Master

Biotechnologie Végétale pour l’amélioration des plantes

Module M8
Biotechnologie végétale

UE8.2
Haplométhodes et création de lignées fixées:
Androgenèse

Pr. Souad Cherkaoui

Faculté des Sciences de
Rabat

M8 UE 8-3 Biotechnologie et amélioration des plantes Pr Souad Cherkaoui FSR UM5

 4/ Différentes techniques d’haplodiploïdisation
4.1/ Androgenèse
4.1.1/ Définition:

- Technique qui permet la formation d’un individu haploïde à partir

de la prolifération d’une microspore par culture d’anthères ou de
grains de pollen isolés.
- L’obtention d’une plante entière n’est possible qu’à la suite d’un
développement embryonnaire.
- Cette observation indique que le programme génétique assurant le
développement embryonnaire peut se dérouler en dehors de la
reproduction sexuée et en l’absence des tissus maternels.

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 4.1.2/ Culture d’anthères

- Extraction des anthères en conditions stériles

- Mise en culture de ces anthères dans des boites de
Pétri sur des milieux spécifiques, induisant le
développement embryonnaire des microspores
- Réalisation d’examens cytologiques préalables
pour connaitre le moment le plus favorable à ce
développement

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 4.1.3 Culture de microspores isolées
• TK qui vise à libérer les grains de pollen (microspores)
dans le milieu de culture liquide ≠ androgenèse in vitro
(culture des anthères sur des milieux solides ou semi-
liquides)
• 2 méthodes utilisées:
➢ déhiscence des anthères immatures et libération de
leurs microspores dans le milieu de culture.
➢ broyage mécanique des anthères pour extraire les
microspores au stade désiré.

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 Technique d’isolement de microspores chez le blé:
a) Développement des épis de blé sous serre b) stade favorable de l’épi pour l’androgenèse
c) prétraitement des épis au mannitol d) stérilisation des épis débarrassés de leur gaine
e) extraction des microspores par broyage dans un microblender f) filtration sur tamis
g) centrifugation et sélection des microspores sur des solutions de mannitol et maltose
1. solution de mannitol 0,4M 2. microspores viables au stade pré-mitose 3. solution de maltose à 21%
4. microspores non viables (Rustgi et al., 2017)
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 Rôle du mannitol dans la culture des microspores isolées:

• Induit une stabilité de la PO.

• Retarde la division mitotique des noyaux.
• Maintient toutes les microspores au même stade conduisant à la formation
d’un grand nombre d’embryons.

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 4.1.4/ Principe androgénétique
- Le phénomène androgénétique correspond à
l’arrêt du programme de différenciation de la
microspore en grain de pollen et à une
réorientation vers un programme de mitoses
organisées aboutissant à la formation d’un embr.
qui se développera en plt haploïde.
- Doublement du stock chromosomique par la
colchicine (agent mitoclasique), rétablissement
en une seule étape de l’état diploïde
homozygote.
- Obtention de lignées pures dites haploïde-
doublées (HD).

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 Développement d’une microspore en condition in vivo et in vitro
Gn : noyau de cellule génératrice, N : noyau, SC : cellule spermatique,
St : amidon, V : vacuole, Vn : noyau de cellule végétative (Daghma et al., 2014)

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 • Pour toutes les espèces, l’androgenèse se caractérise par 2 étapes:
➢ Phase de développement des microspores (embryogenèse ou
callogenèse).
➢ Phase de régénération permettant la germination des embryons ou
une organogenèse à partir des cals.

• Les plantules obtenues sont généralement haploïdes (nb gamétique de

chrom) mais possibilité de régénération de plantes diploïdes (seigle,
orge) ou triploïdes (Pétunia).

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 Culture d’anthères et de microspores pour la production de plantes haploïdes-doublées
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 Obtention de plantes haploïdes à partir de culture d'anthères chez le blé

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 Plantules de blé albinos et vertes

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 Doublement chromosomique: traitement à la colchicine

La colchicine: substance mitoclasique qui bloque la mitose en début de métaphase

empêchant la séparation des chromosomes fils.

Le traitement peut se réaliser:

- au stade plantule par trempage des racines
- par injection dans les méristèmes
- par traitement in vitro au stade embryonnaire

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 4.1.5/ Avantages et inconvénients de l’androgenèse
Avantages :

- Obtention rapide de lignées complètement homozygotes réduisant

le nombre de générations exigées dans la sélection classique.
(l’homozygotie permet l’expression de tous les gènes,
particulièrement les gènes récessifs masqués, ce qui simplifie
l’analyse génétique et l’observation directe des mutations.
- Les lignées HD: caractérisées par une bonne stabilité maintenue
au cours des générations de multiplication.
Les performances agronomiques de ces lignées HD sont plus
faciles à évaluer à cause de leur stabilité génétique.
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 Inconvénients :

- Faible taux d’induction de structures embryogènes.

- Les HD montrent souvent des degrés variables
d’aneuploïdie et de stérilité.
- Problème d’albinisme (délétion au niveau de l’ADN
chloroplastique):facteur limitant pour l’application de cette
TK dans les programmes de sélection.

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 4.1.6/ Albinisme
4.1.6.1/ Définition
- L’albinisme se caractérise par:
➢ une régénération de plantules avec des tiges et des
feuilles dépourvues de pigments chlorophylliens et
donc identifiables par une couleur blanche
➢ une différenciation incomplète des membranes des
chloroplastes.

- Les plantes albinos obtenues sont stériles: incapables de

produire des chloroplastes fonctionnels et donc d’assurer
le processus de photosynthèse.

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 4.1.6.2/ Facteurs liés à l’albinisme
L’albinisme peut être déterminé par 1 ou plusieurs facteurs dont:
- le génotype,
- l’environnement,
- les anomalies méiotiques,
- les déséquilibres hormonaux,
- la suppression de l’ADN plasmidique des plastes,
- la mutation dans les gènes responsables de la biogenèse de la
chlorophylle et/ou du fonctionnement de l’appareil photosynthétique.

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 4.1.6.3/ Hypothèses
Plusieurs hypothèses:
- Le génome chloroplastique des pls albinos présente des
délétions importantes (40 à 80%) par comparaison à celui
des pls chlorophylliennes (Day et Ellis, 1984).
- L’albinisme peut être causé par l’expression des gènes
récessifs sous les conditions de l’haploïdie ou par les
changements moléculaires dans les gènes nucléaires
(Zhou,1996).
- L’albinisme pourrait être dû à une diminution de l’ADN
chloroplastique chez les microspores et à une forte
abondance de génomes chloroplastiques altérés (Maglione,
2016).
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 - Des études ont montré que le chloroplaste subit des altérations aux niveaux
morphologique, biochimique et génomique.
➢ Au niveau morphologique:
- Malformation des membranes
- Faible présence de structures thylacoïdale

Morphologie des structures chloroplastiques en ME chez des embryons issus de la fécondation (A)
et de microspores à un stade de culture avancé (B).
g (granum), S (amidon), P (plaste). * : malformation de structures chloroplastiques
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 ➢Au niveau biochimique:
- Une analyse du contenu chlorophyllien par spectrométrie a
révélé l’absence de chlorophylle a et b chez des plantes
albinos issues de l’androgenèse.

- L’albinisme se caractérise donc par une perte partielle ou

totale des pigments chlorophylliens qui nuit à la
photosynthèse et les plantes meurent à un stade précoce sans
atteindre la maturité.

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 ➢Au niveau génomique:
- Des recherches récentes ont révélé, par approche PCR, des
délétions au niveau des gènes essentiels à la photosynthèse.
L’albinisme peut donc s’expliquer par:
- Certaines mutations ou délétions punctiformes du génome
plastidial.
- La mutation de nombreux loci nucléaires différents.

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 - Réalisations de plusieurs études pour analyser le schéma d’expression
des gènes de plantes albinos par rapport aux plantes chlorophylliennes.

- Résultats : la RuBisCo (protéine impliquée dans les processus

photosynthétiques) n’est pas exprimée ou est exprimée à des niveaux
très bas chez les plantes albinos d’où la relation entre l’absence de cette
protéine et l’albinisme.

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 4.1.7/Principaux facteurs influençant l’androgenèse

• L’efficacité de l’androgenèse varie sous l’influence de 2 types de

facteurs:

➢ Facteurs génétiques liés au matériel végétal

➢ Facteurs environnementaux correspondant aux conditions de
culture des plantes-mères et des anthères.

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 Conditions de croissance de la plante-mère
- Des pls vigoureuses donnent des anthères riches en substances
métaboliques avec une réponse androgénétique svt maximale.
- Meilleur rendement androgénétique pour des plantes cultivées
au champ/ à celles cultivées en serre ou en chambre de culture.

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 Génotype des plantes donneuses
- L’effet du génotype intervient dans la variation de la réponse
androgénétique.
- Des chromosomes portant des gènes impliqués dans le contrôle de cette
réponse ont pu être identifiés.
Il existe une nette supériorité du rendement androgénétique chez quelques
cultivars ex: « Sleipner », « Florida » et « Chinese Spring » dont les
génomes sont porteurs de la translocation 1BL/1RS (blé/seigle) connue pour
son effet très positif sur le rendement androgénétique.

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 -La production de plantes haploïdes est contrôlée par 3 caractères
indépendamment transmissibles.
+ taux d’induction des embryons.
+ capacité de régénération des embryons.
+ rendement : pl. vertes/pl. albinos
- Les HD obtenus par androgenèse sont en général plus
embryogènes que les génotypes dont ils sont issus l’aptitude
à l’androgénèse est un caractère héritable.
- De nombreuses variétés ont été obtenues par androgenèse: Ex
Florin: variété française de blé adaptée au froid (1985).
Jinghua, Haapei: variétés créées en Chine

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 Stade de microsporogenèse du pollen
- Généralement le stade optimal des microspores
pour la mise en culture des anthères est:
le stade microspore uninucléée, vacuolisée.

Les différents stades de microsporogenèse

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 Prétraitement des épis au froid (4°C)
• Effet bénéfique d’un prétraitement au froid (4°C) pdt 7 à 14 jours
chez les Poacées ( blé, riz, orge, triticale), 4 à 6 jours chez les
Brassicacées (chou, betterave) et 2 à 5 jours chez les Solanacées
(tomate, pétunia, piment).
• Le prétraitement au froid permet:
- Une synchronisation de développement des microspores
(ralentissement de la différenciation du pollen).
- Une augmentation du taux de viabilité des microspores,
conduisant à la prolifération d’un nombre élevé d’embryons.
- Un retard de la 1ère mitose pollinique permettant le
déclenchement d’une activité mitotique modifiée conduisant à la
formation de 2 cellules équivalentes (stimule la division égale des
microspores).
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 Milieux de culture
➢ Milieux d’induction
- Les milieux les plus utilisés sont :
P1 ou BPTG (De Buyser et Henry, 1980)
P2 (Chuang et al., 1978)
C17 (Wang, 1986)
N6 (Chu et al., 1975)
(Voir composition, tableaux 1et 2)
Des hormones de croissance: auxine (2,4D) et cytokinine (kinétine) sont ajoutées
à ces milieux d’induction
• 2,4D: auxine forte essentielle dans le milieu d’induction.
• Effet important de l’acide gibbérellique sur la régénération directe des plts.
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 Composition des milieux N6, C17, BPTG et P2 (en mg/l)

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 ➢ Milieux de régénération
- R9 (Picard et De Buyser, 1977)
- C17 (Wang et al., 1986)
- N6 (Chu et al., 1975)
milieux de régénération ≠ des milieux d’induction par :
réduction de la concentration en saccharose de 9 à 2 ou 3% et
remplacement du 2,4D par l’AIA ou l’ANA.

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 Composition du milieu de culture R9

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 Conditions de culture des anthères
- Obscurité : environnement efficace pour la formation d’embryons.
- Lumière :après formation des embryons, indispensable pour le
développement des plantules.
- T° élevées (28 ±2°C) favorables aux processus androgénétiques.

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 - Rôle prépondérant des hormones durant la croissance et le
développement des plantes et particulièrement durant le
développement androgénétique en culture de tissus.

- Rôles importants des gènes impliqués dans le métabolisme des

substances de croissance ou leurs voies de signalisation dans le
déclenchement de l’embryogenèse et la régénération des plantes
androgénétiques.

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 4.1.8/ Comparaison entre culture d’anthères et de microspores isolées
- Culture d’anthères: TK plus simple et plus rapide que celle des microspores isolées.

- Culture de microspores: résultats > culture d’anthères. Pas de contraintes des parois des
anthères.
Les avantages de cette TK reposent sur les applications potentielles :
+ la transformation génétique,
+ la mutagenèse in vitro,
+ la sélection in vitro,
+ la réalisation d’études génétiques
Ex : Au lieu de transformer génétiquement des plts de céréales, on pourrait transformer
directement des grains de pollen (par micro-injection ou bombardement à l’aide du canon à
particules) puis régénération de plts haploïdes et plts diploïdes par traitement à la
colchicine.

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