-1-/- Introduction :

- Le polymorphisme de IL10 ( 1082-G/A) peut être typé par PCR SSP( Polymérase chaine
Réaction –Séquence –spécifique Primer ),une méthode utilisée pour détecter des
polymorphismes génétiques spécifiques. Avec cette méthode, Des amorces spécifiques sont
conçues pour cibler les régions contenant le polymorphisme.
- Ensuite , la PCR est réalisée et Les produits amplifiés sont analysés pour déterminer la
Présence ou l’absence du polymorphisme .
-cette approche Permet une détection précise des variations génétiques dans une
population donnée.

-2-/-Le but :

Est de détecter les variations génétiques spécifiques dans le gène IL-10, qui code pour une
cytokine impliquée dans la régulation du système immunitaire.

-3/-1- Les matériaux :

1-Microtubes PCR 0.2 l stériles . -4- Thermocyleur .

2-Micropipettes p10, p100,p1000. -5- Gants en latex.

3- Pointes jaunes et bleues stériles . -6- Portoir.

-7-Boite de polystyrène pour la glace .

-8- Vortex .

-/- Réactifs :

- Taq polymérase (+tampon10x). –Les amorces .

-DNTPs. – Free nuclease H 20

-ADN humain .

- Bleu de Bromophenol-succrose -Marqueur de taille 100pb.

-3/-2- Méthode :

- Préparer une série de microtubes PCR 0.2µl stériles identifies correspondant au nombre
d'échantillons d'ADN plus le témoin négatif.
- Pour chaque échantillon d'ADN il faut préparer deux tubes; un pour l'allèle G et l'autre
pour l'allèle A.

- Dans un seul tube stérile préparer un Mix pour le total de réactions:

Réactif Concentration Volume (une Volume

finale réaction de (n+1réaction)
250ul)
Tampon 5X 1X 2-5….ul 27.5….ul
Amorce antisens 0.5 uM 2.5…..ul 27.5….ul
commune 10uM
Amorce spécifique à 0.25 uM 2.25…ul …..ul
l’allèleG/A 10uM
L’ADN matriciel 250 500 ng 2….ul
ng/ul
DNTPs 25mM 200 uM 2….ul 2.2….ul
Taq polymérase 1U 0.2….ul 2.2…..ul
5U/ul
MgCl2 2.5mM
Free nuclease H2O / 4.55….ul 160.05…ul

-n+1: nombre d'échantillons à amplifier+ 1 échantillon supplémentaire. Ce calcul permet de

palier les erreurs de pipetage.

-Tous les réactifs de PCR doivent être vortexés juste avant leur utilisation.

- Une fois le mix est préparé, il faut le vortexer, et le dispatcher dans les
Microtubes de PCR.
- Fermer votre microtube et le placer dans la glace, en attendant de rajouter
l'ADN et les amorces spécifiques aux deux allèles.

-L'ADN et les amorces sont rajoutée ensuite dans chaque tube.

-Ne pas ajouter de l'ADN dans les tubes contenant les témoins négatifs.
- Les tubes doivent être correctement identifiées et fermées avant de les placer dans
le thermocycleur.
- Placer les tubes dans le thermocycleur et lancer le programme suivant:
-Initiation: 95°C pendant I min.
-Dénaturation: 95°C pendant 15 sec,10 cycles.
 -Hybridation: 65°C pendant 50 sec
-}
-Elongation: 72°C pendant 40 sec.
-Dénaturation: 95°C pendant 20 sec

-Hybridation: :....C pendant 50 sec. Elongation: 72°C pendant 50 sec.

}20 cycles

-Elongation finale: 72°C pendant 5 min.

-Apres amplification par PCR les microtubes doivent être retirés du

thermocycleur.
-Si l’analyse des produits de PCR n’est pas réalisée dans l’immédiat ,les amplifias
peuvent etre conservés à 40C en vue d’utilisation ultérieure .
-4-/- Résultats et discussion :
La PCR, ou réaction de polymérisation en chaîne, est une technique utilisée en
biologie moléculaire pour amplifier de petites quantités d'ADN en une quantité
suffisante pour l'analyse. Elle implique plusieurs cycles de chauffage et de
refroidissement pour permettre la réplication ciblée de segments spécifiques
d'ADN. La PCR est largement utilisée en recherche scientifique, en médecine
diagnostique et dans d'autres domaines, car elle est rapide, sensible et spécifique.
-n+1 5→10M→17
-21 ,75 M
d’ADN+1,25
-25 Volume – total = 1,25 G/A = 25 Ml.
-Remarque : on gène+ jamais .
-A111→alelle A et G → 111allèle A et G .
- A99→ 99 allèle A et G .
- A 103 → 103 allèle A et G .
- A102 → 102 allèle A et G .
- A 13 → 13 allèle A et G .
- La LOI :
- Tm = 4 ( G-C) + 2 ( A+ T )
- ants = 4 ( 11+ 2/9)
- 44 + 15 = 62
-Tm G = 4 ( 10 ) + 2 ( 13 )
- 40 + 26 = 66
- Tm G = 4 ( 9 ) + 2 ( 14) = 64
- Autre loi / :
- Tm= Tm at + Tm G + T m A
- 62 + 66 +64 = 64 C 0
- Th = Tm – 4 = 64 -4 = 60 C0
- L’ ADN matriciel
-40- 46 ml
ADN pollymérase
Aquaticus Elongation
Amorce = 02 = d NTPS
-5 / - Conclusion :
- Le typage du polymorphisme IL-10, 1082 G sur A, met en évidence les
fréquences alléliques dans les populations étudiées. Il explore également les
implications potentielles de ces variations alléliques sur la régulation de l'IL-10
et leur relation avec certaines conditions cliniques.