MÉTHODES DE SÉPARATION ET

PURIFICATION DES PROTÉINES

« ULTRACENTRIFUGATION »

PRÉSENTÉ PAR : ENCADRÉE PAR :

DR.GUERMACHE PR.ARAB
 PLAN

I-INTRODUCTION
II-DÉFINITION

III-PRINCIPE GLOBAL

IV-ULTRACENTRIFUGATION DES PROTEINES EN GRADIENT DE DENSITÉ

IV-1-SÉPARATION ZONALE
IV-2-SÉPARATION ISO PYCNIQUE
V-CONCLUSION

RÉFÉRENCE BIBLIOGRAPHIQUE
 I-INTRODUCTION

LA PURIFICATION DES PROTÉINES EST UNE SÉRIE DE PROCESSUS DIVERS DESTINÉS

À ISOLER UNE OU PLUSIEURS PROTÉINES À PARTIR D'UN MÉLANGE COMPLEXE
(CELLULES,AUTRES PARTICULES OU MATRICES).
C'EST UNE ÉTAPE IMPORTANTE POUR LA CARACTÉRISATION DE LA FONCTION (ÉTUDES
DES PROPRIÉTÉS), DE LA STRUCTURE, SA COMPOSITION EN ACIDE AMINÉ ET DES
INTERACTIONS D'UNE PROTÉINE D'INTÉRÊT
IL EXISTE À CE JOUR PLUSIEURS MÉTHODE PERMETTANT LA SÉPARATION ET LA
PURIFICATION DES PROTEINES PARMI CES MÉTHODES NOUS POUVONS CITER
L’ULTRACENTRIFUGATION.
 II-DÉFINITION
L’ULTRACENTRIFUGATION EST UNE MÉTHODE DE CENTRIFUGATION DONT LE BUT
EST DE SÉPARER DES PARTICULES TRÈS FINES DISPERSÉES DANS UN LIQUIDE DE
DENSITÉ PRATIQUEMENT ÉGALE . POUR QUE CETTE SÉPARATION AIT LIEU, LA VITESSE
DE ROTATION DE LA CENTRIFUGEUSE DOIT DÉPASSER LES 15 000 TOURS PAR MINUTE.
LE BUT DE L’ULTRACENTRIFUGATION EST D’ISOLER LES ESPÈCES DISPERSÉES :
• ELLE EST UTILISÉE EN BIOLOGIE POUR LA PURIFICATION DES VIRUS, LA SÉPARATION
DES MACROMOLÉCULES (SURTOUT LES PROTÉINES),
 III-PRINCIPE GLOBAL
LE DISPOSITIF COMPORTE UN MOTEUR FAISANT TOURNER UN AXE AUQUEL SONT FIXÉS
DES TUBES CONTENANT LES SOLUTIONS À CLARIFIER.
LA VITESSE DE SÉDIMENTATION EST PROPORTIONNELLE À L'INTENSITÉ DU CHAMP
CENTRIFUGE.
LE RÉSULTAT D'UNE CENTRIFUGATION EST L'OBTENTION DE DEUX FRACTIONS :
-LE SÉDIMENT OU CULOT (SOLIDE, AU FOND DU TUBE),
-LE SURNAGEANT (FRACTION LIQUIDE).
 IV-ULTRACENTRIFUGATION DES PRTOENES
EN GRADIENT DE DENSITÉ
LES PROTÉINES ONT UN COEFFICIENT DE SÉDIMENTATION DÉFINI PAR LEUR TAILLE, LEUR
FORME ET LEUR DENSITÉ. ON PEUT DONC LES SÉPARER PAR ULTRACENTRIFUGATION SUR
DES GRADIENTS DE SUCROSE OU D'AUTRES
LORS DE CE TYPE D'ULTRACENTRIFUGATION, EN PLUS DE L'ÉCHANTILLON, AU MOINS UN LIQUIDE
DE SÉPARATION EST UTILISÉ DANS LE TUBE DE CENTRIFUGATION.
-SI UN SEUL LIQUIDE EST UTILISÉ, IL EST ALORS À GRADIENT CONTINU DE DENSITÉ, C'EST-À-DIRE
QU'IL A UNE DENSITÉ DÉCROISSANTE DU BAS VERS LE HAUT.
-SI PLUSIEURS LIQUIDES SONT UTILISÉS, ALORS CHAQUE LIQUIDE A UNE DENSITÉ DIFFÉRENTE.
NOUS SOMMES ALORS DANS LE CAS DE GRADIENT DISCONTINUE DE DENSITÉ
CES LIQUIDESSONT SUPERPOSÉS, DU PLUS DENSE EN BAS AU MOINS DENSE EN HAUT.
L'ULTRACENTRIFUGIATION EN GRADIENT DE DENSITÉ PEUT SUIVRE DIFFÉRENTES PROCÉDURES,
TELLES QUE LA SÉPARATION ZONALE EN GRADIENT CONTINU OU DISCONTINU ET LA SÉPARATION
ISOPYCNIQUE EN GRADIENT CONTINU
IV-1-SÉPARATION ZONALE
CETTE TECHNIQUE PERMET LA SÉPARATION DES PARTICULES SELON LEURS COEFFICIENTS DE SÉDIMENTATION(MASSE)

DANS UNE CENTRIFUGATION ZONALE, L'ÉCHANTILLON EST DÉPOSÉ EN UNE MINCE BANDE AU SOMMET D'UN TUBE
CONTENANT UN TAMPON PRÉSENTANT UN GRADIENT DE DENSITÉ. LES PROTÉINES S'ENFONCERONT ET SE SÉPARERONT
DANS LE GRADIENT EN FONCTION DE LEUR COEFFICIENT DE SÉDIMENTATION (LES PLUS LOURDES ET DENSES COULENT
PLUS VITE). COMME TOUTES LES PROTÉINES FINIRONT PAR ARRIVER AU FOND DU TUBE, IL FAUT ARRÊTER LA
CENTRIFUGATION AVANT, PUIS SÉPARER CHAQUE "ÉTAGE" DU TUBE (EN FAIT, ON FRACTIONNE LE CONTENU DU TUBE EN
EN RETIRANT DES VOLUMES ÉGAUX À PARTIR DU SOMMET).

PENDANT LA CENTRIFUGATION, CHAQUE ESPÈCE SE DÉPLACE À TRAVERS LE GRADIENT À UNE VITESSE

LARGEMENT DÉTERMINÉE PAR LEUR COEFFICIENT DE SÉDIMENTATION ET DONC MIGRE COMME UNE ZONE

ON UTILISE LE SACCHAROSE, QUI EST VISQUEUX ET BIOCHIMIQUEMENT INERTE POUR FORMER LE GRADIENT

DANS CE TYPE DE CENTRIFUGATION, LA DENSITÉ DU MATÉRIEL À SÉPARER EXCÈDE CELLE DU MATÉRIEL DU

GRADIENT. C'EST CE QUI PERMET AUX PARTICULES DE S'Y ENFONCER SANS S'ARRÊTER EN COURS DE ROUTE.
À LA FIN DE L’EXPÉRIENCE, LA RÉCOLTE DES FRACTIONS SE FAIT PAR L’INSERTION
D’UNE AIGUILLE AU FOND DU TUBE DE CENTRIFUGATION ET ON COLLECTIONNE LE
CONTENU DU TUBE PAR UN COLLECTEUR DE FRACTION
CE GENRE DE SÉPARATION EST PARTICULIÈREMENT APPROPRIÉ POUR LA
PRÉPARATION DE GROS COMPLEXES PROTÉIQUES QUI SÉDIMENTERONT BEAUCOUP
PLUS VITE QUE LEURS COMPOSANTES INDIVIDUELLES. C'EST UNE DES
EXCELLENETES FAÇONS D'EXPLOITER À NOTRE PROFIT LA TAILLE DE TELLES
COMPLEXES SANS NÉCESSAIREMENT AVOIR RECOURS À UNE TECHNIQUE DE
FILTRATION.
LES ARN POLYMÉRASES EUCARYOTES OU LES FACTEURS DE
TRANSCRIPTION ,LESCOMPLEXES COMME TFIIH SE PRÊTENT PARTICULIÈREMENT
BIEN À LA PURIFICATION PAR FRACTIONNEMENT SUR GRADIENT.
IV-2-SÉPARATION ISO PYCNIQUE
DANS UNE CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE, MAINTENANT, LE GRADIENT DE DENSITÉ COUVRE UN
SPECTRE QUI INCLUE LA DENSITÉ DE TOUTES LES PARTICULES À SÉPARER. LE MATÉRIEL
"FLOTTERA" ALORS DANS LE GRADIENT À UN NIVEAU OÙ SA DENSITÉ EST ÉGALE À CELLE DU
MILIEU AMBIANT.
CETTE TECHNIQUE SÉPARE LES MACROMOLÉCULES SELON LEUR DENSITÉ(MASSE
VOLUMIQUE)
-L’ÉCHANTILLON EST DISSOUT DANS UNE SOLUTION CONCENTRÉE D’UNE SUBSTANCE DENSE QUI
DIFFUSE RELATIVEMENT VITE COMME LES SELS CSCL ET CS2SO4, ET QUI EST SOUMIES À DES
HAUTES VITESSES DE ROTATION
- LE FORT CHAMP CENTRIFUGE GÉNÈRE UN GRADIENT IMPORTANT DE SEL DANS LEQUEL LES
COMPOSANTES DE L’ÉCHANTILLON SE RETROUVENT EN ZONE DE DENSITÉS ÉGALES À CELLE DE
LA SOLUTION DE SEL
IL EST POSSIBLE DE PRÉPARER UNE CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE AVEC UN GRADIENT
PRÉPARÉ À L'AVANCE: IL FAUT ALORS S'ASSURER DE CE QUE LA PARTIE LA PLUS DENSE DU
GRADIENT EXCÈDE LA DENSITÉ DU MATÉRIEL QUE L'ON VEUT VOIR SE STABILISER DANS SA
MIGRATION EN FONCTION DE SA DENSITÉ PROPRE.

LA TECHNIQUE PRÉFÉRÉE POUR SÉPARER DES MACROMOLÉCULES QUI POSSÈDENT UNE

GAMME DE DENSITÉS.
• PAR EXEMPLE:
• - ACIDES NUCLÉIQUES (PLASMIDE VS ADN GÉNOMIQUE ET ARN TOTAL)
• - RIBOSOMES ET POLYSOMES
• - VIRUS
• - ORGANITES SUBCELLULAIRES (MICROSOME, MITOCHONDRIES, …)
 V-CONCLUSION
LES ULTRACENTRIFUGEUSES CRÉES UN VIDE DANS LA CHAMBRE DU ROTOR POUR PERMETTRE D’OBTENIR DE TRÈS
HAUTES VITESSES DE CENTRIFUGATION SANS AVOIR LA FRICTION DE L’AIR.

L’ULTRACENTRIFUGATION PEUT ÊTRE UTILISER DANS UN BUT PRÉPARATIF POUR LA SÉPARATION ET LA

PURIFICATION DES PROTÉINES À CONDITION D’AVOIR RECOURS À UN GRADIENT DE DENSITÉ .

IL EXISTE ESSENTIELLEMENT DEUX MODES EN GRADIENT DE DENSITÉ LE MONDE ZONALE QUI PERMET LA
SÉPARATION SELON LA MASSE ET LA TAILLE ET LE MODE ISO PYCNIQUE QUI PERMET LA SÉPARATION SELON LA
DENSITÉ.
 RÉFÉRENCE BIBLIOGRAPHIQUE

SITE WEB BIOCHIMIEDESPROTEINES.ESPACEWEB.

COURS BIOCHIMIE DES PROTÉINES-UNIVERSITÉ DES ANTILLES ET DE LA GUYANE-DR VINCENT VEDEL

JEAN LEMERLE, L'ULTRACENTRIFUGATION ET SES APPLICATIONS EN CHIMIE MINÉRALE, L'ACTUALITÉ

CHIMIQUE, P. 3-28, PARIS, MARS 1974

BERNARD HAINQUE, BRUNO BAUDIN, PHILIPPE LEFEBVRE, APPAREILS ET MÉTHODES EN BIOCHIMIE

ET BIOLOGIE MOLÉCULAIRE, LAVOISIER, 2008