prises d’essai de 1 g (ml), trois de
0,1 g (ml) et trois de 0,01 g (ml) sont utilisées
Nombre de Indice Limites de confiance (95 %) a, c

Catégorie b
résultats positifs NPP a Limite inférieure Limite supérieure
0 0 0 < 0,30 0,00 0,94
0 0 1 0,30 3 0,01 0,95
0 1 0 0,30 2 0,01 1
0 1 1 0,61 0 0,12 1,7
0 2 0 0,62 3 0,12 1,7
0 3 0 0,94 0 0,35 3,5
1 0 0 0,36 1 0,02 1,7
1 0 1 0,72 2 0,12 1,7
1 0 2 1,1 0 0,4 3,5
1 1 0 0,74 1 0,13 2
1 1 1 1,1 3 0,4 3,5
1 2 0 1,1 2 0,4 3,5
1 2 1 1,5 3 0,5 3,8
1 3 0 1,6 3 0,5 3,8
2 0 0 0,92 1 0,15 3,5
2 0 1 1,4 2 0,4 3,5
2 0 2 2,0 0 0,5 3,8
2 1 0 1,5 1 0,4 3,8
2 1 1 2,0 2 0,5 3,8
2 1 2 2,7 0 0,9 9,4
2 2 0 2,1 1 0,5 4
2 2 1 2,8 3 0,9 9,4
2 2 2 3,5 0 0,9 9,4
2 3 0 2,9 3 0,9 9,4
2 3 1 3,6 0 0,9 9,4
3 0 0 2,3 1 0,5 9,4
3 0 1 3,8 1 0,9 10,4
3 0 2 6,4 3 1,6 18,1
3 1 0 4,3 1 0,9 18,1
3 1 1 7,5 1 1,7 19,9
3 1 2 12 3 3 36
3 1 3 16 0 3 38
3 2 0 9,3 1 1,8 36
3 2 1 15 1 3 38
3 2 2 21 2 3 40
3 2 3 29 3 9 99
3 3 0 24 1 4 99
3 3 1 46 1 9 198
3 3 2 110 1 20 400
3 3 3 > 110
a Source: Référence [27].
b Voir le Tableau B.6.
c Les limites de confiance données dans ce tableau ne sont destinées qu'à fournir quelques notions de l'influence des variations
statistiques sur les résultats. Il y aura toujours d'autres sources de variations qui peuvent même, quelquefois, être plus importantes.

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau B.6 — Explication des catégories pour les résultats
Categorie a Définition
Lorsque le nombre de bactéries dans l'échantillon est égal au NPP trouvé, le résultat est un de ceux
1 qui ont le plus de chance d'être obtenu. Il existe tout au plus 5 % de chances d'obtenir un résultat
moins probable que le moins probable dans cette catégorie.
qui ont moins de chances d'être obtenus que même le moins probable dans la catégorie 1, mais il
2
existe tout au plus 1 % de chances d'obtenir un résultat qui est moins probable que le moins probable
dans cette catégorie.
3
existe tout au plus 0,1 % de chances d'obtenir un résultat qui est moins probable que le moins
probable dans cette catégorie.
0
existe tout au plus 0,1 % de chances d'obtenir un résultat dans cette catégorie sans que rien ne soit
faux.
a Avant de commencer les essais, il faut décider quelle catégorie sera acceptable, c'est-à-dire seulement la catégorie 1, 1 et 2 ou
même 1, 2 et 3. Si la décision à prendre sur la base des résultats est très importante, il est recommandé de n'accepter que les résultats
de la catégorie 1 ou, tout au plus, ceux des catégories 1 et 2. Il est recommandé de considérer les résultats de la catégorie 0 avec la
plus grande prudence.

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Tableau B.7 — Valeurs NPP par gramme d'échantillon et limites de confiance à 95 % (lorsque cinq
prises d'essai de 1 g, cinq de 0,1 g et cinq de 0,01 g sont utilisées)
Nombre de tubes donnant une réaction positive NPP Limites de confiance à 95 %

5 de 1 g 5 de 0,1 g 5 de 0,01 g (par g) inférieure supérieure
0 0 0 < 0,2 < 0,1 0,7

0 1 0 0,2 < 0,1 0,7
0 2 0 0,4 < 0,1 1,1
1 0 0 0,2 < 0,1 0,7
1 0 1 0,4 < 0,1 1,1
1 1 0 0,4 < 0,1 1,1

1 1 1 0,6 < 0,1 1,5
2 0 0 0,5 < 0,1 1,3
2 0 1 0,7 0,1 1,7
2 1 0 0,7 0,1 1,7
2 1 1 0,9 0,2 2,1

2 2 0 0,9 0,2 2,1
2 3 0 1,2 0,3 2,8
3 0 0 0,8 0,1 1,9
3 0 1 1,1 0,2 2,5
3 1 0 1,1 0,2 2,5

3 1 1 1,4 0,4 3,4
3 2 0 1,4 0,4 3,4
3 2 1 1,7 0,5 4,6
3 3 0 1,7 0,5 4,6
4 0 0 1,3 0,3 3,1

4 0 1 1,7 0,5 4,6
4 1 0 1,7 0,5 4,6
4 1 1 2,1 0,7 6,3
4 1 2 2,6 0,9 7,8
4 2 0 2,2 0,7 6,7

4 2 1 2,6 0,9 7,8
4 3 0 2,7 0,9 8
4 3 1 3,3 1,1 9,3
4 4 0 3,4 1,2 9,3

2017FA00916 Le 06/12/2017
Tableau B.7 (suite)
Nombre de tubes donnant une réaction positive NPP Limites de confiance à 95 %

5 de 1 g 5 de 0,1 g 5 de 0,01 g (par g) inférieure supérieure
5 0 0 2,3 0,7 7
5 0 1 3,1 1,1 8,9
5 0 2 4,3 1,5 11
5 1 0 3,3 1,1 9,3
5 1 1 4,6 1,6 12
5 1 2 6,3 2,1 15
5 2 0 4,9 1,7 13
5 2 1 7 2,3 17
5 2 2 9,4 2,8 22
5 3 0 7,9 2,5 19
5 3 1 11 3,1 25
5 3 2 14 3,7 34
5 3 3 18 4,4 50
5 4 0 13 3,5 30
5 4 1 17 4,3 49
5 4 2 22 5,7 70
5 4 3 28 9 85
5 4 4 35 12 100
5 5 0 24 6,8 75
5 5 1 35 12 100
5 5 2 54 18 140
5 5 3 92 30 320
5 5 4 160 64 580
5 5 5 > 180 — —

2017FA00916 Le 06/12/2017
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dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces)

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[40] ISO/TR 13843, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la validation des méthodes microbiologiques
[41] ISO 14461-1, Lait et produits laitiers — Contrôle de qualité en laboratoires microbiologiques —
Partie 1: Évaluation de la performance des analystes effectuant les comptages de colonies
[42] ISO 14461-2, Lait et produits laitiers — Contrôle de qualité en laboratoire microbiologique — Partie 2:
Détermination de la fiabilité des comptages de colonies en boîtes parallèles et des dilutions décimales
suivantes
[43] ISO 16654, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Escherichia
coli O157
[44] ISO/CEI 17025:2005, Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages
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[45] EN 12469, Biotechnologie — Critères de performance pour les postes de sécurité microbiologiques
[46] ISO 17604, Microbiologie des aliments — Prélèvement d'échantillons sur des carcasses en vue de
leur analyse microbiologique
[47] ISO 18593, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour les techniques de prélèvement
sur des surfaces, au moyen de boîtes de contact et d'écouvillons
[48] ISO Guide 99:1996, Vocabulaire international des termes fondamentaux et généraux de métrologie
(VIM)
[49] ISO/TC 34/SC 9 N852, Supporting document on the change from two to one plate per dilution for
colony-count techniques (revision of ISO 7218), June 2007, Marie Cornu

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Exigences générales et recommandations

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Microbiologie des aliments — Exigences générales et

ISO 835, Verrerie de laboratoire — Pipettes graduées

ISO 8655 (toutes les parties), Appareils volumétriques à piston

Pages 7 à 32, Articles 5 et 6

Supprimer le texte existant et ajouter ce qui suit.

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Pour le matériel possédant un contrôle de la température, vérifier la stabilité et l'homogénéité de la

5.2 Hottes de sécurité

2 © ISO 2013 – Tous droits réservés

Il est recommandé d'utiliser le moins de matériel possible à l'intérieur de la hotte.

5.2.3 Nettoyage et désinfection

Voir Référence [17].

5.2.4 Entretien et contrôle

5.3 Balances et diluteurs gravimétriques

5.3.1 Utilisation et incertitude de mesure

© ISO 2013 – Tous droits réservés 3

5.3.2 Nettoyage et désinfection

5.3.3 Vérification des performances et étalonnage

5.4 Homogénéisateurs, mélangeurs et mixeurs

⎯ un homogénéisateur par vibrations avec des sacs stériles; ou

4 © ISO 2013 – Tous droits réservés

⎯ un autre système d'homogénéisation d'efficacité équivalente.

5.4.3 Nettoyage et désinfection

Nettoyer et désinfecter régulièrement les homogénéisateurs péristaltiques et les homogénéisateurs par

Contrôler et entretenir le matériel conformément aux instructions du fabricant.

© ISO 2013 – Tous droits réservés 5

5.5.3 Étalonnage et vérification

⎯ le vieillissement et l'encrassement des électrodes; et

⎯ le temps de réponse et la stabilité.

Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant.

Un autoclave permet d'obtenir une température en vapeur saturée dans la chambre.

Il est recommandé que l'autoclave soit muni

⎯ d'au moins une soupape de sécurité;

6 © ISO 2013 – Tous droits réservés

⎯ d'un robinet de purge;

⎯ d'un dispositif de régulation permettant le maintien de la température dans la chambre à ± 3 °C de la température

⎯ d'une sonde thermique ou d'un thermocouple enregistreur.

© ISO 2013 – Tous droits réservés 7

5.7 Préparateur de milieux de culture

Toujours suivre les instructions du fabricant.

Il est recommandé de vérifier la température et la durée de chaque cycle.

Il est recommandé de protéger les parois de l'étuve de la lumière solaire.

8 © ISO 2013 – Tous droits réservés

5.8.3 Nettoyage et désinfection

Il est recommandé de répéter ce processus après chaque réparation ou modification significative.

5.9 Réfrigérateur, chambre froide

⎯ des milieux de culture non ensemencés et des réactifs;

⎯ des échantillons pour essai; et

⎯ des cultures de micro-organismes et des milieux incubés.

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5.9.4 Entretien et nettoyage

⎯ le dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes;

⎯ le nettoyage et la désinfection de l'intérieur des enceintes.

5.10 Congélateur et surgélateur

⎯ certains réactifs non ensemencés;