Produits Phytosanitaires

ANNEE 2010-2011 N DORDRE 1147
Produits phytosanitaires : Dveloppement dune mthode danalyse multi-rsidus dans les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse en mode tandem
THESE DE DOCTORAT tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 (VOLUME 1)
SPECIALITE : CHIMIE ANALYTIQUE ECOLE DOCTORALE : MATIERES, MOLECULES, MATERIAUX DES PAYS DE LOIRE PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE : 27 JUIN 2011 A : ANGERS PAR : YOANN FILLATRE
Devant le jury ci-dessous :

Valrie PICHON, Professeur lUniversit Pierre et Marie Curie Guy JAMET, Ingnieur au Service Commun des Laboratoires du Minefe Bruno LE BIZEC, Professeur lEcole Nationale Vtrinaire Brice BONNET, Ingnieur la socit LOral Paris Marylne DIAS, Matre de Confrences lUniversit dAngers Pierre-Yves COMMUNAL, Professeur associ lUniversit dAngers Alain JADAS-HECART, Matre de Confrences lUniversit dAngers Loc BEYET, Ingnieur la socit AB Sciex Directeur de thse : David RONDEAU, Professeur lUniversit de Brest Nom et coordonnes du Laboratoire
MOLTECH ANJOU UMR CNRS 6200 UFR Sciences 2, Bd Lavoisier 49045 ANGERS CEDEX 01
Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Membre invit
ED N500 3MPL
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
ANNEE 2010-2011 N DORDRE 1147
Produits phytosanitaires : Dveloppement dune mthode danalyse multi-rsidus dans les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse en mode tandem
THESE DE DOCTORAT tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 (VOLUME 1)
SPECIALITE : CHIMIE ANALYTIQUE ECOLE DOCTORALE : MATIERES, MOLECULES, MATERIAUX DES PAYS DE LOIRE PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE : 27 JUIN 2011 A : ANGERS PAR : YOANN FILLATRE
Devant le jury ci-dessous :

Valrie PICHON, Professeur lUniversit Pierre et Marie Curie Guy JAMET, Ingnieur au Service Commun des Laboratoires du Minefe Bruno LE BIZEC, Professeur lEcole Nationale Vtrinaire Brice BONNET, Ingnieur la socit LOral Paris Marylne DIAS, Matre de Confrences lUniversit dAngers Pierre-Yves COMMUNAL, Professeur associ lUniversit dAngers Alain JADAS-HECART, Matre de Confrences lUniversit dAngers Loc BEYET, Ingnieur la socit AB Sciex Directeur de thse : David RONDEAU, Professeur lUniversit de Brest Nom et coordonnes du Laboratoire
MOLTECH ANJOU UMR CNRS 6200 UFR Sciences 2, Bd Lavoisier 49045 ANGERS CEDEX 01
Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Membre invit
ED N500 3MPL
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Remerciements
REMERCIEMENTS
Je tiens remercier le Docteur Monsieur Patrick BATAIL, Directeur du laboratoire MOLTECH ANJOU (UMR CNRS 6200), pour avoir accept de maccueillir au sein de son laboratoire. Je remercie galement Monsieur Pierre-Yves COMMUNAL pour mavoir permis de raliser mes travaux de thse au sein du GIRPA (Groupement Interrgional de Recherche sur les Produits Agropharmaceutiques) dont il est le Directeur. Cette thse a bnfici des supports financiers de lANRT, de lOral et de la FREDON Pays-de-Loire, quils trouvent ici le tmoignage de ma reconnaissance. A ce titre, je tiens remercier plus particulirement Monsieur Grald GUEDON Directeur de la FREDON et tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Dominique JULLIEN de la socit LOral pour avoir mis en uvre les financements ncessaires la ralisation de ce projet. Jexprime mes sincres remerciements Madame Valrie PICHON et Monsieur Guy JAMET pour lhonneur quils mont fait en acceptant dtre Rapporteurs de mon manuscrit et pour la comprhension et les efforts quils ont consentis. Je souhaite galement adresser mes remerciements Monsieur Bruno LE BIZEC, Monsieur Brice BONNET, Madame Marylne DIAS, Monsieur Alain JADAS-HECART et Monsieur Loc BEYET davoir accept de juger mon travail. Jadresse ma profonde reconnaissance Monsieur le Professeur David RONDEAU pour avoir accept de superviser mon travail de thse, pour mavoir prodigu de prcieux conseils et pour avoir rpondu prsent lors des moments cls de ce projet. Je le remercie galement pour le soutien quil ma apport afin de terminer ce travail dans les meilleures conditions.
Un grand merci tous mes collgues de travail pour leur soutien et leur sympathie. Je citerai tout particulirement Antoine DAGUIN, Directeur adjoint du GIRPA, pour mavoir suivi au cours de ces annes de thse, pour la confiance quil ma tmoign sur la ralisation de divers projets et, enfin, pour les discussions trs enrichissantes que nous avons pu avoir durant ces trois annes.
Remerciements
Je voudrais galement adresser de vifs remerciements Solenne, Olivier et Guillaume pour leur bonne humeur, leur disponibilit et surtout leur comprhension et leur aide de tous les instants. Une attention toute particulire Sonia et Nathalie T. pour leurs encouragements et leur soutien quotidien depuis mon arrive au laboratoire. Bien videmment, je noublie pas Hamid, Sylvain, Lucie, Sarah, Gwenalle, Sverine, Aurlie, Caroline, Vronique, Anas, Maud, Sophie, Bertrand et toutes les personnes qui ont contribu, de prs ou de loin, la russite de ce projet. Comment pourais-je conclure autrement ces premires lignes quen adressant mes plus sincres remerciements mes amis et ma famille, auprs de qui jai trouv un soutien sans commune mesure. A ce titre, je souhaiterais ddier une pense particulire mes parents, mon frre et ma petite sur, qui ont toujours rpondu prsents et ont t dun grand secours moral tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 en toutes situations.
Table des Matires
TABLE DES MATIERES

Liste des communications crites et orales Liste des abrviations Glossaire INTRODUCTION GENERALE _______________________________________________ 1
CHAPITRE I Etude Bibliographique Les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

A)
I.
Les Huiles Essentielles ______________________________________________________ 7

Gnralits sur les huiles essentielles __________________________________________________ 8 Le matriel vgtal dorigine ____________________________________________________ 8 Mthodes dextraction __________________________________________________________ 9 I.2.1. Expression froid _______________________________________________________ 10 I.2.2. Distillation _____________________________________________________________ 11 I.2.3. Extraction micro-ondes sans solvant (SFME) __________________________________ 13 I.2.4. Extraction par fluide supercritique (SFE) _____________________________________ 13 I.2.5. Conclusion _____________________________________________________________ 14 I.3 Composition Chimique ________________________________________________________ 15 I.3.1. Les terpnes et terpnodes ________________________________________________ 15 I.3.2. Les composs aromatiques ________________________________________________ 17 I.3.3. Conclusion _____________________________________________________________ 18 II. Les huiles essentielles : le march et le contrle analytique _______________________________ 19 II.1 Les domaines dapplication __________________________________________________ 20 II.1.1. Parfums et Cosmtiques___________________________________________________ 20 II.1.2. Sant : pharmacie et aromathrapie __________________________________________ 20 II.1.3. Agro-alimentaire ________________________________________________________ 21 II.1.4. Agriculture _____________________________________________________________ 22 II.1.5. Conclusion _____________________________________________________________ 23 II.2 Le contrle analytique des huiles essentielles ____________________________________ 23 II.2.1. Analyse conventionnelle par chromatographie en phase gazeuse ___________________ 23 II.2.2. Les techniques chromatographiques avances __________________________________ 25 II.2.3. Le couplage entre les chromatographies gazeuse et liquide _______________________ 27 II.2.4. Les principaux dtecteurs _________________________________________________ 28 II.3 Conclusion : Adultration ____________________________________________________ 29 I.1 I.2
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
B)
I.
Les Produits Phytosanitaires ________________________________________________ 30

Gnralits sur les produits phytosanitaires ____________________________________________ 31 Dfinitions, classification et chiffres cls __________________________________________ 31 Lhistoire des produits phytosanitaires ____________________________________________ 36 La vie dun produit phytosanitaire _______________________________________________ 39 I.3.1. Lhomologation dune substance active : la directive 91/414/CEE __________________ 39 I.3.2. Application et devenir du pesticide dans lenvironnement ________________________ 41 II. Toxicit et scurit du consommateur ________________________________________________ 44 II.1 Toxicit pour lutilisateur ____________________________________________________ 44 II.1.1. Toxicit aige __________________________________________________________ 44 II.1.2. Toxicit chronique _______________________________________________________ 44 II.2 Les risques pour le consommateur _____________________________________________ 45 II.2.1. Dfinition du rsidu ______________________________________________________ 45 II.2.2. Dfinition de la LMR _____________________________________________________ 46 I.1 I.2 I.3
Table des Matires
II.2.3. Evaluation du risque pour le consommateur ___________________________________ 47 II.3 Conclusion _______________________________________________________________ 48 III. Les pesticides dans les huiles essentielles _____________________________________________ 49 III.1 Identification des substances actives pertinentes __________________________________ 49 III.1.1. La rglementation _____________________________________________________ 49 III.1.2. Lusage _____________________________________________________________ 50 III.1.3. La toxicit ___________________________________________________________ 51 III.1.4. Conclusion __________________________________________________________ 51 III.2 Etat de lart sur lanalyse des pesticides dans les huiles essentielles ___________________ 52
CHAPITRE II Rappel Thorique sur la Spectromtrie de Masse Couple la Chromatographie en Phase Liquide (LC-MS/MS)
A)
I.
La source dionisation par electrospray ESI ___________________________________ 57

Lionisation par electrospray ________________________________________________________ 58 Production de gouttelettes charges ______________________________________________ 59 Intervention dun processus lectrochimique _______________________________________ 60 Evaporation du solvant et fission coulombienne _____________________________________ 63 Formation des ions en phase gazeuse _____________________________________________ 64 Poursuite de la dsolvatation linterface pression atmosphrique-vide __________________ 64 Electrospray assist par nbullisation pneumatique ou Ion Spray ________________________ 66 Conclusion__________________________________________________________________ 68 II. Le couplage chromatographie liquide source electrospray _______________________________ 69 II.1 Introduction la chromatographie liquide _______________________________________ 69 II.2 La sparation en chromatographie de partage en phase inverse _______________________ 70 II.2.1. Gnralits _____________________________________________________________ 70 II.2.2. Les mcanismes de retention en RPLC _______________________________________ 71 II.2.3. La rsolution chromatographique ___________________________________________ 72 II.3 Cahiers des charges pour un couplage LC-ESI/MS ________________________________ 73 I.1 I.2 I.3 I.4 I.5 I.6 I.7
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B)
I.
La Spectromtrie de Masse _________________________________________________ 75

Quelques rappels fondamentaux sur la spectromtrie de masse ____________________________ 75 Le spectromtre de masse ______________________________________________________ 75 Les principales caractristiques dun analyseur _____________________________________ 76 II. Les analyseurs champ quadripolaire ________________________________________________ 78 II.1 Le filtre de masse quadripolaire (QMF) ou quadriple (Q) __________________________ 78 II.1.1. Expression du potentiel lectrique ___________________________________________ 79 II.1.2. Equation du mouvement dun ion ___________________________________________ 81 II.1.3. Mouvement dun ion dans un filtre de masse quadripolaire _______________________ 83 II.1.4. Mode de fonctionnement __________________________________________________ 86 II.2 La trappe dions linaire 2D __________________________________________________ 88 II.2.1. Principe du pigeage dions dans une trappe 2D ________________________________ 89 II.2.2. Ljection axiale ________________________________________________________ 90 II.2.3. Le cne de rflexion _____________________________________________________ 93 III. La spectromtrie de masse en tandem_________________________________________________ 95 III.1 La fragmentation par CID____________________________________________________ 96 III.2 Les modes de scans dun spectromtre de masse hybride QqLIT _____________________ 99 III.2.1. Mode full scan et Single Ion Monitoring (SIM) _______________________ 100 III.2.2. Le Product Ions Scan (PI) et l Enhanced Product Ions Scan (EPI) _________ 101 III.2.3. Le Selected Reaction Monitoring (SRM) ou le Multiple Reaction Monitoring (MRM) 102 III.2.4. Conclusion _________________________________________________________ 102 III.3 Les effets matrice et la confirmation des positifs _________________________________ 103 I.1 I.2
Table des Matires
CHAPITRE III Mise au Point de la Mthode d'Analyse Multi-Rsidus LC-ESI/MS/MS

A)
I. II.
Optimisation des paramtres de dtection en spectromtrie de masse _____________ 107

Le spectromtre de masse 4000 QTrap _______________________________________________ 107 Optimisation des rendements dions fragments travers ltude de lion [M+H] + de la butraline _ 110 II.1 Optimisation de lintensit de lion prcurseur ___________________________________ 110 II.2 Optimisation de lintensit des ions fragments caractristiques ______________________ 112 III. Bilan des paramtres de dtection en mode SRM des autres pesticides _____________________ 115
B)
I. II.
Cahier des charges impos par le couplage LC-MS/MS _________________________ 119

Le temps, un facteur crucial du mode SRM classique ___________________________________ 119 La solution apporte par le mode Scheduled SRM _____________________________________ 122
C) Optimisation des conditions chromatographiques pour un couplage en mode Scheduled SRM _______________________________________________________________________ 124
I. II. III. LHPLC Ultimate 3000 et sa colonne chromatographique _______________________________ 124 Choix des phases mobiles et du gradient dlution _____________________________________ 125 Optimisation des conditions dionisation de la source TurboV ____________________________ 128
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D) Les performances du mode Scheduled SRM pour lanalyse multi-rsidus LC-ESI/SRM de 242 pesticides _____________________________________________________________ 131
I. II. III. Protocole Exprimental ___________________________________________________________ 131 Rsultats et discussion ____________________________________________________________ 133 Conclusion _____________________________________________________________________ 136
CHAPITRE IV Application de la Mthode LC-ESI/sSRM la Recherche de Pesticides dans des Huiles Essentielles Surcharges
A)
I.
Prtraitement dhuiles essentielles surcharges et son effet sur la quantification ____ 139
Extraction sur phase solide (SPE) ___________________________________________________ 139 Extraction sur Oasis HLB 500 mg_______________________________________________ 139 I.1.1. Protocole n 1 : extraction SPE sans lavage __________________________________ 140 I.1.2. Protocole n 2 : extraction avec lavage ______________________________________ 140 I.1.3. Rsultats et discussion ___________________________________________________ 141 I.2 Extraction sur MegaBond Elute C18 1g __________________________________________ 142 I.2.1. Protocole exprimental __________________________________________________ 142 I.2.2. Rsultats et discussion ___________________________________________________ 143 I.3 Conclusion_________________________________________________________________ 144 II. Purification SPE dispersive : la mthode QuEChERS ___________________________________ 144 II.1 Blancs de purification ______________________________________________________ 145 II.1.1. Protocole exprimental __________________________________________________ 145 II.1.2. Rsultats______________________________________________________________ 146 II.2 Evaluation de la purification sur lhuile essentielle de lavandin _____________________ 147 II.3 Conclusion ______________________________________________________________ 150 III. Dilution pour une injection directe des huiles essentielles ________________________________ 150 III.1 Protocole exprimental _____________________________________________________ 150 III.2 Rsultats et discussion _____________________________________________________ 151 III.2.1. Mise en vidence des effets matrice ______________________________________ 151 III.2.2. Dtermination des limites de quantification dans le solvant et les huiles essentielles de citron et lavandin ______________________________________________________________ 152 IV. Conclusion sur les mthodes de prparation des huiles essentielles ________________________ 155 I.1
Table des Matires
B) Dveloppement de la mthode danalyse : tude dune huile essentielle de lavandin sucharge en pesticides ________________________________________________________ 156
Optimisation des conditions dinjection dune huile essentielle ___________________________ 156 Nature du solvant et volume dinjection __________________________________________ 156 Effet de la quantit dacide dans les phases mobiles et le solvant dinjection______________ 159 I.2.1. Influence sur le temps de rtention _________________________________________ 160 I.2.2. Influence sur laire des pics chromatographiques ______________________________ 162 I.2.3. Influence sur la forme des pics chromatographiques (efficacit) __________________ 163 I.2.4. Conclusion ____________________________________________________________ 164 II. Etude des effets matrice en LC-ESI/sSRM ____________________________________________ 165 II.1 Protocole ________________________________________________________________ 165 II.2 Rsultats ________________________________________________________________ 166 III. Dtermination statistique des LODs et LOQs _________________________________________ 168 III.1 Description de la mthode partir de lanalyse de lactamipride ____________________ 168 III.2 Rsultats ________________________________________________________________ 172 IV. Analyse dchantillons rels dhuile essentielle de lavandin ______________________________ 174 V. Conclusion _____________________________________________________________________ 175 I. I.1 I.2
C) Analyse dhuiles essentielles peu solubles dans le mthanol : le cas de lhuile essentielle de citron ____________________________________________________________________ 177
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Mise en place dune mthode de purification adapte ___________________________________ 177 Protocole __________________________________________________________________ 177 Rsultats et discussion ________________________________________________________ 178 Conclusion_________________________________________________________________ 181 II. Application lanalyse dchantillons rels ___________________________________________ 182 II.1.1. Analyse par LC-ESI/sSRM _______________________________________________ 183 II.1.2. Seconde srie danalyse : valuation de la rptabilit du prlvement _____________ 184 II.1.3. Conclusion ____________________________________________________________ 185 II.2 Analyse dune huile essentielle dorange _______________________________________ 186 II.2.1. Analyse par LC-ESI/sSRM _______________________________________________ 186 II.2.2. Rsultats et discussion dans le contexte dune analyse interlaboratoire _____________ 187 II.2.3. Rsultats______________________________________________________________ 187 II.2.4. Conclusion ____________________________________________________________ 189 I. I.1 I.2 I.3
CHAPITRE V Vers un Screening Plus Etendu de Pesticides dans les Huiles Essentielles, Plus Sensible et Plus Fiable
A)
I.
Lvaporation sous azote comme mthode ad-hoc denrichissement en pesticides ___ 193
Mise au point de la mthode vaporation sous azote ____________________________________ 193 Protocole exprimental _______________________________________________________ 193 Rsultats et discussion ________________________________________________________ 194 I.2.1. Lhuile essentielle de citron _______________________________________________ 194 I.2.2. Lhuile essentielle de cyprs ______________________________________________ 196 I.3 Conclusion_________________________________________________________________ 197 II. Quantification de 250 pesticides dans 4 huiles essentielles : comparaison des mthodes de dilution et dvaporation sous azote _______________________________________________________________ 198 II.1 Protocole exprimental _____________________________________________________ 198 II.2 Analyse de lhuile essentielle de citron surcharge en pesticides _____________________ 200 II.2.1. Rsultats et discussion ___________________________________________________ 200 II.2.2. Cas des molcules de dithianon, bromoxynil et fludioxonil ______________________ 204 II.2.3. Cas du thiophanate-mthyle et de lamitraz ___________________________________ 205 II.2.4. Bilan des limites de quantification __________________________________________ 206 II.3 Lhuile essentielle de cyprs _________________________________________________ 208 II.3.1. Rsultats et discussion ___________________________________________________ 208 I.1 I.2
Table des Matires
II.3.2. Bilan des limites de quantification __________________________________________ II.4 Lhuile essentielle de lavandin _______________________________________________ II.4.1. Rsultats et discussion ___________________________________________________ II.4.2. Bilan des limites de quantification __________________________________________ II.5 Lhuile essentielle de mlisse ________________________________________________ II.5.1. Rsultats et discussion ___________________________________________________ II.5.2. Bilan des limites de quantification __________________________________________ II.6 Vrification de la linarit de la rponse _______________________________________ II.7 Conclusion ______________________________________________________________
208 209 209 210 211 211 211 212 213
B)
I. II.
Dveloppement dune mthode de confirmation en mode SRM-EPI ______________ 215

Principe et spcificit du mode SRM-EPI ____________________________________________ 216 Optimisation des conditions de dtection en mode SRM-EPI _____________________________ 218 II.1 Dtermination de la valeur globale optimum de la DP _____________________________ 218 II.2 Les crittres IDA _________________________________________________________ 218 II.3 Optimisation du temps daccumulation des ions dans Q0 ___________________________ 220 II.4 Optimisation des nergies de collision _________________________________________ 222 II.5 Optimisation de la vitesse dacquisition de la trappe 2D ___________________________ 223 II.6 Etude de limpact de la rsolution du filtre quadripolaire Q 1 sur la concordance des spectres EPI 224 III. Rsum des principaux paramtres de la mthode SRM-EPI _____________________________ 228
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C)
I.
Application lanalyse dchantillons dhuile essentielle ________________________ 229

Description de la mthodologie analytique____________________________________________ 229 Mthodologie sur la prparation de lchantillon ___________________________________ 229 Analyse LC-ESI-MS/MS de 250 substances actives _________________________________ 230 I.2.1. Limites de quantification de 250 substances actives ____________________________ 230 I.2.2. Analyse par LC-ESI/sSRM et LC-ESI/SRM-EPI ______________________________ 231 I.2.3. Quantification des substances actives _______________________________________ 231 II. Analyse dchantillons rels dhuile essentielle ________________________________________ 233 II.1 Analyse dune huile essentielle de marjolaine dorigine bio _____________________ 233 II.1.1. Concentration et confirmation des 12 substances actives dtectes_________________ 233 II.1.2. Conclusion ____________________________________________________________ 240 II.2 Analyse de deux huiles essentielles de citron ____________________________________ 242 II.2.1. Analyse dun chantillon dhuile essentielle de citron bio ____________________ 242 II.2.2. Analyse dun chantillon dhuile essentielle de citron non bio _________________ 244 II.3 Analyse de deux huiles essentielles dorange douce ______________________________ 248 II.3.1. Analyse dun chantillon dhuile essentielle dorange bio _______________________ 248 II.3.2. Analyse dun chantillon dhuile essentielle dorange non biologique ______________ 249 III. Conclusion _____________________________________________________________________ 251 I.1 I.2
CONCLUSION GENERALE _______________________________________________ 254 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ______________________________________ 258 Abstract _________________________________________________________________ 266 Rsum _________________________________________________________________ 267
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Liste des communications crites et orales
LISTE DES COMMUNICATIONS ECRITES ET ORALES

Publications
Filltre Y., Rondeau D., Jadas-Hcart A., Communal P.-Y. Advantages of the Scheduled SRM algorithm in liquid chromatography/electrospray-tandem mass spectrometry multiresidue analysis of 242 pesticides: a comparative approach with classical selected reaction monitoring mode. Rapid communications in mass spectrometry, Volume 24, 31 May 2010, Pages 2463-2461.
Filltre Y., Rondeau D., Bonnet B., Daguin A., Jadas-Hcart A., Communal P.-Y. Multiresidue Analysis of Multiclass Pesticides in Lavandin Essential Oil by LC/MS/MS tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Using the Scheduled Selected Reaction Monitoring Mode. Analytical Chemistry. Volume 83, 1 January 2011, Pages 109-117.
Communication orale
Multi-residue Analysis of 70 Multi-Class Pesticides in Lavandin Essential Oil by LC/MS/MS using Scheduled MRM. EPRW (European Pesticides Residues Workshop) le 22 Juin 2010 Strasbourg (France).
Posters
Advantages of the Scheduled MRM in LC-ESI-MS/MS multi-residue analysis. A comparative approach with the classical MRM mode. EC/MS/MS les 6 et 7 Octobre 2010 Noordwijkerhoot (Pays-Bas). Application de la LC-MS/MS et du Scheduled MRM lanalyse multi-rsidus de 70 pesticides dans lhuile essentielle de lavandin. JFSM (Journes Franaises de Spectromtrie de Masse) du 13 au 16 Septembre 2010 Clermont-Ferrand.
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Liste des Abrviations
LISTE DES ABREVIATIONS

ACN ACTA ACTEI AFNOR AJMT AMM AOC APCI API APPI ARfD BIRD BPA BPP CA CCM CD CEM CES CI CID CIP CL 50 CP CRM CXP DAR DBS DJA DL 50 DP DSE dw ECD EFSA EI EPI ESI ESP FAB FAPAS FF FID FMC FWHM GB GC GCGC GC-Es GS1 GS2 H ou HEPT HE HPLC HR IDA IELC IEM Actonitrile ; Association de Coordination Technique Agricole; Apport Court Terme Estimatif International ; Association Franaise de NORmalisation ; Apport Journalier Maximal Thorique ; Autorisation de Mise sur le March ; Appellation dOrigine Contrle ; Atmospheric Pressure Chemical Ionization ; Atmospheric Pressure Ionization ; Atmospheric Pressure PhotoIonization ; Acute Reference Dose ; Blackbody Infrared Radiative Dissociation ; Bonnes Pratiques Agricoles ; Bonnes Pratiques Phytosanitaires ; Charbon Actif ; Chromatographie sur Couche Mince ; CycloDextrines ; Channel Electron Multiplier ; Collision Energy Spread ; Chemical Ionization ; Collision Induced Dissociation ; Carbonyl Iron Powder ; Concentration Ltale 50 ; Chromatographie Planaire ; Charge Residue Model ; Cell Exit Potential ; Dlai Avant Rcolte ; Dynamic Background Substract ; Dose Journalire Admissible ; Dose Ltale 50 Declustering Potential ; Dose Sans Effet ; dwell time ; Electron Capture Detector ; European Food Safety Authority ; Electronic Ionization ; Enhanced Product Ion ; Electrospray Ionization ; ElectroSPray ; Fast Atom Bombardment ; Food Analysis Performance Assessment Scheme ; Fringing-Field ; Flame Ionization Detector ; Food Machinery Corporation ; Full Width Half-height Maximum ; Gas phase Basicity; Gaz Chromatography ; bidimensional Gas Chromatography ; Gas Chromatography Enantioselective ; Gaz de nebulisation ; Gaz de dsolvatation ; Hauteur Equivalente en Plateaux Thoriques ; Huile Essentielle ; High Performance Liquid Chromatography ; Haute Rsolution ; Information Dependent Acquisition ; Ion Exchange Liquid Chromatography ; Ion Evaporation Model ;
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Liste des Abrviations
IPRPLC IRMPD IS ISO ITD IUPAC LC LCLC LINAC LIT LMR LOD LOQ MALDI MDGC MeOH MRM MS MS/MS MSAE MW ND NL NOEL NPLC Patm PC PEG PI PLE PPAM ppm PSA PSD QMF ou Q QqQ ou TQ QuEChERS R RE RIRDC RMN RPLC rpm s.a. S/N SFE SFME SID SIM SPE SRM sSRM TCD TOF TR tR TSP TST UE UIPP
Ion Pair Reversed Phase Liquid Chromatography ; Infrared MultiPhoton Dissociation ; IonSpray voltage ; International Organisation for Standardization ; Ion Trap Detector ; International Union of Pure and Applied Chemistry ; Liquid Chromatography ; bidimensional Liquid Chromatography ; Linear Accelerator ; Linear Ion Trap ; Limite Maximale de Rsidus ; Limit Of Detection ; Limit Of Quantification ; Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization ; Multidimensional Gas Chromatography ; Mthanol ; Multiple Reaction Monitoring ; Mass Spectrometry ; Mass Spectrometry/Mass Spectrometry ; Mass-Selective Axial Ejection ; Molecular Weight ; Non dtect ; constant Neutral Loss ; No Observed Effect Level ; Normal Phase Liquid Chromatography ; Pression atmosphrique PreCursor ion scan ; PolyEthylneGlycole ; Product Ion scan ; Pressurized Liquid Extraction ; Plantes Parfums Aromatiques et Mdicinales ; Partie par million ; Primary and Secondary Amine ; Post-source Decay ; Quadrupole Mass Filter ou Quadrupole ; Triple Quadriple ; Quick Easy Cheap Efficient Rugged and Safe ; Rsolution ; Rapport dextraction ; Rural Industries Research and Development Corporation; Rsonnance Magntique Nuclaire ; Reverse Phase Liquid Chromatography ; rotation par minute ; Substance Active ; Signal-to-Noise ratio ; Supercritical Fluid Extraction ; Solvent-Free Microwave Extraction ; Surface Induced Dissociation ; Selected Ion Monitoring ; Solid Phase Extraction ; Selected Reaction Monitoring ; Scheduled Selected Reaction Monitoring ; Thermal Conductivity Detector ; Time of Flight ; Taux de Rcupration ; temps de retention ; ThermoSPray ; Target Scan Time ; Union Europenne ; Union des Industrie de la Protection des Plantes ;
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Glossaire
GLOSSAIRE
Absolue : un absolue est un produit ayant une odeur caractristique, obtenu partir dune concrte, dune pommade florale ou dun rsinode par extraction lthanol temprature ambiante. La solution obtenue est gnralement refroidie et filtre dans le but de supprimer les cires. Lthanol est ensuite limin par distillation. Acaricide : un acaricide est un pesticide destin liminer les acariens. Adsorption : le phnomne dadsorption en chromatographie liquide correspond un solut situ dans linterface entre les greffons et la phase mobile. Adventice : Une adventice est, en botanique, une espce vgtale trangre la flore indigne d'un territoire dans lequel elle est accidentellement introduite et peut s'installer. En agronomie, ce terme dsigne une plante herbace ou ligneuse indsirable l'endroit o elle se trouve. Il est aussi utilis comme synonyme de mauvaise herbe. Bonnes pratiques agricoles : Les BPA constituent un ensemble de rgles respecter (la bonne pratique) dans limplantation et la conduite des cultures de faon optimiser la production agricole, tout en rduisant le plus possible les risques lis ces pratiques, tant vis--vis de lhomme que vis-vis de lenvironnement. En matire de protection des plantes, on peut galement les nommer bonnes pratiques phytosanitaires (BPP). Bonnes pratiques phytosanitaires : voir bonnes pratiques agricoles. BPA critique : la BPA critique pour une substance active et une culture donne, correspond la pratique qui conduit au risque rsidu le plus important. Co-lution : on parle de co-lution en chromatographie lorsque plusieurs composs sont lus de la colonne chromatographique avec des temps de rtention proches qui ne permettent pas de les distinguer sur le chromatogramme. Concentration ltale 50 : la CL 50 par inhalation est la dose ou concentration du produit qui tue 50 % des animaux dexpriences aprs une seule exposition dans des conditions dtudes normalises. Concrte : une concrte est un extrait odeur caractristique, obtenu partir dune matire premire frache vgtale, par extraction au moyen dun solvant non aqueux suivie de llimination de ce solvant par un procd physique. Corvicide : un corvicide est un pesticide destin liminer les oiseaux ravageurs. Cycle Time : le cycle time en mode SRM est le temps mis par le spectromtre de masse pour enregistrer une fois lensemble des transitions SRM. Danger : un danger est ce qui est susceptible de causer un prjudice. Dclusterisation : terme utilis pour dcrire le processus qui consiste liminer les dernires molcules de solvant en intraction avec les ions en phase gazeuse. Dsolvatation : terme au sens plus large que la dclusterisation incluant le processus dvaporation des gouttelettes macroscopiques. Dose de Rfrence Aige : lARfD reprsente la quantit de rsidus de pesticides quun individu ne doit pas dpasser au cours dun repas ou dune journe. Elle permet de prendre en compte le risque toxicologique court terme pour les molcules dont leffet toxique se manifeste rapidement ds la premire ingestion. LARfD est tablie selon une mthodologie similaire celle dcrite pour la DJA mais diffre par le fait quelle est le plus souvent dfinie partir des tudes de toxicit court terme (quelques jours quelques semaines). Elle sexprime en mg/kgpoid corporel/j. Dose Journalire Admissible : la DJA est la quantit de substance quun tre humain peut absorber quotidiennement sa vie durant sans effet nfaste pour sa sant. Elle sexprime en mg/kgpoid corporel/j. Elle est calcule en divisant la DSE par un coefficient de scurit, en gnral de 100, pour tenir compte de
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la variabilit inter- et intra-espce et, parfois, de 500 ou 1000 si des doutes sur la toxicit existent ; elle sert pour lensemble de la population. Dose ltale 50 : la DL 50 par mode dabsorption, orale ou cutan est la dose de produit qui tue 50 % des animaux dexpriences aprs une seule exposition dans des conditions dtudes normalises. Dose Sans Effet observ : la DSE est la quantit maximale de substance dont labsorption quotidienne ne se traduit pas par des effets toxiques sur des animaux de laboratoire. Elle sexprime en mg/kgpoid corporel/j. Duty Cycle : en mode SRM, il sagit du temps total de travail du spectromtre de masse sur une transition, c'est--dire laddition du dwell time et du pause time. Dwell time : le dwell time (dw) est le temps pass par le spectromtre de masse enregistrer une transition. Effet Matrice : augmentation ou suppression du signal de lanalyte cause par des composs co-lus provenant de la matrice. Efficacit dchantillonnage : produit de lefficacit dionisation et de lefficacit de transfert. Efficacit dionisation : efficacit de cration dion pression atmosphrique. Efficacit dune colonne N : lefficacit dune colonne chromatographique, dont dpend ltalement des pics, est mesure pour chaque compos par le nombre de plateaux thoriques N contenus dans la colonne. Lefficacit de la colonne sera dautant meilleure quelle sera compose dun nombre important de plateaux thoriques N et donc dune hauteur quivalente en plateau thorique H rduite :
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L N
Efficacit de transfert : efficacit de transfert des ions entre latmosphre et le vide. Facteur de capacit k : le facteur de capacit k dun analyte se dfinit comme le rapport de la quantit de solut dans la phase stationnaire (qS) la quantit de solut dans la phase mobile (qM) :
k'
qS qM
CS VS CM VM
VS VM
o VS et VM dsigne respectivement le volume de phase stationnaire et le volume de phase mobile. Fit : le Fit mesure la concordance entre le spectre de la librairie et le spectre inconnu. Il ne tient pas compte des pics prsents dans le spectre inconnu et absents de celui de la librairie. Fongicide : un fongicide est un pesticide destin lutter contre les parasites et les champignons pathognes. Gamme matrice : la prparation dun point de gamme matrice consiste mlanger 90 L de tmoin et 10 L dun point solvant une concentration 10 fois suprieure celle dsire. Par exemple, pour prparer un point de gamme matrice 1 g.L-1, 90 L de tmoin seront mlangs avec 10 L dun point de gamme solvant une concentration de 10 g.L-1. Herbicide : un herbicide est un pesticide destin liminer les adventices des cultures. Huile essentielle : une huile essentielle est un produit odorant, gnralement de composition complexe, obtenu partir dune matire vgtale botaniquement dfinie, soit par entrainement la vapeur deau, soit par distillation sche, soit par un procd mcanique appropri sans chauffage. Lhuile essentielle est le plus souvent spare de la phase aqueuse par un procd physique nentrainant pas de changement significatif de sa composition. Insecticide : un insecticide est un pesticide destin liminer les insectes nuisibles. Limite en m/z : elle dtermine les valeurs limites (minimum et maximum) des rapports m/z mesurables.
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Limite Maximale de Rsidus : la LMR est la concentration maximale en rsidus de produit phytopharmaceutique, officiellement fixe, tolre dans une denre alimentaire en ltat ou transforme, destine lhomme ou aux animaux. Elle est exprime en en mg/kg. Log Kow : le log Kow est une mesure de la solubilit diffrentielle de compos chimique dans deux solvants (coefficient de partage octanol/eau). Il est gal au logarithme du rapport de la concentration de la substance tudie dans loctanol et leau. Cette valeur permet d'apprhender le caractre hydrophile ou hydrophobe (lipophile) d'une molcule. En effet, si le log Kow est positif et trs lev, cela exprime le fait que la molcule considre est bien plus soluble dans l'octanol que dans l'eau, ce qui reflte son caractre lipophile et inversement. Molluscicide : un molluscicide est un pesticide destin liminer les mollusques (limaces et escargots). Nmaticide : un nmaticide est un pesticide destin liminer les nmatodes. Partage : le phnomne de partage en chromatographie liquide correspond un processus de transfert de type liquide-liquide o le solut se situe davantage dans la rgion centrale de la phase greffe. Pause Time : le pause time est le temps mis par le spectromtre de masse pour appliquer les paramtres de dtection de la transition SRM suivante.
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Persistance : la persistance est la dure pendant laquelle les rsidus dun produit phytopharmaceutique sont dtectables dans lenvironnement. Pesticide de contact : un pesticide de contact est un pesticide qui agit en surface. Pesticide systmique : un pesticide systmique est un pesticide qui agit aprs transfert lintrieur de la plante et diffusion par la sve. Pesticide : le mot pesticide provient de lassociation du mot anglais pest (animal, insecte ou nuisible), lequel provient du latin pestis (flau, calamit) et du suffixe cide ((latin -cida, du verbe latin caedo, caedere, tuer ). Bien que communment appel pesticides par le grand public, les termes utiliss par la lgislation franaise relative la protection des cultures sont produits phytopharmaceutiques , produits phytosanitaires , produits agropharmaceutiques ou encore produits antiparasitaires usage agricole . Les pesticides dsignent lensemble des substances
actives ou prparations utilises pour la prvention, le contrle ou llimination dorganismes jugs indsirables, quil sagisse de plantes, de nuisibles et de champignons.
Phytopharmacie : la phytopharmacie est la science s'intressant la conception, au mode d'action, la prparation et la distribution des produits qui servent traiter les plantes. Prcision sur la masse : elle dtermine la prcision ou, plus correctement, la justesse des rapports m/z mesurs, c'est--dire la concordance entre la masse mesure et la masse thorique de la molcule. Elle sexprime en partie par million (ppm) :
mth - mmes mth
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Produit phytopharmaceutique : voir pesticide. Purity : la Purity mesure le taux de non concordance d aux pics additionnels prsents sur lun ou lautre des spectres et est fonction du Fit et RevFit. Rapport dextraction : le rapport dextraction est le rapport entre le volume de matrice (V matrice) de la prise dessai et le volume de solvant (Vsolvant) dans lequel lextrait final est repris en fin de manipulation.
RE =
Vmatrice (mL) Vsolvant (mL)
Rsidus de pesticides : il sagit dune ou plusieurs substances prsentes dans ou sur les vgtaux ou produits dorigine vgtale, des produits comestibles dorigine animale, ou ailleurs dans
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lenvironnement et constituant le reliquat de lemploi dun produit phytopharmaceutique, y compris leurs mtabolites issus de la dgradation. Rsolution en masse : elle peut tre calcule partir dun spectre de masse en considrant un pic isol. Elle se dtermine en effectuant le rapport de la masse m sur la largeur mi-hauteur du maximum m.
m m
RevFIT : le RevFit mesure la concordance du spectre inconnu avec le spectre de la librairie. Il ne tient pas compte des ions prsents dans le spectre de la librairie et absents du spectre inconnu. Risque : le risque est la probabilit quun danger survienne. Rodonticide : un rodonticide est un pesticide destin liminer les rongeurs. Slectivit : la slectivit (ou rtention relative) permet de caractriser la distance sparant les sommets de deux pics conscutifs 1 et 2 :
tR 2 t R1
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k '2 k '1
Spectromtrie de masse en tandem : cest lacquisition et ltude du spectre des produits ou prcurseurs lectriquement chargs dun ou de plusieurs ions de rapport m/z slectionns, ou dions prcurseurs dune perte de masse neutre slectionne. Substance active : une substance active est une substance ou micro-organisme, y compris les virus, exerant une action gnrale ou spcifique sur les organismes nuisibles ou sur les vgtaux, parties de vgtaux ou produits de vgtaux. Taux de rcupration : un taux de rcupration TR consiste doper lchantillon avec une quantit connue dun ou plusieurs pesticides et danalyser lchantillon comme un chantillon rel. On dtermine ensuite la quantit de pesticides rcuprs lissue de la prparation de lchantillon et on la compare la quantit initiale :
TR (%)
Quantit finale en pesticide 100 Quantit initiale en pesticide
Tmoin : chantillon possdant des caractriques pr-dtermines qui subit un processus de prparation identique aux chantillons tests et qui sert de base la comparaison. Toxicit aige : la toxicit aige est un effet rsultant de ladministration dune dose unique de la substance tudie. Toxicit chronique : la toxicit chronique est un effet rsultant de ladministration dune dose ou de lexposition quotidienne une concentration de la substance tudie pendant une dure longue, par exemple un ou deux ans. Toxicit subaige : la toxicit subaige est un effet rsultant de ladministration dune dose ou de lexposition quotidienne une concentration de la substance tudie pendant une dure courte, par exemple une semaine. Toxicit subchronique : la toxicit subchronique est un effet rsultant de ladministration dune dose ou de lexposition quotidienne une concentration de la substance tudie pendant une dure moyenne, par exemple trois mois. Transmission : elle correspond au rapport entre le nombre dions arrivant au dtecteur et celui entrant dans lanalyseur. Vitesse de balayage : elle correspond au temps mis par le spectromtre pour analyser lensemble de la gamme de masse. Elle est gnralement exprime en u.s-1 ou u.ms-1.
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INTRODUCTION GENERALE
Introduction Gnrale
De nos jours, environ 3000 huiles essentielles sont produites et utilises de part le monde dans des domaines aussi varis que la cosmtique, la parfumerie, lagro-alimentaire, la pharmacie, et laromathrapie. Ces huiles essentielles sont extraites des hesprids ou des plantes aromatiques et mdicinales, soit par entrainement la vapeur deau, soit par distillation sche, soit encore, par un procd mcanique appropri sans chauffage. La culture de ces matires premires implique gnralement lapplication de produits phytosanitaires.1 Plus connus sous le nom de pesticides, ces produits sont utiliss pour la croissance, la protection et la conservation des vgtaux. Trs employs depuis le milieu du XXme sicle, les pesticides sont aujourdhui au cur dune problmatique dordre aussi bien environnementale, avec une contamination de la faune et de la flore, que sanitaire. En effet, de part leurs proprits toxiques, les pesticides reprsentent un rel danger pour lhomme lorsquils ne sont pas utiliss dans des conditions appropries. Afin de garantir la scurit du tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 consommateur, une lgislation trs stricte a t mise en place, notamment dans lUnion Europene, o la mise sur le march des substances actives est rglemente par la directive 91/414/CEE.2 De mme, leur utilisation doit entrer dans le cadre des bonnes pratiques phytosanitaires (BPP). Ces mesures ont pour but de limiter les teneurs rsiduelles en pesticides en dessous dun certain seuil rglementaire appel limite maximale de rsidus (LMR) . Ds lors, le respect des LMRs impose aux laboratoires de disposer de mthodes analytiques autorisant la dtection et la quantification des pesticides. Le durcissement constant de la rglementation conduit par ailleurs les laboratoires dvelopper constamment des mthodes danalyse toujours plus performantes, capables de doser un nombre de plus en plus lev de substances actives des limites de quantification toujours plus basses. Cependant, la quasi-totalit des mesures rglementaires et de contrle ne concernent que les produits alimentaires. Ainsi il nexiste, ce jour, aucune teneur limite rglementaire en pesticides dans les produits transforms tels que les huiles essentielles. Or, au vu de lorigine et du processus de fabrication des huiles essentielles, il parat vident que la prsence de rsidus de pesticides ne peut tre carte. De plus, compte tenu des domaines dapplication, notamment laromathrapie o les huiles essentielles sont accessibles au grand public et leurs utilisations peu controles, cette prsence pourrait constituer un vritable problme de sant publique. Disposer dune mthode sensible et spcifique pour quantifier les pesticides potentiellement prsents dans ce type de matrice constitue un challenge la fois pour les laboratoires danalyses, mais aussi pour impliqus dans lutilisation et la commercialisation de ces produits.
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les professionnels
Introduction Gnrale
Le contrle analytique des rsidus de pesticides dans les produits alimentaires et les matrices environnememtales est aujourdhui bien tabli et sappuie, principalement, sur les capacits de mthodes danalyse comme la spectromtrie de masse en tandem associe la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) ou chromatographie liquide (LC-MS).3-8 Depuis la fin des annes 1970, cest le couplage GC-MS qui tait essentiellement employ dans le domaine de lenvironnement. Les pesticides spars par chromatographie liquide taient jusqualors dtects par des spectromtres UV ou des dtecteurs fluorescence.9 Le premier souffre, malheureusement, dun problme de confirmation d des spectres UV similaires de certains pesticides alors que le second, plus sensible et slectif, est contraint une application limite due la faible prsence de groupement fluorophore dans les pesticides.9 Le manque de dtecteur performant applicable une large gamme de composs et associ la LC a t surmont, dune part, grce lapparition du couplage entre la tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la spectromtrie de masse et, dautre part, avec la mise au point de la source electrospray. Cette avance technologique a permis lanalyse LC-MS de connatre un dveloppement important partir des annes 1990 ;10 dveloppement qui sest prcis grce lavnement de nouvelles mthodes de spectromtrie de masse impliquant lutilisation de dispositifs analytiques en tandem. La MS/MS ainsi nomme apporte, en plus de sa trs grande sensibilit, un pouvoir didentification et de confirmation.11,12 De nos jours, lanalyse de rsidus de pesticides en LC-MS est effectue principalement avec des sources ESI (Electrospray Ionization) et APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) et, plus rarement, en APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization). LESI et lAPCI nont cependant que rarement t compares13-18 et les rsultats ne sont pas unanimes en faveur de lune ou lautre des sources. En effet, si Titato et al. ont obtenu de meilleurs rsultats avec lAPCI sur une dizaine de pesticides,13 Fernandez et al. ont trouv une sensibilit quivalente entre ces deux sources sur cinq pesticides.14 Dun autre cot, Jansoon et al. ont constat une meilleure sensibilit en ESI sur une cinquantaine de pesticides avec un facteur pouvant atteindre 10 ou 20.15 En comparant ces deux sources sur 75 pesticides de diffrentes classes, Thurman et al. se sont aperus que lAPCI tait gnralement plus sensible mais que le dveloppement des conditions analytiques tait plus simple en ESI.16 En fait, il faut savoir que si la GC-MS sadresse plus particulirement aux composs apolaires et semi-polaires, volatils et semi volatils, la LC-MS/MS est plus adapte aux pesticides polaires et semi-polaires, non volatils et thermolabiles.19 En revanche, les avantages de la LC-MS/MS en termes de gamme de pesticides analysables, de sensibilit et de
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Introduction Gnrale
slectivit sont vidents, de mme que la capacit analyser une quantit plus importante de molcules au cours dune mme analyse.20 Etant donn le nombre consquent de substances actives concernes par notre tude et la diversit des proprits physico-chimiques, notamment en termes de polarit (Figure 1), la LC-MS/MS savre tre la technique la plus mme de rpondre notre problmatique.
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Figure 1.
Champs dapplication des sources dionisations de la LC-MS (ESI, APCI, APPI) et de la GC-MS en fonction de la polarit et de la masse de la molcule21
Concernant la prparation de lchantillon, les mthodes classiques dextraction des pesticides dans les matrices environnementales parmi lesquelles lextraction sur phase solide (SPE),22-25 lextraction avec liquide sous pression (PLE),26-28 ou encore la rcente mthode normalise QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)6,29-33 ne semblent pas adaptes lextraction des pesticides des huiles essentielles. En effet, contrairement aux matrices alimentaires, les huiles essentielles, en plus dtre caractrises par un milieu fortement apolaire, sont dj issues dun procd dextraction (principalement lhydrodistillation). Par consquent, les pesticides susceptibles de se retrouver dans ces extraits possdent certainement des proprits physico-chimiques proches des constituants de lhuile essentielle.34 Au vu du nombre et de la gamme de polarit des substances actives concernes, il apparat compliqu dtablir une mthode de prparation capable dextraire slectivement environ 300 pesticides, ou de purifier efficacement lextrait sans perdre de molcules dintrt. La mthode envisage est une dilution de lchantillon dhuile essentielle suivie dune injection directe en LC-MS/MS. Cette technique de dilution-injection a dj t applique avec succs pour lanalyse des pesticides dans leau potable.35 Elle ncessite cependant un systme LC-MS/MS moderne et performant. Dans ce contexte, il tait intressant de dvelopper une nouvelle mthode danalyse multirsidus dans les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la
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Introduction Gnrale
spectromtrie de masse en mode tandem. Cest pourquoi, le Groupement Interrgional de Recherche sur les Produits Agropharmaceutiques (GIRPA) a acquis un systme analytique compos dun spectromtre de masse 4000 QTrap (AB Sciex) coupl avec une chane HPLC Ultimate 3000 (Dionex) pour proposer la mise au point dune mthode danalyse orgininale applicable la dtection de pesticides dans diffrents types dhuiles essentielles. Au pralable, il fut ncessaire de raliser une tude bibliographique lie ces deux grands domaines industriels que sont la production et lutilisation dhuiles essentielles et de produits phytosanitaires. Etant gnralement peu associs dans les champs dapplication de lanalyse chimique, le rsultat de cette tude bibliographique est report dans un premier chapitre que relativement consquent du fait de la pluridisciplinarit des domaines concerns. Comme celui-ci a mis en vidence le besoin de disposer dune mthode analytique efficace pour le contrle des pesticides dans les huiles essentielles, le deuxime chapitre tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 sintresse aux aspects du couplage entre la chromatographie liquide et la spectromtrie de masse. Cette technologie sest avre tre la plus prometteuse pour le dveloppement de la mthode danalyse multi-rsidus. Notons que ce chapitre sintresse plus particulirement au principe de fonctionnement des sources electrospray et des analyseurs champs quadripolaire puisque cest ce type de dispositif qui a t utilis pour la prsente tude. Le troisime chapitre dcrit le dveloppement et la mise au point de la mthode danalyse multi-rsidus LC-ESI-MS/MS sur un spectromtre de masse 4000 QTrap. Il traite de loptimisation des paramtres de dtection en spectromtrie de masse, de loptimisation des conditions de sparation en chromatographie liquide et de lvaluation dun tout nouveau mode dacquisition : le Scheduled Selected Reaction Monitoring (sSRM). Ensuite, le chapitre quatre se focalise sur linfluence de la matrice dans la problmatique de lanalyse de pesticides dans les huiles essentielles. Aprs avoir dtermin la mthode de prparation des chantillons la plus adapte, ltude de deux huiles essentielles, celles de citron et de lavandin, a permis de mettre en vidence et de rsoudre les principaux problmes poss par ces matrices. Les conclusions de cette partie, associes la mthode instrumentale mise au point dans le troisime chapitre, ont permis denvisager une finalisation de ce travail en proposant un screening plus tendu de pesticides dans les huiles essentielles. Le but tant de proposer une mthode toujours plus sensible et plus fiable, les potentialits du couplage des modes dacquisition Selected Reaction Monitoring et Enhanced Product Ion (SRM-EPI) ont alors t testes pour la recherche de 250 pesticides dans les huiles essentielles.
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Chapitre I
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Etude Bibliographique Les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires
En moins dune dcnnie, les huiles essentielles sont devenues des produits incontournables du march de consommation avec des applications dans des domaines aussi varis que les industries pharmaceutiques et cosmtiques, lagroalimentaire, lagriculture ou encore les parfums dambiance et laromathrapie. Comme la majorit des cultures modernes, les vgtaux, dont sont extraites les huiles essentielles, sont soumis des traitements phytosanitaires. Leurs applications laissent supposer la prsence de rsidus de pesticides dans les huiles essentielles. Laugmentation des procupations en termes de sant publique implique un grand intrt envers les produits phytosanitaires. Cest pourquoi les laboratoires disposent de nombreuses mthodes analytiques afin de contrler, dans un cadre rglementaire, leurs teneurs dans diverses matrices (eau, sols, denres alimentaires). Aprs une prsentation gnrale des huiles essentielles et des produits phytosanitaires permettant de dfinir la problmatique, le lien entre ces formulations sera effectu au travers dun tat de lart des mthodes danalyse propres la dtection de pesticides dans les huiles essentielles.
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Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires
A) Les Huiles Essentielles

Le terme huile essentielle est une contraction de lexpression huile quintessentielle . Son origine provient de lide aristotlicienne selon laquelle la matire est constitue de quatre lments, savoir : le feu, lair, la terre et leau. Le cinquime lment, autrement nomm quintessence, tait alors considr comme tant lesprit ou la force vitale. Dans le pass, les anciens assimilaient la distillation et lvaporation, comme des procds permettant dextraire lesprit de la plante. Cette pense a travers les ges puisque, de nos jours, le terme spiritueux est utilis pour dsigner les boissons alcooliques distilles telles que le rhum, le whisky et les eaux de vie. Cette dernire qualification fait une fois de plus rfrence au concept dextraction de la force vitale de la plante. Au cours de la Renaissance, un mdecin rformateur suisse du nom de Philippus Theophrastus Aureolus Bombastus Von tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Hohenheim - dit Paracelse (1493-1541) - donna un sens particulier au terme huile essentielle. Sa thorie le dfinit comme le dernier extrait possible le plus sublime correspondant la Quinta Essentia , le principe actif du mdicament. Lisolation de cet extrait devrait tre, selon lui, le but de la pharmacie. Lhistoire des huiles essentielles commence cependant 2000 3000 ans avant cette poque. Chez les Egyptiens, lessence de trbenthine tait dj utilise et tout porte penser que certains parfums taient obtenus sous forme dhuiles distilles. Lart de la distillation, initi par les Egyptiens, Indiens et Perses, samliora grandement au cours du IXme sicle sous limpulsion des Arabes avec, notamment, le dveloppement de lalambic attribu Avicenne (980-1037). La science des huiles essentielles prit ensuite le large pour gagner lEurope au cours des croisades durant le XIIIme sicle. Le dveloppement des procds de production et des connaissances de ces extraits fut alors majoritairement men par des pharmaciens. Durant les sicles qui suivirent, les huiles essentielles taient principalement utilises pour leurs vertus thrapeutiques et ne ncessitaient quune production minime, ce qui nest plus le cas de nos jours. Les huiles essentielles font dsormais partie de notre quotidien, leurs utilisations stant gnralises dans de nombreux domaines, des industries pharmaceutiques et cosmtiques lagro-alimentaire, en passant par laromathrapie et les parfums dambiance, mais galement en agriculture o elles sont utilises en tant que pesticides naturels.
I.
Gnralits sur les huiles essentielles

Une huile essentielle ou essence se dcrit communment comme un mlange de composs
aromatiques extraits dune plante. Dun point de vue rglementaire, selon la pharmacope europenne, une huile essentielle est un produit odorant, gnralement de composition complexe, obtenu partir dune matire vgtale botaniquement dfinie, soit par entrainement la vapeur deau, soit par distillation sche, soit par un procd mcanique appropri sans chauffage. Lhuile essentielle est le plus souvent spare de la phase aqueuse par un procd physique nentranant pas de changement significatif de sa composition .36 Cette dfinition, base sur les procds dextraction, est restrictive et exclut aussi bien les produits obtenus par extraction laide de solvants (concrtes et absolues)37 que ceux obtenus par tout autre procd (extraction par fluide supercritique (SFE), extraction micro-ondes sans solvant tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 (SFME)). La rgne vgtal offre une grande diversit permettant dobtenir, aujourdhui, 3 000 huiles essentielles parmi lesquelles environ 300 sont importantes dun point de vue commercial. I.1 Le matriel vgtal dorigine
En pratique, les huiles essentielles sont principalement extraites de deux types de plantes : les hesprids ou agrumes (citron, orange, bergamote) et les plantes parfums aromatiques et mdicinales (PPAM). A priori, toutes les plantes possdent la facult de produire des composs volatils mais seulement ltat de traces le plus souvent. La capacit accumuler lhuile essentielle est cependant la proprit de certaines familles de plantes rparties au sein de lensemble du rgne vgtal, aussi bien reprsentes par la classe des gymnospermes Cupressaceae (bois de cdre, genivre) et Pinacea (pin et sapin) que celle des angiospermes ou plantes fleurs. Les familles les plus importantes sont les dicotyldones comme lApiacea (anise verte, coriandre), lAsteracea (camomille, absinthe), le Genraniaceae (granium), lIlliciaceae (anis toil), la Lamiaceae (menthe, lavande), la Lauraceae (camphre, cannelle), la Myristicaceae (noix), la Myrtaceae (eucalyptus, girofle), lOleacea (jasmin), la Rosacea (rose), la Sandatalacea (bois de santal) et bien sre les Rutacea (citron, orange, bergamote). Les monocotyldones sont principalement reprsentes par les familles Acoracea (jonc), Poacea (vtiver) et Zingiberaceae (gingembre et cardamome).1 Les quantits dhuiles essentielles produites par les plantes sont minimes, entranant des rendements dextraction extrmement faibles, gnralement infrieurs 2 %, mais pouvant
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atteindre 50 % dans le cas de lhuile essentielle de baume.38 Le rendement le plus faible est observ pour lhuile essentielle diris qui demande environ 4 kg de poudre diris pour obtenir 1 g dabsolue diris,38 ce qui explique le tarif exorbitant de cette huile dont le prix au kilogramme atteint les 120 000 $.1 Selon lespce considre, lhuile essentielle scrte par la plante est stocke dans divers organes tels que ceux illustrs dans la Figure 2.
Muscade (graine)
Gingembre (rhizome)
Eucalyptus (feuilles)
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Cannelle (corce) Figure 2.
Rose (fleurs)
Santal (bois)
Illustration des principaux organes vgtaux dont sont extraites les huiles essentielles
Ainsi, une huile essentielle peut tre extraite de racines (iris, vtiver), de bulbes (ail) ou de rhizomes (gingembre). Elle peut aussi tre issue de la tige (petits grains), du bois (rose, cdre, santal) ou encore de lcorce (cannelle). Les feuilles (eucalyptus, citronnelle), les bourgeons (pin), la sve (myrrhe) et mme les fleurs (ylang-ylang, rose), les fruits (orange) et les graines (muscade, anis) sont des sources dhuiles essentielles. Pour certaines huiles essentielles comme celles de lavande ou de sauge, cest la plante entire qui est utilise. Pour certaines plantes, lhuile essentielle peut tre extraite de plusieurs organes. Toutefois, si tous les organes dune mme espce peuvent renfermer une huile essentielle, sa composition peut admettre des variations importantes selon sa localisation. Des diffrences sont ainsi notes pour les huiles essentielles extraites du bourgeon et des feuilles du girofle,39 des feuilles et de la peau du pamplemousse40 ou bien des racines et des feuilles du persil.41 De mme, il est important de souligner que le profil chimique dune huile essentielle est directement reli la procdure dextraction employe.42 I.2 Mthodes dextraction
Parmi les mthodes dextraction disponibles, seuls deux procds permettent dobtenir des huiles essentielles conformes avec la pharmacope europenne. Il sagit de lexpression froid et de la distillation. Leurs principes, rsums dans ce qui suit, sont dcrits plus en dtails dans le Handbook des huiles essentielles.1 Bien quelles naboutissent pas des huiles
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essentielles au sens rglementaire, lextraction sans solvant assiste par micro-ondes et lextraction en fluide supercritique sont deux mthodes dextraction dont lutilisation se gnralise et quil convient donc de prsenter. Dun point de vue gnral, il est intressant de noter que les huiles essentielles notre disposition ne sont pas ncessairement identiques celles produites par les plantes. Aussi potique que soit lide quune huile essentielle puisse correspondre lesprit de la plante et donc tre une rplique exacte de ce qui est prsent dans le vgtal, elle nen demeure pas moins errone, du moins le plus souvent. Les huiles essentielles subissent gnralement des modifications de leur composition chimique lors du processus dextraction causes par la chaleur ou bien par leurs interactions avec leau. En fait, seules les huiles essentielles issues de lexpression froid nayant pas eu de contact avec le jus de fruit et protges de loxydation pourraient correspondre la vritable huile essentielle de la plante. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 I.2.1. Expression froid Applique exclusivement lextraction des huiles essentielles dagrumes, lexpression froid consiste rompre ou dilacrer les parois des sacs olifres contenus dans le msocarpe situ juste sous lcorce du fruit, lpicarpe (Figure 3).
Figure 3.
Photographie dune coupe transversale dun citron
Lhuile essentielle est galement prsente dans les cellules du jus de fruit en quantit beaucoup moins importante et avec une composition qui peut tre diffrente de celle contenue dans les cellules du msocarpe. Les huiles essentielles de citrus ont longtemps t extraites manuellement, la mcanisation et lindustrialisation de la technique dexpression froid ne stant effectues quau dbut du XXme sicle afin de diminuer les cots de production et damliorer les rendements pour faire face laugmentation de la demande. Les systmes rcents comme la Food Machinery Corporation-in-line (FMC) permettent dextraire le jus de fruit et lhuile essentielle de citrus de manire quasi-simultane sans contact des deux. Le principe de la FMC est illustr dans la Figure 4.
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Lame suprieure
Coupe infrieure
Tube passoire
Collecteur
Sortie
Figure 4.
Photographie dcrivant le principe de la FMC-in-line
Le procd consiste dabord amener et fixer le fruit sur une coupe quipe de lames. Une seconde coupe, quivalente la premire, vient alors se fixer au fruit de manire lenfermer. Au mme moment, un couteau circulaire creuse un trou la base du fruit. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Lapplication dune pression sur les parois du fruit entrane lextraction du jus qui va tre transport jusquau collecteur pendant que lhuile est extraite de la peau et collecte laide dun jet deau. Lmulsion eau-huile est ensuite spare par centrifugation. Cette technique prsente lavantage de pouvoir tre couple avec la production du jus de fruit qui constitue le produit commercial le plus important. Cest pourquoi lexpression froid est la mthode de choix pour extraire les huiles essentielles de citrus, dautant que la distillation nest pas une technique trs approprie. En effet, la distillation produit des huiles essentielles de moindre qualit principalement due au fait dune prsence importante daldhydes, composs sensibles loxydation et la chaleur. Pour les autres vgtaux, la distillation leau (hydrodistillation) ou par entranement la vapeur deau reste, sans aucun doute, la mthode la plus frquente.1 I.2.2. Distillation La mthode dextraction des huiles essentielles la plus simple est lhydrodistillation (Figure 5).
Figure 5.
Reprsentation schmatique du principe dhydrodistillation traditionnelle
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Elle consiste immerger la matire premire vgtale dans un bain deau mis bullition. Les composs volatils contenus dans les cellules diffusent travers les parois cellulaires (hydrodiffusion) sous laction physique quexerce le gonflement de la matire vgtale (phnomnes dabsorption deau ou osmotique), via la pression interne et laction chimique de leau. Une fois diffuse en dehors des cellules, lhuile forme avec leau un systme liquidevapeur. La non-miscibilit des deux liquides confre au mlange la proprit davoir une temprature dbullition infrieure aux tempratures dbullition des deux liquides purs. Cette caractristique explique la volatilisation des composs des huiles essentielles une temprature denviron 100C. Une fois vaporiss, les composs sont transports par le flux de vapeur deau refroidi plus loin et condens dans un essencier ou un vase florentin. Lors de la dcantation, la diffrence de densit entre leau et les composs aromatiques entrane la formation dune phase aqueuse et dune phase organique : lhuile essentielle. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Cependant, le contact direct des constituants de lhuile essentielle avec leau occasionne des ractions chimiques conduisant des changements dans la composition finale de lextrait. Une attention particulire doit, notamment, tre porte sur les huiles essentielles riches en esters (cas de la lavande et du lavandin) dont lhydrolyse conduit la formation dalcools et dacides. Pour viter ce type de ractions, la matire premire peut tre spare de leau dans la mme enceinte laide dune grille, dun panier ou, prfrentiellement, dans un rservoir diffrent ; cest la distillation par entranement la vapeur deau (Figure 6).
a)
Vapeur deau charge en HE
Vapeur deau
b)
Eau chaude
Eau froide
chaleur
Plante aromatique
Essencier
Figure 6.
Reprsentation schmatique du principe de la distillation par entrainement la vapeur deau o le matriel vgtal est spar de leau, a) laide dun panier dans la mme enceinte, b) dans un rservoir diffrent.
Les conditions opratoires et, notamment, la dure de distillation ont une influence considrable sur le rendement et la composition de lhuile essentielle. Cest pourquoi sont dvelopps, aujourdhui, des modles mathmatiques qui permettent doptimiser au mieux ces conditions afin de produire des huiles essentielles de manire reproductible.43,44 Une amlioration significative de la dure de distillation peut tre obtenue par une macration du
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matriel vgtal dans un bain dultrasons pralablement la distillation,45 ou bien avec lutilisation assiste de micro-ondes.46,47 I.2.3. Extraction micro-ondes sans solvant (SFME) Lemploi des micro-ondes constitue, par ailleurs, une mthode dextraction part entire en plein dveloppement. La SFME est une combinaison originale des techniques de chauffage par micro-ondes et de distillation sche.48 Elle consiste placer le matriel vgtal dans un racteur au sein dun four micro-ondes sans ajout deau ou de solvant (Figure 7).
Rfrigrant
Huile essentielle Phase aqueuse Systme deau reflux
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Four micro-ondes Racteur Matriel vgtal
Figure 7.
Description schmatique du systme dextraction micro-ondes sans solvant48
Le chauffage interne de leau contenue dans la plante permet den dilater ses cellules et conduit la rupture des glandes et des rcipients olifres. Lhuile essentielle ainsi libre est vapore avec leau de la plante. Un systme rfrigrant situ lextrieur du four microondes permet la condensation du distillat en continu. Lexcs deau est rintroduit dans le racteur de manire restaurer la quantit deau initialement prsente dans la plante. Compare lhydrodistillation traditionnelle, la SFME se caractrise par une diminution de la consommation nergtique et des rejets en CO2 mais, surtout, par un temps dextraction de lordre de 9 fois plus rapide.48 Dans le cas de lextraction dhuiles essentielles provenant de plantes sches, il est possible dajouter de la poudre de carbonyl de fer (CIP : Carbonyl Iron Powder) qui possde la proprit de trs bien absorber les micro-ondes.49 Les huiles essentielles issues de ce procd sont composes dun taux plus important de composs oxygns, de valeurs odorantes plus significatives que les monoterpnes qui sont prsents en moindre quantit.48 I.2.4. Extraction par fluide supercritique (SFE) Loriginalit de la technique dextraction par fluide supercritique, dite SFE, provient de lutilisation de solvants dans leur tat supercritique, c'est--dire dans des conditions de
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tempratures et de pressions o le solvant se trouve dans un tat intermdiaire aux phases liquide et gazeuse et prsente des proprits physico-chimiques diffrentes, notamment un pouvoir de solvatation considrablement accru. Si, en pratique, de nombreux solvants peuvent tre employs, 90 % des SFE sont ralises avec le dioxyde de carbone, principalement pour des raisons pratiques.50 En plus de sa facilit dobtention due ses pression et temprature critiques relativement basses, respectivement 74 bars et 31 C, le CO2 est relativement nontoxique, ininflammable, disponible haute puret et faible prix et il possde lavantage dtre limin aisment de lextrait.50 Leau peut constituer un solvant alternatif au CO2, par exemple dans le cas de lextraction de lhuile essentielle de fenouil.51 Mais, son utilisation est relativement limite due ses conditions dobtention dlicates (T = 374 C ; P = 221 bars) et la nature corrosive de leau.50 Gnralement, la matire premire est dispose en un lit fixe dans une enceinte tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dextraction (extracteur). Le flux de solvant supercritique est aliment, en continu ou non, laide dune pompe haute pression dbit fixe.52 La sparation entre le solvant et le solut pour obtenir lextrait est ralise par simple dtente (diminution de la pression) qui ramne le solvant ltat gazeux et fait prcipiter le solut ; cette tape peut tre effectue en plusieurs temps. Les systmes industriels permettent un recyclage du CO2 (Figure 8).
Figure 8.
Reprsentation schmatique du principe SFE
La SFE est une technique dite verte utilisant pas ou peu de solvant organique et prsentant lavantage dtre bien plus rapide que les mthodes traditionnelles, en offrant galement la possibilit de manipuler la composition de lextrait. Les compositions chimiques des huiles essentielles ainsi obtenues peuvent prsenter des diffrences qualitatives53 et quantitatives54 avec celles issues de lhydrodistillation. I.2.5. Conclusion Lextraction des huiles essentielles de la matire vgtale peut tre ralise au moyen de plusieurs procds, bass sur des techniques anciennes : lexpression froid,
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lhydrodistillation et lentrainement la vapeur deau, ou plus rcentes : extraction micro-
ondes sans solvant (SFME) et extraction par fluide supercritique (SFE). Ces dernires, bien que prsentant de nombreux avantages, notamment celui de rduire considrablement le temps dextraction, ne sont pas, pour linstant, reconnues par la pharmacope. En effet, la composition des huiles essentielles obtenues avec ces techniques peuvent tre sensiblement diffrentes des huiles essentielles issues de la distillation qui reste la mthode de rfrence. Cependant, quel que soit le procd utilis, lextrait final correspond une concentration des composs initialement prsents dans la matire premire. De plus, les mthodes de production tout comme lorigine gographique, le climat, le sol, la priode de rcolte ou bien encore les pratiques agriculturales, peuvent avoir une influence directe sur la composition chimique dune huile essentielle.1 I.3 tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Composition Chimique
Dun point de vue gnral, une huile essentielle se dfinit chimiquement comme un mlange complexe constitu denviron 20-60 composs des concentrations diffrentes appartenant majoritairement deux groupes. Il sagit des terpnes et terpnodes, reprsentant la classe la plus importante et des composs aromatiques et aliphatiques qui sont, tous, des composs de faible poids molculaire.55 I.3.1. Les terpnes et terpnodes Les terpnes forment un groupe de produits naturels largement reprsents et dun intrt chimique considrable. Bien que de structures trs diverses, les terpnes ont un caractre commun : ils sont tous forms par la runion dunits isoprniques (Schma 1).
Schma 1.
Formule de lisoprne (C5H6)
Une classification rationnelle est base sur le nombre dunits isoprniques quils renferment. On dfinit alors les hmiterpnes (1 unit C5), les monoterpnes (2 units : C10), les sesquiterpnes (3 units : C15), les diterpnes (4 units : C20), les sesterpnes (5 units : C25), les triterpnes (6 units : C30), les carotnes (8 units : C40) et les polyisoprnes (n units : C5n). Un terpne qui possde un oxygne est un terpnode. A noter que le terme terpne, anciennement employ pour caractriser lensemble de la classe des terpnodes, a une dfinition aujourdhui plus restreinte et ne sadresse quaux (mono)-terpnodes
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hydrocarbons.1 Dans le cas des huiles essentielles, seuls sont rencontrs les terpnodes les plus volatils, c'est--dire ceux dont la masse molculaire nest pas trop leve, principalement les mono- et sesquiterpnodes et, beaucoup plus rarement, les diterpnodes. Les monoterpnodes reprsentent eux seuls environ 90 % des huiles essentielles.55
Les terpnodes se caractrisent par une grande varit de structures dont certaines sont regroupes dans le Schma 2 :
Ocimne
-terpinne
-pinne
(+)-menthol
R-carvone
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Citronellal
Actate de linalyle
Eucalyptol
Ascaridole
Thymol
Farnsole Schma 2.
Patchoulol
-caryophyllne
Reprsentation de molcules caractristiques des diffrentes structures rencontres chez les mono- et sesquiterpnodes
Ces structures diffrent par : le nombre de carbones qui les constituent :

C10 : monoterpnes, C15 : sesquiterpnes, C20 : diterpnes.
le caractre satur ou insatur des liaisons ; lagencement linaire (ocimne), monocyclique ( -terpinne) ou bicyclique (pinne) des atomes ; la configuration spatiale (forme de chaise, bateau) ; la nature du groupe fonctionnel :
Alcne : CH2=CH2, Alcool R-OH (menthol), Ctone : R1-CO-R2 (carvone), Aldhyde : R-COH (citronellal), Ester : R1-COO-R2 (acetate de linalyl), Ether : R1-O-R2 (eucalyptol), Proxide : R1-O-O-R2 (ascaridol), Phnol : C6H6-OH (thymol).
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Si les composs terpniques sont les constituants majoritaires des huiles essentielles, les molcules aromatiques nen demeurent pas moins des composs importants, lexemple du cinnamaldhyde qui reprsente environ 75 % de lhuile essentielle de cannelle.38 I.3.2. Les composs aromatiques Les composs aromatiques des huiles essentielles sont principalement des drivs du phnylpropane C6-C3 (Schma 3), parmi lesquels se trouvent des aldhydes
(cinnamaldhyde), des alcools (alcool cinnamique), des phnols (chavicol, eugenol), des drivs mthoxy (anethol, estragol) ou methylne dioxy (myristicine, safrol).37
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Cinnamaldhyde Schma 3.
Alcool cinnamique
Eugenol
Anthole
Safrol
Exemples de composs aromatiques C6-C3 caractristiques des huiles essentielles
Il est cependant possible de rencontrer des C6-C1, comme la vanilline et lanthranilate de mthyl (Schma 4), ainsi que des lactones qui proviennent des coumarines, ces dernires tant effectivement entranables par la vapeur deau.37
Vanilline Schma 4.
Anthranilate de methyle
Exemples de composs aromatiques C6-C1rencontrs dans les huiles essentielles
Outre les terpnodes et les composs aromatiques, les huiles essentielles sont galement constitues de nombreuses molcules dorigines diverses. Il sagit, pour la plupart, de produits de dgradation dacide gras et de terpnes. Si la concentration de ces composs est gnralement trs faible, ils peuvent cependant avoir une influence considrable lexemple de la -damascenone et la -ionone. Ces deux molcules, issues de la dgradation des terpnes, ne reprsentent respectivement que 0,14 % et 0,04 % de lhuile essentielle de rose (rosa damascena). Ils sont pourtant les contributeurs majoritaires de lodeur de cette huile.56
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I.3.3. Conclusion Gnralement, les huiles essentielles sont constitues par deux ou trois composs majoritaires, reprsentant entre 20 et 70 % de lextrait, comme le montre le Tableau 1 pour les huiles essentielles de bergamote, lavandin grosso, citron, eucalyptus et menthe poivre. Les autres molcules, qui peuvent tre trs nombreuses, ne sont prsentes qu ltat de traces.
Huile essentielle Bergamote Composs majoritaires Limonne (33-42 %) Actate de linalyl (23-35 %) Linalol (6-15 %) -terpinne (6-10 %) Actate de linalyl (28-38 %) Linalol (24-35 %) Limonne (54-80 %) Pipritone (40-50 %) -phellandrne (20-40 %) (-)-menthol (25-40 %) (-) menthone (5-25 %)
Lavandin grosso Citron Eucalyptus
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Menthe poivre
Tableau 1.
Liste non exhaustive des composs majoritaires de quelques huiles essentielles daprs J.Garnero38
La composition chimique particulire des huiles essentielles leur confre, outre leurs proprits physico-chimiques, deux caractristiques intressantes, savoir : un pouvoir odorant et aromatisant et des proprits antimicrobiennes. Si la richesse en composs volatils explique leurs caractristiques odorantes,57 il semblerait que leurs activits antimicrobiennes soient issues principalement des phnols.58 Ces deux spcificits, aux intrts conomiques considrables, sont lorigine de lengouement actuel pour ces extraits.
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II. Les huiles essentielles : le march et le contrle analytique

Le march des huiles essentielles est en pleine croissance et gnre actuellement plusieurs milliards de dollars chaque anne, le prix dune huile essentielle se ngociant entre 1,80 $/kg pour celle dorange 120 000 $/kg pour celle diris. Parmi les 300 000 espces de plantes estimes, environ 10 % contiennent des huiles essentielles. Chaque continent et rgion possde sa propre flore et donc une production dhuiles essentielles caractristiques. En revanche, si lensemble des pays du globe participent la production dhuile essentielle (Annexe 1), ce march est essentiellement domin par cinq pays (Figure 9).
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Figure 9.
Diagramme illustrant la rpartition mondiale de la production dhuile essentielle par pays en 2008 1
En 2008, le Brsil et lInde se partageaient la moiti de ce march avec des productions respectives de 28,6 % et 25,6 %. Suivent ensuite pour un tiers du march les Etats-Unis, la Chine et lArgentine avec des productions atteignant respectivement 16,8 %, 9,0 % et 4,9 %. Neuf pays avec des productions internes entre 0,1 et 2 % (France : 1 %) psent pour 10 % dans le march. Enfin, les derniers 10 % se rpartissent entre les autres pays du monde avec une production individuelle infrieure 0,1 %. Les huiles essentielles dominant le march en termes de quantit produite sont celles dorange (51 000 t), de menthe poivre (32 000 t) et de citron (9 200 t). Lhuile essentielle de lavandin grosso, principalement produite en France, occupe le 12me rang avec une production annuelle de 1 100 t.59 Limportance et le dveloppement du march des huiles essentielles sexpliquent par le nombre et la diversit des domaines dapplication de ces extraits. Ils induisent aussi la ncessit de proposer des mthodes de contrle analytique garantissant leurs caractristiques.
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II.1 Les domaines dapplication La composition chimique des huiles essentielles confre ces extraits aussi bien des proprits odorantes et aromatiques quantimicrobiennes. Ces caractristiques offrent des dbouchs importants dans de nombreux domaines industriels, que ce soit dans lindustrie cosmtique, les secteurs de la sant, de lagro-alimentaire ou de lagriculture. II.1.1. Parfums et Cosmtiques Dans le domaine des parfums et cosmtiques, les huiles essentielles sont employes en tant quagents conservateurs grce leurs proprits antimicrobiennes qui permettent daugmenter la dure de conservation du produit. Cependant, cest surtout pour leurs caractristiques odorantes quelles sont utilises, notamment dans la formulation de parfums, de produits dentretien personnels ou mnagers.60 Pour constater lampleur de leur utilisation tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dans ce march, il suffit dtudier, chez soi, la composition des produits de consommation courante tels que les shampooings, savons, eaux de toilette, liquides vaisselle ou nettoyants de surface. A noter que le terme huile essentielle nest pas employ ; le Code de la sant publique (article R.5131-4 8) impose, en effet, les mots aroma ou parfum ( fragrance en anglais) qui englobent lensemble des compositions aromatiques ou parfumantes et leurs matires premires.61 En plus des huiles essentielles, il peut sagir de concrtes, dabsolues, mais galement dun ou plusieurs constituants extraits dune huile essentielle, comme le limonne. Toutefois, dans le cas o la substance utilise fait partie de la liste des 26 molcules identifies comme tant susceptibles dentraner des ractions allergiques telles que le citral, le graniol ou linalol (Annexe 2), sa dnomination (chimique, nCAS, IUPAC) doit tre inscrite parmi la liste des ingrdients. II.1.2. Sant : pharmacie et aromathrapie Les vertus thrapeutiques des PPAM et des huiles essentielles sont connues et utilises depuis trs longtemps, notamment en Asie o ces produits naturels constituent la base de la mdecine traditionnelle. Il est donc logique de retrouver les huiles essentielles dans le domaine de la sant avec des applications pharmaceutiques et aromathrapiques. En pharmacie, les huiles essentielles sont majoritairement destines laromatisation des formes mdicamenteuses et la production dantiseptiques.37 Le potentiel thrapeutique des huiles essentielles dpasse, cependant, ce cadre et fait lobjet de nombreuses recherches synthtises en 2007 par Edris.62 Ce travail met en vidence les bienfaits des huiles essentielles et de leurs
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constituants volatils dans le traitement du cancer et des problmes cardiovasculaires. De mme, leurs proprits antibactriennes et antivirales trouvent de nombreuses applications dans la lutte contre les infections bactriennes et virales, en particulier dans le milieu hospitalier. De possibles applications dans la lutte contre le stress oxydatif, le diabte, sont galement exposes.62 Enfin, la proprit des huiles essentielles pntrer aisment dans la peau (principalement due aux terpnes) permettrait de faciliter ladministration des mdicaments par voie transdermique.62 Si les huiles essentielles trouvent des applications importantes dans la mdecine dite conventionnelle ou scientifique, leurs bienfaits constituent la base dun autre domaine de la sant qui se rapproche plus de la mdecine traditionnelle : laromathrapie. Dun point de vue tymologique, laromathrapie se dfinit (tym : latin aroma , grec - arma = arme, aromate ; grec - therapeia = soin, cure) comme tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 tant le soin du corps par des extraits aromatiques de plantes, ce qui la diffrencie de la phytothrapie qui fait usage de l'ensemble des lments d'une plante. En fait, la dfinition de ce terme invent dans les annes 1920 par Ren-Maurice GATTEFOSSSE, considr comme le pre de laromathrapie, prte discussion. Selon les auteurs, laromathrapie correspond lutilisation des odeurs et des substances volatiles pour soigner, attnuer ou prvenir les infections et les indispositions uniquement par le moyen dinhalation.63 Pour dautres, lutilisation des huiles essentielles se fait par application sur la peau au travers de massages.64 Quoiquil en soit, le march de laromathrapie et de ses drivs est en pleine expansion, notamment travers le dveloppement de salons de massages, de bien-tre et douvrages consacrs cet art. Cette pratique a dailleurs tendance sindividualiser travers la publication de guides ou manuels dutilisation des huiles essentielles rfrenant lensemble des vertus de ces extraits, ainsi que des diverses mthodes de prparation pour les mettre en pratique chez soi. II.1.3. Agro-alimentaire Lensemble des secteurs de lagro-alimentaire sont consommateurs dhuiles essentielles : alcools, boissons non alcoolises, confiserie, produits laitiers, produits carns, sauces, soupes, snacks, produits de boulangerie mais galement la nutrition animale.37 Les huiles essentielles ou leurs isolats sont employs aussi bien pour leurs proprits antibactriennes quaromatisantes. Les premires permettent aux huiles essentielles de jouer le rle de conservateurs alimentaires.65,66 Cette application, dj bien dveloppe se renforce ces dernires annes grce des dcisions de scurit importante ; par exemple la
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recommandation portant sur la rduction du sel dans les aliments pour limiter les problmes cardio-vasculaires et prconise par la World Health Organisation (WHO) en 2002.67 Ceci engage les industriels trouver des additifs de substitution permettant dassurer la scurit alimentaire.65 De plus, la tendance actuelle consommer du naturel ainsi quun dveloppement du got de lexotisme de la part de la population poussent les industriels utiliser de plus en plus les huiles essentielles en temps quadditifs aromatisants. Ce retour au naturel est li une prise de conscience gnrale tourne vers la protection de lenvironnement avec, entre autres, la rduction de la consommation en produits phytosanitaires de synthse et le dveloppement de lagriculture biologique. Dans ce contexte, les huiles essentielles constituent, une fois de plus, une voie dintrt et de recherche. II.1.4. Agriculture tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 La volont de rduire lutilisation des pesticides de synthse dans lagriculture moderne sest affermie ces dernires annes, notamment en France avec lintervention des politiques. Le Grenelle de lEnvironnement est un bon exemple de la prise de conscience environnementale de la part des politiques et de la population en gnral. Cette organisation runit des membres issus du monde politique et de la socit civile, dont le but est dtablir une feuille de route en faveur de lcologie, du dveloppement et de lamnagement durables. Concernant les pesticides, lun des projets de loi vise rduire la consommation en produits phytosanitaires de 50 % en dix ans, lchance tant 2018.68 Dans ce contexte environnemental, les pesticides naturels bass, notamment, sur les huiles essentielles reprsentent une alternative intressante pour la protection des cultures contre les insectes mais galement contre les adventices et les champignons.69-71 Outre leurs activits biologiques, les huiles essentielles prsentent dautres caractristiques qui en font des produits adapts dans la lutte contre les nuisibles.72 Parmi celles-ci, on peut citer : leur prix faible et approvisionnement assurs par une production mondiale importante pour de nombreuses huiles essentielles ; leurs multiples modes et sites daction sur les insectes ; leur faible toxicit pour les mammifres ( quelques rares exceptions prs) ; leur faible persistance dans lenvironnement due leur volatilit (temps de demi-vie en extrieur < 24 h sur les surfaces, dans les sols ou leau).
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II.1.5. Conclusion Les huiles essentielles sont devenues, ces dernires annes, une matire dimportance conomique considrable, avec un march en constante croissance dont les domaines dapplication sont directement lis la consommation humaine. Cest pourquoi, ces extraits font lobjet de nombreuses analyses dont les objectifs principaux sont la caractrisation des substances composant lhuile essentielle ou la dcouverte de nouvelles molcules, mais galement le contrle qualit et la recherche dadultration dans un milieu o la fraude est tentante, notamment cause des enjeux conomiques. II.2 Le contrle analytique des huiles essentielles Les huiles essentielles doivent rpondre des caractristiques imposes par les lois des tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 pays producteurs et exportateurs et par les pays importateurs. Ces critres sont dfinis dans des normes internationales ISO (International Organisation for Standardization) ou franaises AFNOR (Association Franaise de Normalisation). Ainsi sont contrles les proprits organoleptiques et physiques telles que la coloration, lodeur, la rfraction, la solubilit, le point clair mais galement les proprits chimiques telles que les indices dacides et desters. La meilleure carte didentit qualitative et quantitative dune huile essentielle reste cependant son profil chromatographique ralis en chromatographie en phase gazeuse, mme si dautres techniques alternatives sont utilises. En effet, malgr les importantes innovations instrumentales ralises ces dernires annes, la dtection de tous les constituants dune huile essentielle reste une tche extrmement difficile qui ncessite souvent lemploi de plusieurs techniques analytiques complmentaires. II.2.1. Analyse conventionnelle par chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse est une technique parfaitement adapte lanalyse des huiles essentielles au vu de leur composition chimique, caractrise principalement par la prsence de molcules volatiles. Les analyses peuvent tre ralises sur colonnes remplies (NF T75-400)73 ou sur colonnes capillaires (NF T75-401)74 de polarits diverses. Les dtecteurs utiliss sont gnralement des dtecteurs ionisation de flamme (FID) ou conductivit thermique (TCD) et ne fournissent pas dinformations structurales. Lattribution des pics seffectue alors grce au systme dindices de rtention. Il se base sur le fait que la position de chaque pic danalyte est encadre par le temps de rtention de deux alcanes linaires (n-alcanes) aux nombres de carbones successifs. Les indices de rtention sont
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calculs partir du modle de Kovats75 pour des analyses en conditions isothermes76 et du modle de Dool et Kratz77 pour des analyses utilisant la programmation de temprature.78 Pharmacopes et normes renseignent, la fois, sur le chromatogramme type de lhuile essentielle obtenu en GC qui est purement informatif (Figure 10) et sur son profil chromatographique qui, lui, est normatif (Tableau 2).
-Thuyne -Pinne 3. Sabinne -pinne 5. Myrcne 6. p-Cymne 7. Limonne -Terpinne
10. 11. 12. 13.
-Terpineol Nral Granial Actate de nryl Actate de granyle -Caryophyllne -Bergamotne Bisabolne
Figure 10.
Chromatogramme type de lhuile essentielle de citron [Citrus Lmon (L.)Burm.f.]79 Type amricain Type ctier Type dsertique Min Max Min Max (%) (%) (%) (%)
0,2 1,5 1,5 9,0 0,05 63,0 8,3 0,10 0,6 1,0 0,45 0,35 0,20 0,5 2,5 2,5 14 0,35 70,0 9,5 0,25 0,9 2,0 0,9 0,60 0,50 0,2 1,4 1,3 10,0 0,01 70,0 6,5 0,06 0,3 0,5 0,4 0,30 0,10 0,5 2,5 2,5 13,0 0,35 80,0 8,0 0,15 0,3 0,9 0,7 0,50 0,30
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Constituants
-Thuyne -Pinne Sabinne -Pinne p-Cymne Limonne -Terpinne -Terpineol Nral Granial -Bisabolne Actate de nryle Actate de granyl
Type mditerranen Espagne Italie Min Max Min Max (%) (%) (%) (%)
0,2 1,5 1,5 10,0 traces 60,0 8,0 0,09 0,4 0,6 0,45 0,30 0,20 0,5 3,0 2,5 16,5 0,40 70,0 12,0 0,35 1,0 2,0 0,9 0,60 0,65 0,2 1,5 1,5 10,0 0,05 60,0 8,0 0,10 0,6 0,8 0,45 0,20 0,30 0,5 3,0 2,5 16,5 0,35 68,0 12,0 0,30 1,2 2,0 0,9 0,50 0,65
Type Equatorial Cte dIvoire, Brsil Min Max (%) (%)

0,2 1,4 1,4 7,0 0,05 59,0 6,0 0,00 0,2 0,5 0,2 0,10 traces 0,5 3,0 3,0 16,0 0,35 75,0 12,0 0,40 1,2 2,0 0,9 0,50 0,30
Tableau 2.
Profil chromatographique de lhuile essentielle de citron [Citrus Lmon (L.)Burm.f.]79
Le profil chromatographique dune huile essentielle correspond la liste de ses constituants slectionns parmi ceux qui sont reprsentatifs et caractristiques. Cette liste est accompagne des limites de concentration des constituants et ventuellement des rapports entre leurs concentrations. La qualit de lidentification peut tre amliore considrablement par lapport dun couplage de la chromatographie gazeuse avec la spectromtrie de masse. La combinaison de ces deux techniques permet la sparation et lidentification de molcules dans des mlanges complexes.
La spectromtrie de masse consiste produire des ions en phases gazeuses, intacts ou dissocis en les sparant en fonction de leur rapport masse sur nombre de charge (m/z). La technique dionisation principalement utilise dans lanalyse des huiles essentielles est
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lionisation lectronique (EI) qui permet dobtenir des spectres de masses caractristiques de la molcule avec un nombre important de fragments. Lionisation chimique (CI), technique dionisation plus douce et complmentaire de lEI, est galement employe pour accder dautres informations spectrales, notamment lobservation du pic molculaire parfois absent des spectres obtenus en EI. En fonction du gaz ionisant utilis, la CI permet de diffrencier divers isomres pinaniques80 ou de dterminer la position de la double liaison dans des molcules diniques conjugues.81 Si la complmentarit des techniques dionisation peut tre utile pour lidentification de molcules, lassociation de plusieurs analyseurs de masse en srie apporte galement une aide prcieuse. En effet, bien que la GC-MS soit adapte lanalyse de mlanges complexes, il nest pas rare quun seul pic chromatographique contienne plusieurs composs (co-lution), ce qui complique dautant le spectre de masse correspondant. La spectromtrie de masse en tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 tandem ou MS/MS est alors une technique de choix qui permet danalyser, sparment, les composs contenus dans ces pics et de dterminer leur structure grce leur fragmentation spcifique, par exemple dans le cas complexe de lhuile essentielle de vtiver.82 II.2.2. Les techniques chromatographiques avances Un point important dans le cadre danalyse de routine concerne la dure danalyse qui a un impact direct sur son cot. Classiquement, la dure de sparation des composs dune huile essentielle par GC ralise sur une colonne capillaire standard (30 m 0,25 mm 0,25 m) est de 40 50 minutes. La mise au point de colonnes de taille rduite permet dsormais de faire de la Fast-GC et ainsi de rduire considrablement la dure danalyse. Lemploi de ce type de colonne (10 m 0,1 mm 0,1 m) dans le cadre danalyse dhuiles essentielles de citrus par GC-FID83 et de menthe poivre par GC-MS,84 a permis de diminuer le temps danalyse respectivement dun facteur 5 et 10, tout en conservant des donnes de qualits analytiques similaires (largeur de pic, rsolution, slectivit, reproductibilit).83 Cependant, ni la sparation chromatographique sur colonne apolaire, ni la spectromtrie de masse en EI ne permettent de distinguer des molcules nantiomres dont les huiles essentielles sont gnralement pourvues. Ces molcules, de mme formule brute, ne se distinguent que par leur organisation spatiale et prsentent donc, non seulement des proprits physico-chimiques similaires, mais galement des spectres de masse identiques. La caractrisation de ces molcules dans les huiles essentielles est ralise par chromatographie gazeuse nantioslective (GC-Es)85 qui utilise des phases stationnaires chirales base de drivs de cyclodextrines (CD).86 De mme
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que pour la GC classique, le dveloppement de colonnes adaptes la Fast-GC87 permet dsormais de rduire considrablement le temps danalyse.88 Larrive de la chromatographie en phase gazeuse multidimensionnelle (MDGC) permet dsormais deffectuer les deux types de sparations dcrites ci-dessus en une analyse unique. Le principe consiste slectionner les fractions dintrt laide dune premire colonne chromatographique (relie un premier dtecteur) afin de les diriger vers une seconde colonne de polarit diffrente (relie un second dtecteur).89 En combinant deux colonnes capillaires, apolaire et chirale, de taille similaire (30 m 0,32 mm 0,40-0,45 m / 25 m 0,25 mm 0,25 m), Mondello et al. ont pu dterminer la distribution nantiomrique en monoterpernes et terpnodes alcooliss des huiles essentielles de citron,90 citron vert91 et mandarine (Figure 11).92 tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 11.
Chromatogrammes issus dune sparation en phase gazeuse des constituants dhuile essentielle de mandarine A) chiral MEGADEXDETTBS des composs transfrs en GC-GC 92
obtenu avec la colonne SE-52 B) obtenu avec la colonne SE-52 avec 5 fractions coupes C) obtenu avec la colonne
Toutefois, une telle configuration ne permet dobtenir une analyse 2D que pour quelques rgions du chromatogramme. Pour atteindre une caractrisation complte dun chantillon en
2
D, une approche dtaille telle que la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle
(GCGC) ou comprhensive GC doit tre utilise.
La GCGC peut tre dfinie comme une sparation orthogonale sur deux colonnes, avec un transfert complet des soluts issus du premier systme de sparation (colonne 1) dans le deuxime systme de sparation (colonne 2), de telle sorte que les performances de chaque systme de sparation soit prserves .93 Diverses combinaisons de colonnes de slectivits
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diffrentes peuvent tre envisages en fonction de lobjectif de lanalyse. Dans le cadre de la caractrisation complte des constituants dune huile essentielle, la combinaison retenue est gnralement une colonne apolaire (95 % Dimethylpolysiloxane/5 % Diphenyl) suivie dune colonne polaire (PEG). Lemploi de cette technique a permis la dtection de 203 composs dans lhuile essentielle de lavande dont le chromatogramme 2D est prsent en Figure 12.94
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 12.
Chromatogramme 1D (A) et 2D (B) dune huile essentielle de lavande94
Le chromatogramme 2D permet de dtecter de nombreux composs non rsolus dans la premire dimension lexemple des composs minoritaire Z et majoritaire Y. Ce profil permet galement de dfinir des rgions chimiques M (Monoterpnes) et S (Sesquiterpnes). II.2.3. Le couplage entre les chromatographies gazeuse et liquide La chromatographie en phase gazeuse, sous toutes ses dclinaisons couvre la grande majorit des analyses dhuiles essentielles. Cependant, la chromatographie en phase liquide prsente galement quelques applications dans ce domaine. Elles sont gnralement limites lanalyse de certaines fractions ou classes de composs particuliers, par exemple la dtermination des composs oxygns (coumarines, flavonodes) prsents dans la fraction non volatile des huiles essentielles dhesprids.95-98 Elle permet galement, dans certains cas, didentifier des composs inconnus non dtectables par GC.99 A limage de la GC, la sparation LC peut tre conduite en 2D (LCLC). La mise en place dune sparation orthogonale faisant intervenir la chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) et phase normale (NPLC) nest cependant pas aise. Les difficults proviennent de la non miscibilit des phases mobiles utilises dans ces deux modes et de leur diffrence de force luante.100 Nanmoins, cette technique a pu tre applique avec succs pour analyser les
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composs oxygns dans lhuile essentielle de citron101 et les carotnodes dans celle dorange sanguine.102 Les performances sparatives uniques des techniques de GC et LC peuvent tre associes travers leur couplage en ligne.103 Ce couplage a dmontr son utilit pour lidentification de terpnes,104 la qualification dexcs nantiomrique,105 mais aussi dans la dtermination de composs inconnus dune huile essentielle trs complexe, celle de nroli.106 II.2.4. Les principaux dtecteurs Les dtecteurs classiquement utiliss sont le FID83,90,91,94,99,106-109 pour la GC et le spectromtre UV pour lHPLC.95-97,101 Le couplage avec la spectromtrie de masse est gnralement ralis avec un simple quadriple.76,82-84,88,93,96,97,99,108,110,111 Le TOF (Time of Flight),112 le triple quadriple (QqQ),82 le QTOF,113 ainsi que la LTQ-Orbitrap99 sont tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 galement employs. Lutilisation du secteur magntique est restreinte lanalyse de ratio isotopique qui permet de contrler lauthenticit de lhuile essentielle.107,109,114 Toutefois, la rponse fournie par ces dtecteurs chimiques ne permet pas dtablir une relation directe entre la concentration des composs dtects et lactivit odorante de lhuile essentielle, les composs majoritaires ntant pas toujours les principaux responsables de lodeur.112 Un dtecteur, que nous utilisons au quotidien, parat tout fait adapt laccomplissement de cette tche : le nez. Lidentification de limpact des composs sur le caractre odorant de lhuile essentielle est ralise par la technique de GC-Olfactomtrie (GC-O) qui consiste renifler les composs lus de la colonne chromatographique afin de les dtecter et de les valuer.115 Les performances de cette technique peuvent tre nettement amliores avec lemploi de la MDGC et GCGC112,115 qui permettent la sparation des composs odorants co-lus. Lemploi de la GC-O a, entre autres, permis dtablir le profil odorant des huiles essentielles de citron vert116 et de coriandre,117 ou de mettre en vidence les diffrences aromatiques entre les huiles essentielles de coriandre et coriandre sauvage112 ainsi que de celles de deux clones de thym.118 Enfin, il important de mentionner les performances de la RMN (Rsonnance Magntique Nuclaire) pour lidentification et llucidation de structures de composs inconnus. Base sur la rsonnance des atomes dhydrognes et de carbones, elle donne diverses informations concernant le squelette et la fonctionnalisation des molcules.119 Bien que la RMN 1H soit utilise dans lanalyse des huiles essentielles,98 cest la RMN employe.
99,111,120,121 13
C qui est gnralement
Lanalyse par RMN est effectue avec
111
ou sans121 fractionnement
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pralable de lhuile essentielle. Lidentification des composs est ralise sur la base dune
comparaison entre les spectres des composs inconnus et ceux dune bibliothque de rfrence. De nombreuses mthodes danalyses, principalement bases sur la sparation chromatographique, sont donc disposition pour lanalyse des huiles essentielles mais aucune delles ne permet, elle seule, de caractriser compltement une huile essentielle. Cest pourquoi, en pratique, lemploi de plusieurs de ces mthodes est gnralement observ pour lanalyse dune huile essentielle et est fonction de lobjectif de lanalyse : caractrisation globale, caractrisation approfondie, recherche de composs inconnus, dtermination nantiomrique et isotopique ou bien encore recherche des composs odorants. II.3 Conclusion : Adultration tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Le secteur analytique des huiles essentielles est en constante volution, cherchant sans cesse amliorer les techniques mises en place afin de caractriser au mieux chaque huile essentielle. La connaissance des constituants dune huile essentielle permet, entre autres, dattribuer ses proprits certains composants et ainsi den tirer partie. Dun point de vue du contrle, la mise disposition de toutes ces techniques permet de dtecter plus aisment les adultrations des huiles essentielles. En effet, en tant que produits dimportance conomique considrable, les huiles essentielles nchappent pas aux tentatives de fraudes, notamment dans le domaine de laromathrapie.122 Ladultration dune huile essentielle, dont le but est den baisser le prix, peut se prsenter sous plusieurs formes.122 Lune delles consiste mlanger une huile essentielle bio avec une huile essentielle dite normale qui est issue dune agriculture utilisant des produits phytosanitaires. Lutilisation des pesticides sur les cultures des matires premires des huiles essentielles (hesprids et PPAM) est effectivement trs courante. Ces traitements, similaires ceux effectus sur les denres alimentaires, peuvent occasionner la prsence de rsidus de pesticides dans le vgtal. Etant donn les procds de fabrication des huiles essentielles, il parait vident que la prsence de rsidus de pesticides dans les huiles essentielles ne peut tre carte.
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B) Les Produits Phytosanitaires

Les produits phytosanitaires, plus communment nomms pesticides, sont des sujets de discussion incontournables de la socit actuelle. Si, auparavant, ces termes taient associs la matrise de la production agricole et la garantie de ressource alimentaire suffisante, ils sont dsormais souvent associs, tort ou raison, un problme de sant publique. En lespace de quelques annes, les pesticides sont en effet passs du rang de produits rvolutionnaires et bienfaiteurs au rang de produits nfastes dont il faut se dbarrasser. Alors pourquoi tant de polmique sur ces produits ? Ce qui est en cause, cest probablement une utilisation abusive et draisonne de ces substances depuis le milieu du XXme sicle conduisant une pollution gnralise de lenvironnement. Depuis prs de cinquante ans, ils ont t mis en vidence dans tous les tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 compartiments de l'environnement, que ce soit dans les eaux de rivires, de pluie et nappes phratiques, dans l'air et dans les denres alimentaires. Si la problmatique pesticides est la fois dordre environnemental avec la contamination de la faune et de la flore, elle est aussi dordre sanitaire. En effet, de par leurs proprits toxiques, les pesticides reprsentent un rel danger pour lhomme lorsquils ne sont pas utiliss dans des conditions appropries. Pourtant, mme sils sont trs controverss, il semble compliqu de sen priver dans un futur proche tant notre socit dpend des pesticides, que ce soit dans lusage agricole ou non agricole. La tendance actuelle est donc une diminution progressive de la consommation en produits phytosanitaires (plan Ecophyto 2018) ainsi qu lamlioration des pratiques agricoles paralllement un durcissement de la rglementation. Pour assurer la scurit du consommateur, la lgislation europenne notamment impose des limites maximales de rsidus (LMR) de plus en plus faibles dans les denres alimentaires, do une ncessit pour les laboratoires danalyse de sadapter constamment et de dvelopper des mthodes danalyse des pesticides toujours plus performantes. Cependant, contrairement aux denres alimentaires et leau qui sont trs contrles, il nexiste aucune rglementation en vigueur sur les teneurs rsiduelles en pesticides dans les produits transforms et, en particulier, dans les huiles essentielles. La prsence de pesticides dans ces extraits ne doit pourtant pas tre carte. Elle pourrait mme, au vu de leurs domaines dapplication, notamment laromathrapie, constituer un problme de sant publique.
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I.
Gnralits sur les produits phytosanitaires

I.1 Dfinitions, classification et chiffres cls
Le mot pesticide provient de lassociation du mot anglais pest (animal, insecte ou nuisible), lequel provient du latin pestis (flau, calamit) et du suffixe cide ((latin -cida, du verbe latin caedo, caedere, tuer ). Bien que communment appel pesticides par le grand public, les termes utiliss par la lgislation franaise relative la protection des cultures sont produits phytopharmaceutiques , produits phytosanitaire , produits agropharmaceutiques ou encore produits antiparasitaires usage agricole .123 Selon la directive 91/414/CEE du 19/08/1991,2 sont entendus par produits phytopharmaceutiques les substances actives et les prparations contenant une ou tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 plusieurs substances actives qui sont prsentes sous la forme dans laquelle elles sont livres lutilisateur et qui sont destines : protger les vgtaux ou les produits vgtaux contre tous les organismes nuisibles ou prvenir leur action, pour autant que ces substances ou prparations ne soient pas dfinies autrement ci-aprs ; exercer une action sur les processus vitaux des vgtaux, pour autant quil ne sagisse pas de substance nutritive (ex : rgulateur de croissance) ; assurer la conservation des vgtaux, pour autant que ces substances ou ces produits ne fassent pas lobjet de dispositions particulires du Conseil de la Comission concernant les agents conservateurs ; dtruire les vgtaux indsirables ; ou dtruire les parties de vgtaux, freiner ou prvenir une croissance indsirable des vgtaux . Plus simplement, les pesticides dsignent lensemble des substances actives ou prparations utilises pour la prvention, le contrle ou llimination dorganismes jugs indsirables, quil sagisse de plantes, de nuisibles et de champignons. Lefficacit dun pesticide dpend donc de sa ou de ses substances actives qui se dfinissent comme tant les substances ou micro-organismes, y compris les virus, exerant une action gnrale ou spcifique sur les organismes nuisibles ou sur les vgtaux, parties de vgtaux ou produits de vgtaux .2
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Une fois le pesticide appliqu sur le vgtal, il peut subsister, plus ou moins long terme, des traces de celui-ci dans lenvironnement qui sont communment appeles rsidus de pesticides. Dun point de vue rglementaire, il sagit dune ou plusieurs substances prsentes dans ou sur les vgtaux ou produit dorigine vgtale, des produits comestibles dorigine animale, ou ailleurs dans lenvironnement, et constituant le reliquat de lemploi dun produit phytopharmaceutique, y compris leur mtabolites issus de la dgradation . 2
Les substances actives peuvent tre classes de trois manires en fonction de leur usage, des organismes cibls ou de leurs caractristiques chimiques. Les trois sont utiles mais ne rpondent pas aux mmes proccupations. Ainsi, si lon sintresse aux proprits dun pesticide, la connaissance structurale de la molcule est indispensable pour dcrire et comprendre lessentiel du comportement de cette substance ; la classification chimique se tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 rvle dans ce cas trs utile. Classification chimique Il existe trois catgories de pesticides : les pesticides inorganiques : ils sont peu nombreux mais certains sont utiliss en trs grande quantit comme le soufre ou le cuivre. Ce sont des pesticides trs anciens dont lemploi est apparu bien avant la chimie organique de synthse (Cf. I.2. lhistoire des pesticides). De cette poque ne subsistent aujourdhui : aucun insecticide, un seul herbicide employ en temps que dsherbant total (chlorate de sodium) et quelques fongicides base de soufre et cuivre comme la bouillie bordelaise ([Cu(OH)2]x, CaSO4). Les pesticides organo-mtalliques : ce sont des fongicides dont la molcule est constitue par un complexe fait dun mtal comme le zinc ou le manganse et dun anion organique dithioarbamate (exemple : mancozbe avec le zinc, manbe avec le manganse). Les pesticides organiques : ils sont trs nombreux et appartiennent diverses familles chimiques. Selon le Pesticide Manual, une famille chimique ou classe chimique correspond lensemble des molcules drives dun groupe datomes qui constituent une structure de base.124 Cependant, il nexiste pas de relations univoques simples entre une famille chimique et les proprits des molcules qui ne peuvent tre comprises qu partir de la connaissance de toute leur composition et de leur structure. Il existe actuellement plus de 80 familles ou classes chimiques dont les plus connues sont prsentes dans le Tableau 3, mais leurs appellations sont parfois arbitraires et peuvent donc tre diffrentes dun ouvrage un autre.
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Famille chimique
Exemple Formule dveloppe Dnomination Nom IUPAC : (2,4-dichlorophenoxy) acetic acid

Fonction acide
Acide carboxylique
Nom commun : 2,4D
Amine
Fonction amine
Amine primaire
Nom IUPAC : 4-amino-3,5,5trichloropyridine-2-carboxylique acid Nom commun : picloram
Amine secondaire
Fonction amine
Nom IUPAC : 5-butyl-5-2-ethylamino6-methylpyrimidin-4-ol Nom commun : thirimol Nom IUPAC : -trifluoro-2,6dinitro-N,N-dipropyl-p-toluidine Nom commun : trifluraline
Acide carbamique
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Amine tertiaire
Fonction amine
Carbamates
Nom IUPAC : isopropyl 3chlorocarbanilate Nom commun : chlorprophame
Thiocarbamates
Groupe thiocarbamate
Nom IUPAC : bis (dimethylthiocarbamoyle) disulfide Nom commun : thirame
Diphnyl ther
Liaison ther
Nom IUPAC : 2-chloro-6-nitro-3phenoxyaniline Nom commun : aclonifen
Htrocylcles azots Nom IUPAC : 6-chloro-N2-ethyl-N4isopropyl-1,3,5 Nom commun : atrazine

triazine
Triazines
Pyrimidine
Nom IUPAC : ()-2-4-dichloro-a(pyrimidin-5-yl)benzhydryl alcohol

pyrimidine
Nom commun : fnarimol 33
Famille chimique
Exemple Formule dveloppe Dnomination Nom IUPAC : 1,1-dimethyl-4,4bipyridium dichloride

ammonium quaternaire
Bipyridinium (ammonium quaternaire)
Nom commun : paraquat Nom IUPAC ()-2(2,4-dichlorophenyl)3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)propyl 1,1,2,2tetrafluoroethyl ether Nom commun : ttraconazole Nom IUPAC : 2,2-dichlorovinyldimethylphosphate Nom commun : dichlorvos
triazole
Azoles
Orthophosphate
Organophosphors
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Nom IUPAC : O-O-diethyl O-(4nitrophenyl) phosphorothioate Nom commun : parathion ethyl

thiophosphate
Pyrthrinodes
pyrthre
Nom IUPAC : (S)- -cyano 3phenoxybenzyl (1R,3R)-3-(2,2dibromovinyl)-2,2dimethylcyclopropane carboxylate Nom commun : deltamethrine Nom IUPAC : 3-(3,4-dichloro)-1methoxy-1-methylurea
ure
Ures substitues
Nom commun : linuron Nom IUPAC : 1-(2chlorophenylsulfonyl)-3-(4-methoxy-6methyl-1,3,5-triazin-2-yl)urea
Sulfonylures
sulfonylure
uracile
Nom commun : chlorsulfuron Nom IUPAC : 5-bromo-3-sec-butyl-6methyluracil Nom commun : bromacil
Uraciles
Tableau 3.
Principales familles chimiques de pesticides125
Il faut souligner la trs grande diversit chimique des pesticides due, la fois, aux lments chimiques quils contiennent mais aussi aux diverses fonctions chimiques prsentes dans les molcules. Elle explique ltendue des proprits et des usages des pesticides.
34
Cependant, la comprhension de cette classification ncessite des connaissances avances en chimie dont ne sont pas pourvus tous les utilisateurs de pesticides. Ils lui prfreront donc les classifications biologique ou par usage qui sont bien mieux adaptes leurs activits. Classification Biologique Selon les organismes viss, trois grandes classes de pesticides reprsentant 90 % des produits phytosanitaires se distinguent : les insecticides, destins liminer les insectes nuisibles, les herbicides, destins liminer les adventices des cultures, les fongicides, destins lutter contre les parasites et champignons pathognes. Dautres classes mineures correspondent des substances actives destines combattre des cibles spcifiques : acaricides (acariens), nmaticides (nmatodes), corvicides (oiseaux tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 ravageurs), rodonticides (rongeurs) et molluscicides (limaces et escargots). Classification selon lusage Les pesticides sont utiliss dans plusieurs domaines dactivits pour lutter contre des organismes vivants nuisibles. Il existe six catgories de pesticides selon leur destination de traitement, savoir : les cultures, les btiments dlevage, les locaux de stockage des produits vgtaux, les zones non agricoles, les btiments dhabitation, lhomme et les animaux. Lagriculture est de loin lactivit la plus consommatrice de pesticides. Lusage nonagricole ne reprsente en effet que 12 % du march global et seulement entre 6 et 10 % en France.126
Le march mondial des produits phytosanitaires reprsente environ 40 milliards de dollars en 2008 et se rpartit comme suit :
Figure 13.
Illustration de la rpartition du march mondial des produits phytosanitaires en 2008126
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LEurope reste le continent le plus consommateur de pesticides, suivie de lAsie, lAmrique Latine et lAmrique du nord. Seule lAfrique, probablement pour des raisons conomiques, nemploi que trs peu de produits phytosanitaires. Avec ses 2,076 milliards deuros et ses 78 600 t de pesticides consommes en 2008, la France se situe au 4me rang mondial derrire les Etats-Unis, le Brsil et le Japon en terme de quantit absolue, et au 3me rang europen une fois cette quantit ramene lhectare cultiv (5,4 kg/ha/an).126 Concernant les catgories de pesticides, ce sont les herbicides qui dominent le march avec environ 47 % de part de march. Cela est principalement d limportante consommation de ces produits en Europe et Amrique du Nord o les herbicides reprsentent 70 80 % de part de march, au contraire de sous les tropiques o les insecticides sont davantage employs (environ 50 % des produits utiliss).126
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
En 2009, le march des produits phytosanitaires semble admettre une stabilisation, voire un lger recul en 2009 (37,860 milliards de dollars). Cest ici un fait marquant dans lhistoire des pesticides dont le march tait jusqualors en constante croissance. I.2 Lhistoire des produits phytosanitaires
De tout temps, lhomme a essay de protger ses cultures et ses rcoltes vis--vis de divers ennemis, mais il est souvent rest dsarm contre ces flaux. Le soufre tait utilis comme fumigne ds la Grce Antique et les produits arsenicaux dans la lutte contre les sauterrelles dans lEgypte Antique. Vers le XVIme sicle, les proprits insecticides du tabac (nicotine) et des racines de Derris et Lonchocarpus (pyrthre) sont signales. L'utilisation plus gnralise des pesticides a suivi les progrs de la chimie minrale. Au XIXme sicle, les traitements fongiques base de soufre ou de sels de cuivre permettent dendiguer de graves pidmies qui atteignent des productions agricoles vitales comme la pomme de terre (mildiou de la pomme de terre : Phytophtora infestans) en 1845, de la vigne (odium : Uncinula necator ; blackrot : Guignardia bidwelii ; Mildiou : Plasmapora viticola) ou encore des crales (rouille : Puccinia). Cest dailleurs cette poque que fut mise au point la clbre bouillie bordelaise par A. Millardet (1838-1902). Pendant cette priode, les insectes ravageurs ont principalement t combattus avec des composs base darsenic notamment larsniate de plomb et lacto-arsniate de plomb pour lutter respectivement contre lEudmis de la vigne en France (1881) et en Algrie (1888) ainsi que le doryphore au USA (fin XIXme sicle).
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La phytopharmacie na vritablement volu quaprs la premire guerre mondiale, paralllement au dveloppement de la chimie organique. Les premiers insecticides organiques sont dorigine naturelle et sont extraits de fleurs sches de Chrysanthemum (pyrthrine 1924) ou de racines de diverses plantes des genres Derris, Lonchocarpu et Tephrosia (rotnone 1930). C'est en 1930, date du brevet du premier herbicide de synthse, le dinitro-orthocrsol (DNOC), que dbute rellement lre des produits phytosanitaires de synthse avec la mise au point des pesticides de 1re gnration. Lanne 1943 voit la commercialisation du dichlorodiphnyl-trichlorothane ou DDT (interdit en France en 1972), un insecticide dvelopp pour lutter contre les ravageurs des cultures et les insectes vecteurs de maladies. Il fera figure pendant de nombreuses annes de chef de file de la premire grande famille de pesticides : les organochlors (aldrine, dieldrine, lindane). Une seconde grande famille ne tardera pas apparatre : les organophosphors (malathion, parathion). Leurs proprits insecticides avaient tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 t mises en vidence durant la seconde guerre mondiale travers le perfectionnement de gaz de combat tels que le gaz sarin. Aprs 1950, les effets conjugus du redressement conomique, de lvolution de la structure de lexploitation agricole et dune industrie chimique en plein essor entranent une augmentation considrable du nombre de pesticides de synthse avec, notamment, le dveloppement de nouvelles familles de pesticides telles que les ammoniums quaternaires (diquat, paraquat), les ures substitues (diuron, linuron) ou encore les triazines (atrazine, simazine). La priode 1970-1980 signe larrive de la la 2me gnration de pesticides caractrise par une diminution des doses employes et une meilleure efficacit. Parmi ces nouvelles familles se trouvent les pyrthrinodes photostables (deltamthrine) pour les insecticides et les sulfonyls ures (chlorsulufuron) pour les herbicides. Cest galement cette priode que la famille des phosphonate est mise sur le march avec dans ses rangs un herbicide trs clbre : le glyphosate (Roundup). Les annes 1980 marquent un tournant dans la manire de concevoir un produit phytosanitaire de synthse, cest le dbut des pesticides de 3me gnration. Jusqualors, les substances actives taient issues du hasard, suite des tests biologiques gnraux et au criblage dun grand nombre de molcules. Elles sont dsormais bases sur une recherche biorationnelle. En effet, grce aux progrs raliss dans les domaines de la biochimie molculaire et de linformatique, il est dsormais possible de relier lactivit dune formule chimique avec sa structure molculaire. La recherche biorationnelle permet dobtenir de nouvelles substances actives plus efficaces avec une rduction des doses appliques, plus
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slectives des organismes viss, occasionnant donc moins de risque pour les organismes noncibles et assurant ainsi un meilleur respect de lenvironnement. L'usage des produits phytosanitaires a connu un trs fort dveloppement au cours des dcennies passes, les rendant quasiment indispensables la plupart des pratiques agricoles, quel que soit le niveau de dveloppement conomique des pays. De 1945 1985, la consommation de pesticides a doubl tous les dix ans. Si les pesticides ont constitu un norme progrs dans la matrise des ressources alimentaires et l'amlioration de la sant publique (en particulier dans la lutte contre les insectes, vecteurs des maladies), le revers de la mdaille est apparu rapidement. En effet, des phnomnes de rsistance chez les insectes, puis des troubles de la reproduction chez les oiseaux ont montr de faon spectaculaire les limites et les dangers de ces substances pour l'environnement, pour les cosystmes mais aussi pour la sant humaine. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Cependant, il faut se rappeler que, dune part, laugmentation des rendements des terres agricoles a permis de limiter la dforestation, les experts estimant que leur utilisation, en 50 ans, a permis de prserver 50 % de la surface de la fort actuelle. Dautre part, leur utilisation a galement permis dradiquer un grand nombre de maladies parasitaires trs meurtrires, ou den limiter la propagation. A ce titre, le DDT est dailleurs toujours prconis pour lutter contre le paludisme.
Herbicides
Avant 1900 Sulfate de cuivre Sulfate de fer
Acide sulfurique
Fongicides
Soufre Sels de cuivre Nicotine
Insecticides
1900-1920
Sels darsenic
1920-1940
Colorants nitrs*
Phytohormones Organochlors** Organophosphors
1940-1950
1950-1960
Triazines Ures substitues Carbamates Dipyridyles Toluidines

Amino-phosphonates Propionates
Dithiocarbamates Phtalimides Benzimidazoles
Carbamates
1960-1970
1970-1980
Triazoles Dicarboximides Phosphites Morpholines Phnylamides
Pyrthrinodes Benzoyl-ures (rgulateur de croissance)
1980-1990
Sulfonyl ures
Dithofencarbe
Imidachlopride
1990-2000
Isoxaflutole Carfentrazone
Strobilurines SDN
Fipronil
*Les derniers usages de colorants nitrs ont t interdits en 2000 **Avec linterdiction du dinochlore (2002) et de lendosulfan (2005), tous les organochlors ont t retirs du march europen.
Tableau 4.
Evolution des dcouvertes des substances actives127
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I.3
La vie dun produit phytosanitaire
La vie dun produit phytosanitaire peut se dcomposer en trois temps : la conception et lhomologation de la substance active, lapplication du pesticide et enfin ce quil en reste aprs son utilisation. I.3.1. Lhomologation dune substance active : la directive 91/414/CEE Avant la mise sur le march dune nouvelle molcule, il faut en moyenne une dizaine dannes dtudes reprsentant un investissement denviron 200 millions deuros par les industriels.128 La conception dun produit phytosanitaire doit ncessairement prendre en compte deux sries dobjectifs. Objectif n 1 : Efficacit/Spcificit La toxicit doit tre leve pour la cible (efficacit) mais nulle ou en tout cas la plus faible tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 possible pour lhomme, les animaux domestiques, la faune, les insectes auxiliaires et pollinisateurs, les plantes cultives (spcificit).127 Objectif n 2 : Persistance La persistance du produit doit tre suffisante pour viter les traitements multiples mais compatibles avec les problmes denvironnement pour viter les phnomnes de concentration dans la chane alimentaire ainsi que les limitations la rotation des cultures.127 Les conditions drastiques imposes par la directive 91/414/CEE pour lhomologation dune substance active ne permettent la commercialisation que dune molcule sur environ 150 000 synthtises.128 Adopte le 15 juillet 1991 par le Conseil des Ministres, la directive 91/414/CEE concerne lautorisation, la mise sur le march, l'utilisation et le contrle l'intrieur de la Communaut de produits phytopharmaceutiques prsents sous leur forme commerciale, et la mise sur le march l'intrieur de la Communaut et le contrle des substances actives destines un usage dfini l'article 2 point 1 .2 Ce texte vise homogniser les critres dvaluation de linnocuit et de lefficacit des prparations phytosanitaires. Ainsi toute nouvelle substance active doit rpondre au texte de la directive et toutes les molcules autorises dans un ou plusieurs Etats membres de lUnion Europenne avant le 25 juillet 1993 (date dapplication franaise) doivent tre rexamines. La directive est compose de 24 articles informant les Etats membres de lensemble des objectifs retenus et de 6 annexes dtailles ci-aprs :
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lAnnexe I rfrence la liste des substances actives autorises au niveau europen ; lAnnexe II dtaille le contenu du dossier ncessaire linscription dune substance active la liste de lAnnexe I : dossiers toxicologique, cotoxicologique, biologique ; lAnnexe III donne la marche suivre pour constituer les dossiers toxicologique et biologique en vue dobtenir lhomologation des produits formuls ; lAnnexe IV contient les informations sur la nature des risques particuliers (phrases de risque R) ; lAnnexe V donne des conseils de prudence, les phrases de prcaution particulires ; lAnnexe VI spcifie les principes uniformes pour lvaluation des prparations. Pour quune matire active puisse tre employe dans la Communaut Europenne, celleci doit tre inscrite sur la liste des substances actives reconnues par la Communaut tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Europenne : la liste positive communautaire situe en Annexe I de la directive 91/414/CEE. En revanche, pour les spcialits commerciales (produits formuls), lautorisation de vente est accorde au niveau de chaque Etat. La demande dinscription dune matire active sur la liste positive doit tre prsente avec des dossiers toxicologique, cotoxicologique et biologique, conformes aux exigences de lAnnexe II de la directive. Celle-ci doit tre accompagne des dossiers cotoxicologique et biologique conformes aux exigences de lAnnexe III pour au moins une spcialit commerciale. La procdure dinscription seffectue au niveau communautaire sur proposition du Comit Phytosanitaire Permanent, prsid par la Commission. La Figure 14 illustre la procdure dhomologation dans lUnion Europenne :
Substance active
Dossiers toxicologique cotoxicologique biologique
Dpt dans un tat membre et examen
Avis des autres tats membres de la commission CEE
Inscription sur la liste positive de la CEE par le Comit Phytosanitaire Permanent
Spcialit commerciale
Dossiers toxicologique cotoxicologique biologique
Autorisation provisoire de vente pour 3 ans dans ltat membre
Homologation pour 10 ans dans ltat membre
Spcialit homologue dans un tat membre
Dossier de comparabilit
Homologation pour 10 ans dans ltat membre
Figure 14.
Description schmatique de la procdure dhomologation europenne des produits phytosanitaires
Lhomologation est la garantie que le produit est efficace, slectif, non phytopathogne vis--vis de la culture concerne et quil prsente un risque clairement valu vis--vis de lapplicateur, de la sant humaine et de lenvironnement. Cette garantie est assure par lensemble des tudes requises par les Annexes II et III travers la constitution de trois dossiers :
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Le dossier toxicologique : il value les effets les plus divers du produit pour lhomme, les risques encourus par le manipulateur et le consommateur. Ainsi, les toxicit aige, subchronique et chronique sont calcules sur la base de nombreuses tudes (cancrognes, tratognes, reprotoxiques) effectues chez des animaux tests. Le dossier cotoxicologique : il recense le comportement et le devenir des produits dans les diffrentes composantes de lenvironnement, le sol, lair et leau ainsi que les effets de ces composs sur la faune et la flore. Le dossier biologique : il apporte la preuve de lefficacit, de la slectivit et de linnocuit du produit vis--vis de la culture concerne. Si la substance active et le produit formul rpondent lensemble de ces critres, lhomologation est accorde par lUnion Europenne et une autorisation de mise sur le tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 march (AMM) est dlivre par lEtat ; le pesticide peut enfin tre commercialis. Remarque sur le programme de rvision des substances actives dj existantes Concernant les substances actives actuellement sur le march, la directive prvoit un programme d'valuation de ces substances tal sur douze ans compter de l'entre en vigueur de la directive (1993). En ralit, ce programme dvaluation a pris fin en mars 2009. Sur quelques 1 000 substances actives prsentes sur le march dans au moins un tat membre avant 1993, 26 %, soit environ 250 substances, ont pass avec succs lvaluation de scurit harmonise de lUE. En revanche, la majorit des substances (67 %) ont t limines en raison de dossiers non dposs, incomplets ou retirs par lindustrie. Approximativement, 70 substances ont chou la rvision et ont t retires du march tant donn que lvaluation ralise ne rvlait pas une utilisation sre concernant le respect de la sant humaine et de lenvironnement.129 I.3.2. Application et devenir du pesticide dans lenvironnement Une bonne mise en uvre du produit phytosanitaire doit viser quatre buts : tre efficace et rentable pour la protection des cultures ; ne pas occasionner de dgts la culture protge, aux cultures voisines et aux cultures suivantes ; viter lintoxication des hommes : lapplicateur, les autres oprateurs, les voisins, les consommateurs ;
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limiter la pollution de lenvironnement en gnral et, en particulier, limpact sur la faune auxiliaire et sur les animaux domestiques. Ces quatre objectifs sont indissociables. Lefficacit et la prvention des accidents de toutes sortes vont de pair et passent par une utilisation correcte des produits. Pour aider les utilisateurs dans lemploi des produits phytosanitaires, il existe des guides relatifs aux Bonnes Pratiques Phytosanitaires (BPP).130 Le respect de ces rgles assure une efficacit optimale des prparations pharmaceutiques ou des autres techniques de protection des plantes, tout en rduisant le plus possible les risques lis leur emploi. Elles impliquent, entre autres, de respecter la dose demploi, le nombre dapplications, ainsi que le dlai demploi avant rcolte (DAR)123 dfinis dans les Bonnes Pratiques Agricoles (BPA). De plus, les utilisateurs sont contraints depuis le 12 septembre 2006131 de respecter des contraintes de type mtorologique tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 (force du vent), de temps (dlai avant rcolte) et de distance par rapport des zones critiques comme des points deaux. Lorsque le produit phytosanitaire est appliqu sur lorganisme cible (adventice, insecte), il doit passer les membranes externes et les couches de protection, ce qui implique une certaine liposolubilit du compos. Les modes dactions des pesticides sont trs varis.132 Ils peuvent aussi bien agir sur le systme nerveux, inhiber la synthse de molcules essentielles au bon fonctionnement de lorganisme (acides amins, lipides, strols) ou encore influer sur le systme respiratoire. Pour agir, les substances actives doivent atteindre leur cible qui peut tre situe en surface ou lintrieur de lorganisme cible. Se distinguent alors les produits de contacts et les produits systmiques. Les pesticides de contacts agissent en surface. Les herbicides provoquent des ncroses et brlent les tissus des plantes, tandis que certains insecticides agissent par contact avec le tgument, par inhalation au niveau du tube respiratoire, ou par ingestion au niveau de lappareil digestif. Les pesticides systmiques agissent aprs transfert lintrieur de la plante et diffusion par la sve. Ces produits, daction plus lente mais plus durable, doivent tre hydrosolubles. Arriv sur le site daction, le produit parvient un rcepteur o se manifeste son action toxique proprement dite.
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Dispers au moment de lapplication ou libr lors de la destruction de lorganisme, le produit phytosanitaire se retrouve dans lenvironnement et peut tre transport dans latmosphre, les eaux souterraines et les eaux superficielles entrainant ainsi leur pollution tel quillustr dans la Figure 15.
Figure 15.
Illustration des mcanismes de transports des pesticides dans lenvironnement
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Limportance des processus de transfert est de lordre (par rapport aux quantits appliques) de:125 ruissellement et rosion : 0 5 % ; volatilisation : 0 90 % ; lixiviation : 1 5 % ; absorption par les plantes : 1 10 %.
Il peut galement, en fonction de sa biodisponibilit, tre absorb par les organismes vivants sur lesquels il peut avoir des effets toxiques recherchs ou non souhaits. Le niveau de contamination de lenvironnement par le pesticide va dpendre de sa persistance, c'est--dire la dure pendant laquelle les rsidus dun produit
phytopharmaceutique sont dtectables. Cette dure va tre fonction des phnomnes de dgradation du pesticide qui peuvent avoir deux origines : abiotique (sans intervention dorganismes vivants) telle que lhydrolyse, la photodgradation et les ractions doxydorduction, ou biotique (intervention dorganismes vivants). La persistance des produits phytopharmaceutiques est un problme important comme le montre le cas des pesticides organochlors. En effet, ces derniers, limage du DDT sont peu ou pas du tout mtabolisables par les tre vivants, ni dgradables dans lenvironnement. Il en rsulte une contamination et une concentration dans les chanes alimentaires, phnomne dimportance considrable puisque des rsidus organochlors sont retrouves jusque dans les graisses des phoques et des morses dAlaska.133 La prise en compte de ces problmes a amen concevoir des molcules de moindre persistance afin de limiter cette concentration le long des chanes alimentaires. Lhomme tant lui-mme au bout dune chane, quels risques encourt-t-il ?
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II. Toxicit et scurit du consommateur

Le problme de toxicologie humaine relatif aux produits phytosanitaires concerne la fois les manipulateurs et les consommateurs. Pour quun pesticide soit mis sur le march selon la directive 91/414/CEE, il faut quil nentrane aucun effet nocif sur la sant humaine lorsquil est utilis et appliqu dans le cadre de bonnes pratiques. Les nombreuses tudes de toxicit menes au cours de lhomologation conduisent tablir diffrents critres de toxicit spcifiques chaque produit et dfinis dans le glossaire fourni en tte du prsent manuscrit. II.1 Toxicit pour lutilisateur Diffrents types de toxicit sont dfinis suivant leur mode de dtermination. II.1.1. Toxicit aige tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 La toxicit aige est dtermine par le calcul des DL 50 orale, DL 50 cutane, CL 50 et par lvaluation du pouvoir irritant pour la peau, les yeux et le pouvoir de provoquer une sensibilisation de la peau. Les substances sont ensuite classes selon leur caractre trs toxique, toxique ou nocif (Tableau 5).
Catgorie
Trs toxique Toxique Nocive
DL 50 orale rat (mg/kg)

< 25 25-200 200-2000 Tableau 5.
DL 50 cutane rat ou lapin (mg/kg)

< 50 50-400 400-2000 Catgorie de toxicit aige127
CL 50 inhalation rat (mg/litre/4heures)

< 0,5 0,5-2 2-20
II.1.2. Toxicit chronique La toxicit chronique est value partir des donnes exprimentales de sant chronique obtenues chez lanimal et exiges lors du dossier dhomologation. Ltiquetage intgre ces critres par les symboles T(toxique), T+(trs toxique), Xn(nocif), Xi(irritant) et les phrases de risques R40 R43, R45 R49 et R60 R64 (Annexe 3) dfinies dans larrt du 20 avril 1994.134 Cependant, certains effets long terme tels que les cancers, les troubles de la fertilit, les malformations, les maladies neurologiques, les effets sur le systme immunitaire sont trs difficiles apprhender et ncessitent des tudes pidmiologiques. Des phrases de risques existent pour les substances cancrognes (R45, R49 et R40), mutagnes (R46 et R60), reprotoxiques (R60 et R62) et tratognes (R61 et R63). Ces phrases de risques font rfrence la classification des composs CMR (Cancrogne, Mutagne,
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Reprotoxique) en trois catgories o x est soit cancrogne, mutagne, reprotoxique ou tratogne en fonction des quatre classements respectifs : catgorie 1 : substance que lon sait tre x pour lhomme ; catgorie 2 : substance devant tre assimile des substances x pour lhomme, daprs des tudes long terme sur lanimal ou dautres informations appropries ; catgorie 3 : substances proccupantes pour lhomme en raison deffets x possibles. Lutilisateur de produits phytopharmaceutique nest cependant pas le seul expos. Le consommateur, dans une moindre mesure, lest galement, notamment au travers de son alimentation. II.2 Les risques pour le consommateur Aprs tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 application, les produits phytosanitaires voluent quantitativement et
qualitativement au cours du temps. La quantit de substances actives ou de ses produits de transformation prsente dans le vgtal la rcolte constitue le rsidu. Son importance dpend tout dabord de la nature du produit utilis mais aussi dun certain nombre de conditions extrieures comme le climat, les conditions dutilisation, la dose et, plus particulirement, le dlai avant rcolte (DAR). Le rsidu la rcolte constitue le passif du traitement phytosanitaire et, afin de garantir la scurit du consommateur, il est ncessaire de passer par un certain nombre dtapes avant de dlivrer lAMM dune substance active. Ainsi, il faut pouvoir : proposer une dfinition du rsidu dans les produits vgtaux et ventuellement dans les produits animaux si la culture est destine lalimentation animale ; fixer une LMR pour les cultures bnficiant dune autorisation dusage de la substance active ; sassurer que les LMRs proposes sont compatibles avec la sant du consommateur en ralisant une valuation du risque. II.2.1. Dfinition du rsidu La premire tape est de connatre le devenir de la substance active aprs quelle ait t applique sur une culture. En effet, comme expliqu prcedemment, une fois applique sur le vgtal, la substance active est susceptible de se dgrader sous linfluence de facteurs physiques (temprature, rayonnement UV, eau) ou biologiques (mtabolisation). Pour connatre le devenir de la substance active dans la plante, des tudes de mtabolisme sont
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ralises dans des conditions reprsentatives des pratiques agricoles, en utilisant la substance active radiomarque (14C). Ces tudes ont pour objectifs : destimer la rpartition des rsidus dans la plante ; destimer les teneurs en rsidus totaux dans les diverses parties de la plante et plus particulirement dans les parties consommes ; et surtout, didentifier et de quantifier les mtabolites et produits de dgradation qui peuvent apparatre aprs traitement. En gnral, la substance active applique, appele aussi molcule mre reste le compos majoritaire dans la plante et le rsidu est dfini comme la substance active elle-mme. II.2.2. Dfinition de la LMR tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Le devenir de la substance active tant connu, il est maintenant possible de mettre en place des essais en plein champ, qui vont permettre de dfinir les teneurs maximales en rsidus admises dans une culture traite. Llaboration de ces LMRs est une procdure qui se droule en deux tapes distinctes correspondant : la dfinition de la Bonne Pratique Agricole (BPA) critique, la mise en place des essais rsidus. La BPA critique pour une substance active et une culture donne, correspond la pratique qui conduit au risque rsidu le plus important. Elle correspond, en gnral, lusage qui ncessite par ordre dimportance : le dlai avant rcolte le plus court, la dose par hectare la plus leve, le nombre maximum dapplications par saison. Telle quelle est tablie, la LMR apparat comme une norme agronomique, reflet dune utilisation de la substance active conforme une bonne pratique agricole et non pas une norme toxicologique. Un dpassement de la LMR doit avant tout tre interprt comme un non-respect dune pratique agricole (en gnral un non respect du dlai avant rcolte). Les dfinitions de rsidus et les LMRs sont consultables sur la base de donnes europenne des pesticides : http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm.
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II.2.3. Evaluation du risque pour le consommateur Il sagit maintenant de vrifier que les LMRs tablies restent dans les limites compatibles avec la sant du consommateur. A long terme (risque chronique) Pour une substance active, les valuations ont pour principe de vrifier que les quantits de rsidus quun individu est susceptible de retrouver quotidiennement dans son alimentation ne dpassent pas les normes de rfrence toxicologique que sont la dose journalire admissible (DJA) et la dose de rfrence aige (ARfD). Lexposition long terme thorique dun consommateur un pesticide est value par le calcul dun Apport Journalier Maximum Thorique (AJMT) qui permet de vrifier que la tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 quantit potentiellement ingre chaque jour par un consommateur est infrieure la DJA. LAJMT calcul en faisant la somme des consommations moyennes individuelles journalires multiplies par les LMRs peut tre rsum par lquation suivante :
AJMT (mg / kg / j ) (Consommation moyenne journalire LMR produit A ) ( Poids Corporel )
(1)
Ce calcul est clairement maximaliste car il est bas sur lhypothse que tous les aliments prsentent des teneurs en rsidus quivalentes aux LMRs. En ralit, il faut considrer que seul un faible pourcentage des aliments affiche de telles teneurs. En 2008, selon lEFSA (European Food Safety Authority), 3,5 % des 70 000 chantillons analyss sur environ 200 types daliments excdaient les LMRs, contre 4,2 % en 2007.135 A court terme (risque aigu) Pour les molcules prsentant un effet toxique immdiat (ex : pesticide anticholinestrasique), il est ncessaire de complter lvaluation long terme par une valuation de lexposition au risque aigu. Dans son principe, il sagit de vrifier que la quantit de rsidus ingre au cours dun repas ou dune journe est infrieure lARfD. Cette valuation se fait par le calcul de lApport Court Terme Estimatif International (ACTEI) qui prend en compte le niveau de consommation non plus moyen, comme dans le cas de lAJMT, mais extrme au percentile 97,5, ainsi quun facteur de variabilit v qui tient compte de lhtrognit lie lchantillonnage :
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ACTEI
HR v
[(C 97,5 - U ) HR]
Poids Corporel
(2)
U le poids de lunit (ex : la pomme), C97,5 la consommation au percentile 97,5, v le facteur de variabilit (5 ou 7), HR la teneur maximum observe lors des essais et PC le poids corporel.
II.3 Conclusion La scurit du consommateur est assure par le fait que les LMRs labores pour une substance active conduisent des niveaux dingestion en rsidus qui restent en de des valeurs toxicologiques de rfrences que sont la DJA et lARfD. Cependant, lensemble de ces calculs sont bass exclusivement sur lalimentation. Mais dans le cas de lutilisation de produits issus de ces mmes cultures et destins un autre usage, comme la fabrication dhuiles essentielles par exemple, il nexiste, aujourdhui, aucune teneur limite rglementaire en pesticides. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Pourtant, quel que soit le procd dextraction considr, le niveau en rsidus de pesticides prsent initialement dans le matriel vgtal est extrait dans un volume dhuile essentielle beaucoup plus petit et conduit donc une concentration du pesticide dans lhuile essentielle. En consquence, mme de faibles teneurs en pesticides dans le vgtal pourraient conduire des concentrations bien plus leves dans lhuile essentielle. Avec des rendements en huiles essentielles gnralement de lordre de 1 5 %, une contamination du vgtal par exemple avec 1 mg.kg-1 dun rsidu de pesticide pourrait conduire thoriquement une concentration de 20 100 mg.kg-1 dans lhuile essentielle, en supposant un facteur de concentration de ce compos de 100 %. Ainsi, si le rapport de lEFSA ne fait tat que de 3,5 % des chantillons dpassant la LMR, il indique aussi que 35,7 % des chantillons contenaient des rsidus de pesticides des teneurs suprieures la limite de quantification mais infrieures la LMR. A supposer que ces chantillons soient lorigine de la production dhuiles essentielles, les concentrations en pesticides pourraient tre non ngligeables. De mme, parmi les denres tudies, 3 % des chantillons doranges et 2 % des chantillons de mandarines contenaient des pesticides des teneurs excdant la LMR. Etant donn limportance de la production dhuile essentielle, notamment dorange, il apparat ncessaire de disposer dune mthode de contrle des rsidus de pesticides dans les huiles essentielles, dfaut pour linstant, davoir des limites rglementaires.
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III. Les pesticides dans les huiles essentielles

La recherche de pesticides dans les huiles essentielles est une problmatique rcente qui provient essentiellement de deux phnomnes. En premier lieu, il sagit de laugmentation de la consommation des huiles essentielles dans les diffrents domaines de lindustrie ainsi que le dveloppement de nouveaux marchs comme laromathrapie. En second lieu, il faut signaler que lune des principales tendances de la socit actuelle est de conduire une politique de qualit de plus en plus drastique sur les produits de consommation en vue de rassurer et de garantir la scurit du consommateur. Cependant, pralablement au dveloppement et la mise en place dune mthode multirsidus de produits phytosanitaires dans les huiles essentielles, il faut dans un premier temps identifier les substances actives pertinentes parmi les 1 000 existantes, puis dans un second tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 temps, raliser un tat de lart des mthodes danalyse des pesticides dans les huiles essentielles. III.1 Identification des substances actives pertinentes Dans le cadre de la mise en place dune mthode danalyse multi-rsidus de pesticides dans les huiles essentielles, la premire tape fut dtablir la liste des substances actives rechercher. Les molcules furent slectionnes selon trois critres principaux : la rglementation : substances actives autorises ou non ? Lusage : sur quels types de cultures sont-elles employes ? La toxicit. III.1.1. La rglementation III.1.1.1. Dans lunion europenne
La mise sur le march de produits phytopharmaceutiques est rglemente dans lUnion Europenne par la Directive 91/414/CEE.2 Seuls sont autoriss les produits
phytopharmaceutiques dont les substances actives figurent sur la liste de l'Annexe I. Si le programme de rvisions des substances actives est dsormais cltur (mars 2009), ce ntait pas le cas lors des dbuts de cette tude (janvier 2008). A cette date, beaucoup de substances taient encore en cours dvaluation.
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Ainsi, les substances ont t classes suivant deux catgories : Usage autoris : substance inscrite sur lAnnexe I ou en cours dvaluation, Usage interdit : substance exclue de lAnnexe I. Lobjectif de ce projet est de dvelopper une mthode danalyse capable de doser les rsidus de pesticides dans les huiles essentielles produites en Europe mais galement de contrler celles provenant de limportation. Il ne serait donc pas judicieux de se limiter exclusivement aux substances autorises dans lUnion Europenne. La seconde tape fut donc dtudier la rglementation des pesticides ltranger, en particulier chez les principaux producteurs dhuiles essentielles. III.1.1.2. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 A ltranger
Les recherches se sont principalement concentres sur les principaux producteurs dhuiles essentielles qui sont le Brsil, lInde et la Chine. Les Etats-Unis, ayant une rglementation assez proche de lUE, nont pas fait lobjet de recherche. La recherche de donnes rglementaires prcises sest malheureusement rvle infructueuse pour la Chine ; en revanche des donnes ont pu tre trouves pour le Brsil et lInde. En Inde, les pesticides sont lgifrs par Central Insecticides Act 1968 .136 Le 26 fvrier 2006, 206 pesticides taient ainsi autoriss parmi lesquels certains sont interdits dans lUE (atrazine, benfuracarbe). Au Brsil, environ 420 substances actives autorises sont rfrences sur le site ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria).137 De mme que pour lInde, un nombre important de ces substances ne sont plus permises en Europe. Enfin, le site internet fluoridalert 138 a galement permis dobtenir des donnes sur lutilisation de pesticides fluors dans le monde et de dterminer ceux bannis en Europe et encore utiliss ltranger (chlorfluazuron, dichlofluanide). Aprs laspect rglementaire, les conditions demplois des pesticides sont un critre dterminant quant leur slection. III.1.2. Lusage Le type de cultures traites apparat comme le critre le plus pertinent pour slectionner les substances actives dintrt. Les molcules retenues en priorit sont donc celles dont lutilisation porte plus particulirement sur les vgtaux dont sont issues les huiles
50
essentielles, c'est--dire les plantes parfums, aromatiques et mdicinales, les cultures florales et les hesprids. Ces donnes ont t renseignes laide de lindex phytosanitaire ACTA,139 le manuel des pesticides124 et le site internet e-phy140 sous label du Ministre de lAgriculture et de la Pche. Enfin, il a t dcid de prendre en compte les substances actives les plus dangereuses (toxicit leve) pour la sant humaine mme si ce ne sont pas celles qui prsentent le plus de risque. En effet, un danger est ce qui est susceptible de causer un prjudice ou un effet nocif alors que le risque est la probabilit que ce danger survienne. III.1.3. La toxicit Cette recherche sest essentiellement base sur un rapport publi par GREENPEACE en fvrier 2008.141 Cette tude, fonde sur les donnes toxicologiques (toxicit aige, chronique ; tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 effets carcinognes, mutagnes) a permis de classer lensemble des substances actives (1134) en trois listes. Liste noire : pesticides particulirement dangereux. Elle comprend 327 substances actives reprsentant 29 % de lensemble des substances rfrences, parmi lesquelles il est important de noter que 168 taient autorises (en 2008) par lUE. Liste grise : pesticides ne prsentant pas de caractres dangereux particuliers. Cette liste comprend 243 substances actives, soit 21 % des substances tudies. Liste jaune : pesticides pour lesquels peu de donnes sont disponibles. 564, soit 50 % des substances examines nont pu tre values du fait du manque de donnes. Il est par consquent impossible dapprcier leur danger. III.1.4. Conclusion Dautres informations, permettant de vrifier la pertinence de la liste obtenue partir du croisement de ces trois types de donnes, sont venues complter les critres de slection dfinis ci-dessus pour minimiser le risque dcarter des molcules dintrt. Elles concernent les pesticides rfrencs dans la Pharmacope Europenne142 et le codex alimentarius dont la prsence dans le screening est indispensable.143 Les autres donnes proviennent de la recherche bibliographique avec, notamment, la liste des pesticides communment utiliss
51
dans lindustrie des huiles essentielles en Australie, dfinie par le RIRDC (Rural Industries Research and Development Corporation).34
Dans le cas de la prsente tude, deux listes ont pu tre tablies. La premire prsente un screening relativement large, regroupant les 300 molcules les plus pertinentes (Annexe 4). La seconde, appele liste prioritaire concerne 74 substances actives (s.a.) qui sont, a priori, les plus susceptibles dtre dtectes dans les huiles essentielles. Ces dernires sont rfrences par lACTA139 ou le Ministre de lAgriculture et de la Pche140 comme tant appliques sur les cultures de PPAM ou faisant partie de la liste des pesticides utiliss dans lindustrie des huiles essentielles.34
Liste prioritaire de 74 substances actives
2,4D Abamectine Carbtamide Chloridazone Chlorprophame Chlorpyrifos Chlopyralid Cycloxydime CyhalothrineCyromazine Dicamba Deltamthrine Difnoconazole Dichlobenyl Diflufnicanil Dimethenamid Dimethoate Diquat Diuron Ethofumesate Fluazifop-p-butyl Flurochloridone Fluroxypyr Haloxyfop Iprodione Isoproturon Isoxaben Lnacile Linuron Mancozbe MCPA Mecoprop Mfnoxam Mtamitrone Mtazachlore Mthomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oryzaline Oxadiazon Oxyfluorfene Paraquat Pendimthaline Pirimicarbe Procymidon Prometryn Propazine Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymtrozine Quizalofop-p-thyl Sethoxydim Simazine Sulfosulfuron Tau-fluvalinate Tebuconazole Terbacil Triclopyr Trifluraline
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Acephate Actamipride Acibenzolar - S- mthyl Aclonifen Amidosulfuron Asulam Azoxystrobine Bentazone Bifenthrine Bromacil Butraline Carbaryl Carbendazime Tableau 6.
Liste prioritaire de 74 s.a. rechercher dans les huiles essentielles
La liste des substances actives rechercher dans les huiles essentielles ayant t tablie, il faut dsormais dterminer la mthode analytique la plus mme de dtecter ces composs. Pour ce faire, il est primordial de raliser un tat de lart des mthodes danalyse de pesticides dans les huiles essentielles. III.2 Etat de lart sur lanalyse des pesticides dans les huiles essentielles Les capacits de la spectromtrie de masse en tandem associe la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) ou chromatographie liquide (LC-MS), pour la dtermination dune multitude de pesticides dans les produits alimentaires et les matrices environnementales, sont aujourdhui bien tablies.3-8 La sensibilit et slectivit des techniques MS/MS se sont nettement amliores avec le dveloppement du mode dacquisition appel Selected
52
Reaction Monitoring (SRM) qui aide rduire les interfrences potentielles dues la matrice.20,144 Dans le domaine danalyse multi-rsidus de pesticides, les analyseurs de type triple quadriple (QqQ)23,145-148 et trappe dions (ITD)24,25,28,149,150 utilisent largement le mode SRM, de mme que les analyseurs hybrides quadriple-trappe dions linaire (QqLIT).32,151,152 En ralisant deux analyses avec des injections distinctes, Greunlich et Alder ont dmontr la capacit des instruments LC-MS/MS modernes dtecter 300 pesticides dans leau potable des concentrations trs faibles, ceci sans tape de prconcentration ou purification.35 Avec la possibilit de crer manuellement des priodes SRM qui se chevauchent sur la base des temps de rtention des analytes, Kmellr et al. et Hiemstra and de Kok ont donn la LC-MS/MS la capacit de dtecter respectivement 160 et 171 pesticides multi-classes dans diffrents types de lgumes.33,153 Dans le cadre du dveloppement dune mthode danalyse sur une matrice huileuse, Hernando et al. ont t capables de dtecter 100 pesticides dans lhuile dolive par tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 LC-MS/MS.32 Cependant, lhuile dolive est exclusivement obtenue partir de procds mcaniques et/ou physiques mais sans traitement supplmentaire.154 Dans le cas des huiles essentielles, le challenge ne concerne pas seulement la dtection et la quantification dune grande varit de pesticides. Il consiste galement comprendre les effets de la prconcentration et de lisolement des pesticides de la matrice puisque les constituants des huiles essentielles prsentent des proprits physico-chimiques similaires ceux des pesticides. Dans ce contexte, relativement peu darticles ont t publis sur lanalyse des pesticides dans les huiles essentielles. Les exemples publis dans la littrature couvrent des matrices aussi diffrentes que les huiles essentielles de citrus (citron ou bergamote)155-157 ou les huiles essentielles distilles de menthe poivre, persil, ou fenouil.34,158-160 Cependant, le nombre de pesticides cibls dpasse rarement dix et est gnralement limit une ou deux catgories de pesticides, i.e. les organochlors,155-157 les organophosphors,157 ou les pesticides acides.34 Par exemple, Garland et al. ont tabli un guide pour la dtermination de diverses classes de pesticides dans plusieurs huiles essentielles. Cependant, jamais plus de dix pesticides ne sont analyss simultanment.34 De mme, le travail de Barrek et al. prsente lanalyse multi-rsidus de vingt-deux pesticides au moyen des couplages GC-MS (12 pesticides) et LC-MS (10 pesticides) dans les huiles essentielles de citrus.156 Concernant la sensibilit de ces mthodes, les limites de dtection (LOD) sont souvent suprieures 20 g.L-1 pour les composs les plus sensibles. La meilleure LOD atteinte est 0,5 g.L-1 pour la propazine34 dans lhuile essentielle de persil mais, dans la mme mthode, une LOD de 200 g.L-1 est obtenue pour le tbuconazole34 indiquant la grande disparit des limites de dtection lorsque les pesticides sont analyss dans ce type de matrice.
53
Pralablement lanalyse, la prparation de lchantillon, constitue gnralement de procds dextraction ou de purification, est limite dans le cadre des huiles essentielles. Les mthodes dveloppes proposent des extractions sur phase solide (SPE) sur colonne de silice,155 sur des cartouches de type Florisil 156,159 ou Bond Elute ,34 des extractions liquide/liquide,34,159 ou encore une sparation par chromatographie changeuse dions.34 La dernire solution consiste injecter directement lhuile essentielle aprs une dilution dans le solvant dinjection.34,157,160 Ltat de lart ralis sur lanalyse des pesticides dans les huiles essentielles tmoigne de la difficult du sujet par le peu de rfrences bibliographiques existantes (environ une dizaine) et le manque de performance des mthodes analytiques proposes, aussi bien en termes de nombre de pesticides analyss (pas plus de douze simultanment) quen termes de limite de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dtection. Il est donc ncessaire de mettre au point une mthode danalyse multi-rsidus, capable de dtecter un screening plus large de pesticides avec un seuil de dtection plus bas, pour disposer dune mthode de contrle efficace des pesticides dans les huiles essentielles. Dun point de vue analytique, deux mthodes de choix bases sur une sparation chromatographique couple une dtection par spectromtrie de masse dominent lanalyse des pesticides dans les matrices environnementales : la GC-MS et la LC-MS/MS. Si la GCMS fut la premire des deux techniques dmontrer ses performances dans ce domaine, la LC-MS/MS a rapidement combl son retard ces dernires annes pour finalement simposer aujourdhui comme la technique de choix dans lanalyse des pesticides.
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Chapitre II
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Rappel Thorique sur la Spectromtrie de Masse Couple la Chromatographie en Phase Liquide (LC-MS/MS)
Le couplage de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse en mode tandem est devenu une technique analytique de rfrence dans le domaine de lanalyse de rsidus de pesticides. Ce chapitre, compos de deux parties, se consacre dans un premier temps au fonctionnement de la source electrospray et de ses variantes Ion Spray, dont la mise au point est lorigine dun couplage plus ais de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse. Cette dernire technique fait lobjet de la seconde partie qui sattachera expliquer le fonctionnement dun spectromtre de masse champ quadripolaire et des possibilits offertes par ces instruments dans le cadre de la spectromtrie de masse en tandem.
56
Chapitre II. Rappel Thorique sur la spectromtrie de masse couple la chromatographie en phase liquide (LC-MS/MS)
A) La source dionisation par electrospray ESI

Les premiers couplages entre la LC et la MS furent raliss au moyen dinterface TSP (Thermospray) et FAB (Fast Atom Bombardment). Mais la vraie perce de la LC-MS dans le milieu de lanalyse environnementale arriva avec le dveloppement de lelectrospray (ESP).10 Si lESP fut introduit en 1968 par Dole et al.,161 son couplage exprimental avec la MS neut lieu quen 1984.162,163 Depuis lors, cette technique ainsi que les sources pressions atmosphriques (API) nont cess dvoluer164 pour atteindre le degr dutilisation que nous connaissons aujourdhui.
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Figure 16.
Histoire des sources pressions atmosphrique164
Le principe de ces sources consiste former un spray continu, issu dun effluent de chromatographie liquide ou lectrophortique. Les ions prexistants en solution, ou forms ultrieurement en phase gazeuse, sont extraits dans un processus dionisation pression atmosphrique travers plusieurs tapes de pompages dans le vide du spectromtre de masse. Les quatre avantages significatifs lorigine de lincroyable succs des techniques API sont :165 les techniques API peuvent soutenir des dbits compatibles avec la LC ; les techniques API sont adaptes lanalyse de composs non-volatils, de polarits moyennes trs polaires et la dtection de composs thermiquement instables ; les techniques API sont dune sensibilit qui approche celles obtenues en GC-MS ; les techniques API sont trs robustes et faciles dutilisation.
57
Dans le domaine des rsidus de pesticides, le choix entre les interfaces ESI et APCI nest pas ais, dautant que les conditions analytiques ne sont pas toujours optimales pour les deux techniques.16 Cependant, au vu du nombre dapplications,5,21 lESI reste linterface la plus universelle et est considre comme le golden standard de la LC-MS.21 Le Tableau 7 prsentent les possibilits de couplage entre les sources dionisation ESI et APCI et la LC.
Mode RPLC NPLC Tableau 7. ESI +++ + APCI ++ +++ Commentaires Formation dions en solutions possible ; volatilit de lchantillon normalement limit ; vaporation de la phase mobile dpendant du pourcentage deau ; utilisation dadditifs pour les phases mobiles. Normalement, pas de formation dions en solution (miscibilit limit avec les phases non aqueuse), chantillon plus volatil quen RPLC.
Comparaison des compatibilits des sources API-MS avec la RPLC et la NPLC adapt166
De plus, si auparavant, la limitation en termes de dbit due la source ESI (~0,2 mL.min1
) pouvait poser des problmes de couplage avec la LC, ou du moins des contraintes
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doptimisation, lvolution de la gomtrie164,167 et de la technologie des sources pression atmosphrique autorise dsormais combiner lESI avec des dbits classiques dHPLC de lordre de 1 mL.min-1.165 Ces interfaces portent gnralement le nom de Pneumatically assisted electrospray ou Ion Spray .168 Linterface de choix pour le couplage de la LC avec la MS dans le domaine de lanalyse multi-rsidus de pesticides reste donc lESI. Il ne faut cependant pas dlaisser totalement lAPCI qui constitue une vritable mthode complmentaire de lESI sur une gamme assez large de pesticides. Elle peut prsenter moins deffets matrice17 et permettre daccder lanalyse de composs plus apolaires. Un dernier point important concerne le changement de source ESI/APCI qui est gnralement trs ais sur les spectromtres de masse modernes.
I.
Lionisation par electrospray

Le principe de lelectrospray est bas sur la gnration dions en phase gazeuse partir
dun analyte dissous dans une solution perfusant travers un fin capillaire mtallique. Celuici, maintenu une certaine valeur de potentiel par rapport une contre-lectrode pere, permet lchantillonage des ions produits (Figure 17). Une diffrence de potentiels de valeur adquate et la prsence dun gaz coaxial au capillaire, permettent de disperser lanalyte charg dans des fines gouttelettes qui vont subir une succession dvaporation de solvant et de fissions coulombiennes pour, finalement, conduire la production dions en phase gazeuse.169
58
1. Production de gouttelettes charges
2. Evaporation
3. Emission dion en phase gazeuse
Figure 17.
Illustration schmatique du principe dionisation par electrospray
Comme le montre la Figure 17, le processus dans sa globalit se rsume en trois tapes principales, toutes se droulant pression atmosphrique :166 1. production de gouttelettes charges lextrmit du capillaire ; tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 2. rtrcissement des gouttelettes par vaporation du solvant et dsintgrations rptes et successives des gouttelettes conduisant des gouttelettes hautement charges et de tailles rduites ; 3. mission despces ioniques solvates en phase gazeuse partir dune gouttelette de petite taille selon un mcanisme encore sujet discussion. I.1 Production de gouttelettes charges
Lanalyte en solution est introduit dans la source travers un capillaire mtallique port un potentiel de 2 5 kV (positif ou ngatif) par rapport une contre-lectrode loigne de 1 5 cm. Sous ces conditions se cre un champ lectrique intense Ec au niveau de la pointe du capillaire dont la valeur peut tre dtermine par lquation (3) :
Ec 2Vc 4d ln rc rc
(3)
o Vc est le potentiel du capillaire, rc le rayon externe du capillaire et d sa distance par rapport la contre lectrode.170 Sous linfluence du gradient de champ lectrique lextrmit du capillaire, une sparation des charges se produit. Dans le cas dun champ positif, les anions vont migrer vers les parois du capillaire alors que les cations vont se propager vers le mnisque de la gouttelette forme la pointe.167 En prsence dun champ lectrique suffisant, le liquide
59
merge de lextrmit du capillaire sous la forme dun cne, communment appel cne de Taylor (Figure 18).
Figure 18.
Evolution de linterface avec une augmentation de Ec adapt169
Quand les forces de rpulsions lectrostatiques approchent la tension de surface du cne de Taylor, les gouttelettes charges sont expulses de la pointe sous la forme dun spray. La taille des gouttelettes, qui dpend du dbit de phase mobile et du diamtre du capillaire, est un point critique quant lefficacit de lionisation.167 Une fois expulses du capillaire, les tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 gouttelettes contenant lexcs de charges suivent les lignes de champ lectrique pression atmosphrique vers la contre-lectrode. Les trajectoires sont cependant affectes par les effets de charges despace et les flux de gaz. I.2 Intervention dun processus lectrochimique
Les ractions lectrochimiques qui se droulent linterface conducteur-solution, lintrieur ou trs prs de la sortie du capillaire ESI, font partie intgrante de la production et du chargement des gouttelettes ESI. Interrog sur le dbat concernant limportance de llectrochimie en ESI, le pionnier de lESI-MS, John FENN dclara the idea that electrochemical reactions might be taking place in an ES source was too obvious to mention .171 La source dionisation peut, en effet, tre considre comme une cellule lectrochimique constitue dune anode, lmetteur ou le capillaire, et dune cathode, la contre-lectrode. La conduction travers la cellule est soutenue par le mouvement des ions dans la solution puis dans la phase gazeuse avant datteindre la contre-lectrode. Dans ce flux lectrochimique, ltape limitante est ljection des gouttelettes, conditionne par le courant de lelectrospray iES qui a pour expression simplifie dans le cas de solutions suffisamment conductrices (4) :169
iES
1/2 r)
(4)
o f( r) est une fonction dpendante de la constante dilectrique du solvant, est la tension de surface du solvant, la conductivit de la solution et
f
est le dbit. La loi de la continuit du

60
courant impose que le courant de Faraday iF, associ loxydation des espces de la solution lectrolyte lanode, soit toujours gal au courant du spray iES (5).169
iF
iES
(5)
Pour soutenir laccumulation et la perte dun excs dions de mme polarit dans les gouttelettes charges et pour autoriser un courant travers le circuit, des ractions htrognes de transferts dlectrons (produisant le courant de Faraday) doivent se drouler linterface mtal/solution dans lmetteur et la contre-lectrode.171 Les lectrolytes avec le plus faible potentiel doxydation seront oxyds en premier. Puis, si le courant nest pas suffisant, les composs avec un potentiel suprieur subiront loxydation de manire garder un courant constant.166,169,171,172
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Figure 19.
Illustration schmatique, base sur les ractions se produisant dans une source ESI montrant linterdpendance du potentiel linterface lectrode/solution EE/S, dans le capillaire comme une fonction du courant iES et de la
composition des espces lectroactives en solution. Trait plein : trois lectrolytes A, B et C avec des potentiels EA+/A < EB+/B < EC+/C sont prsents en solutions concentrations gales. Trait ray : seule lespce lectroactive C est prsente en solution.166
La concentration de lexcs de charges dans les gouttelettes charges [Q] (mol.L-1) peut tre calcule partir de la premire loi de llectrolyse de Faraday :171
Q iF (F f )
f
nc i i i
(6)
o F est la constante de Faraday (96 485 C.mol-1),
est le dbit volumtrique de la solution, i
est le nombre de ractions dlectrolyse diffrentes, ni lquivalent molaire en lectrons engags dans la production dune mole du produit de llectrolyse de lespce i, et ci la concentration de lespce produite. Cette relation illustre le fait que la concentration de lespce produite ci sera minimise en cas de dbit important plus grand que le dbit sera faible.171
61
f,
dun faible courant et dun
nombre lev de ractions parallles. Limpact de llectrochimie sur la solution sera dautant
Toutefois, dans la majorit des expriences, les ractions chimiques impliquent les espces de la phase mobile (solvant et additifs) prsentes haute concentration et/ou le capillaire lui-mme (corrosion de lacier inoxydable). Les analytes classiquement sujets lanalyse en ESI sont en effet considrs comme des lectrolytes spectateurs .166 De plus, beaucoup danalyses sont conduites des dbits de lordre de 10 L.min-1 1 mL.min-1 limitant donc le temps disponible pour que des ractions lectrochimiques homognes aient lieu avec les espces dilues.171 Par exemple leau qui est un solvant utilis trs couramment en ESI donne lieu de nombreuses ractions lectrochimiques (Tableau 8).
Oxydation (ESI+)
4OH = 2H2O + O2 + 4e 2OH- = H2O2 + 2e2H2O = O2 + 4H+ + 4e2H2O = H2O2 + 2H+ + 2eOH- = OH* + e-
E0 (V) vs SHE
0,4 0,88 1,23 1,77 1,89
Rduction (ESI-)
O2 + 4H + 4e = 2H2O O2 + 2H+ + 2e- = H2O2 2H2O + O2 + 4e- = 4OH2H2O + 2e- = H2 + 2OH2H+ + 2e- = H2 O2 + 2H2O + 2e- = H2O2 + 2OHO2 + e- = O2+ -
E0 (V) vs SHE
1,23 0,70 0,40 0,07 0,00 -0,13 -0,33
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 8.
Ractions lectrochimiques de leau en ESI171
La production de protons due loxydation de leau peut induire des changements importants dans la solution lextrmit du capillaire, notamment une diminution considrable du pH. En effet, la concentration de protons produits par cette raction peut tre dtermine par :
H iES . nF f
(7)
Les protons produits lectrochimiquement vont tre lorigine dun changement de pH qui peut tre exprim tel que :
pH max - log [ H ]initial [ H ]elec - pH initial
(8)
Les quations (7) et (8) montrent que lamplitude de variation du pH ( pHmax) est directement relie la grandeur iES et inversement proportionnelle au dbit
f.
Par exemple,
pour la pulvrisation dun analyte en solution aqueuse pHinitial = 7 et en supposant un courant iES de 0,1 A, le pH de la solution rsultant dans le capillaire pour des dbits de 10, 1,0 et 0,1 L.min-1 serait respectivement de 5,2, 4,2 et 3,2.166 La variation de pH a une influence sur la formation des ions et facilite, notamment, la formation dions [M+H]+.
62
I.3
Evaporation du solvant et fission coulombienne
Sous leffet conjugu des gaz schant et de nbulisation, du chauffage de la source et du gradient de pression, le solvant de la gouttelette svapore (dsolvatation) et conduit une rduction de sa taille et donc une augmentation des rpulsions lectrostatiques des charges lintrieur de celle-ci. Lorsque la gouttelette atteint un certain rayon, les rpulsions coulombiennes galent les forces cohsives de la tension de surface du liquide. Le rsultat de cette instabilit est la fission de la gouttelette qui libre un jet de gouttelettes filles de plus petites tailles. Ce phnomne, appel fission Coulombienne se produit lorsquest atteinte la limite de Rayleigh, dfinie par lquation (9) :172
QRy
o QRy est la charge de la gouttelette, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 gouttelette et
0
8 (
R3 )1/2
(9)
la tension de surface du solvant, R le rayon de la
la permittivit lectrique.
La fission de la gouttelette, qui peut tre de type rgulire ou irrgulire , donne respectivement des gouttelettes filles de tailles quivalentes ou non. Elle se produit chaque fois que la limite de Rayleigh est atteinte, conduisant ainsi la cration de gouttelettes de plus en plus petites (Figure 20).
Figure 20.
Reprsentation schmatique de lhistoire dune gouttelette173 (insert : fission irrgulire) ; N est le nombre
de charges lmentaires dans la gouttelette, R le rayon de la gouttelette en m, t est le temps ncessaire lvaporation du solvant pour atteindre la fission.
Le processus rpt de fission Coulombienne des gouttelettes parentes, conduisant des gouttelettes filles de plus en plus petites, mnera finalement de trs petites gouttelettes charges, prcurseurs des ions en phase gazeuse. Le mcanisme par lequel ces ions sont produits partir de la gouttelette finale est dcrit selon deux thories.
63
I.4
Formation des ions en phase gazeuse
Deux mcanismes ont t proposs pour expliquer la formation des ions en phase gazeuse partir de gouttelettes trs petites et trs charges. Propos en 1968 par Dole et al., le premier mcanisme, du nom de Charged Residue Model ou CRM, sadresse aux analytes de haut poids molculaire.161
Charge Residue Model
Evaporation de solvant
n+
Evaporation du solvant rsiduel
n+
Ion nu en phase gazeuse
Explosions coulombiennes Ion mono-ou multicharg

entour de solvant
Figure 21.
Reprsentation schmatique du modle CRM
Lhypothse de ce modle consiste considrer que pour des macromolcules, lorsque de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 petites gouttelettes sont formes au cours du processus dvaporation et dexplosions coulombiennes, certaines de ces gouttelettes ne seront formes que dune molcule danalyte associe une ou plusieurs charges en surface. Lvaporation du solvant rsiduel va conduire la formation dun ion en phase gazeuse dont la charge proviendra des charges qui taient la surface de la gouttelette disparue.172 Contrairement au CRM, le second modle, IEM pour Ion Evaporation Model dIribarne and Thomson (1976), tente dexpliquer la formation dions en phase gazeuse issus de molcules de faible poids molculaire.174
Ion Evaporation Model
Evaporation de solvant Explosions coulombiennes Evaporation dion
n+ n+ n+
Ions nus en phase gazeuse
Gouttelette de rayon < 10nm
Figure 22.
Reprsentation schmatique de lIEM
LIEM est bas sur le principe selon lequel lion sera directement mis en phase gazeuse partir dune gouttelette, lorsque la rduction de celle-ci, par les processus dvaporation de solvant et de fission coulombienne, conduira une gouttelette de rayon infrieur 10 nm.172 I.5 Poursuite de la dsolvatation linterface pression atmosphrique-vide
Une fois en phase gazeuse, des ractions, notamment de transfert de proton peuvent avoir lieu. Elles dpendent de la basicit en phase gazeuse (GB) des espces. Ainsi, si GB(B) > GB(A), la raction suivante pourra avoir lieu sans ncessit dnergie dactivation :
64
AH
BH
(10)
Par consquent, des analytes vapors ltat neutre peuvent se charger travers des ractions de transfert de proton partir du moment o ils ont une basicit en phase gazeuse assez leve.175 Les ions sont produits en phase gazeuse sous la forme de clusters, associant lespce ionique dintrt et des molcules de solvant. Il reste, enfin, les acheminer vers lanalyseur au moyen dune interface permettant de passer de la pression atmosphrique de la source au vide pouss du spectromtre de masse, tout en continuant le processus de dsolvatation. Les ions crs dans la source doivent effectivement tre transports dune pression atmosphrique dans un vide pouss de lordre de 3.10-5 Torr. A la fin du processus dionisation, il reste gnralement quelques molcules de solvant ou clusters lis aux ions en phase gazeuse quil faut liminer avant lentre dans lanalyseur. La dclusterisation est un tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 terme utilis pour dcrire le processus consistant liminer les dernires molcules de solvant en intraction avec les ions en phase gazeuse. A noter que la dsolvatation est un terme plus large incluant le processus dvaporation des gouttelettes macroscopiques.164 Cette tape est ralise en schant les ions grce lapplication dun gaz schant contre courant (Schma 5) et dune temprature adapte en fonction du dbit de phase mobile.
Cne de dsolvatation ou orifice Contre-lectrode multiple en RF only Capillaire mtallique
Skimmer
760 Torr
Cne de Taylor
1~2 Torr
10 Torr
-1
10-3
Torr
10-3 - 10-6Torr
++
++
++
Solution
+ ++ ++
++ ++ ++
+ ESI Droplets + + + + + + ++ + + + + +
ions
Oxidation
Oxydation
Electrons
Haut voltage
Reduction Rduction
Rideau de N2 chauff
Pompe primaire
Pompe turbomolculaire
Pompe turbomolculaire
Schma 5.
Schma de linterface Patm-vide dune source ESI
Cependant, la dclusterisation complte nest pas toujours acheve dans la partie pression atmosphrique. De plus, une ventuelle reclusterisation peut avoir lieu avec les molcules de solvant neutres, dans la rgion o les ions sont en expansion supersonique (Figure 23) du fait de leur passage travers lorifice de petit diamtre.176 Pour viter ce phnomne, un gaz circule contre-courant entre lorifice et le skimmer et une tension de dclusterisation DP (Declustering Potential) est applique entre lorifice et le skimmer de manire liminer ces clusters par dissociation induite par collision (CID).
65
Figure 23.
Structure du jet supersonique
La Figure 23 montre la structure en tonneau du jet en expansion qui se termine sous la forme dun disque de Mach. Le skimmer est gnralement plac lintrieur de ce disque de manire optimiser la focalisation et la dclusterisation des ions. 164 Les ions sont ensuite tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 refocaliss par le champ radiofrquence du guide dion multipolaire (quadriple, hexaple, octople) qui va les diriger vers lanalyseur. Lensemble de ces tapes permet de passer progressivement de la pression atmosphrique un vide pouss, avec laide de pompes primaire et turbomolculaires disposes aux endroits adquats de lanalyseur (Schma 5). I.6 Electrospray assist par nbullisation pneumatique ou Ion Spray
Actuellement, la dnomination electrospray laisse sous entendre, par abus de langage, lutilisation dune assistance mcanique la nbulisation et implique lemploi dun gaz coaxial pour la formation du spray. Le dveloppement de variantes la source electrospray provient de la volont de disposer dinterfaces compatibles pour le couplage avec la chromatographie liquide. C'est--dire des sources capables daccepter une gamme largie de dbits (dizaines centaines de millilitres par minute) et qui soient tolrantes au changement de composition de la phase mobile. Comme il a t montr prcdemment, le dbit a un impact direct sur la taille des gouttelettes. Par consquent, dbit lev, les gouttelettes formes seront de tailles considrables. Le processus conduisant ces gouttelettes macroscopiques la formation dions en phase gazeuse totalement dsolvats nest pas encore entirement connu.164 Les deux principaux modles (CRM et IEM) concluent sur la formation dions en phase gazeuse contenant probablement un nombre de molcules de solvants attaches. Si les techniques haut et bas dbits partagent le mme mcanisme dionisation et de chargement des gouttelettes, elles diffrent dans le processus de cration des gouttelettes. En effet, pour des faibles dbits, la production de gouttelettes charges passe par
66
lintermdiaire dun cne de Taylor, ce qui nest plus le cas haut dbit o il est davantage question de jet dynamique (Figure 24).164
Figure 24.
Photographie ( gauche) et schma ( droite) dun jet dair provenant dun nbuliseur et montrant la structure de Mach164
La majorit des nbuliseurs atteignent aujourdhui des vitesses de gaz de lordre de 100 300 m.s-1 (Mach 1) sur des distances infrieures 3 mm conduisant des acclrations tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 moyennes de 340 000 g. A un tel dbit, les forces turbulentes arodynamiques correspondantes linterface liquide-gaz provoqueraient la rupture de nimporte quel liquide en populations de gouttelettes charges de tailles variables (submicrons plusieurs dizaines de microns). La rgion la plus intressante est celle qui est situe la plus proche de lextrmit du jet, car cest cet endroit que se situe la densit la plus importante de gouttelettes de petites tailles.164 A ces vitesses, plus de 20 L dair sont consomms par minute, ce qui prsente une excellente opportunit de transfrer une large quantit de chaleur aux gouttelettes et ainsi obtenir une dsolvatation rapide et efficace. En effet, avec 10 20 L.min-1 dair chauff 800C, 1 mL.min-1 deau serait compltement dsolvat sur quelques centimtres.164 Si en premire approximation, de telles tempratures pourraient laisser supposer loccurrence de dgradations thermiques, celles-ci restent rares. En effet, les modles analytiques prvoient que la temprature lintrieur de la gouttelette nest pas beaucoup plus leve que la temprature ambiante. Ainsi une gouttelette chauffe 750C natteindra quune temprature denviron 44C en son sein.164 Lefficacit dchantillonnage est le produit de lefficacit dionisation (efficacit de cration dions pression atmosphrique) et de lefficacit de transfert (efficacit de transfert des ions entre latmosphre et le vide). Elle correspond finalement la fraction de molcules danalyte prsentes dans la solution et introduites dans la source qui est capture par le spectromtre de masse en tant quions. Lefficacit dchantillonnage est beaucoup moins performante dans le cas de dbit lev (Figure 25).
67
Figure 25.
Efficacit dchantillonnage en fonction du dbit. La courbe noire en pointille, lire par rapport laxe Y de droite est une extension des valeurs basses de la courbe en rouge qui se rfre laxe Y de gauche. 164
La diffrence defficacit dchantillonnage entre des hauts et bas dbits peut atteindre un facteur 100, passant dune efficacit maximale de 22 % pour un dbit de 0,5 L.min-1 0,2 % pour un dbit de 500 L.min-1.164 Toutefois, cette baisse defficacit pour les dbits levs tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 peut tre largement compense par linjection de volume dchantillon beaucoup plus important autoris par les systmes HPLC. I.7 Conclusion
Lionisation par electrospray permet lionisation et le transfert en phase gazeuse des espces neutres ou ioniques prsentes initialement dans la solution. Les ions danalyte peuvent tre forms par oxydation ou rduction lectrolytiques, partir de ractions acide/base lintrieur des gouttelettes, ou partir des ractions de transfert de proton en phase gazeuse se droulant entre les ions librs des gouttelettes.177 Ce procd dionisation conduit majoritairement la formation dions [M+H]+ en mode positif, et [M-H]- en mode ngatif dans le cas de lanalyse de petites molcules. En effet, lionisation de macromolcules telles que les peptides et les protines gnrent couramment des ions multichargs de type [M+nH]n+ ou [M-nH]n- dus la prsence de nombreux sites basiques, ce qui permet de saffranchir des limites en masse des spectromtre de masse.178 La formation dadduits de type sodium [M+Na]+, potassium [M+K]+, ammonium [M+NH4]+ en mode positif est rgulirement observe et peut aider lionisation de certains composs neutres et/ou polaires.175 La mise au point de source de type Ion Spray permet un couplage ais de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse.
68
II. Le couplage chromatographie liquide source electrospray

Cette partie a pour objectif de dcrire synthtiquement la chromatographie liquide dans le but de cerner les principaux lments intervenant dans son couplage avec la source electrospray et ses consquences sur la mise au point dune mthode analytique LC-ESI/MS. Pour une description plus dtaille de la chromatographie liquide, et notamment des diffrents critres de sparation, il est conseill au lecteur de se rfrer ces ouvrages.179-183 II.1 Introduction la chromatographie liquide La chromatographie est une mthode danalyse immdiate qui permet de sparer les constituants dun mlange, en utilisant les diffrences entre les constantes dquilibre de ces composs, lors de leur partage entre une phase mobile dans laquelle ils sont solubles et une tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 phase dite fixe, ou stationnaire, qui exerce sur eux un effet retardateur.179 Cette technique se dcline sous de nombreuses formes selon la nature des phases et des phnomnes mis en jeu, ainsi que le schmatise la Figure 26.
CHROMATOGRAPHIE
En phase gazeuse
En phase supercritique
En phase liquide
Sur colonne
De surface
Adsorption
Partage sur phases greffes ou gels
Paires dions
change de ligands
change dions
Exclusion
CCM
CP
Figure 26.
Classification des mthodes chromatographiques
Grce sa vitesse et sa sensibilit, la chromatographie en phase gazeuse a t bien plus utilise que celle en phase liquide. Cependant, le potentiel de cette dernire est bien plus important puisque environ 85 % des composs connus ne sont pas suffisamment volatils ou stables thermiquement pour tre analyss en GC.180 La LC prsente galement lavantage dtre plus polyvalente du fait de linteraction de trois composantes (solut, phase mobile, phase stationnaire) contre seulement deux pour la GC (solut, phase stationnaire) et de la varit des phases stationnaires disponibles. Enfin, le couplage de cette technique avec la spectromtrie de masse travers les sources pression atmosphrique a permis de rsoudre son principal dfaut, savoir le manque de performance de ses dtecteurs. Dans le domaine de lanalyse de rsidus de pesticides, trois modes chromatographiques sont principalement utiliss : la chromatographie de partage en phase inverse, la chromatographie de paires dions en phase inverse (IPRPLC) et la chromatographie
69
changeuse dions (IELC).5 Cependant, la technique prdominante reste la RPLC qui, grce sa robustesse et sa facilit de mise en uvre, couvre 80 % des applications en chromatographie liquide.5 II.2 La sparation en chromatographie de partage en phase inverse II.2.1. Gnralits Les sparations en chromatographie liquide sont fondes sur la diffrence de distribution des espces entre deux phases non miscibles, lune stationnaire (silice vierge, greffe, alumine, rsine changeuse dions), lautre mobile (phase liquide constitue par un solvant ou plus souvent un mlange de solvants) qui permet dentraner lanalyte. Pour le solut A, cet quilibre est dcrit par lquation (11) : tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Amobile
Astationnaire
(11)
La constante dquilibre K de cette raction est appele coefficient de distribution (ou coefficient de partage) et se dfinit par la relation :
K CS CM
(12)
o CS et CM dsignent respectivement les concentrations du solut lquilibre dans les phases stationnaire et liquide. Les diffrences daffinits des divers constituants du mlange pour ces deux phases vont entraner des diffrences entre les vitesses de migration de ces composs au sein de la colonne, do une possibilit de sparation.
Une bonne sparation en chromatographie liquide implique : que les divers constituants du mlange soient retenus dans la colonne, donc prsentent une affinit pour la phase stationnaire suffisante ; que les diffrents pics soient bien spars, ce qui dpend de deux facteurs : la distance sparant les sommets des deux pics et leur largeur ; que lanalyse soit aussi rapide que possible.
70
II.2.2. Les mcanismes de retention en RPLC Le comportement des soluts, les mcanismes de rtention et leurs interactions avec la phase mobile et la phase stationnaire ont toujours t un sujet trs controvers en RPLC. Parmi les nombreuses recherches effectues, la premire thorie propose fut celle de la solvophobicit en 1976.184 Cette thorie considre que la phase stationnaire joue un rle passif dans le processus de rtention (autre que fournir un site de liaison) et que cette rtention est principalement due aux interactions thermodynamiques ayant lieu dans la phase mobile.185 Cependant, cette thorie ne permet pas dexpliquer la diffrence de slectivit des colonnes vis--vis de la forme des hydrocarbures polyaromatiques,186 de mme que la forte relation entre la rtention et la densit de la phase greffe hydrocarbone.187 Il semblerait en ralit que la rtention soit gouverne par des processus de partage, 188 ou tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 plus exactement par une combinaison des phnomnes de partage et dadsorption.189 En chromatographie liquide, ladsorption correspond un solut situ linterface entre les greffons et la phase mobile (avec un probable second site dadsorption prs de la surface des silanols rsiduels). Le partage correspond plus un processus de transfert type liquideliquide o le solut se situe davantage dans la rgion centrale de la phase greffe.190 Plus rcemment, Rafferty et al. ont propos une approche molculaire base sur la technique de Monte Carlo pour lucider les mcanismes de rtention en RPLC.191 Leurs travaux ont mis en vidence lintervention simultane des processus de partage et dadsorption qui dpendent de la nature du solut,191 mais galement de la longueur de la chane greffe.192 Laugmentation du taux de greffage conduit une lvation du coefficient de transfert du solut de la phase mobile la phase stationnaire193 (plus grande rtention), de mme qu un meilleur alignement des chanes allyliques qui forment une couche plus uniforme.194 En revanche, la composition de la phase mobile ninfluence que lgrement la conformation des chanes, mais un paississement de la rgion interfaciale avec une augmentation de la proportion de mthanol est cependant constat.195 Limplantation dun groupement polaire (embedded polar group) dans la chane greffe C18 permet daugmenter le taux de liaison hydrogne avec la phase mobile, ce qui accrot le pourcentage de cette dernire lintrieur de la phase stationnaire. Cela a pour effet de conduire une meilleure organisation des chanes greffes compare des C18 classiques, ainsi qu une meilleure rtention des composs polaires due davantage de liaisons hydrogne entre le solut et le groupement implant.196 La sparation chromatographique rsultant de ces mcanismes de rtention est caractrise par la rsolution chromatographique.
71
II.2.3. La rsolution chromatographique La rsolution chromatographique RS permet de caractriser la sparation de deux pics chromatographiques et se dfinit par la relation :
RS 2 (t R2
2
t R1 )
1
(13)
o tR1 et tR2, et
et
sont respectivement les temps de rtention et les largeurs des pics des
1
composs 1 et 2. Dans le cas de deux pics adjacents, leur largeur est suppose gale, soit
2
et par consquent :
RS t R2
2
t R1
(14)
Il dcoule de cette relation que la sparation entre deux pics sera dautant meilleure que RS tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 est grand (Figure 27).
A B
Figure 27.
Evolution de la sparation de deux pics chromatographiques en fonction de la rsolution RS
Ainsi, pour deux composs conduisant des pics de surface voisine, la sparation est pratiquement complte quand Rs = 1 (Figure 27, C). Pour des valeurs de RS < 1, les pics se chevauchent (Figure 27, B) et pour des valeurs de RS < 0,8, la sparation est gnralement insuffisante (Figure 27, A et B). La rsolution RS peut galement tre exprime par la relation :
RS 1 4 1 1
' k2 ' k2
( N 2 )1/2
(15)
o lindice 2 se rapporte au compos le plus retenu. Cette expression tablit la relation fondamentale liant la rsolution aux trois paramtres chromatographiques principaux : le premier terme en exprime linfluence de la slectivit ;
72
le second terme en k exprime linfluence du facteur de capacit ; le dernier terme N2 exprime linfluence de lefficacit de la colonne. La sparation chromatographique pourra donc tre amliore en jouant sur lun de ces trois facteurs. La largeur des pics chromatographiques apparat comme un paramtre critique dans la sparation dun mlange de composs. Llargissement des bandes et la perte defficacit rsultent de la vitesse finie de plusieurs processus de transfert de masse pendant la progression du solut. La minimisation de ces processus permet daugmenter lefficacit de la colonne et dobtenir une meilleure sparation. Limportance des effets cintiques sur lefficacit de la colonne dpend essentiellement de la dure de contact entre la phase mobile et la phase stationnaire qui dpend, elle-mme, de la vitesse dcoulement de la phase mobile u. La thorie cintique de llargissement des bandes chromatographiques197 tablit par Van tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Deemter en 1956 permet de prvoir avec prcision la variation de H en fonction de u. II.3 Cahiers des charges pour un couplage LC-ESI/MS La mise au point dune mthode danalyse par LC-ESI/MS ncessite de prendre en compte un nombre consquent de paramtres lis, pour la plupart, les uns aux autres, complexifiant dautant le dveloppement. les dimensions de la colonne, la phase stationnaire, le dbit de la phase mobile, la composition des phases mobiles, la temprature, le gradient dlution, le solvant dinjection.
Le premier paramtre critique dterminer est le dbit de phase mobile qui influe, aussi bien sur la sparation chromatographique198 que sur lionisation en ESI.18 Il est aussi dterminant dans le choix des dimensions de la colonne. Aprs le dbit, la composition des phases mobiles est le facteur prpondrant, que ce soit pour lefficacit de lionisation199 ou pour la qualit de la sparation qui implique aussi de tenir compte de la composition et du volume du solvant dinjection. En chromatographie de phase inverse, lluent est compos dune phase aqueuse (H2O) et dune phase organique, gnralement le mthanol ou lactonitrile. Dans le cadre danalyses comportant de nombreux composs aux proprits physico-chimiques diffrentes, la sparation chromatographique est classiquement ralise au moyen dun gradient dlution,
73
c'est--dire en augmentant le pourcentage de solvant organique de manire linaire ou non au cours de lanalyse.200 Ce procd permet de conduire la sparation de plusieurs centaines de pesticides en moins de 45 min.33,35,153 Lanalyte sera donc lu de la colonne chromatographique avec plus ou moins de phase organique conduisant une plus ou moins bonne efficacit dionisation. En effet, leau, de par sa tension de surface leve, sa faible volatilit et sa capacit de solvatation importante des ions, conduit une faible sensibilit des analytes dissous compare aux solvants organiques caractriss par de faibles tensions de surface, des volatilits leves et des capacits de solvatation moindres.201 Parmi les solvants organiques, le mthanol semble tre lgrement mieux adapt que lactonitrile. En premier lieu, la force luotropique du mthanol tant moindre que celle de lACN, les composs sont lus avec un pourcentage de phase organique suprieur, amliorant ainsi lionisation.146 De plus, ce solvant est connu pour produire des pics chromatographiques de plus belles allures tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 pour les composs basiques202 et conduit gnralement une ionisation ESI plus efficace que lACN,203 quelque soit le mode dionisation.204 Pour amliorer la rsolution et la rproductibilit de la sparation chromatographique, les phases mobiles sont gnralement enrichies avec des additifs dont les plus courants sont lacide actique, lacide formique, lhydroxide dammonium, lactate dammonium et le formate dammonium. Lajout de ces tampons des concentrations leves peut conduire une suppression partielle de lionisation mais, dans des proportions raisonnables, ils peuvent amliorer lionisation ESI en facilitant, notamment, lionisation des composs neutres par la formation dadduits ammonium en mode positif ([M+NH4]+) et actate en ngatif ([M+CH3COO]- .199 Le solvant dinjection est galement un lment prendre en compte lors du dveloppement. Sil est reconnu que la composition du solvant dinjection doit correspondre celle des phases mobiles au dbut du gradient dlution, la prparation de lchantillon ne le permet pas toujours. Ds lors, il est important de considrer les diffrences de viscosits et de forces luantes des solvants mis en jeu,205-209 et dadapter en consquence la temprature danalyse210,211 et le volume dinjection207,208 de lchantillon.
74
B)
La Spectromtrie de Masse
Parmi les mthodes analytiques, la spectromtrie de masse occupe une place privilgie grce ses qualits didentification, sa spcificit, sa sensibilit et ses limites de dtection ingales.212 La varit des applications de la spectromtrie de masse tmoigne de la polyvalence de cette technique danalyse. Elle est, en effet, aussi bien utilise en physique atomique, pour la cintique des ractions, en gochronologie, dans toutes les formes danalyse chimique quantitative et qualitative (en particulier en biomdecine, en contrle de lenvironnement ou pour les ractions ion-molcule) ainsi que pour la dtermination des paramtres thermodynamiques ( G0, Ka,).212
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
I.
Quelques rappels fondamentaux sur la spectromtrie de masse

La spectromtrie de masse est ltude de la matire travers la formation dions gazeux
caractriss par le rapport de leur masse sur leur nombre de charge, not m/z.213 I.1 Le spectromtre de masse
Fondamentalement, un spectromtre de masse se dcline selon le Schma 6 :

Vide pouss
Echantillon Systme dintroduction
Ions
Interface
Ions
Ions
Signal
Spectre
S
SOURCE
Cration des ions ltat gazeux
A
ANALYSEUR
Tri des ions selon leur rapport m/z
D
DETECTEUR
Collecte et comptage des ions
de masse
ENREGISTREUR
Traitement du signal et visualisation du spectre de masse
Schma 6.
Description dun spectromtre de masse
Un spectromtre de masse fonctionne sous un vide pouss de lordre de 10 -6 10-7 Torr de faon limiter le risque de collisions avec des particules de gaz rsiduelles qui entraneraient des dviations dans la trajectoire de lion. Cependant, en fonction de lappareil, la source dionisation peut tre sous vide (EI, CI, MALDI) ou pression atmosphrique (ESI, APCI, APPI) ; ces dernires possdent alors une interface permettant le passage de la pression atmosphrique de la source un vide pouss au niveau de lanalyseur. Aprs avoir introduit la substance analyser au moyen dun systme dintroduction de type direct, tel une canne pour les solides ou coupl avec une technique chromatographique, la source va permettre dioniser
75
la molcule mais galement de transfrer la substance de son tat solide, liquide ou gazeux, ltat gazeux. Lanalyseur va ensuite sparer les divers ions produits en fonction de la valeur de leur m/z, ceux-ci arrivent ensuite au dtecteur pour la collecte et le comptage. Lenregistreur, classiquement un ordinateur, traite ensuite le signal et permet sa visualisation au travers dun spectre de masse dont laxe des abscisses est dfini par le rapport m/z. Le symbole m/z est un nombre sans dimension, form en divisant la masse m dun ion exprime en unit de masse atomique u ou dalton (Da), par son nombre de charges z. Bien que non recommands par lIUPAC, les termes rapport masse-sur-charge et thomson (Th) sont communment employs dans les publications et diffrents ouvrages pour exprimer lunit m/z.213 I.2 tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Les principales caractristiques dun analyseur
Les cinq principales caractristiques dun analyseur sont sa limite en m/z, sa vitesse de balayage, sa transmission, son exactitude en masse et sa rsolution. La limite en m/z : elle dtermine les valeurs limites (minimum et maximum) des rapports m/z mesurables. La vitesse de balayage : elle correspond au temps mis par le spectromtre pour analyser lensemble de la gamme de masse. Elle est gnralement exprime en u.s-1 ou u.ms-1. La transmission : elle correspond au rapport entre le nombre dions arrivant au dtecteur et celui entrant dans lanalyseur. La prcision sur la masse : elle dtermine la prcision ou plus correctement la justesse des rapports m/z mesurs, c'est--dire la concordance entre la masse mesure et la masse thorique de la molcule. Elle sexprime en partie par million (ppm) :
P mth - mmes mth 106
(16)
Par exemple, un instrument dont la mesure de masse donne mmes = 400,0020 u pour une molcule possdant une masse molculaire mth = 400,0000 u, soit une erreur de 0,002 u admet une prcision de 5 ppm. La prcision de lanalyseur dpend fortement de la stabilit et de la rsolution de lanalyseur. La rsolution : elle peut tre calcule partir dun spectre de masse en considrant un pic isol. Elle se dtermine en effectuant le rapport de la masse m sur la largeur mi-hauteur du maximum m (FWHM : Full Width Half-height Maximum),
76
R
soit pour le pic de la Figure 28 :
m m
(17)
R=
500 = 5000 0,1
Figure 28.
Calcul de la rsolution avec la mthode FWHM
La prcision sur la masse et la rsolution sont les deux premiers paramtres considrer tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 pour savoir si linstrument sera adapt lobjectif de lanalyse.214 Si la haute rsolution est importante car elle permet de distinguer de nombreuses informations supplmentaires telles que les pics monoisotopiques ou la sparation entre les substances dintrts et les interfrents de la matrice, son augmentation est gnralement synonyme dune diminution de la sensibilit et dun prix lev de linstrument.214 De plus, laugmentation de la rsolution ne devient un argument convaincant que pour des molcules de tailles significatives.214 Pour ces raisons, lemploi dappareils haute rsolution (HR) reste rare dans le milieu de lanalyse environnementale.10 Seuls le TOF et son hybride Q-TOF (association dun quadriple et dun TOF) sont de plus en plus employs dans le milieu environnemental,5,215 notamment pour la confirmation des chantillons.21,216 En rgle gnrale, les instruments basse rsolution (R < 5000) de types triple quadriple et trappe dions sont prfrentiellement utiliss.5,10,20
77
II. Les analyseurs champ quadripolaire

II.1 Le filtre de masse quadripolaire (QMF) ou quadriple (Q) Les quadriples sont constitus de quatre barres parfaitement parallles ayant une section circulaire ou idalement hyperbolique tels que lillustre le Schma 7.
a)
b)
r0 r0
Schma 7.
Illustration a) globale et b) dune coupe transversale dun quadriple
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Les ions cheminant suivant laxe z sont soumis linfluence dun champ lectrique total, constitu dun champ alternatif quadripolaire superpos un champ constant rsultant de lapplication sur les barres respectivement des potentiels :212
0
(U - V cos t )
0
-(U - V cos t )
(18)
Dans cette quation, radiofrquence en rad.s-1 (
reprsente la tension applique aux barres,
la pulsation
= 2 f o f est la frquence du champ radiofrquence RF), U la peuvent
tension continue et V est lamplitude zro pic du voltage RF. Les valeurs de
diffrer dune production scientifique une autre, elles dpendent de linstant du cycle RF considr comme le montre le graphique de la Figure 29.
Figure 29.
Valeurs des tensions appliques aux barres en fonction de linstant du cycle RF considr
78
La thorie prsente ici est base sur le comportement dun seul ion dans un champ quadripolaire idal, infini, en labsence total de gaz. II.1.1. Expression du potentiel lectrique Dans un tel systme, le potentiel
x,y,z
en tout point de lespace peut tre exprim en
coordonnes cartsiennes par sa forme la plus gnrale :217

x, y , z
x2
x2
z2
(19)
o A est un terme indpendant de x, y, z qui inclut le potentiel lectrique appliqu entre les barres de polarits opposes, C est un potentiel fixe appliqu lensemble des lectrodes, , et sont respectivement les constantes pondres pour les coordonnes x, y et z. Cette quation met en vidence, dune part, laugmentation quadratique du potentiel avec x, y et z, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 mais galement labsence de termes croiss de type xy, xz.... Il est, ds lors, possible de considrer les composantes du champ lectrique comme tant indpendantes les unes des autres.217 Dans tout champ lectrique, il est essentiel de satisfaire lquation de Laplace :
2
(20)
avec loprateur laplacien :

2 2 2 2
(21)
En substituant lquation du potentiel lectrique (19) dans lquation de Laplace, lexpression suivante est obtenue :
2 2 2 2
(22)
Les drives partielles du second ordre conduisent

2
x
2
( A x2 )
(2 A x) 2 A
(23)
y
2
( A y2 )
(2 A y) 2 A
(24)
( A z2 )
(2 A z ) 2 A
(25)
Ce qui donne pour lexpression (22) :

79
A(2
2 )
(26)
A tant forcment diffrent de zro, lquation (26) peut alors scrire :

2
(27)
Lquation (27) admet une infinit de combinaisons de ,
et satisfaisantes. En pratique
sont utilises les plus simples dentre elles, savoir pour des quadriples en deux dimensions tels que les filtres de masse quadripolaires et les trappes dions linaires :
1;
(28)
Lexpression dun champ lectrique (19) dans un quadriple en deux dimensions devient donc :
x, y
A x2 - y 2
(29)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Les constantes A et C sont dtermines en considrant la configuration dun filtre de masse quadripolaire comprenant deux paires dlectrodes symtriques telles que :217
x0
y0
r0
(30)
o r0 est le rayon du cercle interne, tangent la surface des lectrodes comme le montre le Schma 7b. Le potentiel quadripolaire auquel est soumis un ion est donn par la diffrence entre les potentiels appliqus aux paires dlectrodes x et y, soit :217
0 x x y y
(31)
En considrant maintenant seulement la paire dlectrodes-(x) et puisque le potentiel doit tre gal sur lensemble de la surface de llectrode, il est alors possible dcrire que, pour une portion de lespace o y = 0, x
r0 et x 2
x x
r02 , lquation (29) devient :

A(r02 ) C
(32)
et de manire analogue pour la paire dlectrodes-(y) :

y y
A( r02 ) C
(33)
Par consquent, en substituant les quations (32) et (33) dans lquation (31) :
0 x x y y
A(r02 ) C ( A(r02 ) C)
2 A(r02 )
(34)
Le paramtre A se dfinit alors comme tant :
0 2r02
(35)
80
Lexpression (29) du potentiel
x,y
devient :
x, y 0 2r02
x2 - y 2
(36)
et pour lorigine (x = 0, y = 0) :
0,0
(37)
Si la structure est relie la terre, C = 0 et lexpression (36) du champ quadripolaire devient dans ces conditions :
x, y 0 2r02
x2 - y 2
(38)
Aprs avoir dtermin lquation du potentiel lectrique en tout point dun filtre de masse quadripolaire, linfluence de ce mme potentiel sur le mouvement de lion va tre tudi. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 II.1.2. Equation du mouvement dun ion Le mouvement dun ion dans un champ multipolaire en deux dimensions est dtermin par la loi de Newton :
F ma m dv dt
(39)
o v est la vitesse de lion et F la force lectrique sappliquant sur lion de masse m. Un ion acclr suivant laxe z pntre dans les barres du quadriple et conserve sa vitesse suivant cet axe, mais il est soumis suivant x et y aux acclrations rsultantes des forces dues aux champs lectriques :
2
Fx
x
2
t
2
- ze
x
2
t
2
- ze
0x r02 0y r02
(40)
Fy
y
2
- ze
y
2
- ze
(41)
o z est le nombre charge de lion et e la valeur de la charge dun lectron (e = 1,6.10-19 C) En considrant un systme rel auquel est applique une tension
0 x- x
telle que : (42) (43)
y- y
U
x- x
V cos t - - U - V cos t
y- y
2(U - V cos t )
81
Et en incluant lexpression (43) dans les quations (40) et (41), on obtient :

2
x
2
t
2
2 ze r02
2 ze r02
(U - V cos t ) x
(44)
m
ou
2
y
2
(U - V cos t ) y
(45)
x
2
2 ze mr02
U - V cos t x 0
(46)
y
2
t
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
2 ze mr02
U - V cos t y 0
(47)
Ces deux quations, correspondant aux mouvements dun ion de masse m et de charge ze au sein dun filtre de masse quadripolaire, peuvent tre compares une quation diffrentielle du second ordre, appele quation de Mathieu (48).
2
u
2
au - 2qu cos 2
u 0
(48)
Dans cette quation, u = x ou y, au et qu sont des paramtres de stabilit sans dimension, t et o 2 est appel angle de phase. Lidal est de pouvoir identifier terme terme cette quation diffrentielle. Afin dexprimer les termes au et qu en fonction des paramtres des quations (46) et (47), un changement de variable est ncessaire. On pose :
t
2
2
2 2
(49)
t2
(50)
Ce changement de variable (50), effectu pour les relations (46) et (47), conduit aux relations suivantes :
2
x
2
8 ze mr02 8 ze mr02
2 2
U - V cos t x 0
(51)
y
2
U - V cos t y 0
(52)
82
Lanalogie avec lquation de Mathieu (48) permet de dterminer les paramtres de stabilit au et qu avec u = x ou y.
au ax -a y 8 zeU mr02 4 zeV mr02
2 2
(53)
qu
qx
-q y
(54)
Les paramtres au et qu sont particulirement intressants car ils sont caractriss par la pulsation (rad.s-1) fonction de la frquence RF, du rapport m/z de lion considr et de la
taille r0 du systme. De plus, au et qu dpendent chacun des tensions continue (U) et alternative (V). II.1.3. Mouvement dun ion dans un filtre de masse quadripolaire tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Dans ce type de champ, le mouvement des ions est caractris par une quation issue des solutions de lquation de Mathieu telle que :217
u( )
o
ue
C2n,u e2in
n
' ue
C2n,u e
n
2in
(55)
et sont des constantes arbitraires caractristiques de lorigine des positions et des
vitesses, C2n,u est lamplitude de la trajectoire des ions selon la direction u, et u est un nombre complexe de la forme u
u
Les solutions de cette quation, dont le traitement partiel218 ou dtaill219 du problme peut tre trouv respectivement dans les ouvrages de March et al. et Campbell, sont classes en stables et instables. Le terme u permet en effet de caractriser la stabilit dun ion de rapport m/z au sein dun champ quadripolaire : Lorsque le terme u est un nombre imaginaire pur, c'est--dire avec
u u
= 0, soit u = i
un nombre non-entier, les solutions de lquation de Mathieu sont dfinies et
priodiques. Les trajectoires des ions sont stables et dcrivent des mouvements priodiques finis. Au contraire, pour un terme u tel que
u
0 et
un nombre entier, lamplitude de la
trajectoire ionique crot indfiniment suivant la direction de u : la trajectoire des ions est dite instable. Ainsi, la valeur du paramtre sein du quadriple.
83
u
caractrise la stabilit dun ion de rapport m/z donn au
En fait, tant que simultanment x et y, qui mesurent la distance par rapport au centre des barres, restent infrieurs r0, lion pourra traverser le quadriple sans toucher les barres. Dans le cas contraire, il se dchargera sur les barres et ne sera pas dtect.212 Pour un quadriple donn, r0 est constant et est maintenue constante, les paramtres U et V sont donc les seules
variables. Dans un diagramme au en fonction de qu, il est possible de reprsenter les zones de stabilit ou zones de valeurs de U et V telles que x et y natteignent pas, au cours du temps, des valeurs suprieures r0.212 Ce graphique est le trs connu diagramme de stabilit pour un quadriple linaire (Figure 30) :
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 30.
Reprsentation des diagrammes de stabilit pour un ion de masse m donn suivant x ou y ( gauche) et suivant x et y ( droite). u reprsente soit x soit y212
Les quatre zones A D encercles sur le diagramme de stabilit correspondent aux zones de stabilit de lion, la zone agrandie A est la plus couramment utilise dans les spectromtres de masse. La frquence de rsonnance fondamentale de lion peut tre exprime sous la forme :220
u ,n
2n
1 n 0, 1, 2
(56)
est une fonction complexe de a et q qui peut tre reprsent sur le diagramme (seule la
partie positive de la zone A du diagramme est considre).

APEX qx = 0,706 ax = 0,237
ax
qx
Figure 31.
Diagramme de stabilit avec la reprsentation du paramtre
84
Dans les conditions o a = 0 et pour de faibles valeurs de q ( q de peut tre obtenue selon la relation :
qu
u
0, 4 ), une approximation
2
0
(57)
Pour ces valeurs de q, le mouvement de lion la frquence
avec n = 0) conduit
lamplitude la plus large et le mouvement est alors presque harmonique, de frquence :

qu
0
2 2
(58)
Avec cette approximation, lion se comporte comme sil tait confin dans un potentiel lectrique efficace, Veff(r) donn par :
Veff r
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Du
r r0
(59)
o le puits de pseudo-potentiel Du est fonction de q et V tel que :
Du
quV 4
zeV 2 mr02
2
(60)
Le fait que les puits de pseudo-potentiel soient fonction de la tension V confre au quadriple la proprit de focaliser les ions en leur centre (Figure 32).
Figure 32.
Reprsentation de la trajectoire dun ion sein dun quadriple212
Un ion positif situ au centre des barres dun quadriple verra son nergie potentielle augmenter sil sapproche dune barre positive. Rciproquement, elle diminuera sil sapproche dune barre ngative. Mais le champ alternatif revient tourner ce puits et ce sommet de potentiel. Si la frquence est suffisante, un ion qui commencerait dvaler la pente vers une barre ngative se trouverait pris dans le puits de potentiel positif et donc ramen au centre des barres du quadriple.212 Du fait de leurs proprits, les quadriples peuvent tre utiliss en tant que filtres de masse, guides dions ou cellules de collision.
85
II.1.4. Mode de fonctionnement II.1.4.1. Filtre de masse
Les dfinitions de au (53) et qu (54) imposent, pour une pulsation dtermine par une frquence fixe, une proportionnalit directe entre m et U ou m et V, et donc une volution de la zone de stabilit A. Par consquent, en balayant simultanment ces deux tensions tout en maintenant leur rapport constant, les ions de diffrentes masses (m1 < m2 < m3) seront transmis au dtecteur la condition que ce rapport U/V corresponde un point situ l'intrieur du diagramme de stabilit (Figure 33).
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 33.
Illustration des zones de stabilit en fonction de U et V pour des ions de diffrentes masses (m 1 < m2 < m3)
La largeur des pics observe sur le spectre de masse est proportionnelle la longueur du segment de la droite de travail traversant le domaine de stabilit. La rsolution m/ m va donc dpendre de la pente de la droite OA et donc du rapport des tensions. En dautres termes, plus la droite est proche du sommet du diagramme de stabilit, plus la rsolution est leve mais plus la transmission est faible, do une perte de sensibilit. Lorsqu'on effectue un balayage U/V constant, la rsolution est constante sur toute la gamme de m/z explore. Il est galement possible davoir une rsolution qui crot avec la masse ( m fixe) en ralisant un balayage de type U = V- V (o V est une tension fixe qui dtermine la valeur de m) ou dajuster le rapport U/V tout au long du balayage par ordinateur pour maintenir un bon quilibre rsolution/sensibilit. En pratique, la rsolution sur ces appareils nest jamais suffisante pour dduire lanalyse lmentaire, de sorte que lon travaille habituellement une rsolution qualifie dunitaire, c'est--dire qui permet de sparer les ions qui diffrent dune unit de masse. II.1.4.2. Guide dions et cellule de collision
Une autre application intressante du quadriple consiste transmettre efficacement une gamme de masse dune source un analyseur, en y ajoutant une refocalisation des ions. En
86
labsence de tension continue (U = 0), la tension applique sur un quadriple est limite sa composante radiofrquence Vcos t. Les trajectoires des ions sont donc limites par le seul paramtre qu. Daprs la Figure 31, le diagramme de stabilit se limite au segment qu compris entre 0 et 0,908, ce qui signifie que pour une valeur de V dtermine ( lquation (61) seront transmis par le systme.
(m / z ) min 4eV 0,908r02
2
et r0 tant
gnralement fixe), tous les ions suprieurs une valeur (m/z)min calcule partir de
(61)
Cependant, la transmission des ions de hautes masses ptit de leur faible focalisation. En effet, le puits de potentiel, qui dtermine si lion qui traverse le quadriple est efficacement focalis ou non, est inversement proportionnel la masse m (60). En consquence, les ions de hautes masses sont faiblement focaliss et peuvent tre perdus sur les barres. La focalisation tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 des hautes masses ncessite laccroissement de la tension V (car le potentiel augmente proportionnellement V2) ce qui conduit, dans un mme temps, fixer une limite de masse plus leve. Dautres guides dions de type multiples (hexaple, octople) peuvent tre galement utiliss. Le potentiel, qui dtermine si lion qui traverse le multiple est efficacement focalis, est donn par lquation suivante :212
U eff r
zeVeff r
N 2 ( ze)2 V 2 r 4 m 2 r02 r0
2 N -2
(62)
o 2N reprsente le nombre de ples (de barres) et r la distance radiale depuis laxe longitudinal du multiple. Si pour un quadriple (n = 2), le potentiel est proportionnel r2, loctople (n = 4) prsente un potentiel proportionnel r6 ; ds lors, le potentiel du quadriple augmente rapidement lorsque lion sloigne de laxe alors que loctople prsente un potentiel caractris par une faible valeur autour du centre et une forte augmentation prs des bords de loctople.
Figure 34.
Comparaison des potentiels effectifs pour des champs quadripolaires, hexapolaires et octapolaires220
87
En consquence, vu la forme de son puits de potentiel, le guide dions quadripolaire est suprieur aux autres multiples pour son pouvoir de focalisation. Mais, du fait de la faible amplitude de son potentiel, il ne sapplique pas une gamme de masse tendue. Cependant, ltendue de la gamme de masse des ions ne prsente pas de problme quand le guide dions est combin avec un analyseur balayage (ex : autre quadriple). En effet, dans ce cas, lefficacit de la transmission dans lensemble de la gamme de masse peut tre optimise en faisant varier la tension V durant le balayage de lanalyseur lors de lacquisition du spectre. Si les ions sont dlibrment injects dans le quadriple avec une nergie suffisante pour se fragmenter lors de collisions avec un gaz, alors ces systmes sont appels cellules de collisions .220 Le fonctionnement de ces cellules sera dtaill ultrieurement lors du traitement de la spectromtrie de masse en tandem (Cf. III.). Un quadriple de type linaire peut tre aisment converti en une trappe dions linaire tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 2D par la simple application de tensions darrt en entre et sortie du systme.220 II.2 La trappe dions linaire 2D Dans un filtre de masse quadripolaire, la slection en masse des ions est ralise en appliquant une combinaison approprie de tensions U et V de telle manire que les ions appartenant une fentre troite de rapport m/z sont stables sur toute la longueur du quadriple. Ce critre de slection reprsente galement lun des inconvnients majeurs de ce type dappareil car il conduit la perte de la majorit des ions gnrs dans la source. 221 Les piges ioniques, au contraire, permettent de stocker les ions lintrieur de lenceinte afin de pouvoir les manipuler avant de les jecter. Parmi les analyseurs quadripolaires de type trappe dions se distinguent, les piges ioniques en trois dimensions (ITD) bass sur le travail brevet de Paul and Steinwedel en 1953222 et ceux en deux dimensions appels trappe dions linaire (LIT) dont le dveloppement est plus rcent.223
Figure 35.
Reprsentation schmatique dune trappe dions 3D217 ( gauche) et 2D223 ( droite)
88
Les trappes dions linaires prsentent une efficacit de pigeage suprieure, de mme quune capacit stocker un plus grand nombre dions (due leur volume plus important). De plus, la facult concentrer les ions sur un axe central (axe z) au lieu dun point dans les trappes 3D (centre du volume) limite leffet de charge despace.221 II.2.1. Principe du pigeage dions dans une trappe 2D Les ions pigs dans une trappe dions 2D peuvent tre extraits slectivement en masse de manire radiale travers une ouverture cre au sein dune lectrode,223 ou axiale limage dun quadriple.224 Cette dernire catgorie prsente lavantage de pouvoir tre facilement intgre dans un systme de type triple quadriple, ce qui permet de combiner les forces des deux plateformes, notamment dans lanalyse des petites molcules.225
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Schma 8.
Illustration du principe de lintroduction dune LIT dans un systme QTrap bas sur une configuration de type TQ224
Les paragraphes suivants sattacheront donc expliquer le fonctionnement particulier de ce pige ionique et, notamment, son principe djection axiale brevet par la socit AB Sciex. Le comportement des ions en rponse lapplication dune combinaison de tensions RF et DC a t dcrit, prcdemment, dans le cadre dun quadriple (cf. II.1.2 et II.1.3) conduisant aux quations des paramtres de stabilits au et qu rappeles ci-dessous :
au ax -a y 8 zeU mr02
4 zeV mr02
2
(63)
qu
qx
-q y
(64)
Dans une trappe dions linaire jection axiale (Schma 9), les ions sont pigs radialement par un voltage RF radial (VRF) appliqu sur les lectrodes (U = 0 => a = 0) et axialement par une tension continue (VDC) applique sur des lentilles situes aux extrmits du quadriple. Une troisime tension qualifie dauxiliaire (VAC) peut tre applique de manire dipolaire sur une paire oppose dlectrodes, ou quadripolaire sur lensemble des
89
quatre lectrodes. Cette dernire tension, applique une frquence correspondant la frquence sculaire de lion, permet de faire entrer celui-ci en rsonnance de manire ljecter ou le fragmenter.
IQ3 VRF Exit lens
Ions
y x z
VAC
VDC
Schma 9.
Description schmatique dune LIT dcrivant les diffrentes tensions appliques.
Pour ce type de dispositif, les quations de Mathieu ne sont valables quau centre du quadriple, lieu o le champ quadripolaire est pur. En effet, une chute brutale du champ tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 quadripolaire est observe aux extrmits du quadriple, principalement due la prsence dlments optiques proximit. Ces champs de bordures ou Fringing-Field (FF) dforment le champ quadripolaire idal et engendrent des couplages entre les composantes radiale et axiale du mouvement de lion, normalement indpendantes.221 Ces changements impactent la frquence sculaire de lion pouvant conduire une jection ou une fragmentation. Ljection axiale slective en masse (MSAE) tire avantage de ces effets de champs pour convertir lexcitation radiale de lion en jection axiale.224 Via un processus dexcitation rsonnante, les ions pigs gagnent en degr dexcitation radiale qui se transforme, aux abords de la sortie de la LIT, en nergie cintique axiale qui permet de surpasser la barrire de potentiel impose par la tension de la lentille de sortie.224 II.2.2. Ljection axiale Dans un pige ionique linaire jection axiale, la trajectoire des ions va dpendre essentiellement de trois champs lectriques provenant de lapplication dune tension RF damplitude VRF sur les lectrodes du quadriple, dune tension continue VDC au niveau des lentilles et, au besoin, dune tension auxiliaire dipolaire RF damplitude VAC sur deux lectrodes opposes, comme le montre lquation (65).224
d2 r dt
2
e [VRF E quad m
VDC E lens
VAC E dipolaire ]
(65)
90
Dans cette expression,
est le vecteur position dun ion positif monocharg de masse m et de
charge lectrique e. Le terme VRF E quad peut tre remplac par une approximation analytique du potentiel du quadriple dans la zone bordure : E quad
FF
En premire approximation, la diminution du champ quadripolaire en deux dimensions

x,y
dans la rgion proche de la lentille de sortie peut tre dcrite par une fonction f(z) de
manire crire le potentiel du champ de bordure tel que :

FF x, y
f ( z)
(66)
Ainsi, la composante axiale du champ lectrique due la diminution du champ quadripolaire se dfinit comme tant :
Ez ,quad
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 avec
x, y
x, y
f ( z) z
(67)
( x2 - y 2 ) 2r02
0
(68)
En labsence de tension continue U (
-2V cos t ) et en considrant lapproximation
de Dehmelt226 qui consiste dcomposer le mouvement dun ion selon un axe x en un macromouvement de variation lente mais de grande amplitude sculaire X et un micromouvement de variation trs rapide mais de faible amplitude x tel que :
x
avec
(69)
X et
d2 x dt 2
d2X (lacclration du micromouvement est suprieure celle du dt 2
macromouvement fondamental), lquation de Mathieu peut scrire :
d2x d d2x Or, comme d d2 x et x d 2
d2X d 2
d2 x d 2
(ax
2qx cos 2 ) x
(70)
X , lquation (70) devient :

d2 x d 2
(ax
2qx cos 2 ) X
(71)
En labsence de composante DC, U = 0 et donc ax = 0. En supposant que X est constant sur la gamme de x, lquation (71) peut tre intgre deux fois pour donner x en fonction de X.
91
d2 x d 2
2qx X cos 2
d x d
x
2 qx X sin 2 2
1 qx X cos 2 2
(72)
avec x
x et
t , la coordonne selon x peut tre crite : 2

x X 1 qx X cos t 2
(73)
et selon y : tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
1 q y Y cos t 2
(74)
Lexpression du champ quadripolaire bidimensionnel peut alors scrire en substituant les expressions (73) et (74) aux paramtres x2 et y2 de lquation (68) telle que :
x, y
1 ( V cos t ) r02
1 qx X cos t 2
1 q y Y cos t 2
(75)
La composante axiale du champ lectrique due la diminution du champ quadripolaire sexprime alors telle que :
Ez ,quad V 1 cos t X 2 1 qx X cos t 2 2 r0
2
Y2 1
1 q y Y cos t 2
f ( z) z
(76)
Il est alors possible de dterminer la valeur du champ quadripolaire selon laxe z moyenne sur un cycle RF complet :
Ez ,quad
RF
1 TRF
TRF t 0
Ez ,quad t
Ez ,quad
RF
f z m 2 2 q X2 z 8e
Y2
(77)
Comme le montre la Figure 36, le micromouvement de lion est donc en phase avec le potentiel appliqu aux lectrodes-(x). Le maximum, quil soit positif ou ngatif, survient toujours au cours de la partie positive du cycle RF, ainsi la moyenne de Ez ,quad RF Ez ,quad
RF
sur un cycle
est toujours positive.

92
Figure 36.
Diagramme de lamplitude du mouvement de lion selon x en fonction des cylces RF et montrant la synchronisation entre le potentiel appliqu aux lectrodes et le micromouvement de lion 224
Ce champ lectrique axial augmente radialement avec le carr de la distance par rapport au centre des lectrodes (77) et axialement quand lion sapproche de la sortie. Par consquent, plus lion sera loign du centre ou proche des lectrodes et plus il sera prs de la tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lentille, plus le champ lectrique sur la composante axiale sera important. Pour contrebalancer ce champ lectrique positif, lapplication dune tension VDC (2-4V) sur la lentille de sortie permet de crer un champ lectrique ngatif de proportion adapte, dont la force dcrot avec laugmentation du dplacement sculaire permettant ainsi dobtenir une discrimination dans ljection des masses. Le champ lectrique axial admet donc une composante positive composante ngative
Ez ,quad
RF
et une
E z ,lens
RF
qui, pour toutes valeurs de X (Y = 0), conduisent une

Ez
RF
position sur laxe z pour laquelle le champ est nul : surfaces porte le nom de cne de rflexion . II.2.3. Le cne de rflexion
0 . Lemplacement de ces
Ce point dsigne une surface pour laquelle la force axiale nette agissant sur un ion est nulle sur la dure dun cycle RF. La Figure 37 montre lvolution du champ axial total
Ez
RF
somme de Ez ,quad
RF
et E z ,lens
RF
en fonction de la position radiale X et axiale z.
93
Figure 37.
Cartographie des cnes de rflexion en fonction de la position radiale X et axiale z 224
Dans la Figure 38, le cadre (a) permet de visualiser la superposition des champs
Ez ,quad
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
RF
et E z ,lens
RF
. Lorsque les ions sont relativement loigns de la fin du quadriple,

RF
la contribution de E z ,lens champ total

Ez
RF
est plus importante que celle de Ez ,quad
RF
conduisant un
ngatif. Plus il se rapproche de lextrmit des lectrodes, plus
Ez ,quad
RF
devient important, phnomne dautant plus significatif que la position radiale X
est grande. Le cne de rflexion est atteint lorsque la courbe croise laxe des abscisses
Ez
RF
0 , autrement dit quand
Ez ,quad
RF
Ez ,lens
RF
. Les effets de champ augmentant
avec la distance radiale X, les cnes de rflexion sont par consquent atteints plus tt lintrieur du quadriple (z lev avec pour origine z = 0 la position de la lentille) comme le montre clairement le cadre (b). Finalement, les ions positionns gauche du cne de rflexion subiront une force axiale nette ngative contraire la direction de la lentille, alors que ceux situs droite seront sous linfluence dune force axiale nette positive dirige vers la lentille. En consquence, pour une tension de la lentille de sortie judicieusement choisie, les ions qui possderont une amplitude radiale suffisante seront capables de pntrer cette surface et dtre jects axialement, les autres seront rflchis. Ljection ou lisolement des ions dans une trappe dions linaire seffectue de manire similaire aux procds employs dans une trappe 3D, c'est--dire, soit en effectuant un balayage de la tension VRF conduisant les ions de rapport m/z croissant leur limite de stabilit, soit au moyen de lexcitation rsonnante en appliquant une frquence auxiliaire, gnralement dipolaire VAC, la frquence de rsonnance de lion donne par lquation (58). Employe judicieusement, lexcitation rsonnante permet galement de raliser des expriences de spectromtrie de masse en tandem dites MS/MS.223
94
III. La spectromtrie de masse en tandem

La spectromtrie de masse en tandem ou MS/MS est lacquisition et ltude du spectre des produits ou prcurseurs lectriquement chargs dun ou de plusieurs ions de rapport m/z slectionns, ou dions prcurseurs dune perte de masse neutre slectionne. Cette technique peut tre accomplie par des instruments faisceaux dions comportant plus dun analyseur (ex : triple quadriple) ou avec des instruments de type pige dions (ex : trappes 2D et 3D).213 Dans le premier cas, les analyses de masse sont ralises successivement dans des enceintes distinctes. Dans le second cas, lensemble des expriences sont effectues successivement dans le temps au cur de la mme enceinte. Ces techniques portent respectivement les appellations de MS/MS dans lespace et MS/MS dans le temps. Lobjectif de la MS/MS a t, dans un premier temps, dobtenir des informations tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 structurales sur les molcules ionises par des techniques dites douces. En effet, pour des techniques dionisation dures, telles que lionisation lectronique qui apporte assez dnergie interne aux molcules pour se fragmenter, une seule analyse en masse permet dobtenir de nombreuses informations structurales et dlucider la structure de la molcule. En revanche, les techniques dionisation douces telles que lESI, le MALDI et autre FAB gnrent essentiellement dans la source des espces protones ou dprotonnes avec pas ou peu de fragmentation. Les informations structurales apportes par une analyse en masse unique sont donc trs limites. Lide a t de trouver un moyen dexciter hors de la source les ions stables afin daccrotre leur nergie interne et, ainsi, de les faire fragmenter.227 Plusieurs mthodes dactivation faibles et hautes nergies ont t dveloppes pour exciter lion prcurseur ; elles dpendent du type dinstruments utiliss (Tableau 9).
Mthode
PSD
(Post-Source Decay)
Domaine dnergie
Faible Faible Haute
Instruments
RETOF QqQ, ITD, QqTOF, QqLIT, FTICR TOF en tandem, secteurs Hybride (BqQ), QqQ, ITD, FTICR TOF en tandem, RETOF FTICR
description
Dissociation induite par collision ou dorigine mtastable dans le tube de vol reflectron de linstrument temps de vol. Dissociation induite par collision par la collision de lion prcurseur avec des molcules inertes de gaz cibles. Domaine dnergie de 1-100eV. Idem quau dessus avec des nergies de lordre du keV Collisions entre les ions prcurseurs et une surface cible solide avec ou sans monocouche auto-assemble causant la fragmentation et des ractions secondaires. Idem quau dessus avec des ions precurseurs dnergies cintiques plus leves (dpendant des instruments) Faisceau dlectrons de basse nergie qui conduit la capture dlectrons sur les sites de protonation avec des fragmentations ultrieures suivant la chimie de lion radical. Onde continue de faible nergie produite par un laser infrarouge active les ions prcurseurs par ladsorption multiphotonique avec des fragmentations consquentes. Mthode dactivation thermique de faible nergie idale pour le calcul des seuils dnergies et des proprits thermodynamiques.
CID
(Collision Induced Dissociation)
SID
(Surface Induced Dissociation)
Faible Haute
ECD
(Electron Capture Dissociation)
Faible
IRMPD
(Infrared MultiPhotons Dissociation)
Faible Faible
ITD, FTICR ITD, FTICR
BIRD
(Blackbody Infrared Radiative Dissociation)
Tableau 9.
Description gnrale des procds dactivation adapte227
95
La dissociation induite par collision (CID) est le procd dactivation MS/MS le plus employ lheure actuelle.227 Ceci est d au fait quil est utilis dans les instruments de type triple quadriple et trappe dions qui sont les appareils les plus courants sur le march. Par consquent, aprs un bref rappel sur les processus de fragmentation, nous nous attacherons expliquer les particularits de lactivation par CID, les possibilits de scan offertes par ce mode en fonction des instruments, avant de conclure sur lutilit de la MS/MS dans le domaine de lanalyse de pesticides. III.1 La fragmentation par CID A la sortie de la source dionisation, les ions sont acclrs par lapplication dune diffrence de potentiel Vacc en direction de lanalyseur, confrant ainsi aux ions de mme rapport m/z une mme nergie cintique : tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Ec
1 2 mv 2
zVacc
(78)
o m est la masse de la molcule ionise, v sa vitesse et z le nombre de charge.
Le processus de collision complet se droule en deux tapes successives faisant intervenir, dans un premier temps, lexcitation de lion prcurseur suivie, dans un second temps, dune dissociation unimolculaire de lion :
mp
mp*
mf
mn
(79)
La premire tape consiste faire entrer en collision la molcule danalyte avec un gaz cible, ce qui conduit un transfert de lnergie cintique en nergie interne, celle-ci tant la somme de lnergie lectronique (Ee) et vibrationnelle (Evib). La conservation de la quantit de mouvement et dnergie, lors de la collision entre un ion et un atome de gaz, implique que seule une partie de lnergie cintique est convertie en nergie interne. Ce taux de conversion est reli la nature de la collision qui peut tre lastique ou inlastique. Lnergie totale disponible pour le transfert dnergie cintique en nergie interne est lnergie relative au centre de masse (Ecom) et dpend de manire importante des masses des particules impliques (quation (80)).
Ecom
mn Elab mi mn
(80)
96
o Elab est la quantit dnergie cintique de lion dans le rfrentiel du laboratoire, mn la masse de la cible neutre et mi la masse de lion prcurseur.228 Comme indique par lquation (80), Ecom augmente avec la masse de la cible et diminue avec la masse des molcules danalyte. Par consquent, le taux dnergie convertible en Eint sera dautant plus lev que le gaz sera lourd et la molcule dintrt lgre. La seconde partie du mcanisme correspond la dissociation unimolculaire de lion excit. La fragmentation de lion prcurseur aura lieu si et seulement si lnergie apporte par la collision est suffisamment leve pour exciter lion au-del de son seuil de dissociation. Ces dissociations unimolculaires en phase gazeuse sous vide peuvent tre expliques par deux thories : la thorie du quasi-quilibre (Quasy-Equilibrium Theory : QET)229 ou la thorie Rice, Ramsperger Kassel and Marcus (RRKM).230-233 Ces thories affirment que lion tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 excit rpartit son nergie interne de faon totalement alatoire sur tous les tats quantiques disponibles avant que la dissociation nait lieu, en favorisant les conversions internes vers ltat lectronique et les transitions vibrationnelles fondamentales.227 Par consquent, le modle dactivation en deux tapes suppose que ltape dactivation soit complte avant que ne commence la dissociation unimolculaire de lion. Cest donc le taux dnergie interne et non le mode dactivation qui va dfinir le processus de dissociation.228 Dautre part, la fragmentation de lion peut tre attribue lexcs dnergie vibrationnelle quil contient. Une liaison chimique peut, en effet, tre compare un oscillateur (un ressort) dont lamplitude des mouvements (son nergie vibrationnelle) conduit la rupture ou, en dautres termes, la fragmentation. Soit une raction de dcomposition :
AB
k (E)
(81)
o AB+ est un ion pseudo-molculaire, A+ un ion produit, B un fragment neutre et k(E) la constante de vitesse. Par approximation de la thorie du quasi-quilibre, la constante de vitesse k(E) est lie lnergie interne selon :
k E
Eint - E0 Eint
S -1
(82)
o S reprsente le nombre de degrs de libert,
le facteur de frquence et Eint et E0 sont
respectivement lnergie interne de lion et lnergie dactivation qui correspond lnergie minimale ncessaire la fragmentation (Figure 38).
97
Figure 38.
Diagramme dnergie illustrant lnergie dactivation E0 ncessaire au processus de dissociation
Daprs lquation (82), la raction de fragmentation sera dautant plus rapide que Eint excde E0 et que sera lev, privilgiant donc un tat de transition lche loose plutt que
tendu tight . Les spectres de masse obtenus par CID vont tre fonction de deux scnarios de fragmentation, savoir : tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
N N N
(1) m p
N
mf 1
N
mf 2
N
Etc.
(83)
(2) m p
m p*
m p**
ions produits
La premire raction dcrit la CID de lion prcurseur suivie par une succession de CID des ions produits activs, alors que la seconde illustre lactivation progressive de lion prcurseur pralablement la dissociation. Les processus dactivation par CID pour les ions organiques de masses modres (quelques centaines de g.mol-1) se classent en deux catgories : les collisions hautes nergies (high-energy collision) de lordre du keV qui sont gnralement ralises dans des instruments type secteurs et TOF/TOF et les collisions faibles nergies (low-energy collision) de lordre de 1 100 eV qui se droulent dans des spectromtres de masse type triple quadriple ou trappe dions avec, cependant, des diffrences dans le procd dexcitation.227 Concernant le QqQ, lexcitation de lion prcurseur est ralise au moyen de collisions avec un gaz cible, paralllement lapplication dune tension dans une cellule de collision ddie cet effet. Pour la trappe dions, lion prcurseur est isol et acclr par une excitation rsonnante en prsence de gaz (gnralement de lhlium). Dans les deux cas, le gaz cible joue un rle important dans lefficacit des collisions. Ainsi, un gaz lourd (Ar, Xe), de mme quune pression leve permettront daugmenter le rendement de fragmentation,234 la pression ayant galement une influence directe sur la transmission des ions.235 En rgle gnrale, les rendements dions produits en low-energy-CID sont trs levs, principalement
98
grce aux collisions multiples autorises par la pression du gaz et la longueur des cellules de collision dans les QqQs et par les temps allous au CID dans les trappes dions.227 La spectromtrie de masse en tandem offre la possibilit daccder une multitude dinformations qualitatives et quantitatives dont la nature va dpendre des instruments et des modes de scans utiliss.236 Le QqQ et la trappe dions, qui sont les deux technologies les plus employes dans le domaine des pesticides, prsentent chacune des spcificits intressantes. Le premier est trs clairement linstrument le plus adapt la quantification. Il dmontre, en effet, de meilleures qualits que la trappe dions en termes de prcision, linarit, robustesse150 ainsi que de meilleurs limites de dtection,237 notamment grce son mode SRM qui permet denregistrer spcifiquement un processus de fragmentation.5 En revanche la trappe dions permet dobtenir des spectres full scan plus sensibles et de meilleures qualits quun QqQ et offre galement la possibilit de faire de la MSn, c'est--dire de rpter tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lopration disolation et de fragmentation sur le ou les fragments de lion prcurseur. Les fabricants de spectromtres de masse essayent dsormais de combiner les qualits des divers analyseurs avec la mise au point de spectromtres de masse qualifis dhybrides de type : LIT/FTICR, Q-TOF ou QqLIT. Ce dernier sappuie sur les possibilits offertes par ljection axiale, mise au point dans les LIT224 pour intgrer cet analyseur dans un systme de type triple quadriple, ce qui permet cet instrument de cumuler les avantages des deux dispositifs.221,225 III.2 Les modes de scans dun spectromtre de masse hybride QqLIT Un spectromtre de masse triple quadriple comporte deux filtres de masse quadripolaires Q1 et Q3 fonctionnant en mode RF/DC spars par une cellule de collision q2 qui opre uniquement en mode RF. Le systme QqLIT ou QTrap (Figure 39) est un instrument dvelopp par la socit AB Sciex. Il est bas sur la mme configuration quun triple quadriple la diffrence que le troisime quadriple Q3 peut aussi bien oprer comme un quadriple classique (mode RF/DC) quen mode LIT. Le quadriple Q0 est utilis en temps que guide dions.
99
Figure 39.
Illustration du principe de foncionnement dun systme QqLIT avec la description de lensemble des modes de scans225
Ce dispositif, en plus des expriences de masse simple telles que le full scan et le tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 SIM (Selected Ion Monitoring), offre un nombre consquent de modes dacquisition MS/MS parmi lesquels se trouvent les modes classiques des QqQ, le balayage dion produit (PI : Product Ion Scan), le balayage dion prcurseur (PC : Precursor Ion Scan), le balayage dune perte de neutre (NL : Constant Neutral Loss) et le suivi de ractions slectionnes (SRM : Selected Reaction Monitoring). Lassociation de la LIT donne accs dautres modes dacquisition intressants, notamment lEPI (Enhanced Product Ion) qui est un balayage dion produit plus performant que le Product Ion (PI) dun QqQ, et la MS3 qui permet de raliser une exprience de masse supplmentaire. Aprs avoir expliqu le fonctionnement des modes de scan de base full scan et SIM , les modes PI, EPI et SRM, couramment utiliss dans lanalyse de pesticides seront plus particulirement dtaills. III.2.1. Mode full scan et Single Ion Monitoring (SIM) Ces deux expriences de MS simple sont disponibles sur des analyseurs de type simple quadriple et peuvent donc ici tre effectues avec les quadriples Q1 ou Q3.
Q1 q2 Q3
Q1
q2
Q3
balayage de m/z full scan
Rf
Rf
m/z fixe SIM
Rf
Rf
Figure 40.
Reprsentation schmatique des modes dacquisition full scan ( gauche) et SIM ( droite)
100
Le mode full scan permet danalyser lensemble des ions produits dans la source appartenant une gamme de rapport m/z dtermine et consiste balayer successivement ces rapports m/z. Ce mode dacquisition donne des spectres de masse fournis, reprsentatifs de lchantillon analys. Cependant, lorsque la molcule recherche est connue, lutilisation du mode SIM offre une plus grande slectivit et sensibilit puisquil permet de ne suivre quun seul rapport m/z pendant un laps de temps dtermin en utilisant des tensions adaptes sa dtection. Dans les deux cas, un seul quadriple est utilis en tant quanalyseur, les deux autres fonctionnent en mode RF, servant ainsi de guide dions. III.2.2. Le Product Ions Scan (PI) et l Enhanced Product Ions Scan (EPI) tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Ces deux modes dacquisition sont bass sur le mme principe et ncessitent la mise en uvre des trois quadriples. Le premier quadriple Q1 slectionne les ions de rapport m/z unique (mode SIM) qui vont se fragmenter par CID dans la cellule de collision q2. Ces ions conduisent, aprs dissociation, la formation dions produits qui vont tre dtects par Q3 oprant en mode quadriple dans le cas du PI, et en mode LIT dans le cas de lEPI.
Q1 q2 Q3
Q1
q2
LIT
SIM
CID
Full scan
SIM
CID
Full scan
Figure 41.
Reprsentation schmatique des modes Product Ions Scan ( gauche) et Enhanced Product Ions Scan ( droite)
Ce mode dacquisition permet dobtenir un spectre de masse caractristique dune molcule spcifique et donne accs de nombreuses informations structurales. Le mode PI se rvle galement trs utile pour la confirmation de molcule connue avec la possibilit de confronter le spectre de masse obtenu partir de lchantillon avec celui de rfrence. Lutilisation de la LIT pour effectuer le full scan permet de bnficier dune sensibilit accrue, de lordre de 200 pour la rserpine par exemple.151
101
III.2.3. Le Selected Reaction Monitoring (SRM) ou le Multiple Reaction Monitoring (MRM) Le mode dacquisition SRM est obtenu en faisant fonctionner les quadriples Q1 et Q3 en mode SIM. A noter que pour ce mode, labrviation MRM, bien que non recommande par lIUPAC, est couramment utilise.213
Q1 q2 Q3
SIM
CID
SIM
Figure 42.
Reprsentation schmatique du mode Selected Reaction Monitoring
Lutilisation du mode SRM permet de suivre un ion produit spcifique dune tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 fragmentation particulire de lion prcurseur. La relation entre un ion prcurseur et un ion produit est communment appele transition . Il est possible de suivre un nombre important de transitions au cours dune mme analyse, cela dpend des performances du spectromtre de masse, notamment de sa vitesse dacquisition. Dans tous les cas, ce mode offre une trs grande spcificit par le suivi dune ou plusieurs transitions spcifiques dun analyte et une trs grande sensibilit car toutes les conditions de dtection sont optimises pour chaque transition. Le mode SRM est donc le mode dacquisition de choix pour les mthodes multi-rsidus. III.2.4. Conclusion En plus de proposer des modes dacquisition polyvalents et tirant profit des avantages dun QqQ et dune LIT, le systme hybride QqLIT offre galement la possibilit de combiner plusieurs modes de scan au cours dune mme acquisition.225 Il est, ds lors, possible de raliser une premire exprience appele scan de surveillance pour laquelle, en fonction de critre(s) pralablement dfini(s), une ou plusieurs autres expriences (scans dpendants) peuvent tre dclenches. Il est par exemple faisable dassocier la sensibilit du mode SRM avec le pouvoir de confirmation du mode EPI.225,238 Il est donc dsormais possible de combiner lanalyse quantitative et qualitative avec le mme instrument et au sein dune mme analyse. De plus, le QqLIT dispose dune vitesse dacquisition leve, lui confrant une meilleure sensibilit compar au QqQ et ITD classique, de lordre dun facteur 10 pour un 4000 QTrap.10 Lensemble de ces qualits font du QqLIT linstrument le plus adapt ddi
102
lanalyse LC-ESI-MS/MS de rsidus de pesticides grce ses performances quantitatives suprieures et les nombreuses possibilits de confirmation offertes par ce systme hybride. La spectromtrie de masse en tandem est dune aide considrable dans lanalyse des rsidus de pesticides. En effet, si le couplage LC-MS sest rvl plus sensible et slectif que les anciens dtecteurs coupls la LC, il souffre nanmoins dun inconvnient majeur : les spectres de masse des pesticides obtenus par ionisation dans des sources API sont principalement constitus de lion pseudo-molculaire ou dun adduit et prsente peu de fragmentations.239 La slectivit et la sensibilit apporte par la MS/MS permet dune part, de minimiser la prparation de lchantillon239 et dautre part, de limiter la sparation chromatographique entre les analytes puisquil est trs rare de trouver des molcules partageant la mme unique transition (en mode SRM).5 Les performances impressionnantes tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 de la MS/MS conduisent souvent dlaisser la chromatographie qui reste pourtant un lment essentiel de la mise au point dune mthode analytique. Son optimisation assure une sensibilit et une robustesse optimum de la mthode et permet de limiter au maximum les divers problmes, limage des effets matrice. De plus si lamlioration constante des instruments (HPLC et MS) permet la quantification de composs des concentrations toujours plus basses, la confirmation de la positivit dune molcule, c'est--dire la certitude que la molcule dtecte soit bien celle suppose, est un sujet complexe auquel la rglementation essaye de rpondre. III.3 Les effets matrice et la confirmation des positifs La LC-ESI-MS/MS dispose dune trs grande slectivit vis--vis des composs analyss. En effet, avec des modes dacquisition tels que le SIM et le SRM, seul le signal dintrt est enregistr, laissant de cot les informations provenant dautres substances. Pour cette raison, certains chercheurs pensent que les effets matrice qui correspondent des augmentations ou des suppressions de signal de lanalyte causs par des composs co-lus, sont rduits ou limins avec lutilisation de ces modes, ce qui est une fausse ide.240 Les effets matrice sont gnralement dus linfluence des composs co-lus sur le processus dionisation de lanalyte, donc bien avant quil nintgre le vide du spectromtre de masse.240 La Figure 43 montre, par exemple, linfluence de diffrentes matrices sur le signal du triflumisol. Malgr lutilisation du mode SRM, les effets matrice entranent une suppression trs nette du signal atteignant presque une extinction totale dans le cas du poivre.241
103
Figure 43.
Influence de diffrentes matrices sur lintensit du signal du triflumisol acquis en mode SRM241
Les consquences de ces effets sont multiples, affectant diffrents aspects du rsultat analytique. En plus de la diminution du signal et donc dune augmentation de la limite de dtection, la rptabilit est galement affecte car le degr de suppression peut varier dun tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 chantillon un autre.242 De mme, cette variabilit peut entraner des modifications dans le ratio des ions, la linarit et la quantification. Finalement, dans le pire des cas, la suppression dions peut mener une non-dtection de lanalyte, une sous-estimation de sa concentration, ou encore des difficults de confirmation dues des problmes divers dans les critres didentification (changements de ratio des ions ou modification du spectre de masse).243 Bien que le mcanisme de suppression dions ne soit pas encore parfaitement connu, trois hypothses principales ont t dveloppes.240,243-245 La prsence de composs interfrents non-volatils issus de la matrice entrainerat une diminution de lefficacit dvaporation due une augmentation de la viscosit et de la tension de surface des gouttelettes, rduisant par consquent la capacit de lanalyte entrer en phase gazeuse.245 De mme, la co-prcipitation des analytes avec des macromolcules limiterait leur transfert en phase gazeuse. Le second mcanisme concernerait la comptition entre lanalyte et les composs interfrents en termes daffinit protonique vis--vis de lefficacit maximale dionisation, connue pour tre 10-5 mol.L-1.246 Enfin, la dernire hypothse se base sur la modification de lefficacit dionisation dans le processus de formation de la gouttelette par une altration de la tension de surface due la formation de fortes paires dions avec lanalyte prform en solution.244 Etant donn lorigine du mcanisme, il est vident que les effets matrice vont tre analytedpendant et fonction des interfrents de la matrice dont le temps de rtention concidera avec celui de lanalyte. Certaines stratgies ont t dveloppes pour dtecter chromatographiquement ces effets matrice240,243 et des solutions existent pour les liminer ou, du moins, les prendre en compte.240,243 La mise en place dtapes de purification247,248 ou un travail chromatographique247,249 plus pouss en termes de sparation peut conduire une nette
104
diminution des effets matrice. Sans pour autant les liminer, la mthode des ajouts doss, la prparation de gammes matrices,240,243,244 ou linjection post-colonne dune substance de rfrence250 permettent de prendre en compte les effets matrice et dassurer une quantification plus juste, contrairement la mthode du standard interne qui est difficilement applicable en multi-rsidus.242 Lutilisation de la spectromtrie de masse en tandem, bien qutant un atout considrable dans lanalyse multi-rsidus, nassure donc pas pour autant une certitude absolue du rsultat. Devant une inquitude grandissante concernant la confirmation des donnes, diffrents critres, visant assurer la qualit des rsultats et viter ainsi le report de faux positifs, ont t mis en place par la rglementation. La commission europenne a, par exemple, tabli la confirmation des positifs sur la base dun systme de points didentification qui dpendent des tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 techniques analytiques et autres modes dacquisition utiliss.251 Ainsi, en plus dune adquation du temps de rtention avec celui du standard, trois ou quatre points didentification sont ncessaires selon la catgorie des contaminants. Par exemple, la slection dun ion prcurseur et lenregistrement de deux ions produits en SRM (2 transitions) apportent quatre points. De plus, des guides relatifs la validation de mthodes et au contrle qualit tels que le guide SANCO/31/31/2007, prconisent galement un respect des ratios relatif entre les ions produits de lordre de 10 50 %.252 Ces tolrances ne dpendent cependant ni de la concentration de lanalyte, ni de la matrice tudie puisque, mme si des effets matrice peuvent avoir lieu en ESI, la slection en masse de lion prcurseur par le premier quadriple est cens liminer toutes les interfrences pralablement la fragmentation. Par consquent, la fragmentation de lion prcurseur en q2 devrait mener des ions produits identiques, que lanalyte provienne dune solution de standard ou dun chantillon de matrice. Or, comme le dmontre le travail de Kauffman et al., ce critre de ratio nest pas sans quivoque.253 En effet, pour les molcules prsentant plusieurs sites de protonation, les conditions dionisation et, notamment la prsence de composs interfrents, ont une influence directe sur le site o va se fixer le proton pour former lion [M+H] +. En fonction de ce site, la formation dun ion produit plutt quun autre lors de la fragmentation peut alors tre privilgie. De plus, faible concentration, lune des transitions peut ne pas tre assez sensible pour tre dtecte. Dans ce cas, la possibilit deffectuer un scan EPI avec un QqLIT peut tre une solution de confirmation envisageable.
105
Chapitre III
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Mise au Point de la Mthode dAnalyse Multi-Rsidus LC-ESI-MS/MS
Avant daborder la problmatique lie lanalyse de pesticides dans les huiles essentielles, la premire tape du dveloppement dune mthode danalyse multi-rsidus LCESI-MS/MS consiste optimiser lensemble des paramtres analytiques dans le solvant dinjection. Ainsi, ce chapitre, compos de quatre parties, traite successivement de loptimisation des paramtres de dtection propres chaque substance active en spectromtrie de masse, du cahier des charges impos par le couplage LC-MS/MS, de loptimisation de la sparation des pesticides en chromatographie liquide et, enfin, des performances analytiques de la mthode ainsi mise au point avec un nouveau mode dacquisition : le Scheduled SRM.
106
Chapitre III. Mise au point de la mthode danalyse LC-ESI-MS/MS
A) Optimisation des paramtres de dtection en spectromtrie de masse

La premire tape dans la mise en place dune mthode danalyse LC-ESI-MS/MS est loptimisation des paramtres de dtection en masse. Ltude bibliographique a montr que le mode dacquisition le plus appropri pour la quantification des pesticides dans les huiles essentielles est le mode SRM. Pour que ses performances soient optimales, ce mode ncessite de dterminer un ensemble de paramtres spcifiques chacune des substances actives analyses. Aprs une prsentation des spcificits du spectromtre de masse 4000 QTrap, loptimisation des conditions de dtection en mode SRM sera dtaille.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
I.
Le spectromtre de masse 4000 QTrap

Le 4000 QTrap est un spectromtre de masse nouvelle gnration. Cest un systme
hybride de type QqLIT bas sur la configuration dun triple quadriple o Q3 peut tre utilis, selon les cas, en mode RF/DC comme un quadriple classique, ou en mode LIT (voir Figure 44).
orifice 1 Torr Patm 6/8 mTorr skimmer
~1.10-5 Torr
Cellule de collision
LIT
CEM
Q0 DP Source Turbo V
Q1
CE
Q2
CXP
Q3
Triple Quadriple
Figure 44.
Illustration schmatique dun spectromtre de masse 4000 QTrap sur laquelle son galement mentionnes les
diffrentes tensions appliques en mode SRM : DP (Declustering Potential), CE (Collision Energy), CXP (Cell Exit Potential)
La Figure 44 prsente de faon schmatique un 4000 QTrap aux travers des lments qui le composent. Les principales composantes du systme intervenant dans le mode SRM et les pressions qui rgnent dans les diffrentes parties de linstrument sont mentionnes sur la Figure 44. Afin de le prsenter de manire globale, il a t choisi dexposer les lments et paramtres importants en suivant le cheminement dune molcule analyse en mode SRM. La molcule en solution arrive dans le spectromtre de masse par lintermdiaire de la source dionisation TurboV. La source TurboV est une source API, assiste par nbullisation pneumatique, capable de fonctionner des dbits de phase mobile de 1 mL.min-1 en ESI.167
107
Pour atteindre des dbits de cet ordre, il faut pouvoir vaporer une grande quantit de solvant tout en vitant, au maximum, les contaminations provenant de lentre de gouttelettes dans lanalyseur. La source TurboV a donc une gomtrie dite orthogonale de manire ce que le spray soit cr perpendiculairement lorifice.
GS 1 GS 2 lectrode ESI GS 2
air chaud
orifice spray exhaust
Figure 45.
Photographie de la source Turbo V ( gauche) et son schma descriptif adapt ( droite)167 illustant les flux de gaz GS1 (gaz de nbullisation) et GS2 (gaz de dsolvatation)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
En plus du gaz de nbulisation (GS1), deux sources auxiliaires gnrent du gaz chauff (GS2) assurant une dsolvatation optimale de lluant. Si, dans notre cas, le gaz utilis est de lair, il est galement possible dutiliser de lazote. Le dbit de ces gaz, de mme que la temprature de chauffage (TEM), sont des paramtres optimiser en fonction du dbit et de la composition de lluant. De manire gnrale, plus le dbit sera lev, plus les valeurs de ces trois paramtres devront tre augmentes. La conception de la source TurboV permet galement de changer rapidement de type dionisation en permutant simplement les sondes dintroduction ddies lESI et lAPCI, reprsentes dans la Figure 46.
Sonde ESI
Sonde APCI
Figure 46.
Photo des lectrodes ESI et APCI
Par lapplication dune tension de spray (IonSpray voltage, IS) entre llectrode ESI et la contre-lectrode (Curtain plate), la molcule danalyte va tre ionise tout en passant de ltat liquide ltat gazeux selon le processus dionisation par electrospray dcrit dans le chapitre prcdent. Lion pntre ensuite dans linterface Patm-vide constitue de lorifice, du skimmer et du quadriple Q0. Un flux de curtain gas ou gaz rideau qui peut tre de lazote est inject entre la curtain plate et lorifice afin de prvenir lencrassement de lorifice. Ensuite, lion est soumis une tension de dclusterisation (DP) pour liminer les dernires traces de
108
solvants, puis acclre avant dentrer dans le quadriple Q0. La fonction principale de Q0 consiste refocaliser les ions. En mode SRM, le quadriple Q1 va slectionner lion dintrt de rapport m/z avec une rsolution unitaire. Pour un rapport m/z = x, les ions transmis en q2 seront tous les ions de rapport m/z = x 0,5 u. Les ions entrent ensuite dans la cellule de collision q2 de type LINAC (Linear Accelerator) o ils vont subir un processus de dissociation induite par collision avec lapplication dune tension CE (Collision Energy) en prsence dun gaz de collision, lazote. Les collisions des ions avec le gaz peuvent aussi entraner un refroidissement et surtout une diminution de leur vitesse axiale, ce qui mne des temps de rsidence relativement longs qui peuvent conduire, dans certains cas, la formation dadduits ou des phnomnes de cross-talk.254,255 Le crosstalk, illustr par la Figure 47, peut survenir en SRM lorsque sont analyses des substances qui tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 partagent des ions prcurseurs ou fils de mme rapport m/z.
Cellule de collision Q2 Cellule de collision Q2
transition n
transition n+1
400
200
300
200
Figure 47.
Schmatisation du phnomne de cross-talk dans la cellule de collision lors du passage dune transition n 400200 une transition n+1 300200
Le passage dune transition lautre est trs rapide dans ce mode et tous les ions nont pas toujours le temps dtre vacus. Par exemple, dans le cas de la Figure 47, une rponse sera observe pour la transition m/z 300200 cause des ions rsiduels de rapport m/z 200 provenant de la dissociation par CID des ions m/z 400. Lapplication dun gradient de champ lectrique permet la LINAC dacclrer les ions vers Q3 et, ainsi, dviter ces phnomnes tout en amliorant la vitesse de scan.254,255 De plus, lapplication dune autre tension la sortie de q2, dite CXP (Cell Exit Potential) et qui est spcifique chaque fragment, permet damliorer la transmission vers Q3. Le quadriple Q3 filtre ensuite le fragment de rapport m/z dintrt dont le signal va tre finalement dtect et amplifi au moyen dun dtecteur de type CEM (Channel Electron Multiplier) quand linstrument opre en mode SRM. Q3 peut aussi fonctionner en mode LIT. Dans ce cas, le quadriple Q0 a la capacit de retenir les ions (Q0 trapping), ce qui a pour effet damliorer considrablement le duty cycle qui correspond au temps de travail.256
109
II. Optimisation des rendements dions fragments travers ltude de

lion [M+H]+ de la butraline
Lacquisition en mode SRM ncessite de dterminer un certain nombre de paramtres qualifis de compos-dpendant pour chacune des substances actives tudies, les principaux tant : le rapport m/z de lion prcurseur (filtr en Q1), les rapports m/z des deux fragments principaux (filtrs) en Q3, la tension de dclusterisation optimum, les nergies de collision CE donnant les meilleurs rapports de fragmentation, les tensions de sorties CXP qui optimisent la transmission des ions fragments.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
La procdure employe pour y parvenir est relativement simple. Elle consiste injecter individuellement les substances actives une concentration de 100 g.L-1 avec un dbit de lordre de 10 L.min-1. Lutilisation de dbit de cet ordre permet de se concentrer sur les paramtres de dtection en limitant linfluence dautres facteurs tels que la temprature et le gaz chauffant qui nont pas besoin dtre activs pour assister lvaporation. Le solvant de dilution est par contre important et il est conseill de se placer dans des conditions proches de ce que seront les conditions chromatographiques. En effet, nous avons mis en vidence, dans le chapitre prcdent, limportance de la composition des phases mobiles dans le processus dionisation. Lactate dammonium est, par exemple, utile pour ioniser les molcules neutres et moins polaires en formant des complexes de type [M+NH4]+. Le solvant dinjection tait donc, dans un premier temps, constitu dun mlange MeOH/Eau (50/50) enrichi avec 5 mM dactate dammonium. La concentration de la substance active, ainsi que les proportions en solvants et additifs pouvaient tre modifies dans un second temps en fonction de la premire observation, pour favoriser lionisation et la dtection de lion prcurseur et, ainsi, faciliter son optimisation. II.1 Optimisation de lintensit de lion prcurseur Le processus dionisation par electrospray conduit la formation de plusieurs ions partir de la molcule initiale qui, comme nous lavons dj vu, peuvent se prsenter sous la forme [M+H]+ ou sous forme dadduits du type [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+. Dun point de vue quantitatif, les adduits sodium et potassium ne peuvent pas tre utiliss car leur formation, due la prsence dlments alkino-terreux dans la verrerie par exemple, est difficilement
110
contrlable. Gnralement, ce sont les ions de type [M+H]+ et [M+NH4]+ (contrls par ajout dactate dammonium dans les phases mobiles) qui sont privilgis. Pour certains composs, il est possible dobtenir une rponse en mode ESI- avec la formation dions [M-H]-. Dans tous les cas, lion prcurseur slectionn sera celui qui donne le signal le plus intense. Prenons lexemple de loptimisation de la substance active butraline dont la formule dveloppe, la formule brute et les masses moyenne et monoisotopique sont dtailles dans la Figure 48.
Butraline
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Formule brute Masse moyenne Masse monoisotopique

Figure 48.
C14H21N3O4 295.33 g/mol 295
Caractristiques de la molcule de butraline
Un balayage en full scan dans la gamme de masse de rapport m/z = 250-350 permet de visualiser les diffrents adduits possibles : [M+H]+ = 296, [M+NH4]+ = 313, [M+K]+ = 314, [M+Na]+ = 306. Lion le plus intense observ correspond la protonation de la molcule sur lamine secondaire de la butraline. La DP va donc tre optimise en balayant une gamme de tensions entre 0 et 100 V de manire valuer son effet sur la rponse de lion [M+H]+ de rapport m/z 296 (Figure 49).
Figure 49.
Graphique reprsentant lvolution de la rponse de lion prcurseur (intensit en coups) en fonction de la variation de la DP (en V)
La Figure 49 montre trs clairement linfluence de la DP sur la rponse dun ion et limportance doptimiser cette tension. La courbe dcrit une augmentation rapide de lintensit de lion m/z 296 entre 0 et 36 V, admet un maximum pour une tension de dclusterisation gale 36 V et diminue rapidemment pour finalement atteindre une valeur proche de 0 pour des tensions suprieures 120 V. Lallure de cette courbe, compose de
111
deux segments, sexplique par la succession de deux phnomnes. Laugmentation de la DP conduit une amlioration de lefficacit de la dclusterisation qui a pour consquence une production dions nus de rapport m/z 296 plus importante. Pour une DP > 36 V, lnergie transfre au cours des collisions conduit non seulement participer ltape de dsolvatation suprathermique, mais surtout accrotre lnergie interne de lion au-dessus de son seuil de dissociation. Les fragmentations ainsi induites, contribuent une diminution du signal de lion prcurseur. Ce phnomne, similaire celui se produisant dans une cellule de collision, est appel CID in source . Cette exprience permet donc de dterminer la DP qui assurera le maximum de sensibilit. Dans le cas de la butraline, la DP est gale 36 V. Ltape doptimisation suivante consiste dterminer les deux ions produits principaux, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 accompagns de leurs paramtres respectifs CE et CXP, permettant de maximiser la formation de ces fragments (CE) dans la cellule de collision et leurs transmissions vers Q3 (CXP). II.2 Optimisation de lintensit des ions fragments caractristiques Les ions fragments susceptibles dtre conservs pour lanalyse, sont slectionns partir dun spectre dions produits ralis non pas avec une nergie de collision constante, mais avec un balayage sur une gamme de valeurs de tensions, de manire obtenir un spectre de masse reprsentatif des diffrents types de fragmentation de lion prcurseur (Figure 50).
Figure 50.
Spectre de masse dions produits de lion prcurseur (m/z 296) de la butraline obtenu avec un balayage dnergie de collision CE et reprsentatif des diffrents types de fragmentation de lion prcurseur
Le spectre de masse ci-dessus met en vidence la fragmentation de lion m/z 296 en deux ions produits principaux m/z 240 et m/z 222. Lobjectif est, ds lors, de favoriser la dissociation de lion prcurseur en ces deux ions produits au dtriment des autres dans le but
112
dobtenir la meilleure sensibilit. Ceci est effectu en dterminant lnergie de collision adapte au chemin de fragmentation concern. Afin dviter de mettre de ct des ions qui pourraient se rvler intressants par la suite, loptimisation de la CE est ralise pour les quatre fragments principaux de rapport m/z 240, 222, 132 et 77.
296 240
296 222
296 132 296 77
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Figure 51.
Evolution de lintensit des ions produits en fonction lnergie de collision
La Figure 51 montre quil existe une nergie de collision optimale pour chaque transition. Elle est respectivement de 19, 31, 65 et 105 V pour les ions m/z 240, 222, 132 et 77. Ce graphique met galement en vidence que plus la CE est grande, plus la dissociation de lion prcurseur conduit des fragments de faibles masses, consquence dune nergie interne accumule de plus en plus importante. Dans le cas de la butraline, les deux transitions SRM les plus sensibles sont donc la SRM1 296240 et la SRM2 296222. Le Schma 10 prsente le mcanisme de fragmentation suppos, expliquant la formation de lion produit m/z 240 partir de lion prcurseur m/z 296.
NO2 N H NO2 m/z 296 NO2 N H NO2 NO2 H H Allongement de la liaison en de la charge H Shift [1,2] d'hydrogne N H NO2 H
NO2 Sparation des partenaires du complexe ion-neutre, le proton restant sur l'entit de plus faible affinit protonique m/z 240 NH3 NO2
NO2 NH3 NO2 Formation d'un complexe ion-neutre
Schma 10.
Mcanisme de fragmentation caractristique de la transition 296240
Lion produit de rapport m/z 222 peut, a priori, avoir deux origines. Ainsi que le montre le Schma 11, il peut tre issu de la dissociation de lion fils m/z 240 conduisant la perte dune
113
molcule deau. Mais on peut aussi considrer un autre prcurseur pour cet ion m/z 222. Dans ce cas, il sagit de dcrire la formation de celui-ci partir de la perte dun groupement butyl provenant de lion m/z 279, lui-mme issu de la perte dun radical hydroxyl partir du m/z 296 (voir Schma 12).
NO2 NH3 NO2 m/z 240 NO2 NH3 N O O NO2 NH2 N OH O
NO2 NH N O
NO2 NH N OH O H
NO2 NH N OH OH
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OH
NO2 NH N O H2O
NO2 NH N m/z 222 O
OH2
Schma 11.
Premier mcanisme de fragmentation caractristique de la transition 296222

O NO2 N H H NO2 m/z 296 N O N H H NO2 Perte du radical OH HO N O N H NO2
NO N H C 4 H9 Rupture intie par le radical NO2 Formation d'un radical cation
NO N H NO2 m/z 279 N O N H NO2
NO
NH NO2 m/z 222
Schma 12.
Second mcanisme de fragmentation caractristique de la transition 296222
Le mcanisme de fragmentation suppos selon lequel lion m/z 222 serait issu dune fragmentation secondaire de lion m/z 240 (Schma 11) semble tre corrobor par
114
linterprtation des courbes de la Figure 51. En effet, laugmentation significative du signal de la transition 296222 (courbe verte) a lieu juste aprs que celui de la transition 296240 (courbe grise) ait atteint son maximum. Cette hypothse pourrait probablement tre confirme au moyen dune exprience de type MS3. Les paramtres de fragmentation tant maintenant connus, il ne reste qu optimiser la transmission des ions produits entre q2 et Q3 travers la CXP (Figure 52).
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Figure 52.
Evolution de lintensit de la transition 296240 en fonction de la CXP
Comme en tmoigne la Figure 52, la CXP a un impact bien moindre que les paramtres prcdemment dcrits (DP et CE) sur la sensibilit de la transition. En effet, le signal volue peu sur lensemble de la gamme de tensions testes (0-50 V) avec cependant une baisse lgre mais significative de la rponse pour des CXP suprieures 20 V. Lensemble des paramtres de dtection obtenus durant loptimisation de la butraline peuvent tre rsums dans un tableau de la forme :
Transition Butraline -1 Butraline -2 Forme de lion prcurseur [M+H] [M+H]
+ +
Q1 (m/z) slection de lion prcurseur 296,0 296,0
DP (V) 36 36
Q3 (m/z) slection de lion produit 240,0 222,2
CE (V) 19 31
CXP (V) 16 12
Tableau 10.
Tableau type rcapitulatif dune optimisation (dans ce cas la butraline)
III. Bilan des paramtres de dtection en mode SRM des autres pesticides
Au cours de ce projet, un peu plus de 250 substances actives, dont les paramtres de dtection sont disponibles en Annexe 5, ont t optimises selon la manire dcrite ci-dessus. Si, dans la suite du projet, certaines de ces molcules ont d tre retires de la mthode multirsidus pour des raisons de sensibilit, dautres nont pas abouti ltablissement de paramtres de dtection malgr les diffrentes tentatives doptimisation. Cest le cas, en particulier, des molcules du Tableau 11.
115
Substance active
Famille chimique (sous famille)
Formule plane
PM
Formule brute
Log Kow
Benfluraline
Dinitroanilines
335,28
C13H16F3N3O4
5,29
Bromopropylate
Benzilate
428,1
C17H16Br2O3
5,4
Chlorothalonil
Organochlors
265,92
C8Cl4N2
2,94
Dichlobnil
Benzonitriles
172,01
C7H3Cl2N
2,7
Dicofol
Organochlors
370,49
C14H9Cl5O
4,3
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Lindane ( -HCH)
Organochlors
290,83
C6H6Cl6
3,69
Quintozene
Organochlors
295,3
C6Cl5NO2
4,46
Tefluthrine
Pyrthrinode de synthse
418,73
C17H14ClF7O2
6,4
Tetradifon
Sulfone sulfonate
356,06
C12H6Cl4O2S
4,61
Trifluraline
Dinitroanilines
335,28
C13H16F3N3O4
5,27
Tableau 11.
Liste de la dizaine de molcules non ionises en ESI au cours de la prsente tude
Les molcules exposes dans le Tableau 11 se caractrisent par une faible, voire trs faible polarit avec des log Kow > 4 lexception du chlorothalonil (2,94), dichlobnil (2,7) et lindane (3.69). De plus, ces composs prsentent peu de sites de protonation ou de dprotonation. En consquence, il est trs difficile de les ioniser par le processus delectrospray, comme en tmoigne le travail dAlder et al. qui ne fait tat daucune rfrence danalyse LC-MS/MS pour ces substances actives.20 Au vu de leurs caractristiques, elles sont gnralement analyses en GC-MS ou GC-MS/MS avec une ionisation de type EI ou CI. Parmi les substances actives optimises, le Tableau 12 prsente les paramtres de dtections de 70 pesticides qui ont t optimiss prioritairement pour effectuer les premiers
116
essais. 63 dentre eux appartiennent la liste prioritaire dfinie dans la premire partie de ce mmoire.
Pesticide 2,4D Abamectine Acphate Actamipride Acibenzolar-S-mthyl Aclonifen Acrinathrine Amidosulfuron Azoxystrobine Benalaxyl Bentazone Bifenthrine Bromacil Buprofzine Butraline Carbaryl Carbendazime Carbtamide Carbofuran Chlorfenvinphos Chloridazon Chlorpyrifos Clopyralide Cycloxydime Cyhalothrine-( ) Cyromazine Deltamethrine Dicamba Difnoconazole Diflufnican Dimthnamid Dimthoate Diuron Ethion Ethofumsate Ethoprophos Fluazifop-p-butyl Flurochloridone Fluroxypyr Haloxyfop Iprodione Isoproturon Isoxaben Lnacil Linuron MCPA Mcoprop Mfnoxam Mtamitron Mtazachlor Mthomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oryzalin Oxadiazon Oxyfluorfne Pendimthalin Pirimicarbe Promtryn Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymetrozine Quizalofop-p-ethyl Simazine Sulfosulfuron Tau-fluvalinate Tbuconazole Triclopyr Ion prcurseur [M-H][M+NH4]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+NH4]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M-H][M+NH4]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+NH4]+ [M+H]+ [M+NH4]+ [M-H][M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M-H][M-H][M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M-H][M-H][M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M-H][M+H]+ [M+NH4]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M-H]DP* (V) -41 66 26 56 46 66 46 41 36 46 -71 41 21 26 36 31 61 21 36 56 76 41 56 51 36 66 56 -30 61 56 31 11 66 36 81 61 51 81 -45 -81 61 46 51 56 66 -46 -51 46 61 21 26 46 31 81 -90 86 41 51 36 51 71 36 36 76 71 46 31 81 21 -36 SRM1 (Quantification) 219,0/169,9 890,5/305,1 184,1/142,9 223,1/126,0 211,2/140,0 265,1/248,0 559,1/208,1 370,0/217,9 404,0/372,0 326,3/148,1 239,1/132,0 440,1/166,1 261,0/205,0 306,2/201,2 296,0/240,0 202,1/145,1 192,1/160,1 237,1/192,0 222,1/165,0 359,0/155,0 222,0/104,2 349,9/198,1 192,1/110,1 326,1/280,1 467,1/225,0 167,2/85,1 521,0/278,9 218,9/174,7 406,1/251,0 395,1/265,8 276,1/168,1 230,0/199,0 233,0/72,0 385,0/199,1 287,1/259,1 243,0/130,9 384,1/282,1 312,0/291,9 252,9/194,7 360,0/287,9 330,1/244,9 207,1/72,0 333,1/165,0 235,1/153,1 249,1/182,1 199,0/140,8 213,0/140,7 280,2/160,1 203,1/104,1 278,1/134,2 163,0/88,0 224,1/127,0 272,3/129,0 304,0/284,1 345,0/281,1 345,0/220,0 379,0/316,1 282,1/212,0 239,2/72,0 242,0/158,0 342,1/123,1 256,1/190,0 252,0/91,1 218,2/105,1 373,1/298,9 202,1/132,0 471,1/261,0 503,1/208,1 308,0/70,1 255,9/197,9 SRM1 CE (V) -14 35 13 29 31 25 23 31 19 27 -32 57 19 17 21 15 25 13 17 19 31 25 47 17 23 27 23 -10 37 33 33 13 31 17 15 29 27 29 -18 -15 21 33 25 21 21 -18 -14 31 33 29 13 21 21 31 -26 29 25 15 31 31 83 19 29 27 25 27 23 17 39 -12 SRM1 CXP (V) -15 18 12 22 22 14 15 15 15 15 -15 8 10 15 16 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 14 12 -9 15 15 15 15 15 15 14 10 15 15 -9 -15 20 15 8 15 15 -15 -15 15 18 15 14 15 15 15 -5 12 16 10 15 15 22 15 15 15 15 15 15 12 15 -15 SRM2 (Confirmation) 219,0/124,9 890,5/145,2 184,1/124,9 223,1/90,0 211,2/136,0 265,1/182,1 559,1/181,1 370,0/260,9 404,0/343,9 326,3/208,2 239,1/197,0 440,1/181,1 261,0/187,9 306,2/116,2 296,0/221,9 202,1/127,1 192,1/132,1 237,1/118,1 222,1/123,0 359,0/99,2 222,0/92,2 349,9/96,9 192,1/146,0 326,1/180,1 467,1/141,2 167,2/108,1 521,0/504,1 218,9/140,9 406,1/337,1 395,1/246,1 276,1/244,1 230,0/125,0 233,0/159,9 385,0//171,0 287,1/121,1 243,0/96,9 384,1/328,1 312,0/145,0 252,9/232,8 / 330,1/288,0 207,1/165,2 333,1/85,0 235,1/136,1 249,1/160,0 / / 280,2/220,2 203,1/175,1 278,1/210,0 163,0/106,1 224,1/98,0 272,3/171,0 304,0/160,1 345,0/78,0 345,0/302,9 379,0/237,1 282,1/194,0 239,2/181,9 242,0/200,0 342,1/159,0 256,1/173,0 252,0/128,1 218,2/79,0 373,1/271,0 202,1/124,1 471,1/211,1 503,1/181,1 308,0/125,0 255,9/219,8 SRM2 CE (V) -34 51 25 49 39 41 43 19 29 21 -24 21 37 21 29 35 41 19 29 43 35 41 29 25 57 31 15 -10 23 43 19 29 33 23 23 43 23 63 -10 / 17 19 19 43 23 / / 19 25 15 15 17 23 41 -64 19 39 25 21 25 39 31 17 47 33 25 21 39 47 -6 SRM2 CXP (V) -15 14 10 16 12 18 15 15 15 15 -15 10 15 15 22 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 18 14 -1 15 15 15 15 15 15 10 6 15 15 -1 16 15 14 15 15
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
15 10 15 8 15 15 15 -1 16 15 10 15 15 8 15 15 15 15 15 15 10 15 -15
Tableau 12.
Liste des paramtres de dtection de 70 pesticides analyss dans le contexte de la prsente tude
117
Les ions prcurseurs des 70 pesticides prsents dans le Tableau 12 sont trs majoritairement de la forme [M+H]+ (55/70). Neuf molcules sont analyses en mode ESI(en bleu) avec la formation dion [M-H]- qui sexplique par la prsence de proton(s) acide(s) dans leur structure. Les six dernires molcules (en rouge) admettent un ion prcurseur sous la forme dadduit ammonium [M+NH4]+. A noter que ces molcules, qui appartiennent la famille des pyrthrinodes (acrinathrine, bifenthrine, cyhalothrine- , deltamthrine), des avermectines (abamectine) ou des diphnyl ther (oxyfluorfne) sont relativement peu polaires avec un log Kow compris entre 4 (abamectine) et 6,9 (cyhalothrine- . Il faut galement noter que, parmi les 70 substances actives du Tableau 12, trois molcules ne prsentent quune transition SRM. Il sagit de lhaloxyfop, du MCPA et du mcoprop pour qui le processus de fragmentation par CID ne conduit qu un seul ion majoritaire, correspondant la perte de la partie portant la fonction acide. Lexemple du MCPA est donn tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dans le Schma 13.
O Cl O MCPA MW : 200 u
Schma 13.
O O Cl O [M-H]- : m/z 199 O Cl O Ion fragment m/z 141 + O
OH
Proposition dun mcanisme de fragmentation du MCPA
Les paramtres de dtection exposs dans le Tableau 12 vont permettre de crer une mthode dacquisition capable danalyser les 70 pesticides (137 transitions). Etant donn le mode de fonctionnement du SRM, c'est--dire Q1 et Q3 en mode SIM et q2 en mode RF, il est vident que le spectromtre de masse ne peut pas scanner toutes les transitions en mme temps. Des paramtres de temps sont donc prendre en considration, notamment dans le cas dun couplage avec la chromatographie liquide.
118
B) Cahier des charges impos par le couplage LC-MS/MS

I.
Le temps, un facteur crucial du mode SRM classique
De manire simplifie, lacquisition en mode SRM suppose que le spectromtre de masse applique les paramtres de dtection propres la premire transition pendant un certain laps de temps avant de passer la deuxime, puis ventuellement la troisime, ceci jusqu la dernire transition qui constitue la fin dun cycle de scan. Le spectromtre de masse recommence alors lacquisition de la premire transition et rpte ce processus durant toute la dure de la mthode danalyse. La dure du cycle est lie la vitesse dacquisition du spectromtre de masse. Certains lments comme la LINAC contribuent acclrer ce processus. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Le mode de fonctionnement du mode SRM amne donc dfinir plusieurs paramtres de temps : le dwell time (dw), qui est le temps pass par le spectromtre de masse enregistrer une transition SRM ; le pause time ou temps de pause, qui est le temps mis par le spectromtre de masse pour appliquer les paramtres de dtection de la transition SRM suivante ; le duty cycle qui correspond au temps total de travail sur une transition SRM, c'est--dire laddition du dwell time et du pause time.
duty cycle dwell time
pause time
(84)
Le cycle time ou temps de cycle est le temps mis par le spectromtre de masse pour enregistrer une fois lensemble des transitions SRM.
cycle time duty cycle SRMs
(85)
Limpact de ces paramtres sur le rsultat qualitatif et quantitatif est considrable et, particulirement, dans le cas dun couplage avec une technique chromatographique. Afin dassurer une quantification fiable, il est admis quun pic chromatographique doit tre dfini par un nombre de dix points de donnes minimum, le temps de cycle par dfinition correspond au temps mis par le dtecteur pour crer un de ces points (voir Figure 53).
119
.
Figure 53. Reprsentation dun pic chromatographique avec les diffrents points de donnes
Compte tenu des relations (84) et (85), le nombre de transitions SRM, le dwell time et le temps de cycle, sont directement relis entre eux. Par consquent, plus le nombre de transitions SRM est augment dwell time constant, plus le temps de cycle sen trouve allong. Le spectromtre de masse va, par consquent, gnrer moins de points de donnes par pic (Figure 54) et donc occasionner une dgradation de la forme des pics qui aura un impact tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 direct sur la quantification.
Figure 54.
Impact dun temps de cycle plus long sur le nombre de points/pics
Pour viter ce problme, il est possible de diminuer le dwell time des transitions, voire galement le pause time et ainsi de conserver un nombre de points par pic convenable, comme lillustre la Figure 55.
Figure 55.
Influence du dwell time sur le temps de cycle et le nombre de points/pic gnrs
Bien videmment, le dwell time, tout comme le pause time, ne peuvent tre rduits indfiniment et dpendent de la vitesse dacquisition de linstrument. Dans le cas dun 4000 QTrap, les valeurs minimum du dwell time et du pause time sont respectivement de 5 ms et 2
120
ms, soit un duty cycle de 7 ms. De plus, une rduction du dwell time signifie que lanalyseur passe moins de temps sur lacquisition dune transition et la qualit du signal sen trouve affect, comme en tmoigne la Figure 56 qui montre lvolution du rapport S/N (Signal-toNoise) en fonction du dwell time pour la molcule dazoxystrobine injecte une concentration de 0,5 g.L-1.
Sample Name: "0.5 ppb 500 ms" Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A 1.4e4 Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 Acq. Time: 5:47:23 AM 11.41
1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4
Sample Name: "0.5 ppb 250 ms" Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 Acq. Time: 6:15:25 AM 1.5e4
Modified: Yes Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 70 Base. Sub. Window: 1.00 min Peak-Split. Factor: 10 Report Largest Peak: Yes Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 90.0 sec Expected RT: 11.4 min Use Relative RT: No Int. Type: Base To Base Retention Time: 11.4 min Area: 1.21e+005 counts Height: 1.55e+004 cps Start Time: 11.2 min End Time: 11.7 min
11.41
Sample Name: "0.5 ppb 100 ms" Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL 1.6e4 Acq. Date: 3/11/2011 Acq. Time: 6:43:26 AM
11.43
1.5e4 1.5e4 1.4e4 1.4e4 1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4
Sample Name: "0.5 ppb 50 ms" Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A 1.5e4 Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 Acq. Time: 7:11:27 AM
11.43
1.4e4 1.4e4 1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4
1.5e4 1.4e4 1.4e4 1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4
Dw = 500 ms
S/N = 1600
Dw = 250 ms
S/N = 1440
Dw = 100 ms
S/N = 811
Dw = 50 ms
S/N = 595
9500.0 9000.0 8500.0
1.0e4 9500.0
1.0e4 9500.0
9500.0 9000.0
In te n s ity , c p s
9000.0 8500.0 8000.0 7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0 4500.0 4000.0
7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0
8500.0 8000.0 7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0
9000.0
8000.0
8500.0 8000.0 7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0 4500.0 4000.0 3500.0
4500.0 4000.0 3500.0 3000.0 2500.0 2000.0 1500.0
5000.0 4500.0 4000.0 3500.0 3000.0 2500.0 2000.0 1500.0
3500.0
3000.0
3000.0 2500.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0

9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min
11.44
2500.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0
1000.0 500.0
Sample Name: "0.5 ppb 20 ms" Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 1.3e4 Acq. Time: 7:39:28 AM
1000.0 500.0
9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min
11.44
0.0
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0Sample Name: "0.5 ppb 20 ms" Sample ID: "" 13.2 13.4
File: "Essai Dwell time.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 1.3e4 Acq. Time: 7:39:28 AM
0.0
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0
0.0 Sample ID: "" File: "Essai Dwell time.wiff" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 7 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/11/2011 1.20e4 Acq. Time: 8:07:28 AM
Sample Name: "0.5 ppb 10 13.2 Name: "azoxystrobinems" 13.4 Peak -1"
XIC of0.0 +MRM (4 pairs): 404.0/372.0 Da ID: azoxystrobine -1 from Sample 2 (0.5 ppb 500 ms) of Essai Dwell time.wiff (Turbo Spray)
9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min
11.45
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0
13.2
13.4
9.6
9.8
10.0
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0
11.2
11.4 11.6 Time, min
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0
13.2
Max. 1.5e4 cps.

13.4
1.7e4 1.6e4
11.41
1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4 9500.0 9000.0 8500.0 8000.0
1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e4 9500.0 9000.0
1.15e4 1.10e4 1.05e4 1.00e4

11.40
Dw = 20 ms
11.40
Dw = 10 ms
11.40
Dw = 5 ms
11.47
1.4e4
9500.00 9000.00
7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0 4500.0 4000.0 3500.0
7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0
S/N = 440
8500.0 8000.0
S/N = 274
8000.00 7500.00 7000.00 6500.00
S/N = 200
11.51 11.37
11.59
8500.00
1.2e4
1.0e4
6000.00 5500.00 5000.00 4500.00
8000.0
6000.0
4500.0
4000.00
4000.0
3500.00
3500.0 3000.0 2500.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
3000.0 2500.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0 0.0 9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 13.4
3000.00 2500.00 2000.00 1500.00

11.34
4000.0
11.53
2000.0
11.56
1000.00 500.00
9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 13.4
11.33
0.0
9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 Time, min 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 13.4
0.0
0.00
11.25
11.30
11.35
11.40
11.45
11.50 11.55 Time, min
11.60
11.65
11.70
11.75
11.80
Figure 56.
Evolution de lintensit et du rapport S/N de lazoxystrobine en fonction du dwell time inject une concentration de 0,5 g.L-1
Dans le cadre de mthodes danalyse multi-rsidus comprenant un nombre important de pesticides et donc un nombre global de transitions suprieur 100, une mthode courante consiste segmenter le temps danalyse en plusieurs fentres dacquisition en fonction du temps de rtention des analytes,153 comme lillustre la Figure 57.
Figure 57.
Illustration de la segmentation du temps danalyse en fonction du temps de rtention des analytes153
Ce procd permet denregistrer moins de transitions sur une priode de temps dfinie et, donc, de conserver des valeurs de dwell time plus leves. Cependant, lorsque le nombre de composs est trs important, il devient compliqu de mettre en place cette technique. Cest pourquoi un algorithme dynamique, permettant denregistrer les transitions de lanalyte seulement lors de son lution, a t mis au point : il sagit du mode Scheduled SRM.
121
II. La solution apporte par le mode Scheduled SRM

En combinant le temps de rtention de chaque compos avec une fentre de dtection et un temps de cycle fix par lutilisateur, le logiciel dite une mthode dacquisition dite scheduled SRM (sSRM), illustre par la Figure 58.
Temps de rtention
Fentre de dtection
Temps de cycle
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 58.
Editeur de mthode scheduled SRM
Elle permet au spectromtre de masse denregistrer les transitions de lanalyte seulement autour de son temps de rtention avec suffisamment de points de donnes pour gnrer un pic chromatographique bien dfini. Les paramtres dune mthode dacquisition sSRM sont directement relis la chromatographie. En effet, en plus de dfinir les temps de rtention de lensemble des analytes, il faut fixer une fentre de dtection (MRM detection window) commune lensemble des transitions et un temps de cycle (Target Scan Time).
La fentre de dtection dfinit la dure pendant laquelle la transition va tre enregistre. Par exemple, dans le cas du mthomyl dont le temps dlution est estim 2,3 min (Figure 58), une fentre de 60 s conduira lacquisition de ses deux transitions entre 1,8 et 2,8 min. Plus les pics chromatographiques seront fins et plus les temps dlution seront reproductibles, plus la fentre de dtection SRM sera troite. De cette manire, le nombre de transitions SRM concurrentes chaque temps t est considrablement rduit, comme lillustre la Figure 59 qui prsente la simulation dune mthode dacquisition SRM comprenant 480 transitions rparties le long du run chromatographique avec des fentres dacquisition de 30, 60, 90 et 120 s.
122
100
MRM detection window

30s 60s 90s 120s
Number of concurrent SRM's
SRMs max
80
60
40
20
10
15
20
25
Time (min)
Figure 59.
Evolution du nombre de transitions SRM enregistres au temps t en fonction de la fentre de dtection
Contrairement au mode SRM classique o lensemble des 480 transitions seraient scannes sur toute la dure de lanalyse, le mode sSRM permet de rduire considrablement le tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 nombre de SRMs acquises chaque temps t. En effet, le nombre de SRMmax ne dpasse pas 24, 50, 62 et 78 pour des fentres de rtention respectives de 30, 60, 90 et 120 s (Figure 59). Le travail chromatographique est donc primordial et doit conduire lobtention de pics fins mais galement homognes, car la fentre de dtection sera dtermine par le pic le plus large. La diminution du nombre de SRMs concurrentes chaque temps t permet dallouer chacune delles un dwell time plus lev. Le logiciel calcule le dwell time maximum pour les espces co-lues en conservant le temps de cycle dsir. Ce dernier porte lappellation de Target Scan Time (TST), il indique combien de fois la transition sera enregistre au cours du pic chromatographique. Il est fix manuellement par loprateur pour gnrer suffisamment de points (au minimum 10) pour le pic le plus fin. Donc, si le pic le plus fin dun chromatogramme a une dure de 14 s, un TST de 1.4 s devrait conduire, en thorie, la cration de 10 points de donnes pour ce pic. En conclusion, cette simulation a permis de mettre en vidence limpact de la chromatographie sur les performances du Scheduled SRM. Pour bnficier au maximum des avantages de ce mode dacquisition, il faut disposer de pics relativement fins et homognes. Par consquent, loptimisation des conditions chromatographiques est une tape essentielle de la mise en place de la mthode multi-rsidus LC-ESI/sSRM.
123
C)
Optimisation des conditions chromatographiques pour un couplage en mode Scheduled SRM
De plus en plus nglige au profit des performances de la spectromtrie de masse, la chromatographie est pourtant indispensable et complmentaire de la MS pour obtenir une mthode danalyse sensible mais galement robuste. Sil est relativement ais de dterminer les conditions de sparation et de dtection optimales dans le cadre danalyses mono-rsidu ou multi-rsidus ne comportant que quelques composs, la difficult est grandement accrue lorsquil est question de plusieurs centaines de pesticides qui prsentent, de surcrot, des proprits physico-chimiques trs varies. Obtenir des conditions optimales pour chacune des molcules tant irralisable, lobjectif est de dterminer le meilleur compromis possible, en tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 privilgiant parfois les composs les plus problmatiques aux dtriments des autres, mais en veillant rester dans une juste mesure. Aprs avoir expos les lments influant sur la sparation chromatographique, nous nous intresserons aux paramtres dionisation de la source TurboV qui permet le couplage avec le 4000 QTrap.
I.
LHPLC Ultimate 3000 et sa colonne chromatographique

Il existe sur le march une trs grande diversit de colonnes chromatographiques, aussi
bien en termes de phases stationnaires quen gomtries et en fournisseurs, les diffrences annonces entre certaines tant parfois assez floues. Pralablement lacquisition dune colonne, des critres de slection ont d tre tablis. Le premier concernait la volont de travailler un dbit de 1 mL.min-1 pour profiter des performances optimales de la source dionisation TurboV, dont la gomtrie a t conue pour favoriser lionisation des dbits de cet ordre, selon les annonces du fabricant. De plus, cela permettait denvisager une marge de manuvre plus large pour loptimisation des conditions dinjection. De ce dbit dcoule la gomtrie de la colonne chromatographique puisque 1 mL.min-1 est le dbit optimal des colonnes de diamtre 4,6 mm. Afin doptimiser la sparation tout en vitant de gnrer de trop fortes contrepressions dans le systme HPLC Ultimate 3000 (Dionex), une colonne HPLC dune longueur de 150 mm remplie avec des particules de diamtres 4 m a t choisie. Au finale, les dimensions gomtriques de la colonne chromatographique sont relativement classiques, de type 150 mm 4,6 mm 4 m.
124
Le second critre porte sur les caractristiques de la phase stationnaire. Daprs ltude bibliographique, la phase la plus adapte, dans le cadre danalyse multi-rsidus comportant des pesticides de polarit variable, est une phase stationnaire base de silice greffe avec des ligands de type octadcyl (C18). Cependant, les pesticides slectionns couvrent galement une gamme dacidit importante avec, la fois, la prsence dacides (2,4D) mais aussi de bases (cyromazine). Cest pourquoi le choix dun endcapping polaire pour augmenter la slectivit des composs acides et la rtention des composs basiques a paru judicieux.257 Cette rflexion a donc conduit la slection dune colonne chromatographique de type octadcyl avec un endcapping polaire, la Synergy Hydro RP (150 mm 4,6 mm 4 m) de Phenomenex. La pratique de la chromatographie en phase inverse implique lemploi de solvants polaires dont les plus communs sont leau, le mthanol et lactonitrile.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
II. Choix des phases mobiles et du gradient dlution

La composition des phases mobiles est un facteur dterminant la fois pour la sparation chromatographique et lionisation en electrospray. En considrant ces deux lments dtaills dans le chapitre II, le solvant organique le plus adapt pour les phases mobiles savrait tre le mthanol. Les solvants tant dfinis (eau et mthanol), la premire tape fut dtablir un gradient de phases mobiles permettant une sparation optimale des pesticides sur une dure danalyse compatible avec un fonctionnement en routine de la mthode danalyse. Loptimisation du gradient dlution a fait lobjet de plusieurs essais et adaptations au cours de ce projet. Cette partie prsente le gradient final avec linterprtation de quelques gradients cls qui ont conduit son laboration. Lefficacit de la sparation a, dans un premier temps, t value partir de linjection dun mlange dune soixantaine de pesticides prpar dans un mlange MeOH/Eau (50/50) et analys en mode ESI+. Lobjectif tant terme danalyser plusieurs centaines de pesticides de polarits trs diverses, le gradient a t optimis de manire sparer rgulirement au cours de lanalyse chromatographique la soixantaine de substances actives slectionnes, sachant que ces pesticides sont reprsentatifs dune large gamme de polarit : -2,68 (clopyralide) < log Kow < 6,9 (cyhalothrine- ). Le gradient final de la mthode chromatographique, dtaill dans la Figure 60, est obtenu avec lemploi des phases mobiles suivantes : phase mobile A : H2O + 0,1% acide actique + 5 mM actate dammonium, phase mobile B : MeOH + 0,1% acide actique + 5 mM actate dammonium.
125
Temps (min) 0 1 5 9 16 20 22 27
% phase mobile A 50 50 30 30 0 0 50 50
% phase mobile B 50 50 70 70 100 100 50 50
Figure 60.
Gradient dlution final de la mthode chromatographique dcrit sous forme de tableau ( gauche) et schmatique ( droite)
Une temprature constante de 35 C est applique au four colonne pour amliorer lefficacit de la colonne et diminuer la viscosit des solvants. Dans ces conditions, la contrepression gnre au cours de ce gradient dlution ne dpasse pas 200 Pa. Elle est donc parfaitement compatible avec le systme qui tolre des pressions de lordre de 300 Pa. Ce gradient, optimis dans un premier temps pour la sparation dune soixantaine de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 pesticides, a t appliqu par la suite lanalyse de 242 pesticides et conduit une sparation efficace et rgulire de lensemble des pesticides sur une dure totale de 27 minutes (Figure 61). Notons que cette dure comprend une priode de 5 minutes pour la rquilibration de la colonne chromatographique.
Figure 61.
Chromatogramme montrant lefficacit du gradient dlution sur la sparation de 242 pesticides en mode ESI+
Une des caractristiques particulires de ce gradient concerne le ratio initial quilibr en phases mobiles. Les solvants A et B sont effectivement prsents en proportions gales (50/50). Classiquement, les gradients dlution dbutent avec un pourcentage lev en phase aqueuse. Dans notre cas, un gradient dlution dbutant avec une proportion de 90 % de phase aqueuse (voir Figure 62 a)) a t utilis pour tester la sparation dune soixantaine de pesticides (voir Figure 62 b)).
126

XIC of +MRM (100 pairs): 163.0/88.0 Da ID: methomyl -1 from Sample 5 (100 ppb) of essai grad2.wiff (Turbo Spray)
XIC of +MRM (100 pairs): 163.0/88.0 Da ID: methomyl -1 from Sample 5 (100 ppb) of essai grad2.wiff (Turbo Spray) Max. 1.7e5 cps.
Max. 1.7e5 cps.
9.6e5
1.5e4 1.4e4 1.3e4
9.0e5 8.0e5 7.0e5
1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 Time, min 5.2 5.3 5.4
1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5
c)
b)
a)
5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0
Max. 1.7e5 cps. 8.58 XIC of +MRM (100 pairs): 163.0/88.0 Da ID: methomyl -1 from Sample 5 (100 ppb) of essai grad2.wiff (Turbo Spray)
6.0e5 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0
d)
1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 Time, min 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0
8.58
Temps (min) 0 10 14 16 20
% Solvant A 90 0 0 90 90
% Solvant B 10 100 100 10 10
10 Time, min
12
14
16
18
20
Figure 62.
a) Illustration dun gradient dlution dbutant avec 90 % de phase aqueuse conduisant b) la sparation
chromatographique dune soixantaine de pesticides obtenue pour un solvant dinjection MeOH/Eau (50/50) et pour laquelle un zoom sur deux composs c) la cyromazine et d) le mthomyl permet de juger de la la forme des pics
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
chromatographiques des composs polaires
Ce type de gradient entraine une mauvaise efficacit de la colonne pour les composs polaires limage de la cyromazine (Figure 62 c)) dont le log Kow est gal 0,07. De plus, ces composs sont lus de la colonne avec un faible pourcentage de solvant organique, ce qui produit une ionisation peu efficace et donc une faible sensibilit, comme le montre le cas de la cyromazine (Figure 62 c)) et du mthomyl (Figure 62 d)). La modification des conditions initiales en passant dun ratio de phases mobiles A/B (90/10) A/B (50/50) (Figure 63 a)) occasionne des changements importants dans la rtention des substances actives, comme le met en vidence le chromatogramme de la Figure 63 b).
XIC of +MRM (100 pairs): 163.0/88.0 Da ID: methomyl -1 from Sample 4 (100 ppb) of essai grad 3.wiff (Turbo Spray) Max. 1.6e5 cps.
1.00e6
XIC of +MRM (100 pairs): 163.0/88.0 Da ID: methomyl -1 from Sample 4 (100 ppb) of essai grad 3.wiff (Turbo Spray) 2.38 Max. 1.6e5 cps.
b)
1.6e5
9.00e5
1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5
c)
8.00e5
1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4
a)
7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 1.00e5 0.00
2.0e4 1.0e4 0.0 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 Time, min 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0
Temps (min) 0 10 14 16 20
2.38
% Solvant A 50 0 0 50 50
% Solvant B 50 100 100 50 50
10 Time, min
12
14
16
18
20
Figure 63.
a) Illustration dun gradient dlution dbutant avec 50 % de phase aqueuse conduisant b) la sparation
chromatographique dune soixantaine de pesticides obtenue pour un solvant dinjection MeOH/Eau (50/50) et pour laquelle un zoom sur deux composs c) la cyromazine et le mthomyl permet de juger de la forme des pics chromatographiques des composs polaires
127
Le gradient report dans la Figure 63 a) autorise une rpartition des pesticides plus rgulire au cours du temps. Les composs polaires sortent beaucoup plus tt quavec le prcdent gradient et prsentent une meilleure rsolution et sensibilit (voir les pics chromatographiques de la Figure 63 c) par rapport ceux de la Figure 62 c) et d)). En effet, le pourcentage lev (50 %) en mthanol, ds linjection, permet daugmenter lefficacit de la colonne et assure ainsi des pics plus fins. Laffinement du pic, auquel sajoute une ionisation plus efficace du fait dun pourcentage plus lev de phase organique dans la source dionisation (voir Figure 63 c)), sont les facteurs dune amlioration significative de la sensibilit. En fait, le gradient final de la Figure 60 a t labor partir de celui de la Figure 63 en allongeant la dure danalyse, notamment par lintroduction dune priode de rquilibration plus longue et lajout de quelques modifications mineures. Loptimisation du gradient dlution a donc permis dassocier, la fois, une sparation efficace des pesticides et une bonne rsolution des pics chromatographiques pour lensemble des composs. Les derniers paramtres considrer sont ceux de la source TurboV pour optimiser lefficacit de lionisation electrospray.
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III. Optimisation des conditions dionisation de la source TurboV

La mthode dveloppe concernant une analyse multi-rsidus, les paramtres de la source ont t dfinis de faon obtenir la sensibilit la plus satisfaisante possible pour lensemble des pesticides. En ralit, le seul paramtre rellement influant et optimisable en multi-rsidus est la temprature de dsolvatation. Celle-ci est fonction du dbit et de la composition de phase mobile. Ainsi, un dbit de 1 mL.min-1, une temprature minimale de 550 C est ncessaire pour vaporer efficacement lluant au cours du gradient dlution. En effet, en dessous de cette temprature, des gouttelettes apparaissent sur la curtain plate, preuve dune dsolvatation incomplte. Elle est notamment observe lorsque le ratio de phases mobiles est de 50/50 (H2O/MeOH), ce qui constitue les conditions les plus dfavorables la dsolvatation. Leffet de la temprature a t test sur un mlange de 235 pesticides une concentration de 10 g.L-1 analyss en mode ESI+. Cinq tempratures ont ainsi t testes : 550, 600, 650, 700 et 750 C. Les molcules ont t rparties en deux groupes (A et B) selon que les aires des pics chromatographiques taient infrieures (groupe A), ou strictement suprieures (groupe B) aux aires de rfrences obtenues pour la temprature de 550 C.
128
Groupe A (177 pesticides)

Abamectine Acphate Actamipride Acrinathrine Alachlore Aldicarbe Aldicarbe sulfone Aldicarbe sulfoxyde Amtryn Amitraz Atrazine Azimphos-methyl Azoxystrobine Bendiocarbe Benfuracarbe Bnomyl Bnoxacore Bifnazate Bifenthrine Bitertanol Boscalid Buprofzine Carbaryl Carbendazime Carbtamide Carbofuran-3 OH Carbofuran Carbosulfan Carboxin Carfentrazone thyle Cartap Hydrochloride Chlorfenvinphos Chloridazone Chlorotoluron Chlorpropham Clomazone Clopyralid Cyanazine Cyazofamide Cycloxydime Cymoxanil Cypermthrine Cyproconazole Cyromazine Daminozide Deltamhtrine Desmdipham Diallate Diazinon Dichlofluanid Dichlorvos Diclofop-methyl Dithofencarb Dimtachlor Dimthnamid Dimthoate Dimthomorph Diniconazole Diphnylamine Disulfoton Diuron Epoxyconazole Esfenvalerate Ethion (diethion) Ethofumesate Ethoprophos Etofenprox Famoxadone Fnamidone Fenhexamid Fenoxycarbe Fenpyroxymate Fenthion sulfone Fenthion sulfoxide Fipronil Flucythrinate Flufnacet Flufnoxuron Flutolanil Flutriafol Fosthiazate Furathiocarb Heptnophos Hexaconazole Hexazinone Imazalil Indoxacarbe Iprovalicarbe Isoproturon Isoxaben Isoxaflutol Krsoxim mthyl Lnacile Linuron Malaoxon Malathion Mpanipyrim Mpronil Mtazachlore Mthabenzthiazuron Mthamidophos Mthidathion Mthiocarbe Mthiocarbe sulfone Mthiocarbe sulfoxide Mthomyl Mthoxyfenozid Mtobromuron Mtolachlor Mtoxuron Mtrafenone Mtribuzine Mvinphos Molinate Monocrotophos Napropamide Norflurazon Nuarimol Omthoate Oxadiazon Oxamyl Oxycarboxin Oxyfluorfne Penconazole Pendimthaline Permthrin Phenmdipham Phenthoate Phorate Phosalone Phosmet Phosphamidon Picolanifen Piperonyl butoxide Pirimicarbe Pirimicarbe desmthyl Pirimiphos-thyl Prochloraz Prometryn Propachlore Propaquizafop Propargite Propazine Propiconazole Propoxur Prosulfocarbe Pymetrozine Pyraclostrobine Pyridaben Pyridafenthion Pyridate Pyrimthanil Quinalphos Quizalofop-p-ethyl Resmthrin Sthoxydim Simazine Spinosad Spiroxamine Sulfosulfuron Sulfotep tau-fluvalinate Tbuconazole Tbufenozide Terbufos Terbuthylazine Terbutryn Thiabendazole Thiachlopride Thiametoxam Thiodicarbe Tolyfluanide Triadimefon Triadimenol Trichlorfon Vamidothion Zoxamide
Groupe B (58 pesticides)

Acibenzolar-S-methyl Aclonifen Amidosulfuron Azaconazole Benalaxyl Bromacil Bupirimate Butraline Chlorpyrifios Chlorpyrifos methyl Clofentezine Coumaphos Difnoconazole Diflufnican Etoxazole Fnamiphos Fnarimol Fnazaquin Fenbuconazole Fenpropimorphe Fenthion Flazasulfuron Fluazifop-p-butyl Fluquinconazole Furochloridone Flusilazole Fonofos Formtanate Hexythiazox Imidachlorpride Iprodione Lufnuron Mfnoxam Msosulfuron methyl Mtamitrone Metconazole Myclobutanil Paclobutrazol Paraoxon methyl Parathion thyl Pencyuron Pirimiphos mthyl Propyzamide Prosulfuron Prothiofos Pyriproxyfen Quinoclamine Quinoxyfen Rimsulfuron Rotnone Tbufenpyrade Ttraconazole Thiophanate mthyl Tolclofos mthyl Triallate Trifloxystrobine Trisulfuron mthyl Triticonazole
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Tableau 13.
Rpartition de 235 pesticides selon que leur intensit diminue (Groupe A) ou augmente (Groupe B) avec llvation de la temprature de la source
Sur les 235 pesticides prsents dans le Tableau 13, 58 admettent une augmentation de leur intensit avec une lvation de la temprature (Groupe B), les plus significatives tant observes pour le diflufnican et liprodione (Figure 64).
XIC of +MRM (477 pairs): 330.1/244.9 amu Expected RT: 15.1 ID: iprodione -1 from Sample 11 (10 ppb 700) of Essai temperature.wiff (Turbo Spr... Max. 1271.6 cps.
XIC of +MRM (477 pairs): 395.1/265.8 amu Expected RT: 18.3 ID: diflufenicanil -1 from Sample 15 (10 ppb 750) of Essai temperature.wiff (Turbo S... 18.18 Max. 5.0e4 cps.
1478 1400 1300 1200 1100
5.0e4
750 C
14.96
4.5e4 4.0e4
750 C
700 C
1000 900 800 700 600 500 400 300 200

15.24
3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4
700 C
650 C 600 C
550 C
15.34 15.49
650 C 600 C
1.0e4 5000.0 0.0
550 C
100 0 14.4 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9 15.0 15.1 15.2 Time, min 15.3 15.4
15.5
15.6
15.7
17.8
17.9
18.0
18.1 Time, min
18.2
18.3
18.4
18.5
Figure 64.
Mise en vidence de linfluence positive de la temprature de source sur la sensibilit de liprodione et du diflufenican
129
Comme illustre dans la Figure 64, lapplication dune temprature de 750 C au lieu de 550 C permet damliorer lintensit du signal du diflufenican et de liprodione denviron un facteur deux. Nanmois, bien quune amlioration significative soit constate pour 58 substances actives, lapplication dune temprature suprieure 550 C entrane la dgradation dune majorit des composs (Tableau 13 : Groupe A) limage de laldicarbe et de la bifenthrine (Figure 65).
XIC of +MRM (477 pairs): 208.0/116.0 amu Expected RT: 5.3 ID: Aldicarbe -1 from Sample 11 (10 ppb 700) of Essai temperature.wiff (Turbo Spray)... Max. 666.0 cps.
XIC of +MRM (477 pairs): 440.1/166.1 amu Expected RT: 21.4 ID: bifenthrine -1 from Sample 15 (10 ppb 750) of Essai temperature.wiff (Turbo Spr...
Max. 297.9 cps.
4392 4000
1957 1800
550 C
1600 1400
550 C
3500
3000
600 C
1200
2500
600 C
1000 800
2000
1500
650 C
650 C
5.23
600 400
1000
700 C
5.36 5.52
21.29
500
700 C
4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2
750 C
5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0
200 0
21.24
750 C
21.3 21.4 21.5 Time, min 21.6 21.7 21.8 21.9
5.4 5.6 Time, min
21.0
21.1
21.2
Figure 65.
Mise en vidence de linfluence ngative de la temprature de source sur la sensibilit de laldicarbe et de la bifenthrine
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Au vu des rsultats de cette exprience, il savre que le meilleur compromis en termes de temprature de dsolvatation pour lanalyse multi-rsidus de pesticides est 550 C. Lensemble des paramtres de la source TurboV sont rsums dans le Tableau 14 :
Profondeur de llectrode Curtain gas (gaz rideau) Ionspray voltage (tension du capillaire) Temprature Gaz 1 (gaz de nbullisation) Gaz 2 (gaz de dsolvatation)
Tableau 14.
2 mm 35 psi 5500 V (ESI+) / -4500 V (ESI-) 550 C 40 psi 50 psi
Paramtres de la source TurboV
Avec ltude des conditions dionisation de la source TurboV, tous les paramtres de dtection et de sparation ont t dfinis pour optimiser la sensibilit de la mthode multirsidus. Dans ces conditions, lintrt dutiliser le mode Scheduled SRM a t valu par rapport au mode SRM classique.
130
D) Les performances du mode Scheduled SRM pour lanalyse multi-rsidus LC-ESI/SRM de 242 pesticides
Le scheduled SRM est un mode dacquisition SRM dont le principe consiste enregistrer les transitions SRM seulement si ncessaire. Compar au mode SRM classique, le scheduled SRM permet de diminuer le nombre de SRMs concurrentes conduisant un dwell time optimal pour chaque transition qui doit se traduire, normalement, par une amlioration gnrale de la qualit du signal. Aprs avoir dtermin les paramtres du sSRM dans les conditions chromatographiques dfinies prcdemment, les performances de ce mode ont t values en comparant les rsultats obtenus pour un mlange de 242 pesticides par rapport au mode SRM classique.258 tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
I.
Protocole Exprimental
Les paramtres du mode scheduled SRM dterminer sont les temps de rtention des
pesticides, la fentre de dtection (MRM detection window) et le temps de cycle (TST).
La fentre de dtection est fixe partir du pesticide prsentant le pic chromatographique le plus large. Avec les conditions dcrites prcdemment, il est obtenu pour les molcules de dimtachlore et iprovalicarbe qui, une concentration de 25 g.L-1, prsentent des pics chromatographiques de lordre de 50 s (Figure 66).
Sample Name: "MRM 25 ppb 7" Sample ID: "" File: "MRM repetabilite.wiff" Peak Name: "dimetachlor -1" Mass(es): "256.1/224.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 8 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 1.4e5 Acq. Time: 3:03:14 AM
Modified: Yes Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 0.50 min Peak-Split. Factor: 1 Report Largest Peak: No Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 10.7 min Use Relative RT: No Int. Type: Manual Retention Time: 10.7 min Area: 1.92e+006 counts Height: 1.42e+005 cps Start Time: 10.1 min End Time: 11.0 min
10.73
Sample Name: "MRM 25 ppb 6" Sample ID: "" File: "MRM repetabilite.wiff" Peak Name: "iprovalicarbe -1" Mass(es): "321.2/119.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 7 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 Acq. Time: 2:35:11 AM
13.73
1.05e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4 7.00e4 6.50e4
1.3e5 1.3e5 1.2e5 1.2e5 1.1e5 1.1e5 1.0e5 9.5e4 9.0e4 8.5e4
8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4
6.00e4 5.50e4 5.00e4 4.50e4
5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4

1.00e4 2.50e4 2.00e4 1.50e4 4.00e4 3.50e4 3.00e4
1.0e4 5000.0 0.0 9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 Time, min 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6
5000.00 0.00 12.6 12.8
12.8
13.0
13.2
13.4
13.6
13.8
14.0
14.2 14.4 Time, min
14.6
14.8
15.0
15.2
15.4
15.6
15.8
16.0
0,83 min 50s
0,83 min 50s
Figure 66.
Pics chromatographiques des deux pesticides prsentant la dure dlution la plus longue
La fentre de dtection a donc t fixe 60 s pour tenir compte dune augmentation de la largeur du pic chromatographique en fonction de la concentration, de mme que pour avoir une marge de scurit par rapport aux lgres variations du temps de rtention pouvant tre observes en chromatographie.
131
Le second paramtre est le target scan time ou temps de cycle. Il se dtermine par rapport au pic chromatographique le plus fin qui, dans notre cas, est de lordre de 14 s (chlorpyrifos : Figure 67).
Sample Name: "ssch 25 ppb 2" Sample ID: "" File: "Sch 242 repetabilite.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 Acq. Time: 5:23:24 AM
19.77
8500
8000
7500
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
19.30
19.35
19.40
19.45
19.50
19.55
19.60
19.65
19.70
19.75
19.80
19.85
19.90 19.95 Time, min
20.00
20.05
20.10
20.15
20.20
20.25
20.30
20.35
20.40
20.45
20.50
20.55
0,24 min 14s
Figure 67.
Pic chromatographique du chlorpyrifos dont le temps dlution est le plus court (14 s)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
En fixant le TST 1,3 s, tous les pics devraient normalement tre dfinis par au moins 10 points de donnes. Dans le but dvaluer les performances du scheduled SRM avec ces paramtres, trois mthodes dacquisition ont t cres.
La premire mthode SRM 242 a t construite en mode SRM classique avec la premire transition de chaque pesticide, soit 242 SRMs (nombre de transitions limit par le logiciel 300). Le dwell time par transition a t fix 5 ms, avec un temps de pause de 5 ms galement, conduisant un duty cycle de 10 ms (84) et donc un temps de cycle de 2,42 s (85). La deuxime mthode sSRM 242 a t labore en mode sSRM avec les mmes 242 transitions que la mthode classique, dans le but de comparer directement les performances de ces deux modes. Enfin, une troisime mthode sSRM 483 a t cre en mode sSRM et inclut 483 transitions SRM, correspondant aux transitions 1 et 2 des 242 pesticides (lisoxaflutole ne dispose que dune seule transition). Lobjectif de cette mthode est dvaluer leffet provoqu par laugmentation du nombre de transitions sur les performances du scheduled SRM. Dans le but dvaluer les mthodes dacquisitions en termes de reptabilit et de sensibilit, un mlange de 242 pesticides, prpar dans du mthanol acidifi avec 1% dacide actique une concentration de 25 g.L-1, a t inject dix reprises avec chaque mthode dacquisition.
132
II. Rsultats et discussion

La Figure 68 illustre le nombre de transitions SRM concurrentes enregistres au cours du gradient dlution pour les trois mthodes dacquisition.
120 240 220 200 180 160
140
Nombre de SRMs concurrentes
SRM 242 sSRM 242 Gradient sSRM 483
100
80
120 100 80 60 40
20
60
40
20
0 0 5 10 15 20 25
Temps (min)
Figure 68.
Nombre de transitions SRM concurrentes en fonction de la mthode dacquisition et du temps
Cette figure souligne une rduction considrable du nombre de SRMs concurrente avec tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lemploi du mode scheduled SRM. Alors quavec le mode classique, 242 SRMs doivent tre scannes sur toute la dure de lanalyse, avec le mode scheduled, le nombre maximum de SRMs concurrentes nexcde pas 50 19,2 min avec la mthode sSRM 483 (25 avec sSRM 242 ). Lacquisition simultane de moins de transitions SRM en mode sSRM permet au spectromtre de masse de passer plus de temps sur chaque transition sans impacter le temps de cycle assurant, ainsi, la cration de suffisamment de points de donnes. Le Tableau 15 montre le nombre de points par pic obtenus pour 18 pesticides avec les trois mthodes dacquisition. Signalons que les pesticides slectionns dans ce tableau sont connus pour leur faible sensibilit en LC-MS/MS.20,33
Nombre de points par pic Pesticide Cartap hydrochloride Daminozide Acetamipride Quinoclamine Dichlorvos Flutriafol Bnoxacore Chlorpropham Pyrimethanil Acibenzolar-S-mthyl Iprodione Parathion thyl Aclonifen Fenthion Fonofos Phorate Diphnylamine Triallate tR (min) 1,5 1,7 3,3 7,04 7,75 9,62 11,2 13,,0 13,34 13,6 15,3 16,2 16,6 16,88 17 17,5 17,79 19,91 MRM 242 7 10 13 13 10 8 9 10 13 10 6 6 4 8 7 7 11 8 sSRM 242 22 29 42 46 37 23 33 35 41 37 31 29 22 26 29 23 43 26 sSRM 483 21 29 42 42 37 23 27 29 38 32 29 27 20 20 24 23 36 20 MRM 242 11,0 9,7 5,2 8,9 22,2 16,6 13,6 24,5 13,0 17,0 15,4 23,1 30,2 13,9 11,1 15,8 12,4 28,2 CV (%) sSRM 242 3,9 2,6 3,1 3,9 9,4 1,8 7,1 6,0 3,4 3,8 4,8 8,6 8,5 3,5 3,4 3,6 2,8 4,8 sSRM 483 7,1 3,2 3,4 4,5 5,5 2,8 3,6 5,1 3,6 5,1 8,0 3,9 9,6 4,2 5,6 7,4 4,4 9,0 MRM 242 S/N 47 37 1208 49 58 246 124 35 92 49 29 57 20 45 61 41 25 41 S/N 210 88 6028 271 175 884 380 153 175 316 113 282 97 245 200 211 111 170 sSRM 242 Facteur damlioration 4,5 2,4 5,0 5,5 3,0 3,6 3,1 4,4 1,9 6,4 3,9 4,9 4,9 5,4 3,3 5,1 4,4 4,1 S/N 129 80 4610 169 109 549 260 121 173 191 66 217 71 175 128 184 81 142 S/N sSRM 483 Facteur damlioration 2,7 2,2 3,8 3,4 1,9 2,2 2,1 3,5 1,9 3,9 2,3 3,8 3,6 3,9 2,1 4,5 3,2 3,5
Tableau 15.
Comparaison des trois mthodes dacquisition SRM 242, sSRM 242 et sSRM 483 en termes de nombre de points
par pic, coefficient de variation (CV % ; n=10) des aires des pics chromatographiques et rapport signal sur bruit (S/N)
gradient d'lution
133
La diffrence entre les deux modes dacquisition est vidente puisque, en moyenne, trois fois plus de points sont acquis avec le mode sSRM. Par exemple, avec le sSRM, un pic chromatographique contenant 23 points est obtenu pour le flutriafol alors que 8 points seulement sont crs avec le mode SRM classique. Ces diffrences, en termes de nombre de points de donnes et de duty cycle, ont une influence directe sur la rptabilit de lanalyse. Le Tableau 15 (colonne 2) et la Figure 69 prsentent la rptabilit de lanalyse, exprime par le coefficient de variation (CV) en % de laire des pics sur dix injections (n = 10).
80.0
% de substances actives
70.0
SRM 242
sSRM 242 sSRM 483
60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0
Rptabilit (%CV)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 69.
Rptabilit des mthodes dacquisition SRM 242, sSRM 242 et sSRM 483
Comme lillustre la Figure 69, les effets de lemploi du mode sSRM sont trs significatifs. Alors que seulement 40 % des transitions admettent un CV < 10 % avec le mode SRM classique, 98 % ont un CV < 10 % avec les deux mthodes sSRM dont environ 90 % donnent un CV < 5 %. Cette observation est confirme par les rsultats du Tableau 15 (colonne 2) o les mthodes sSRM permettent damliorer considrablement les CVs des composs les moins sensibles. Lemploi du sSRM permet en effet dobtenir des CVs infrieurs 10 % (gnralement < 5 %) quand ils se situent entre 10 et 30 % avec le mode classique. La comparaison des deux mthodes sSRM met en vidence des CVs lgrement plus levs avec la mthode sSRM 483. En effet, la majorit des CVs sont infrieurs 2,5 % pour la mthode sSRM 242 alors quils sont davantage situs entre 2,5 et 5 % avec la mthode sSRM 483. En plus damliorer la rptabilit, le mode sSRM influe galement sur le signal en termes dintensit des aires. La Figure 70 montre la comparaison de la variation du signal obtenue entre chaque mthode sSRM et la mthode classique (SRM 242).
40
sSRM 242/SRM 242

35
% de substances actives
30 25 20 15 10 5 0
sSRM 483/SRM 242
-10 to 0
-50 to -25
-25 to -10
25 to 50
10 to 25
> -50
0 to 10
Variation du signal (%)
Figure 70.
Variation de lintensit du signal entre les mthodes sSRM et la mthode classique SRM
> 50
134
Une augmentation de lintensit du signal est observe pour respectivement 85 % et 75 % des transitions des mthodes sSRM 242 et sSRM 483. Le mode scheduled SRM a donc un effet positif significatif sur la rponse des transitions. Cependant, une amlioration de lintensit du signal ne signifie pas toujours une augmentation de la sensibilit dfinie comme le rapport S/N. La colonne 3 du Tableau 15 regroupe les S/N obtenus avec les trois mthodes dacquisition et le facteur damlioration entre les mthodes sSRM et SRM. Lalgorithme scheduled conduit lamlioration du S/N dun facteur 1,9 minimum (pyrimthanil avec sSRM 242 et 483) et jusqu un facteur 6,4 (acibenzolar-S-mthyl avec sSRM 242). La hausse du rapport S/N est toutefois moins importante lorsque le nombre de transitions est doubl. En effet, une diffrence significative, pouvant atteindre 40 %, est observe entre les deux mthodes sSRM dans le cas du cartap hydrocloride et du fonofos. Cette observation peut tre tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 explique par deux hypothses. En premier lieu, la transition ajoute dans la mthode sSRM 483 correspond la transition de confirmation du pesticide. Son acquisition seffectue donc dans la mme fentre de dtection que la premire, ce qui conduit une division thorique du dwell time par deux. Ensuite, les deux transitions sont gnres partir dun mme ion prcurseur provoquant une augmentation du signal moins importante (Figure 70) et donc une diffrence en termes de rapport S/N. Lamlioration de la qualit des donnes acquises due lemploi du mode sSRM est illustre par la Figure 71 qui prsente les chromatogrammes obtenus pour le chlorpropham et laclonifen avec les trois mthodes dacquisition, lors de la cinquime injection.
SRM 242
Sample Name: "MRM 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "MRM repetabilite.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 Acq. Time: 2:07:09 AM
Modified: Yes Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 0.50 min Peak-Split. Factor: 1 Report Largest Peak: No Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 13.1 min Use Relative RT: No Int. Type: Base To Base Retention Time: 13.0 min Area: 2.18e+004 counts Height: 1.90e+003 cps Start Time: 12.7 min End Time: 13.2 min
sSRM 242
Sample Name: "ssch 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "Sch 242 repetabilite.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 3300 Acq. Time: 6:47:21 AM
Modified: Yes Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 0.50 min Peak-Split. Factor: 1 Report Largest Peak: No Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 13.0 min Use Relative RT: No Int. Type: Valley Retention Time: 13.0 min Area: 3.21e+004 counts Height: 3.33e+003 cps Start Time: 12.7 min End Time: 13.2 min
13.04
12.99
1800
Sample Name: "dsch 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "Sch 483 repetabilite.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 2900 Acq. Time: 11:27:19 AM
sSRM 483
12.97
3200 3100 3000 2900 2800 2700 2600 2500 2400 2300
2800 2700 2600 2500 2400 2300 2200 2100 2000 1900 1800
1700
1600
1500
S/N = 26
1400
S/N = 111
S/N = 85
1300
1200
2200 2100
1100
2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400
1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300
Chlorpropham
1000
900
800
700
1300 1200
600
1100 1000
500
900 800
400
700 600 500
300
12.59 12.23 13.52 13.82 13.90 14.07
200
400 300 200 100

13.24 13.37
200 100 0 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 Time, min 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6 14.8
100
11.2
11.4
11.6
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0 13.2 Time, min
13.4
13.6
13.8
14.0
14.2
14.4
14.6
14.8
15.0
0 11.0
11.2
11.4
11.6
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0 Time, min
13.2
13.4
13.6
13.8
14.0
14.2
14.4
14.6
14.8
Sample Name: "MRM 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "MRM repetabilite.wiff" Peak Name: "aclonifen -1" Mass(es): "265.1/248.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 Acq. Time: 2:07:09 AM
16.60
1350 1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950 900 850
Sample Name: "ssch 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "Sch 242 repetabilite.wiff" Peak Name: "aclonifen -1" Mass(es): "265.1/248.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 2/17/2010 1500 Acq. Time: 6:47:21 AM
16.57
Sample Name: "dsch 25 ppb 5" Sample ID: "" File: "Sch 483 repetabilite.wiff" Peak Name: "aclonifen -1" Mass(es): "265.1/248.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL 1250 Acq. Date: 2/17/2010 Acq. Time: 11:27:19 AM
Modified: No Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 0.50 min Peak-Split. Factor: 1 Report Largest Peak: No Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 16.5 min Use Relative RT: No Int. Type: Valley Retention Time: 16.6 min Area: 1.01e+004 counts Height: 1.24e+003 cps Start Time: 16.5 min End Time: 16.8 min
16.61
1450 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950
1200 1150 1100 1050 1000 950 900 850 800
S/N = 25
S/N = 68
S/N = 48
800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300
900 850 800 750 700 650 600 550 500 450
750 700 650 600 550 500 450 400 350
Aclonifen
400 350 300
300 250 200 150

16.81 16.96
250 200 150 100 50 0 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 Time, min 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6
250 200 150 100 50 0 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 Time, min 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6
100
16.02
16.99 16.09 16.27
16.06
16.13
50 0 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 Time, min 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4
Figure 71.
Comparaison des pics LC du chlorpropham et de laclonifen obtenus avec les modes SRM et sSRM
135
Les deux pesticides dvoilent des pics LC de meilleures formes, avec plus de points par pic, un signal plus intense et des rapports S/N plus levs en sSRM quen SRM. A noter quaucun signal nest enregistr en dehors de la fentre de dtection (tRanalyte 0,5 min) en sSRM.
III. Conclusion
Cette tude a permis de mettre en vidence la facilit dutilisation et lintrt du nouveau mode dacquisition scheduled SRM pour lanalyse en routine de pesticides par LC-MS/MS. Les conditions dutilisation du sSRM sont un bon contrle de la chromatographie qui doit donner des temps de rtention rptables et des pics relativement fins pour les analytes. En combinant le temps de rtention de lanalyte (tRanalyte) avec une fentre de dtection SRM et un tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 target scan time (e.g. temps de cycle), le logiciel construit automatiquement une mthode dacquisition qui enregistre seulement les transitions lintrieur de cette fentre de temps.
Compar avec le mode SRM classique, le sSRM offre des performances nettement meilleures en termes de rptabilit (CV gnralement infrieur 5 %), dintensit du signal et de rapport S/N, mme quand le nombre de transitions SRM est doubl. De plus, en contrlant le temps de cycle (TST), loprateur sassure que suffisamment de points de donnes sont acquis pour dfinir correctement le pic chromatographique. Lamlioration du S/N est significative pour lensemble des composs, variant dun facteur 2 6,4 pour les pesticides tudis. Etant donn que le rapport S/N dfinit les limites de quantification, cela signifie que le scheduled SRM autorise de descendre les limites de quantification pour tous les composs dun facteur au moins gal deux, voire suprieur en fonction du pesticide considr.
136
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Chapitre IV
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Application de la Mthode LC-ESI/sSRM la Recherche de Pesticides dans des Huiles Essentielles Surcharges
La mise au point de la mthode danalyse LC-ESI/sSRM dans le chapitre prcdent a t ralise partir de pesticides directement introduits dans le solvant dinjection HPLC. Il est maintenant ncessaire de ladapter aux cas de la dtection de pesticides dans des huiles essentielles sucharges. Ce chapitre, compos de trois parties, sintresse dans un premier temps rechercher la mthode de prparation des huiles essentielles la plus adapte. Aprs avoir modifi les conditions dinjection en consquence pour appliquer la mthode LC-ESI/sSRM lanalyse dune huile essentielle de lavandin surcharge en pesticides dans une seconde partie, ce chapitre se conclura par ltude de lhuile essentielle de citron, reprsentative des problmes rencontrs lors de lapplication de la mthode lanalyse de pesticides dans des huiles essentielles dhesprids.
138
Chapitre IV. Application de la mthode LC-ESI/sSRM la recherche de pesticides dans des HE surcharges
A) Prtraitement dhuiles essentielles surcharges et son effet sur la quantification

Ltude bibliographique a mis en vidence que la mthode de prparation, a priori la plus adapte, lanalyse des pesticides dans les huiles essentielles est une simple dilution de lextrait suivie dune injection directe. Toutefois, tant donn que la littrature dans ce domaine est relativement limite, il convenait de tester dans un premier temps la faisabilit de plusieurs approches avant de slectionner la plus prometteuse. Ainsi diffrents protocoles ont t mis en place pour valuer lefficacit de lextraction sur phase solide, de la mthode QuEChERS et de la dilution. Il convient de prciser ici que le nombre de pesticides tudis au cours de cette partie peut tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 varier dune exprience lautre, ceci tant li la prparation des mlanges de pesticides qui dpendaient de la disponibilit et de la stabilit des items de rfrence au moment de ltude. Cependant, les mlanges de pesticides tudis sont toujours reprsentatifs dune large gamme de polarit et dacidit.
I.
Extraction sur phase solide (SPE)

Deux cartouches SPE de phases adsorbantes diffrentes, lOasis HLB et la MegaBond
Elute C18, ont t testes. La premire est un macropolymre [poly(divinylbenzene-co-Nvinylpyrrolidone)] qui allie des caractristiques de rtention lipophiles grce au divinylbenzne et hydrophiles grce au N-vinylpyrrolidone. LOasis HLB semblait donc adapte la large gamme de polarits des substances actives tudies. La MegaBond Elute C18 est une cartouche plus classique prsentant une phase adsorbante compose de silice greffe avec des ligands octadcyl. I.1 Extraction sur Oasis HLB 500 mg
Lextraction sur Oasis HLB 500 mg a t teste au travers dune prise dessai constitue dun volume de 500 L dhuile essentielle de citron surcharge 50 g.L-1 de pesticides. Cette surcharge est ralise en mlangeant 475 L dhuile essentielle de citron avec 25 L dune solution de mlange de pesticides 1 mg.L-1. Deux protocoles ont ensuite t considrs selon que la cartouche subisse ou non un lavage pralablement llution.
139
I.1.1. Protocole n 1 : extraction SPE sans lavage Lextraction sur cartouche SPE Oasis HLB 500 mg selon le protocole n1 consiste en trois tapes. Dans un premier temps, la cartouche SPE est conditionne avec 5 mL de CH2Cl2 et 5 mL dhexane. Les 500 L de prise dessai sont ensuite dposs sur la cartouche avant de procder, dans un dernier temps, ltape dlution au moyen de trois fractions de 5 mL de CH2Cl2 qui sont rcupres dans 3 ballons distincts. Les fractions dlutions sont ensuite plonges dans un bain marie 40 C et vapores sous vide laide dun vaporateur rotatif maintenu dans un premier temps une pression de 630 mbar, avant de la diminuer progressivement. Lvaporation de la 1re fraction a conduit la rcupration des 500 L dhuile essentielle dans le ballon, ce qui correspond la totalit de la prise dessai. Le protocole a donc t tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 avort. I.1.2. Protocole n 2 : extraction avec lavage Le but de ce protocole est de laver la cartouche avec plusieurs volumes dhexane pour liminer les composants de lhuile essentielle avant dluer les pesticides avec du dichloromthane. Lextraction sur cartouche SPE Oasis HLB 500 mg selon le protocole n 2 consiste en quatre tapes. Dans un premier temps, la cartouche SPE est conditionne avec 5 mL de CH2Cl2 et 5 mL dhexane. Les 500 L de prise dessai sont ensuite percols sur la cartouche. La cartouche est alors lave par des fractions successives de 500 L dhexane qui sont vapores sous vide. Lvaporation a pu tre conduite sec pour les deux premires fractions, contrairement aux fractions trois et quatre pour lesquelles il reste un rsidu de couleur jaune. Lvaporation a de nouveau pu tre conduite sec lors de la cinquime fraction. Le lavage ayant a priori limin les composs peu volatils de lhuile essentielle, ltape dlution a pu tre effectue au moyen de deux fractions de 5 mL de CH2Cl2 rcupres dans deux ballons distincts. Les fractions dlutions sont ensuite plonges dans un bain marie 40 C et vapores sous vide laide dun vaporateur rotatif maintenu dans un premier temps une pression de 630 mbar, avant de la diminuer progressivement. Une fois vapors sec, les extraits ont t repris avec 1 mL de mlange MeOH/Eau (50/50). Les solutions ainsi obtenues sont lgrement troubles et des particules visqueuses
140
semblent se dposer sur les parois du ballon. Les solutions ont nanmoins t transfres dans des vials et injectes en LC-MS/MS avec un volume dinjection de 50 L. I.1.3. Rsultats et discussion La Figure 72 a) prsente le chromatogramme dun point de gamme solvant prpar une concentration de 25 g.L-1 (MeOH/Eau) et les chromatogrammes des deux fractions dlution du protocole n 2 (Figure 72 b) et c)).
3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5
XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 1 (25 ppb) of essai oasis 500mg.wiff (Turbo Spray) Max. 6.9e4 cps.
a)
2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4

2.39
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
4.0e4 2.0e4 0.0

XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 2 (1ere fraction) of essai oasis 500mg.wiff (Turbo Spray...
2.57
Max. 4.5e4 cps.
10
12 XIC of +MRM(111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 fromSample 3 (2e fraction) of essai oasis 500mg.wiff (Turbo Spray) 14 16 18 20 22 24 Time, min
2939 2800 2600 2400
Max. 425.8 cps.
8.9e4 8.0e4 7.0e4
b)
c)
2200
6.0e4 5.0e4
2.20
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0
600 400 200 0
10
12 14 Time, min
16
18
20
22
24
10
12 14 Time, min
16
18
20
22
24
Figure 72.
Chromatogrammes a)du point de gamme solvant 25 g.L-1 b) de la fraction dlution n1 et c)de la fraction dlution n2
Avec un rapport dextraction (RE) gal 0,5, la concentration finale en pesticides attendue dans les fractions dlution devrait tre de 25 g.L-1. Le rapport dextraction est le rapport entre le volume de matrice (Vmatrice) de la prise dessai et le volume de solvant (Vsolvant) dans lequel lextrait final est repris en fin de manipulation.
RE = Vmatrice (mL) Vsolvant (mL)
(86)
Dun point de vue qualitatif, les chromatogrammes de la Figure 72 montrent que la majorit des composs sont rcuprs dans la fraction n 1. Toutefois les composs peu polaires, lus la fin du gradient, ne sont pas rcuprs efficacement. Ces observations sont confirmes par le calcul des taux de rcupration prsents en Annexe 6. En revanche, ces
141
taux de rcupration, tant calculs partir du point de gamme solvant, ne prennent pas en considration les ventuels effets matrice, mais ils donnent cependant une bonne indication. Sur la cinquantaine de pesticides analyss, la moiti, majoritairement des pesticides peu polaires, admettent un taux de rcupration infrieur 30 % et six dentre eux ne sont pas du tout dtects. La faible rcupration des composs apolaires peut sexpliquer par leur lution durant le lavage lhexane ou par leur plus grande affinit pour les rsidus visqueux prsents sur les parois du ballon. I.2 Extraction sur MegaBond Elute C18 1g
Le but de ce protocole est de tester la cartouche MegaBond Elute C18 travers un protocole dj utilis au laboratoire pour les matrices de composition apolaire. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 I.2.1. Protocole exprimental La prise dessai est constitue dun volume de 500 L dhuile essentielle de citron surcharge 50 g.L-1 de pesticides. Cette surcharge est ralise en mlangeant 475 L dhuile essentielle de citron avec 25 L dune solution de mlange de pesticides 1 mg.L-1. Ces 500 L sont ensuite dilus avec 1,5 mL dactonitrile, conduisant un volume final dchantillon de 2 mL. Lextraction sur cartouche MegaBond Elute C18 consiste en trois tapes. Dans un premier temps, la cartouche SPE est conditionne successivement avec 6 mL de mthanol, 6 mL deau et 6 mL dactonitrile. Les 2 mL dchantillon sont ensuite dposs sur la cartouche. Llution est alors ralise au moyen de trois fractions de 5 mL dun mlange ACN/Eau (25/5), puis de deux fractions de 5 mL dactonitrile. Lensemble de ces fractions est collect dans un ballon de 100 mL. Lvaporation du solvant est effectue sous pression continue avec une temprature du bain marie fixe 40C. Une fois le ballon sec, les parois sont rinces avec 1 mL dactate dthyle qui est ensuite transfr dans un vial. Il faut noter quil reste, encore une fois, un faible volume de rsidu gras de couleur jaune la fin de lvaporation. Un aliquote de 400 L est ensuite prlev, vapor sec sous un faible flux dazote, puis repris dans 400 L de mthanol pour viter le problme de solubilit rencontr en I.1.2.. Lextrait est finalement transfr dans un vial, puis inject en LC-MS/MS avec un volume dinjection de 50 L.
142
I.2.2. Rsultats et discussion La Figure 73 prsente les chromatogrammes dun point de gamme solvant prpar une concentration de 50 g.L-1 (MeOH) et du TR. Un point de quantification 25 g.L-1 aurait cependant t plus judicieux puisque la concentration attendue dans lextrait est de 25 g.L-1. En effet, le RE est, comme dans lexprience prcdente, gal 0,5.
XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 2 (50 ppb meoh) of essai mega bond et filtre.wiff (Turbo ... Max. 5.6e4 cps.
XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 7 (test mega bond) of essai mega bond et filtre.wiff (Turb... Max. 1.5e4 cps.
9.0e5 8.0e5 7.0e5

1.0e5
a)
9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4
b)
6.0e5 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5

2.12
2.0e4
2.08
1.0e4
1.90
0.0
10
12 14 Time, min
16
18
20
22
24
0.0
10
12 14 Time, min
16
18
20
22
24
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 73.
Chromatogrammes a)du point de gamme solvant 50 g.L-1 et b) du taux de rcupration
La dgradation de la rsolution des pics chromatographiques pour les composs peu et moyennement polaires est due linjection dans du MeOH pur avec un volume trop lev. Dun point de vue qualitatif, lobservation des chromatogrammes ci-dessus semble montrer une meilleure rcupration des composs apolaires que lors de lexprience prcdente. Cette supposition est confirme par les taux de rcupration prsents dans le Tableau 16.
Substance active Abamectine Acephate Actamipride Acibenzolar - S- mthyl Aclonifen Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Bromacil Butraline Carbaryl Carbendazime Carbtamide Chlopyralid Chloridazone Chlorpyrifos Cycloxydime Cyhalothrine (lambda) Cyromazine Deltamthrine Difnoconazole Diflufnicanil Dimethenamid Dimethoate Diuron Ethofumesate Fluazifop-p-butyl Flurochloridone TR (%) 47 64 46 50 28 63 52 39 48 16 61 77 59 82 55 27 3 40 9 38 35 1 55 47 47 52 12 42 Substance active Fluroxypyr Iprodione Isoproturon Isoxaben Lnacile Linuron Mfnoxam Mtamitron Mtazachlore Mthomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oxadiazon Oxyfluorfene Pendimthaline Pirimicarbe Prometryn Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymetrozin Quizalofop-p-ethyl Simazine Sulfosulfuron Tau-fluvalinate Tebuconazole TR (%) 85 59 52 63 62 55 54 48 39 52 49 32 39 10 41 14 15 35 44 61 31 53 16 55 35 21 47
Tableau 16.
Taux de rcupration des substances actives obtenus lors de lextraction sur la cartouche SPE MegaBond Elute
143
Le Tableau 16 indique que lensemble des substances actives ont t dtectes. En revanche certaines admettent des TR extrmement faibles, infrieur 10 % (cycloxidime, cyromazime, diflufenican). Les autres composs ont des rendements compris entre 12 % (fluazifop-p) et 85 % (fluroxypyr). Les TRs sont ici, comme lors de lexprience prcdente, des estimations puisquils ont t calculs partir dun point solvant. I.3 Conclusion
La mise en place dune mthode dextraction en phase solide apparat relativement complique dans le cadre dune analyse multi-rsidus comportant un grand nombre de substances actives. Certaines substances actives admettent en effet des taux de rcupration trs faibles. Le taux de rcupration du diflufenican a, ainsi, t valu environ 1 %. Ceci nest pas encourageant si lon envisage dlargir la mthode un nombre plus consquent de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 substances actives. De plus, il faut savoir que des essais complmentaires, raliss sur lhuile essentielle de lavandin, ont montr que la quasi-totalit de lhuile essentielle tait rcupre lissue de lvaporation sous vide. De ce fait, la mthode de prparation SPE, ventuellement applicable lhuile essentielle de citron, ne le serait pas celle de lavandin. Pour rappel, lobjectif du projet est de proposer une mthode danalyse polyvalente capable danalyser un grand nombre de substances actives mais qui soit galement applicable diverses huiles essentielles.
II. Purification SPE dispersive : la mthode QuEChERS

Les essais de purification par SPE dispersive sont bass sur la mthode normalise QuEChERS.30 La QuEChERS est une mthode danalyse multi-rsidus de pesticides dans les aliments dorigine vgtale tels que les fruits, les lgumes, les crales, ainsi que leurs produits drivs. Le principe consiste extraire les pesticides avec de lactonitrile mlang ventuellement de leau, chlorure de sodium et sels de citrate tampons. Un aliquot de la phase organique est ensuite prlev et purifi par SPE dispersive, laide dadsorbants en vrac type PSA (Primary Secondary Amino) et de sulfate de magnsium pour retirer leau rsiduelle. Les extraits sont ensuite acidifis afin damliorer la stabilit et le stockage de certains pesticides sensibles aux bases. Les expriences prsentes ci-aprs ne concernent que la partie purification par SPE dispersive. En effet, lextraction des pesticides de lhuile essentielle de lavandin avec lactonitrile ne peut tre mise en place du fait de la solubilit de lhuile essentielle dans ce
144
solvant. Avant denvisager la poursuite de la mise en place dun tel protocole, nous avons dcid dvaluer lefficacit de la purification de la SPE dispersive. II.1 Blancs de purification Deux phases adsorbantes ont t testes lors de ces essais, le PSA et un mlange de PSA/C18. Il faut signaler que le mlange PSA/CA (charbon actif), couramment utilis dans la mthode QuEChERS, a t cart volontairement. En effet, le charbon actif est connu pour adsorber les composs possdant une structure planaire. Le contact avec le PSA engendre une augmentation de pH jusqu une valeur environ gale 8, ce qui compromet la stabilit de certains pesticides. Il est donc conseill dacidifier lextrait aprs la purification. Plusieurs taux dacide actique (0, 0,05, 0,1, 0,5%) ont donc t tests avec une application pr et post purification pour en valuer linfluence. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 II.1.1. Protocole exprimental Le protocole gnral de purification commence par lintroduction de 1 mL dextrait dans un tube contenant soit : o 150 mg MgSO4 + 50 mg PSA (tube PSA) ; o 150 mg MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 (tube PSA/C18) ; Les tubes sont agits pendant une minute au vortex, puis centrifugs pendant 2 minutes 3000 rpm. 500 L de surnageant sont ensuite prlevs et injects (Vinj = 50 L) en LCMS/MS avec ajout pralable ou non dacide actique. Quatre points de gamme, pour autant de taux dacides, sont prpars une concentration de 50 g.L-1 pour quantifier les taux de rcupration des pesticides : o G1 : 50 g.L-1 dans lACN ; o G2 : 50 g.L-1 dans lACN acidifi 0,05 % ; o G3 : 50 g.L-1 dans lACN acidifi 0,1 % ; o G4 : 50 g.L-1 dans lACN acidifi 0,5 %.
Six blancs de purification ont t raliss pour chaque phase adsorbante avec deux rptats chacun. Cette procdure est illustre dans la Figure 74. Les blancs ont tous t analyss en mode ESI+ et ESI-.
145
Blanc 1 50 g.L-1 ACN
Blanc 2 50 g.L-1 ACN 0,05%
Blanc 3 50 g.L-1 ACN 0,1%
Blanc 4 50 g.L-1 ACN 0,5%
SPE dispersive
SPE dispersive
Prlvement du surnageant
Acidification 0,05%
Acidification 0,1%
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Figure 74.
Schma du protocole relatif aux blancs de purification par SPE dispersive
II.1.2. Rsultats Le Tableau 17 regroupe lensemble des rsultats obtenus pour les substances actives analyses en ESI+ lors de cette exprience. En effet, il na pas t jug utile dinclure dans ce tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 tableau les molcules analyses en ESI- dont les taux de rcupration ne dpassent pas 10 % dans le meilleur des cas, c'est--dire lorsque les extraits sont acidifis hauteur de 0,5 % dacide actique.
Substance active Abamectine Acephate Acetamipride Acibenzolar-S- methyl Aclonifen Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Bromacil Butraline Carbaryl Carbendazime Carbetamide Chlopyralid Chloridazone Chlorpyrifos Cycloxidime Cyhalothrine ( ) Deltamethrine Difenoconazole Diflufenican Dimethanamide Dimethoate Diuron Ethofumesate Fluazifop-p-butyl Flurochloridone Fluroxypyr Iprodione Isoproturon Isoxaben Lenacile Linuron Mefenoxam Metamitrone TR (%) ~50 90-100 90-100 90-100 90-100 variable 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 100 90-100 Non rcupr 90-100 90-100 20-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 Jusqu' 70 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 Phase la plus adapte PSA seul Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux PSA seul Les deux Les deux PSA seul Les deux Les deux Les deux PSA seul Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux PSA+C18 Les deux Les deux Les deux PSA seul Les deux Les deux Les deux Taux dacide 0,1 % / / / 0.5 % / / / / / / / / 0.5 % post SPE / / / / / 0,1 % / / / 0,1 % post SPE / / / / / / / TR = 100% avec les deux phases pour les blancs 4 Remarque Il semble que lacidification joue sur la stabilit
Seulement recupr en prsence dacide
146
Substance active Metazachlore Methomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oxadiazon Pendimethaline Pirimicarbe Procymidon Prometryn Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymetrozin Quizalofop-p-ethyl Simazine Sulfosulfuron Tau-fluvalinate Tebuconazole
TR (%) 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 90-100 15-35 90-100 90-100 10 90-100 90-100
Phase la plus adapte Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux Les deux PSA seul Les deux PSA seul Les deux Les deux Les deux PSA seul Les deux Les deux Les deux Les deux PSA seul
Taux dacide / / / / / / / / / / / / / 0,1 % / /
Remarque
TR 70 % avec C18 TR infrieur avec C18
TR infrieur avec C18 Meilleur TR avec acidification post SPE
Lgrement rcupr avec 0,5 % dacide / / TR infrieur avec C18
Tableau 17.
Rsultats des blancs de purification par SPE dispersive pour les substances actives dtectes en mode ESI+
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Si la majorit des pesticides du Tableau 17 admettent un taux de rcupration suprieur 90 %, cette purification montre tout de mme des limitations avec des pertes importantes pour les composs sensibles au pH (acides et bases). La mthode QuEChERS prvoit effectivement une injection pr-purification pour lanalyse des composs acides. Avant de rechercher des conditions de purification plus optimales avec notamment loptimisation des masses dadsorbants, limpact de cette purification a t valu sur lhuile essentielle de lavandin avec lutilisation de la phase adsorbante PSA qui apparat, compte tenu du Tableau 17, plus adapte. II.2 Evaluation de la purification sur lhuile essentielle de lavandin Linfluence de la SPE dispersive a t value en comparant lvolution du rapport S/N entre, une huile essentielle de lavandin dilue purifie, et non purifie sur PSA, selon le protocole illustr par la Figure 75.
HE lavandin tmoin HE lavandin tmoin HE lavandin Surcharge 500 g/L HE lavandin Surcharge 500 g/L
Dilution 1/10e ACN
Dilution 1/10e ACN
Dilution 1/10e ACN
Dilution 1/10e ACN
SPE di spersive PSA
SPE di spersive PSA
Prlvement du surnageant 500 L
Prlvement du surnageant 500 L
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Figure 75.
Protocole dvaluation de la purification de la SPE dispersive sur lhuile essentielle de lavandin
147
La Figure 76 prsente les chromatogrammes obtenus pour six substances actives reprsentatives de lensemble des pesticides en termes de polarit et de temps de rtention. Il sagit de lactamipride, du bromacil, du dimthanamide, du propiconazole, de la deltamthrine et du tau-fluvalinate.
Lavandin tmoin non surcharg
XIC of +MRM (111 pairs): 223.2/126.0 amu Expected RT: 2.8 ID: actamipride -1 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turbo ... 2.76 Max. 204.4 cps.
Lavandin surcharg 500 g.L-1

XIC of +MRM (111 pairs): 223.2/126.0 amu Expected RT: 2.8 ID: actamipride -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (Tur... 2.79 Max. 2.7e4 cps.
200 180 160

2.59
2.6e4 2.4e4
Sans purification
Avec purification PSA

2.2e4 2.0e4
Sans purification S/N = 636
Avec purification PSA S/N = 682
140 120
2.30
2.39 2.69
1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0
Actamipride
3.05 3.22 2.80 2.90 2.99 3.10 3.15 3.27
100 80 60 40 20 0
2.51
2.43
2.64
Log Kow = 0,8 tR = 3,3 min
2000.0 0.0
XIC of +MRM1.9 pairs): 261.0/205.0 amu Expected RT: 7.1 ID: Bromacil -12.6 Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turbo Spra... (111 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 from 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
3.5 3.6 3.7 3.8 Max. 115.7 cps. 3.9 4.0
XIC of +MRM (111 pairs): 261.0/205.0 amu Expected RT: 7.1 ID: Bromacil -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turbo S... 7.00
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
Tim min e,
140 130 120 110 100
6.44 6.66 7.00 7.20 6.21 6.03 6.14 6.40 6.75 6.30 6.50 7.17 7.40 7.56 6.89 7.51
3.0 3.1 Tim min e,
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
Max. 1.1e4 cps.
3.9
4.0
1.06e4 1.00e4
Sans purification
6.39 7.25

9000.00 8000.00
7.27
90 80 70 60 50 40 30 20
Bromacil
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
10 0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Tim m e, in 7.4 7.6 7.8 8.0
14.55
7000.00 6000.00 5000.00 4000.00 3000.00 2000.00 1000.00 0.00
XIC of +MRM (111 pairs): 276.1/244.1 amu Expected RT: 14.1 ID: Dimethenamid -1 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turb...
8.2
8.4
8.6
8.8 413.8 cps. 9.0 Max.
5.6 5.8 6.0 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 XIC of +MRM (111 pairs): 276.1/244.1 amu Expected6.214.1 ID: Dimethenamid -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (... RT: Tim m e, in
13.98
8.0
8.2
8.4
8.6 Max. 8.8 cps. 7.6e4
400
14.50 14.19 14.12 14.29 14.40
7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4
350
300
13.66
13.94
13.99
250
Dimthnamide
Sans purification Avec purification PSA
5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0
200
150
100
50
0 13.0 13.2 13.4 13.8 14.0 14.2 14.4 XIC of +MRM (111 pairs): 342.1/69.1 amu Expected RT: 18.0 ID: 13.6 Propiconazole -2 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turb... Tim m e, in
18.19
14.6
14.8
15.0 Max. 2885.4 cps.
XIC of +MRM (111 pairs): 342.1/69.1 amu Expected RT: 18.0 ID: Propiconazole -2 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison14.3 psa.wiff (T... 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 13.9 14.0 14.1 14.2 dilution 14.4 14.5
0.0
Max. 14.6 14.7 14.8 14.9 15.0 1.3e4 cps.
Tim m e, in
2800 2600 2400 2200
1.3e4 1.2e4 1.1e4
17.99

17.91
Sans purification
1.0e4
1800 1600 1400 1200

18.07 17.86 17.96
18.36
Propiconazole
Log Kow = 3,72 tR = 16,9 min
2000
9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0

18.42 18.51
1000 800 600 400 200 18.0 18.2 18.4 18.6 XIC of +MRM (111 pairs): 521.0/278.9 amu Expected RT: 19.6 ID: deltamthrine -1 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turb... Tim m e, in
19.15
1000.0
16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.8 19.0 19.2 19.4
0.0
Max. 670.1 cps.
XIC of +MRM (111 pairs): 521.0/278.9 amu Expected RT: 19.6 ID: deltamthrine -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (...
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2 18.4 Tim m e, in
18.6
18.8
19.0
19.2
Max. 2680.2 cps.
19.4
650 600 550 500
Sans purification
3118 3000 2800 2600 2400
19.63

19.64 19.70
2200
450 400 350

19.85 19.93
Deltamthrine
Log Kow = 4,26 tR = 19,6 min
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
300 250 200 150
600
100 50 0 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 Tim m e, in 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0
19.14
19.82 19.88
400 200 0
Max. 251.6 cps.
XIC of +MRM (111 pairs): 519.9/208.1 amu Expected RT: 19.7 ID: tau-fluvalinate -1 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Turb... 19.38
XIC of +MRM (111 pairs): 519.9/208.1 amu Expected RT: 19.7 ID: tau-fluvalinate -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (...
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8 Tim m e, in
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
Max. 1824.2 cps.
21.0
252 240 220 200 180
1950
19.49 19.61
1800
19.63
Sans purification
19.71

20.10 20.16
1600 1400
160
19.88
140
19.29 19.83 20.04
Tau-fluvalinate
Log Kow = 4,26 tR = 20,5 min
1200 1000 800 600 400
120 100 80 60 40 20 0 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 Tim m e, in 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0
19.76
200 0
19.43 19.26 19.32
19.87
20.01
20.13
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6 19.8 Tim m e, in
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
Figure 76.
Chromatogrammes issus des premires transitions de six pesticides choisis pour leur tR rpartis sur lensemble purifi (en bleu) et purifi (en rouge) sur PSA
du run chromatographique dans le cas de lanalyse LC-ESI/sSRM dchantillons dhuile essentielle de lavandin non
148
La comparaison des chromatogrammes obtenus partir dchantillons purifis avec ceux issus dchantillons non purifis permet de montrer limportance de considrer certains aspects caractristiques de la ligne de base comme sa hauteur et la prsence ou non dinterfrents. La mise en place dune purification a pour objectif de diminuer lintensit de la ligne de base et donc du bruit de fond, permettant dobtenir un meilleur rapport S/N et par suite, dabaisser la limite de quantification de la substance active. Un second objectif concerne llimination dinterfrents dont les lutions sont proches du compos dintrt. En effet, ces composs interfrents peuvent engendrer des difficults dintgration, voire des faux positifs. Pour les trois composs les plus polaires (actamipride, bromacil, dimthanamide), la purification PSA na pas une influence significative sur le bruit de fond (Figure 76 colonne de gauche). Cette observation est confirme par les valeurs des rapports S/N calculs pour les tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 chantillons surchargs (Figure 76 colonne de droite) qui se rvlent gales, que lhuile essentielle ait t traite par SPE dispersive ou non. En revanche, pour les trois composs les moins polaires (propiconazole, deltamthrine, tau-fluvalinate), une amlioration au niveau du bruit de fond est constate. Si elle est lgre dans les cas de la deltamthrine et du tau-fluvalinate, elle permet dliminer un interfrent pour le propiconazole. Cet effet est par ailleurs plus prononc sur la seconde transition du propiconazole o linterfrent cause un paulement du pic de propiconazole dans le cas de lchantillon non purifi (Figure 77).
a) Lavandin tmoin non surcharg
XIC of +MRM (111 pairs): 342.1/159.0 amu Expected RT: 18.0 ID: Propiconazole -1 from Sample 2 (Lav d10) of comparaison dilution psa.wiff (Tur... 18.14 Max. 6732.7 cps.
b) Lavandin surcharg 500 g/L

XIC of +MRM (111 pairs): 342.1/159.0 amu Expected RT: 18.0 ID: Propiconazole -1 from Sample 4 (lav 500 d10) of comparaison dilution psa.wiff (...
Max. 4.0e4 cps.
6500 6000 5500 5000
4.2e4 4.0e4
17.99
3.5e4
17.90
Sans purification
3.0e4
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500

18.46
Propiconazole
Log Kow = 3,72 tR = 16,9 min
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
Epaulement du linterfrent
1000
17.69
17.91
5000.0
500 0 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 Time, min 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0
0.0 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 Time, min 18.4 18.6 18.8 19.0
Figure 77.
Chromatogrammes de masse illustrant leffet de la purification sur la seconde transition du propiconazole
(342,1159,0) dun chantillon dhuile essentielle de lavandin a) non sucharg et b) surcharg en propiconazole
Les donnes recueillies sur le propiconazole mettent en vidence que, malgr la grande spcificit du mode SRM, la prsence dinterfrents nest toujours pas exclue.
149
II.3 Conclusion Tout comme lextraction sur phase solide, il apparat difficile de mettre en place une purification par SPE dispersive dans le cadre dune analyse multi-rsidus largie, notamment cause de la rcupration des composs acido-basiques qui ncessiteraient, de toute faon, une injection sans purification. De plus, mme si ces essais ont t directement injects dans lactonitrile, le chapitre I a permis dtablir que le solvant dinjection optimal tait le mthanol. Linjection directe des extraits dans lactonitrile ou la mise en place dune tape supplmentaire dvaporation pour changer le solvant de reprise auraient des consquences nfastes sur la sensibilit de la mthode. Ces essais ont cependant mis en vidence quelques points positifs de la purification par SPE dispersive, principalement sur les pesticides peu polaires. Elle permettrait de diminuer tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lgrement le bruit de fond des transitions et pourrait se rvler utile pour liminer certains interfrents, limage de celui prsent sur les transitions du propiconazole.
III. Dilution pour une injection directe des huiles essentielles

Lobjectif des essais suivants tait destimer les limites de quantification quil tait envisageable dobtenir si le protocole de prparation consistait diluer les huiles essentielles pour les injecter directement en LC-MS/MS. Bien que les conditions analytiques pour une injection dans le mthanol ntaient pas totalement optimises lors de ces essais, ce solvant a tout de mme t choisi pour la dilution des huiles essentielles (non solubles dans le MeOH/Eau). III.1 Protocole exprimental Afin dvaluer linfluence de la dilution sur leffet matrice et les limites de quantification, trois taux de dilutions 1/10e, 1/25e et 1/50e ont t testes pour les deux huiles essentielles de citron et lavandin. Des tmoins dhuiles essentielles non surcharges en pesticides, correspondant aux taux de dilution de 1/50e, 1/25e et 1/10e, ont t prpars en mlangeant 20, 40 et 100 L dhuile essentielle dans respectivement 980, 960 et 900 L de mthanol. Des gammes matrices comprenant sept points de gamme (0,5, 1, 2, 5, 10, 25, 50 g.L-1) ont ensuite t ralises partir de ces tmoins. La prparation dun point de gamme matrice consiste mlanger 90 L de tmoin et 10 L dun point solvant une concentration 10 fois
150
suprieure celle dsire. Par exemple, pour prparer un point de gamme matrice 1 g.L-1, 90 L de tmoin sera mlang avec 10 L dun point de gamme solvant une concentration de 10 g.L-1. Une gamme solvant a galement t prpare pour servir de rfrence. Elle est constitue de six points de gamme : 0,1, 1, 5, 10, 20 et 50 g.L-1. III.2 Rsultats et discussion III.2.1. Mise en vidence des effets matrice Une mthode commune pour valuer leffet matrice consiste comparer deux droites dtalonnage, lune obtenue partir dune gamme prpare dans le solvant, lautre partir dune gamme prpare dans la matrice. La diffrence de rponse entre les points prpars tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dans la matrice et ceux dans le solvant permet de calculer leffet matrice. Il sera qualifi de positif dans le cas dune augmentation du signal et de ngatif dans le cas dune diminution. Les effets matrice des huiles essentielles de lavandin et de citron ont t mis en vidence en comparant les gammes solvants et matrices de 56 pesticides. Lensemble de ces gammes sont exposes en Annexe 7 et ordonnes par temps de rtention croissant de la substance active. Ce classement permet de visualiser plus aisment la corrlation entre le temps de rtention li la polarit de la molcule et leffet matrice d lhuile essentielle. Le Tableau 18 prsente un compos polaire (actamipride) qui nest pas sujet leffet matrice et un compos apolaire (oxadiazon) pour lequel linfluence de la matrice est clairement ngative.
Substance active
Log Kow tR (min) Gammes solvant et matrice dans le citron Gammes solvant et matrice dans le lavandin
Actamipride
0,8
3,05
Oxadiazon
5,33
19,2
Tableau 18.
Comparaison des gammes solvants et matrices de deux substances actives : lactamipride (polaire) et loxadiazon (apolaire)
151
Lobservation des droites talons de loxadiazon montre que limportance de leffet matrice diffre selon lhuile essentielle considre. En effet, si une dilution au 1/25e de lhuile essentielle de lavandin permet de dissiper presque totalement leffet matrice (superposition des gammes solvant et matrices), mme une dilution au 1/50e de lhuile essentielle de citron naboutit pas la suppression de leffet matrice. Dun point de vue gnral, leffet suppresseur de la matrice est surtout observ pour les composs apolaires. En effet, seules 4 des 31 substances actives lues dans les 16 premires minutes du run sont affectes par un effet matrice, contre 15 des 20 substances actives lues aprs 16 minutes. La comparaison de ces droites talons reportes dans le Tableau 18 permet de mettre en vidence leffet suppresseur de la matrice au niveau de lionisation electrospray. Cependant, il peut galement se traduire par une augmentation du bruit de fond (ligne de base), ce qui ne tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 modifie pas directement lintensit du pic chromatographique de lanalyte considr mais son rapport S/N et donc, sa limite de quantification. III.2.2. Dtermination des limites de quantification dans le solvant et les huiles essentielles de citron et lavandin La limite de quantification se dfinit comme la plus petite quantit danalyte pouvant tre dtermine quantitativement. La LOQ dun appareil analytique correspond un rapport signal sur bruit S/N = 10. Pour faciliter linterprtation des rsultats, elle est assimile, dans ce paragraphe, au point de gamme de concentration la plus basse pour lequel lanalyte a pu tre quantifi (S/N 10). De mme, il sagit bien l des LOQs appareillage et non des LOQs dans les huiles essentielles brutes. Ces dernires peuvent toutefois tre obtenues en tenant compte du facteur de dilution. Le Tableau 19 recense les LOQs des substances actives obtenues dans le solvant et pour les trois taux de dilution des deux huiles essentielles.
LOQs Solvant (MeOH) 1 5 1 1 5 1 0,1 1 1 0.1 1 1 1 5 LOQs dans lhuile essentielle de citron dilue au 1/50e 1/25e 1/10e 2 5 5 5 5 5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 5 5 5 2 5 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 LOQs dans lhuile essentielle de lavandin dilue au 1/50e 1/25e 1/10e 5 5 25 5 5 5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 5 5 5 2 5 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 0.5 0.5 0.5 5 5 5
Pesticide Abamectine Acephate Actamipride Acibenzolar-S-mthyl Aclonifen Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Bromacil Butraline Carbaryl Carbendazime Carbtamide Chloridazone
152
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Pesticide Chlorpyrifos Cycloxydime Cyhalothrine ( ) Cyromazine Deltamthrine Difnoconazole Diflufnicanil Dimethenamid Dimethoate Diuron Ethofumesate Fluazifop-p-butyl Flurochloridone Iprodione Isoproturon Isoxaben Lnacile Linuron Mfnoxam Mtamitron Mtazachlore Mthomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oxadiazon Pendimthaline Pirimicarbe Prometryn Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymetrozin Quizalofop-p-ethyl Simazine Sulfosulfuron Tau-fluvalinate Tebuconazole
LOQs Solvant (MeOH) 1 0.1 10 5 1 0.1 0.1 1 1 1 1 0.1 1 5 0.1 0.1 1 1 0.1 1 0.1 1 1 0.1 1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1 0.1 1 2 5 0.1
LOQs dans lhuile essentielle de citron dilue au 1/50e 1/25e 1/10e 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10 10 25 5 5 5 1 1 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 2 5 10 10 10 0.5 0.5 0.5
LOQs dans lhuile essentielle de lavandin dilue au 1/50e 1/25e 1/10e 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 25 25 50 5 5 5 5 10 25 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 2 Non dtect 5 5 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Pic coup 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 2 5 5 5 10 10 0.5 0.5 0.5
Tableau 19.
LOQs en g.L-1 des substances actives en fonction de lhuile essentielle et du taux de dilution
Avant de dbuter linterprtation du Tableau 19, il convient de prciser un point qui pourrait paratre anormal. De nombreuses molcules ont une LOQ matrice gale 0,5 g.L-1 alors que leur LOQ solvant slve 1 g.L-1 (ex : actamipride). Cela ne signifie pas pour autant que, pour ces molcules, la sensibilit de la mthode est meilleure dans la matrice que dans le solvant. En fait, il faut signaler que, lors de la prparation des solutions, les points de gamme solvant navaient pas exactement les mmes concentrations que les points de gamme matrice. Ainsi, une augmentation de la LOQ dans les gammes matrice par rapport la gamme solvant est observe pour 13 molcules (lignes bleues dans le Tableau 19) de nature polaires et apolaires. Ces augmentations sont dues soit un effet matrice suppresseur, soit une augmentation du bruit de fond. Malgr leffet suppresseur de la matrice, mis en vidence en
153
comparant les droites talons, les composs apolaires conservent, pour la majorit, des LOQs satisfaisantes. Ceci est principalement d leur grande sensibilit. En outre, si on se focalise uniquement sur linfluence du taux de dilution, on observe que le rapport S/N de chaque pesticide augmente globalement avec le taux de dilution pour une concentration donne. Toutefois, lamlioration constate sur le rapport S/N nest pas assez importante pour induire une baisse de la LOQ lexception des huit molcules du Tableau 20.
Composs polaires et moyennement polaires Amidosulfuron Sulfosulfuron Flurochloridone Ethofumesate
Tableau 20.
Composs apolaires CyhalothrineDeltamethrine Tau fluvalinate Abamectine
Substances actives dont la LOQ varie avec le facteur de dilution de lhuile essentielle
Si llvation de la LOQ est plutt modre pour les composs polaires et moyennement polaires, de lordre dun facteur 2, elle est plus prononce pour les molcules apolaires. Par tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 exemple, la LOQ de la deltamthrine volue de 5 g.L-1 dans le lavandin dilu au 1/50e 25 g.L-1 pour une dilution au 1/10e. Ces essais dmontrent la faisabilit dune dilution suivie dune injection directe pour lanalyse multi-rsidus de pesticides dans les huiles essentielles. Malgr des effets matrice moindres et des LOQs lgrement plus basses pour des dilutions au 1/25e et 1/50e, il apparat difficile de sorienter sur ces taux. En effet, en termes de sensibilit dans les huiles essentielles brutes, la baisse des LOQappareillage constate pour des dilutions au 1/25e et 1/50e nest pas assez importante pour compenser le taux de dilution par rapport une dilution de 1/10e. Les LOQs correspondantes dans les huiles essentielles brutes sont par consquent beaucoup plus leves que pour une dilution au 1/10e. Ainsi, une substance active dont la LOQappareillage serait gale 0,5 g.L-1 conduirait une limite de quantification dans lhuile essentielle brute (LOQHE) de 25 g.L-1 et 5 g.L-1 respectivement, pour des taux de dilutions de 1/50e et 1/10e. Dans le cas dune dilution au 1/10e, une limite de quantification de 10 g.L-1 dans lhuile essentielle (soit une LOQappareillage de 1 g.L-1) pourrait tre obtenue pour 35 des 53 pesticides du Tableau 19.
154
IV. Conclusion sur les mthodes de prparation des huiles essentielles

Les essais dvelopps dans cette partie ont permis de tester trois mthodes de prparation des huiles essentielles bases sur des procds diffrents, savoir la SPE, la SPE dispersive et la simple dilution. La SPE parat difficilement envisageable au vu des taux de rcupration extrmenent faibles admis par plusieurs composs, lexemple du diflufenican (TR = 1 %). La SPE dispersive, bien que possdant des avantages notamment concernant llimination de certains interfrents, ne peut tre applique lensemble des substances actives du fait de la sensibilit des composs acido-basiques la variation de pH cause par la phase adsorbante de type PSA. Au final, la troisime et dernire mthode teste, qui consiste en une simple dilution suivie dune injection directe en LC-MS/MS, semble tre la prparation la plus adapte lanalyse de rsidus de pesticides dans les huiles essentielles. En effet, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 contrairement aux deux autres procdures, elle ne pose aucun problme de rcupration des composs, et les LOQs envisageables avec une dilution au 1/10e sont encourageantes puisque, ce stade du dveloppement, une LOQ de 10 g.L-1 pourrait tre atteinte pour un peu plus de la moiti des substances actives.
155
B) Dveloppement de la mthode danalyse : tude dune huile essentielle de lavandin sucharge en pesticides
Compte tenu des essais prliminaires mens sur la prparation des chantillons dhuiles essentielles, la mthode retenue est une dilution au 1/10e dans un solvant organique. Ce type de prparation implique que la sensibilit de la mthode danalyse est entirement dicte par lanalyse LC-MS/MS. Cest pourquoi, un travail consquent a dabord t fourni pour optimiser les conditions chromatographiques dans le cas dune injection dans un solvant organique pur comme le mthanol. Puis, les effets matrice ainsi que les limites de quantification denviron 70 substances actives, ont t valus dans lhuile essentielle de lavandin.259 Enfin, la mthode tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 nouvellement dveloppe, a t applique lanalyse dchantillons rels dhuile essentielle de lavandin.
I.
Optimisation des conditions dinjection dune huile essentielle

I.1 Nature du solvant et volume dinjection
Les essais dtaills ci-dessous avaient pour objectifs dtudier, dans un premier temps, limpact de la nature du solvant dinjection sur la rsolution chromatographique puis, dans un second temps, dvaluer linfluence du volume dinjection.
Il est largement reconnu que les conditions chromatographiques idales sont obtenues lorsque lchantillon analys est inject dans un solvant dinjection de mme nature que la composition initiale de la phase mobile. Dans notre cas, il sagit dun mlange MeOH/Eau (50/50). Cependant, du fait de la non-miscibilit des huiles essentielles avec leau, il faut envisager un solvant de dilution de nature 100 % organique tel que le mthanol et lactonitrile. Les injections de 50 L de trois mlanges de 54 pesticides une concentration de 100 g.L-1 prpars respectivement dans les solvants MeOH/Eau (50/50), MeOH et ACN ont abouti aux chromatogrammes de la Figure 78.
156
X IC o + R (1 1 p irs): 1 3 /8 .0 a u E e f M M 1 a 6 .0 8 m xp cte R : 2 ID m th m l -1 fro S m le 4 (1 0 p b M 5 u o ... d T .2 : o y m a p 0 p /E 0 ) f
M x. 1 e cp a .5 5 s.
1.16e6 1.10e6
XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 4 (100 ppb M/E 50u) of essai volume inj.wiff (Turbo Spra... Max. 1.5e5 cps.
(a)
3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5
1.00e6 9.00e5
2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4

2.21
In te n sity , c p s
8.00e5 7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 1.00e5 0.00
4.0e4 2.0e4 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, min 6.0 7.0 8.0 9.0
2 1 .2
10
12 14 T e, m im in
16
18
20
22
24
M x. 5 e cp a .7 4 s.
X IC o + R (1 1 p irs): 1 3 /8 .0 a u E e f M M 1 a 6 .0 8 m xp cte R : 2 ID m th m l -1 fro S m le 1 (1 0 p b M 5 u o e d T .2 : o y m a p 2 0 p 0 ) f ...
1.06e6 1.00e6 9.00e5 8.00e5

XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 12 (100 ppb M 50u) of essai volume inj.wiff (Turbo Spray... Max. 5.7e4 cps.
(b)
8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4
6.0e4
7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 1.00e5 0.00
2.12
5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4

1.69
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, min 6.0 7.0 8.0 9.0
10
12 14 T e, m im in
16
18
20
22
24
M x. 4 e cp a .3 4 s.
X IC o + R (1 1 p irs): 1 3 /8 .0 a u E e f M M 1 a 6 .0 8 m xp cte R : 2 ID m th m l -1 fro S m le 2 (1 0 p b A 5 u o e d T .2 : o y m a p 1 0 p 0 ) f ...
1.18e6 1.10e6 1.00e6 9.00e5

XIC of +MRM (111 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.2 ID: mthomyl -1 from Sample 21 (100 ppb A 50u) of essai volume inj.wiff (Turbo Spray... Max. 4.3e4 cps.
(c)
5.3e4 5.0e4 4.5e4
2.19
8.00e5
4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4
7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 1.00e5 0.00
5000.0 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0 Time, min
6.0
7.0
8.0
9.0
10
12 14 T e, m im in
16
18
20
22
24
Figure 78.
Chromatogrammes issus de linjection de 50 L dun mlange de 54 pesticides 100 g.L-1 dans (a) du MeOH/Eau, (b) du MeOH, (c) de lACN
La Figure 78 montre une trs nette dgradation de la rsolution des pics chromatographiques lorsque linjection est effectue dans un solvant organique pur (b et c) par rapport un solvant hydro-organique. Celle-ci est dautant plus importante que le compos est polaire, cest--dire caractris par un temps dlution court. Ces dformations et largissements des pics peuvent tre dus la diffrence de force luotropique entre les phases mobiles et le solvant dinjection, ou linstabilit hydrodynamique de la bande de solvant cause par la diffrence de viscosits avec les phases mobiles. Etant donne lorigine de ces
157
dformations, il est comprhensible quelles influent davantage sur les composs les moins retenus. Quel que soit le phnomne considr, ces dformations sont dues des perturbations gnres au moment de linjection, linfluence du volume dinjection a donc t investigue. Les solutions prcdentes ont t rinjectes avec des volumes dinjections de 2, 5, 10, 15, 20, 25 et 50 L. La Figure 79 met en vidence lvolution de la largeur du pic chromatographique du compos polaire monocrotophos (log Kow = -0,22).
XIC of +MRM (111 pairs): 224.1/127.0 amu Expected RT: 2.1 ID: Monocrotophos -1 from Sample 3 (100 ppb M/E ...
XIC onocrotophos -1 fromSample 12 (100 ppb M5... Max. 2.5e5 cps. of +MRM(111 pairs): 224.1/127.0 amu Expected RT: 2.1 ID: M
Max. 8.1e4 cps.
XIC of +MRM(111 pairs): 224.1/127.0 amu Expected RT: 2.1 ID: Monocrotophos -1 from Sample 21 (100 ppb A 5...
Max. 4.8e4 cps.
2.5e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5
2.12
50
a)
I n te n s ity , c p s
8.0e4 7.0e4 6.0e4
2.06
4.8e4
1.77
50 25
b)
4.5e4 4.0e4
2.11
c)
50 25 10 5
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 Time, min
1.8e5
3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4
1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4
25
5.0e4
1.62
4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0
10
10
1.0e4 5000.0 0.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
2.0e4 0.0 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 Time, min 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9 2.0 2.1 Time, min
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3.0
Figure 79.
Evolution de la forme du pic chromatographique du monocrotophos en fonction du volume et du solvant dacquisition du scheduled SRM.
dinjection a) MeOH/Eau, b) MeOH, c) ACN. A noter que la coupure brutale des pics est due aux bornes de la fentre
Les 13 premires minutes des chromatogrammes de la Figure 78, dvoilant limpact gnral du volume dinjection sur la rsolution des pesticides polaires et moyennement polaires, sont disponibles en Annexe 8 pour les volumes dinjection de 10, 25 et 50 L. Le volume dinjection dun mlange de pesticides dilu dans du MeOH/Eau na pas deffet significatif sur la forme des pics chromatographiques (Figure 79 a)), comportement attendu tant donn que le solvant dinjection a une composition similaire celle de la phase mobile initiale. En revanche, dans le cas dinjections ralises avec des solvants organiques purs, la forme du pic chromatographique varie en fonction du volume dinjection avec des dformations proportionnelles aux volumes. Selon la Figure 79 (b et c) qui montre lvolution de lallure du pic chromatographique du monocrotophos en fonction du volume dinjection de solvants organiques purs, le mthanol semble plus adapt que lactonitrile. En effet, le mthanol donne un pic de forme bien dfini pour un volume dinjection allant jusqu 25 L (Figure 79 b), alors que de nettes dformations sont encore observes dans lACN pour un volume de 10 L (Figure 79 c). Ce phnomne peut sexpliquer par la plus faible viscosit de lactonitrile compare au mthanol, i.e., 0,345 contre 0,59 mPa.s. En considrant la composition initiale de la phase mobile, i.e., Eau/MeOH (50/50), la diffrence de viscosit entre la solution dinjection et la phase mobile doit tre plus importante pour lactonitrile que pour le mthanol.
158
Le solvant le plus adapt semble donc tre le mthanol, qui permet dinjecter un volume de 25 L en gardant des pics chromatographiques bien dfinis, mme pour les composs les plus polaires. Pour atteindre une efficacit quivalente avec lactonitrile, il faudrait se limiter un volume dinjection de 5 L. Or, la sensibilit de la mthode analytique est directement relie au volume dinjection puisquil dfinit la quantit danalyte injecte. Par consquent, en thorie, plus le volume dinjection est lev, plus la quantit danalyte injecte est grande, et meilleure sera la sensibilit. Ceci nest pas tout fait exact quand il est question dinjecter de la matrice. En effet, dans ce cas, une quantit suprieure danalyte sera effectivement injecte dans le systme mais galement plus de matrice, ce qui peut entraner des effets matrice plus importants, donc diminuer la sensibilit. Dans tous les cas, une meilleure sensibilit sera obtenue avec le mthanol mme si le volume dinjection devait tre diminu. Cest, par consquent, ce solvant qui a t retenu. Le tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 volume dinjection a t fix 20 L pour avoir des pics un peu plus fins qu 25 L pour tirer un meilleur profit du scheduled SRM. I.2 Effet de la quantit dacide dans les phases mobiles et le solvant dinjection En plus de la nature des phases mobiles et du gradient dlution, de la nature et du volume du solvant dinjection, ltude bibliographique a mis en vidence limportance du taux dacide et par consquent du pH. Il influe dune part, sur la protonation des groupements silanols et donc sur la qualit de la sparation chromatographique et, dautre part, sur la formation de molcules protonnes en solution qui est un facteur primordial de lionisation electrospray. Pour ces raisons, linfluence du taux dacide actique a t investigue la fois dans les phases mobiles et dans le solvant dinjection. A partir dun mlange de pesticides identiques aux expriences prcdentes, 4 solutions de concentrations gales 20 g.L-1 ont t prpares dans du mthanol en faisant varier le taux dacide actique : 0 %, 0, 1%, 0,5 %, 1 %. Ces solutions ont ensuite t injectes en mode ESI+ et ESI- avec, lors de la premire exprience, des phases mobiles acidifies avec 0,1 % dacide actique et, lors de la seconde exprience, des phases mobiles acidifis avec 1 % dacide actique.
159
I.2.1. Influence sur le temps de rtention Si le taux dacide actique dans le solvant dinjection na pas dinfluence sur le temps de rtention des pesticides, son augmentation dans les phases mobiles entrane la variation du tR dune trentaine de composs. Les substances actives les plus affectes sont les molcules acides et basiques : la carbendazime, le pirimicarbe, la prometryn, lamidosulfuron, le sulfosulfuron (molcules dtectes en ESI+) ainsi que lensemble des composs dtects en ESI-. Seuls les composs dont le temps de rtention variait dau moins 0,2 minutes ont t considrs et rpertoris dans le Tableau 21.
Pesticide Acibenzolar-S-methyl Azoxystrobin Dimethenamid Diuron Ethofumesate Flurochloridone Iprodione Isoproturon Isoxaben Linuron Mfnoxam Mtazachlore Napropamide Norflurazon Propyzamide Lnacile Prometryn Oryzaline Pirimicarbe Carbendazime Triclopyr MCPA Amidosulfuron Sulfosulfuron Bentazone Mecoprop Fluroxypyr Haloxyfop 2,4D Dicamba Phase 0,1% Tr (min) 15,2 13,3 14,1 11,5 13,5 15,5 16,8 10,9 14,6 13,8 10,7 10,5 16,6 11,5 15 15,5 16,4 16,2 9,6 4,1 7,5 6,2 4,2 7,7 2,2 9,1 2,4 14,4 5,6 2,4 Phases 1% Tr (min) 14,9 13 13,8 11,2 13,3 15,2 16,6 10,6 14,4 13,5 10,4 10,2 16,4 11,2 14,7 15,2 15,6 16 7,9 3,2 10,9 9,7 7,7 12 4,4 12,8 4,5 16,5 8,5 3,4 Tr 1%- tr 0,1% (min) -0,3 -0,3 -0,3 -0,3 -0,2 -0,3 -0,2 -0,3 -0,2 -0,3 -0,3 -0,3 -0,2 -0,3 -0,3 -0,3 -0,8 -0,2 -1,7 -0,9 +3,4 +3,5 +3,5 +4,3 +2,2 +3,7 +3,1 +2,1 +2,9 +1,0 Acide/base / / / / / / / / / / / / / / / Acide trs faible Acide trs faible Acide trs faible Base faible Base faible Acide faible Acide faible Acide faible Acide faible Acide faible Acide faible Acide fort Acide faible Acide fort Acide fort Pka / / / / / / / / / / / / / / / 10,4 9,95 9,4 4,4 4,2 3,97 3,73 3,58 3,57 3,28 3,11 2,94 2,9 2,87 1,87
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 21.
Evolution du taux de rtention des pesticides en fonction du taux dacide actique dans les phases mobiles
Parmi les pesticides du Tableau 21, trois groupes se distinguent. Le premier se compose des molcules ne possdant pas de proprits acido-basiques. Si leur tR diminue avec laugmentation de lacidit, la variation reste faible et ne dpasse jamais plus de 0,3 minutes. Le second groupe est constitu par les substances actives admettant un pKa suprieur 4 et
160
pour lesquelles le tR diminue galement. Enfin, le troisime groupe comprend les molcules de pKa infrieur 4 et pour lesquelles une augmentation du tR est observe. Une hypothse plausible permettant dexpliquer la variation des temps de rtention des pesticides en fonction du taux dacide actique concerne lvolution de lespce prdominante acide ou basique en fonction du pH, et donc le changement dinteractions avec la phase stationnaire, notamment les silanols.
[acide] majoritaire [base] majoritaire
pH=pKa - 1
pH=pKa
pH=pKa +1
pH
[acide] >10 [base] [acide]=[base] [base] >10 [acide]
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 80.
Rappel du diagramme de prdominance des espces acide et basique en fonction du pKa et du pH
Une explication dtaille de ce phnomne ncessiterait de connatre avec prcision tout moment t, le pH et les pKa de chaque molcule concerne ainsi que celui des silanols. Or, ces donnes sont dpendantes non seulement du pourcentage de solvant organique dans la phase mobile, mais galement de la temprature,210 leur dtermination dpassant le cadre de cette tude. De plus, il est impossible de connatre la formule de lendcapping polaire qui est probablement de nature alcoolique et donc vraisemblablement influenc par la valeur du pH.257 Nous nous limiterons donc une interprtation globale du phnomne. Concernant le premier groupe, le changement de pH nest pas cens affecter les substances actives. En revanche, les groupements silanols sont davantage protons et sont donc moins susceptibles dinteragir avec les analytes. Les composs, lgrement moins retenus par la phase stationnaire, ont donc un tR plus faible avec les phases acidifies avec 1 % dacide actique. Pour le second groupe, on distingue le lnacile, la prometryne et loryzaline de la carbendazime et du pirimicarbe. Les premiers ont des pKa levs (> 9), la forme prdominante est la forme basique RCOO- quelles que soient les phases mobiles. Llvation de pH influe seulement sur les silanols, donnant lieu moins dinteractions et, par consquent, une lution lgrement plus rapide. Concernant la carbendazime et le pirimicarbe, avec les phases 0,1%, les formes acides et basiques sont en concentration peu prs gales. Lorsque le pH diminue, la forme acide devient prdominante, tout comme pour les silanols, donnant lieu moins dinteractions et donc des tR plus faibles.
161
Enfin, pour les acides de pKa < 4, la forme prdominante dans lexprience 1 est la forme basique RCOO-, tout comme pour les silanols. Trs peu de liaisons entre les silanols et les analytes interviennent, dans ce cas, dans le processus de rtention. En revanche, quand le pH diminue, les espces acides et basiques vont coexister (idem pour les silanols) augmentant ainsi le degr dinteractions entre les analytes et la phase stationnaire et, donc, le temps de rtention. I.2.2. Influence sur laire des pics chromatographiques Les aires des pics chromatographiques des substances actives en fonction du taux dacide actique dans le solvant dinjection et les phases mobiles sont prsentes en Annexe 9. Linfluence du taux dacide actique dans le solvant dinjection est faible. En effet, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lintensit des aires de chaque pic chromatographique est relativement stable quelque soit lacidit du solvant dinjection. Le coefficient de variation pour une mme phase mobile et pour les quatre solvants dinjection ne dpasse jamais 10 %. Il est dailleurs, pour la majorit des molcules, infrieur 5 %. Par contre, linfluence du taux dacide dans les phases mobiles est prendre en compte. Il a en effet une influence considrable sur la sensibilit des molcules, comme le montre le tableau prsent en Annexe 9. Laugmentation du taux dacide actique peut avoir une influence positive, par exemple pour labamectine (amlioration de lintensit dun facteur 2,8), mais a plus gnralement une influence ngative comme le montre le Tableau 22. Le facteur F correspond au rapport entre la moyenne des aires obtenues pour les quatre solvants dinjection des phases mobiles 1 % sur la moyenne de celles obtenues pour les phases mobiles 0,1 %.
F > 1,1 0,9 < F < 1,1 F < 0,9
Tableau 22.
Nombre de pesticides 3 22 43
Rpartition des substances actives en fonction de la variation de lintensit des aires des pics chromatographiques entre les taux dacide 1 % et 0,1 % des phases mobiles
Le Tableau 22 montre trs clairement linfluence ngative globale dun taux dacide lev (1 %). En effet, 43 pesticides admettent une baisse de sensibilit pouvant aller jusqu un facteur 4 (diflufenican) quand seulement trois admettent une augmentation (abamectine, carbendazime, chloridazon).
162
XIC of +MRM (112 pairs): 395.1/265.8 amu Expected RT: 18.7 ID: diflufnicanil -1 from Sample 2 (20 ppb meoh esi+) of acidifiaction MeOH 20 ppb.... 18.69 Max. 1.4e5 cps.
XIC of +MRM (112 pairs): 890.5/305.1 amu Expected RT: 19.7 ID: Abamectine -1 from Sample 2 (20 ppb meoh esi+) of acidifiaction MeOH 20 ppb... Max. 5899.4 cps.
1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5
1.4e4 1.3e4
Phases 0,1%
1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0

19.72
Phases 1%
1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 18.0 18.1 18.2 18.3 18.4 18.5 18.6 18.7 18.8 18.9 19.0 19.1 19.2 19.3 19.4 19.5 19.6 Time, min
Phases 0,1%
Phases 1%
3000.0 2000.0 1000.0 0.0 19.1 19.2 19.3 19.4 19.5 19.6 19.7 19.8 19.9 Time, min 20.0 20.1 20.2 20.3 20.4 20.5
Figure 81.
Chromatogrammes montrant linfluence ngative ( gauche) et positive ( droite) de laugmentation du taux dacide dans les phases mobiles
La variation dintensit pour les 22 autres composs nest pas trs significative puisque infrieure 10 %. Cette exprience a permis de mettre en vidence leffet suppresseur de lacide actique sur lionisation en electrospray. En conclusion, on saperoit quen termes de sensibilit, les phases mobiles acidifies tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 avec 0,1 % dacide actique sont clairement plus adaptes que celles acidifies avec 1 %. Lacidification du solvant a quant elle une influence ngligeable. Lobjectif premier de ces essais tait damliorer lefficacit de la sparation sans pour autant ngliger la sensibilit. I.2.3. Influence sur la forme des pics chromatographiques (efficacit) Laffinement des pics chromatographiques concerne principalement les composs acidobasiques. Dun point de vue global, les pics sont plus fins avec les phases mobiles acidifis 1 % avec une influence mineure de lacidit du solvant dinjection. Concernant les phases mobiles 0,1 %, linfluence de lacidit du solvant dinjection est plus importante et permet damliorer sensiblement lefficacit de la colonne pour certains pesticides tels que lamidosulfuron (pKa = 3,58) prsent dans la Figure 82.
XIC of +MRM (112 pairs): 370.0/217.9 amu Expected RT: 4.2 ID: amidosulfuron -1 from Sample 5 (20 ppb meoh 1% esi+) of acidifiaction MeOH 2... 4.32 Max. 3130.0 cps.
XIC of +MRM (112 pairs): 370.0/217.9 amu Expected RT: 7.7 ID: amidosulfuron -1 from Sample 6 (20 ppb meoh 1% +) of 20 ppb meoh grad class...
Max. 1513.8 cps.
3130 3000 2800 2600 2400
1600 1500 1400

7.53
MeOH 1%
MeOH 1%
7.61
MeOH 0,5%
1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500
MeOH 0,5%
2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 Time, min 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0
MeOH 0,1%
MeOH 0,1%
MeOH
400 300 200 100 0 6.2
MeOH
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0 8.2 Time, min
8.4
8.6
8.8
9.0
9.2
9.4
9.6
9.8 10.0
Figure 82.
Evolution de la largeur du pic chromatographique de lamidosulfuron en fonction du taux dacide dans le solvant dinjection et du taux dacide des phases mobile 0,1 % ( gauche) et 1 % ( droite)
Comme le montre la Figure 82, avec une acidification du solvant dinjection 1 % et des phases 0,1 %, la largeur des pics est comparable celle obtenue avec les phases acidifies 1 %. Laffinement du pic chromatographique de lamidosulfuron peut tre expliqu par le fait
163
quen augmentant le taux dacide et donc en diminuant le pH, une seule espce prdomine ; ce qui favorise lhomognisation des interactions avec la phase stationnaire et donc un talement moindre de la bande dlution. La mme observation quant lamlioration de la forme des pics peut tre faite pour deux autres pesticides en ESI+ (cyromazine, sulfosulfuron) et tous les pesticides analyss en ESI-, lexception de loryzaline. Pour les pesticides ne possdant pas de proprits acido-basiques, aucune variation na t releve, ni dans lallure des pics chromatographiques, ni dans leur intensit. I.2.4. Conclusion Le meilleur compromis entre sensibilit et efficacit est obtenu avec lacidification des phases mobiles hauteur de 0,1 % et du solvant dinjection 1 %. Assurment, les phases mobiles 1 %, bien que prsentant des pics plus fins de manire gnrale, sont nettement tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 moins performantes que les phases 0,1 % dun point de vue sensibilit. Lexplication la plus probable est la mise en vidence de leffet suppresseur de lacide actique sur lionisation electrospray lorsquil est prsent en quantit trop importante. Laugmentation du taux dacide actique dans le solvant dinjection, dont linfluence est ngligeable pour des phases mobiles 1 %, permet daffiner significativement les pics des composs acido-basiques pour des phases mobiles 0,1 %. Il est mme possible datteindre des largeurs de pics proches de celles obtenues avec les phases acidifies 1 %. En rsum, lajout de 1 % dacide actique dans le solvant dinjection (mthanol) conduit une amlioration de lallure des pics et donc du rapport S/N pour 12 des 64 pesticides tests, sans avoir dinfluence ngative sur les autres molcules. A travers ltude de la nature, du volume et de lacidit du solvant dinjection, ainsi que du taux dacide actique dans les phases mobiles, loptimisation des conditions chromatographiques a permis damliorer sensiblement la rsolution des pics
chromatographiques, principalement pour les composs polaires et acido-basiques. Ainsi, linjection de 20 L dun mlange de 54 pesticides prpar dans du mthanol acidifi avec 1 % dacide actique une concentration de 50 g.L-1 et des phases mobiles acidifies avec 0,1 % donne lieu au chromatogramme de la Figure 83.
164
X IC of +M M (123 pairs): 163.0/88.0 am E R u xpected R 2.3 ID m T: : thom -1 from S yl am ple 2 (50 ppb solvant) of E chan esi+.w (Turbo S iff pray) M ax. 7.2e4 cps.
5 e .3 5 5 e .0 5
XIC of +MRM (123 pairs): 163.0/88.0 amu Expected RT: 2.3 ID: mthomyl -1 from Sample 2 (50 ppb solvant) of Echan esi+.wiff (Turbo Spray) Max. 7.2e4 cps.
1.4e5
4 e .5 5
1.3e5 1.2e5 1.1e5
4 e .0 5
1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4

2.31
3 e .5 5 3 e .0 5 2 e .5 5 2 e .0 5 1 e .5 5 1 e .0 5
3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, min 6.0 7.0 8.0 9.0
2.31
5 e .0 4 0 .0
22.85 26.09 26.41
1 0
1 2
1 4 T e m im , in
1 6
1 8
2 0
2 2
2 4
2 6
Figure 83.
Chromatogramme dun mlange de 54 pesticides une concentration de 50 g.L-1 analyss en mode ESI+
Les conditions chromatographiques permettent dsormais dinjecter directement lchantillon dans un solvant organique pur, le mthanol, tout en conservant des pics chromatographiques homognes et de belles allures sur la totalit du run chromatographique, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 mme pour les composs polaires. Lhuile essentielle de lavandin a t choisie pour prouver les performances de la mthode danalyse nouvellement optimise. Aprs avoir tudi les effets matrice et vrifi la linarit de la mthode, les limites de dtection et de quantification de 70 pesticides (Tableau 12) ont t dtermines statistiquement partir dun plan doptimisation de type A dcrit dans la norme AFNOR NF XP T 90-210.260
II. Etude des effets matrice en LC-ESI/sSRM

Lors de ces essais, les gammes matrice nont pas t ralises partir du tmoin dilu, contrairement aux essais prcdents (cf Chapitre IV A) III.). Les surcharges ont en effet t effectues directement dans lhuile essentielle brute de manire se placer dans des conditions danalyse dchantillons rels. II.1 Protocole Pour prparer les points dtalonnage matrice, lhuile essentielle de lavandin a t surcharge avec une solution contenant 62 pesticides. Les volumes ont t fixs de manire limiter, dans la mesure du possible, la quantit de solvant introduit dans lhuile essentielle. Les solutions obtenues furent ensuite dilues au 1/10e avec du mthanol acidifi avec 1 % dacide actique. Les concentrations finales de ces huiles essentielles surcharges dilues taient comparables celles utilises pour la gamme solvant savoir : 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,
165
2, 2,5, 5, 7,5 et 10 g.L-1. 20 L de ces extraits furent ensuite injects en LC-ESI/sSRM avec les paramtres analytiques rsums en Annexe 10. II.2 Rsultats Le chromatogramme de la Figure 84 permet de juger de la bonne sparation chromatographique ainsi que de la rsolution satisfaisante admise par les 54 pesticides analyss en mode ESI+ au cours de cette exprience.
4 .0e 4 3 .5e 4
X of +M M (123 pairs): 163.0/88.0 am E IC R u xpected R 2.3 ID m T: : thom -1 from S yl am ple 41 (5 ppb 3) of P lan A iff (Turbo S .w pray) M ax. 1.0e4 cps.
3 .0e 4
2 .5e 4
2 .0e 4
1 .5e 4
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
1 .0e 4
2.31
5 0 00 .0
0 .0
1 0
1 2
1 4 T e, m im in
1 6
1 8
2 0
2 2
2 4
2 6
Figure 84.
Chromatogramme acquis en ESI+ et correspondant linjection de 20 L dun mlange de 54 pesticides une concentration de 5 g.L-1 (concentration finale) dans lhuile essentielle de lavandin.
Les effets matrice (EM) ont t mis en vidence en comparant les gammes solvant et matrice pour 62 pesticides. Ils sont exprims en % partir des coefficients directeurs tels que
EM (%) coefficent directeurmatrice 100 coefficent directeursolvant
(87)
et dtaills en Annexe 11 pour 54 pesticides en ESI+ et 8 en ESI-. Les effets matrice ont t considrs comme significatifs lorsque la dviation admise par la pente de la gamme matrice tait suprieure dau moins 5 % celle du solvant. Les gammes solvant et matrice dmontrent une bonne linarit avec des coefficients de dtermination suprieurs 0,99. La Figure 85 prsente les droites talons solvant et matrice obtenues pour trois pesticides : prometryn, amidosulfuron et chlorpyrifos.
Prometryn
250000 6000
Amidosulfuron
10000
Chlorpyrifos
9000
Solvant
200000
Matrice
y = 29223x + 536.92 R = 0.9994
5000 4000
Solvant Matrice
y = 552.94x + 15.446 R = 0.999 y = 537.51x + 30.55 R = 0.9991
Solvant
8000
7000
y = 901.01x + 312.62 R = 0.9971
Matrice
Aire du pic
Aire du pic
Aire du pic
150000
6000
5000 4000 3000 2000
3000 2000 1000
100000
y = 23174x + 264.04 R = 1
y = 709.15x + 159.04 R = 0.9985
50000
1000
0
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 2 4 6 8 10 12
0 0 2 4 6 8 10 12
concentration en g.L -1
concentration en g.L-1
Figure 85.
Comparaison des droites talons solvant (bleue) et matrice (rouge) illustrant des effets matrice a) ngatif pour la prometryn b) positif pour le chlorpyrifos c) nul pour lamidosulfuron
166
Le chlorpyrifos et la prometryn ont t choisis pour illustrer respectivement un effet matrice positif (augmentation du signal) et ngatif (suppression du signal). Le comportement de lamidosulfuron indique labsence deffet matrice. Le Tableau 23 prsente une synthse des effets matrice en fonction de leur valeur et du mode dionisation (ESI+ et ESI-).
ESI+ Effet Matrice < -20 % -20 % -10 % -10 % -5 % -5 % 0 % 0%5% 5 % 10 % 10 % 20 % Nombre de s.a. 2 2 1 9 10 5 18 7 54 Effet Matrice < -20 % -20 % -10 % -10 % -5 % -5 % 0 % 0%5% 5 % 10 % 10 % 20 % >20 % ESINombre de s.a. 0 0 0 1 1 0 1 5 8 Effet Matrice < -20 % -20 % -10 % -10 % -5 % -5 % 0 % 0%5% 5 % 10 % 10 % 20 % >20 % ESI+ et ESINombre de s.a. 2 2 1 10 11 5 19 12 62
Effet matrice ngatif 14 Effet matrice positif 40
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
>20 %
Tableau 23.
Evaluation de leffet matrice en fonction du mode dionisation ESI+ ( gauche), ESI- (au milieu), ESI+ et ESI( droite) (s.a. : substances actives)
Sur les 62 pesticides tudis, 47 sont sujets une augmentation de lintensit de leur signal et 18 une diminution. Pour la majorit (48) de faibles effets matrice, gaux ou infrieurs 20 %, sont observs dont environ la moiti sont infrieurs 10 %. Cependant, de forts effets matrice, suprieurs 20 %, sont constats pour 14 pesticides, les plus importants tant observs en ESI- pour le 2,4D, le mcoprop et le MCPA, qui admettent une augmentation de leur signal suprieure 50 %. En ESI+, les effets matrice les plus levs sont reports pour les composs lus aprs 18 minutes (abamectine, bifenthrine, prometryn, oxyfluorfen, difenoconazol, cyhalothrine- , cycloxidim, chlorpyrifos). Lhuile essentielle de lavandin tant majoritairement constitue de composs apolaires, il est trs probable quils soient lus dans ces temps et interfrent avec la dtection des pesticides.
Cette tude a donc dmontr des effets matrice significatifs empchant une quantification avec une gamme solvant. Cest pourquoi la dtermination des LODs et LOQs a t ralise partir de gammes matrice.
167
III. Dtermination statistique des LODs et LOQs

Bas sur un plan doptimisation de type A,260 les performances de la mthode danalyse ont t values laide de tests statistiques pertinents qui permettent de valider le modle de rgression, vrifier la linarit du domaine dtalonnage pour, finalement, dduire les limites de dtection et de quantification. Afin dvaluer la totalit du processus analytique, cinq gammes matrice comportant douze concentrations ont t prpares. A partir dune solution dhuile essentielle de lavandin surcharge avec lensemble des 70 pesticides une concentration de 200 g.L-1, douze points de calibrations (cinq rptas) allant de 1 150 g.L-1 ont t prpars indpendamment. Les solutions ont ensuite t dilues au 1/10 e dans du MeOH 1 % pour obtenir des concentrations entre 0,1 et 15 g.L-1. Les extraits ont t injects deux fois pour autoriser lanalyse de 61 pesticides en ESI+ dans un premier temps, et tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 9 en ESI- dans un second. III.1 Description de la mthode partir de lanalyse de lactamipride Le Schma 14 expose le droulement des tests statistiques qui aboutissent la dtermination des limites de dtection et de quantification de chacune des substances actives dans lhuile essentielle de lavandin.
Refus Test de Shapiro-Wilk
(Etude de la normalit) Test de Dixon
Elimination des points aberrants
Accept
Refus
Test de Cochran
(Homognit des variances)
Suppression du point de concentration la plus haute
Accept
Etude de linarit (Validation du modle de rgression Linarit du domaine dtalonnage)
Refus
Suppression du point de concentration la plus haute
Limites de Dtection Limites de Quantification
Schma 14.
Droulement des tests statistiques conduisant la dtermination des LODs et LOQs
168
Dans un souci de simplifier la comprhension, un exemple dapplication de ces tests la molcule dactamipride va servir de support leur explication. Une description des sigles et symboles employs est disponible en Annexe 12. Dans un premier temps, le test de Shapiro-Wilk261 permet de tester, au seuil de risque
1 %, la normalit de la distribution des cinq aires des pics chromatographiques relatives chaque concentration.
Xi 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 5 5 5 5 5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 10 10 10 10 10 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 15 15 15 15 15 Yi 6980 9030 9150 9260 9310 11100 11300 11500 11700 12200 22200 23200 23200 24400 24700 26800 27500 27800 28000 29500 54300 55500 55700 56000 56400 79500 80000 80300 80600 84400 103000 104000 104000 106000 107000 127000 129000 129000 130000 134000 152000 154000 155000 157000 158000 Z di 2330 230 ai 0,6646 0,2413 aidi 1548,52 55,50 b W W0,01 Conclusion
3944920
1604,02
0,65
0,686
L'hypothse de normalit est rejete
1100 712000 400
0,6646 0,2413
731,06 96,52 827,58 0,96 0,686 L'hypothse de normalit est retenue
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
2500 4112000 1200
0,6646 0,2413
2700 3948000 500
0,6646 0,2413
2100 2508000 500
0,6646 0,2413
4900 15452000 600
0,6646 0,2413
4000 10800000 2000
0,6646 0,2413
7000 26800000 1000
0,6646 0,2413
6000 22800000 3000
0,6646 0,2413
Tableau 24.
Rsultats du test de Shapiro-Wilk appliqu la molcule dactamipride
Lhypothse de la normalit de la distribution est admise pour toutes les concentrations, celle de 0,75 g.L-1 excepte. Cependant, laire de 6980 semble tre un point aberrant.
169
Dans un deuxime temps, le test de Dixon262 a t utilis. Il permet de dterminer si une valeur, au sein dune population, est aberrante ou non. Les rsultats de ce test, pour la concentration de 0,75 g.L-1, sont regroups dans le Tableau 25.
Xi 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 Yi 6980 9030 9150 9260 9310 r r0,01 Conclusion
0,9798
0,7800
La valeur est limine
Tableau 25.
Test de Dixon appliqu sur le point de gamme 0,75 g.L-1 de lactamipride
Daprs le test de Dixon, la valeur 6980 nest pas reprsentative de la population donne et peut tre limine. La normalit de la distribution doit donc tre vrifie nouveau sans cette valeur, comme le montre les rsultats du test de Shapiro-Wilk (Tableau 26).
Nouveau test Shapiro 0,75 0,75 9030 9150 9260 9310 46475 110 0,2413 26,54 Z di 280 ai 0,6646 aidi 186,09 212,63 0,9728 0,6860 L'hypothse de normalit est retenue b W W0,01 Conclusion
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
0,75 0,75
Tableau 26.
Test de Shapiro-Wilk de nouveau appliqu au niveau 0,75 g.L-1 sans la valeur aberrante du Tableau 25
La distribution tant dsormais qualifie de normale, le plan A peut se poursuivre avec la vrification de lhomognit des variances, ralise travers le test de Cochran263 dont les rsultats sont reports dans le Tableau 27.
Xi 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 Variances Somme S2i Max (S2i) Cobs Ccrit Conclusion Yi 6980 9030 9150 9260 9310 Xi 1 1 1 1 1 Yi 11100 11300 11500 11700 12200 Xi 2 2 2 2 2 Yi 22200 23200 23200 24400 24700 Xi 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Yi 26800 27500 27800 28000 29500 Xi 5 5 5 5 5 Yi 54300 55500 55700 56000 56400 Xi 7,5 7,5 7,5 7,5 7.5 Yi 79500 80000 80300 80600 84400 Xi 10 10 10 10 10 Yi 103000 104000 104000 106000 107000 Xi 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 Yi 127000 129000 129000 130000 134000 Xi 15 15 15 15 15 Yi 152000 154000 155000 157000 158000
1182433,333
923620
25028000
1803000
134320000 779248942,2 258055111,1 0,331158757 0,564
112503000
258055111,1
239733777,8
5700000
Lhypothse dhomognit des variances est accepte
Tableau 27.
Test de Cochran applique la molcule dactamipride
Le test de Cochran conclut une variance homogne, c'est--dire que la variance entre les diffrentes concentrations nest pas significative, ltude peut donc se poursuivre par ltude de linarit. Cette dernire permet dtablir une fonction linaire de calibration de type y
b0
b1u o
u et y sont respectivement la concentration et la rponse (aire du pic) de lanalyte, b0 est lordonne lorigine, correspondant la rponse du blanc et b1 est la pente, correspondant la sensibilit. Les rsultats de cette tude sont visibles dans le Tableau 28.
170
u 0,75 0,75 0,75 0,75 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 7,50 7,50 7,50 7,50 7,50 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 12,50 12,50 12,50 12,50 12,50 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00
y 9030 9150 9260 9310 11100 11300 11500 11700 12200 22200 23200 23200 24400 24700 26800 27500 27800 28000 29500 54300 55500 55700 56000 56400 79500 80000 80300 80600 84400 103000 104000 104000 106000 107000 127000 129000 129000 130000 134000 152000 154000 155000 157000 158000
y(ui) 10314 10314 10314 10314 12869 12869 12869 12869 12869 23090 23090 23090 23090 23090 28201 28201 28201 28201 28201 53754 53754 53754 53754 53754 79307 79307 79307 79307 79307 104860 104860 104860 104860 104860 130413 130413 130413 130413 130413 155966 155966 155966 155966 155966
(yi-y(ui)) 1648056 1354352 1110423 1007547 3129586 2461960 1874335 1366709 447646 792550 12045 12045 1715438 2591287 1962372 491187 160678 40340 1687798 298313 3049146 3787618 5045326 7002271 37329 480537 986462 1672386 25940766 3458725 739195 739195 1300136 4580607 11646776 1995827 1995827 170352 12868453 15726855 3864016 932596 1069756 4138336
SCEi(y) 46475
712000
4112000
Etalonnage Moyenne gnrale Moyenne gnrale Somme totale des carrs des talons Sensibilit (pente) Blanc (ordonne l'origine) Nombre de mesure par niveau Nombre de niveau Nombre totale de mesure Variance rsiduelle Ecart type de la sensibilt Ecart type du blanc Intervalle de confiance de la sensibilit Intervalle de confiance du blanc
u 6,4 y 67808,0 SCE(u) 1082,81 b1 10221,189 b0 2647,874 n 4,888888889 p 9 np 44 s2(res) 3271265,71 s(b1) 54,96437332 s(b0) 443,9883133 lim inf 10072,9 lim sup 10369,5 lim inf 1450,0 lim sup 3845,8 Fcalcul 45417 2,88 Fcritique 7,42 3,20
3948000
2508000
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Test de linarit SCE ddl variance regression 113124351156 1 113124351156 erreur de modele 50214685 7 7173526 erreur experimentale 87178475 35 2490814 Totale 113261744316 43 Le modle de rgression est acceptable Le domaine d'talonnage choisi est valid Limite de dtection/quantification Limite de dtection (g.L-1) 0.13 Limite de quantification (g.L-1) 0.43
Droite talon de l'Actamipride
180000 160000 140000 120000
Aire du pic
100000
15452000
10800000
y = 10221x + 2647. R = 0.998
26800000
80000 60000 40000
22800000
20000
0 0.00
2.00
4.00
6.00
8.00 Concentration en ppb
10.00
12.00
14.00
16.00
Tableau 28.
Etude de linarit applique la molcule dactamipride
Aprs avoir valid le domaine dtalonnage et vrifi ladquation de la distribution avec le modle de rgression linaire, en sassurant que lerreur relative au modle est infrieure lerreur exprimentale travers un test de Fisher, les LODs et LOQs peuvent tre dtermines. Elles sont calcules partir de lcart type relatif au blanc s(b0) telles que :
LOD 3s (b0 ) b1
(88) ;
LOQ
10 s (b0 ) b1
(89)
En appliquant cette mthodologie, lactamipride admet une LOD = 0,13 g.L-1 et une LOQ = 0,43 g.L-1 pour un domaine de linarit compris entre 0,75 et 15 g.L-1. Elles
171
correspondent des concentrations de 1,3 g.L-1 et 4,3 g.L-1 dans lhuile essentielle si lon tient compte du facteur de dilution. III.2 Rsultats Les rsultats du plan doptimisation de type A sont exposs dans le Tableau 29. Pour calculer les LODs et LOQs laide des quations (88) et (89), les courbes de calibrations ont t construites en considrant au moins cinq concentrations avec cinq rplicats pour chacune. De plus, elles doivent conduire un coefficient de dtermination suprieur ou gal 0,99. A noter que lanalyse du tmoin dhuile essentielle de lavandin na pas rvl la moindre trace de rsidus de pesticides. En outre, les molcules damidosulfuron, sulfosulfuron, 2,4D et MCPA ne furent pas incluses dans le plan A, les rsultats ne concernent donc que 66 des 70 pesticides. En revanche, leur LOD et LOQ ont t estimes exprimentalement partir des tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 chromatogrammes obtenus lors de ltude sur les effets matrice et dfinies comme tant la concentration minimum danalyte donnant des rapports S/N de 3 et 10 respectivement. Lensemble des rsultats sont rgroups dans le Tableau 29.
Pesticide 2,4Da Abamectine Acephate Acetamipride Acibenzolar - S- methyl Aclonifen Acrinathrine Amidosulfurona Azoxystrobine Benalaxyl** Bentazone Bifenthrine Bromacil Buprofezine Butraline Carbaryl Carbendazime Carbetamide Carbofuran Chlorfenvinphos Chloridazone Chlorpyrifos Clopyralide Cycloxydime CyhalothrineCyromazine Deltamethrine Dicamba Difenoconazole Diflufenicanil Dimethenamide Dimethoate Diuron Ethion Ethofumesate Ethoprophos Fluazifop-p-butyl Flurochloridone Fluroxypyr tR (min) 6,4 20,6 1,9 3,3 13,3 16,5 20,2 5,5 11,1 16,7 2,8 21,4 7,6 19,1 20,1 8,5 4,6 6,0 7,5 16,7 3,5 19,7 1,8 17,9 19,9 1,8 20,3 2,8 18,0 18,3 12,0 3,4 10,4 19,3 11,4 14,7 18,7 12,9 3,1 b0 181,1 486,0 1438,8 237,2 283,8 205,9 809,3 4830,5 11085,6 185,3 -63,7 6266,3 -61,1 129,0 -362,9 944,2 -1373,9 829,9 204,2 364,5 344,1 295,7 456,7 57,0 214,8 400,0 531,0 162,3 263,4 540,9 857,5 370,1 415,6 675,7 780,8 281,6 129,9 s(b0) 69,7 421,3 358,3 24,3 86,9 72,3 485,1 791,1 1992,3 30,7 125,2 446,1 225,6 104,8 165,8 81,3 683,9 193,9 79,0 104,5 45,0 95,4 186,9 188,9 104,1 1149,3 215,0 146,5 71,2 92,8 113,3 242,9 159,2 174,7 509,0 59,7 43,7 b1 3461,9 11685,4 10675,5 364,9 631,4 497,0 51247,0 44831,6 230764,9 1695,6 1179,1 36815,3 9375,8 7152,2 6983,4 6412,2 37865,7 12626,6 1750,8 1079,3 157,3 10973,4 471,7 4563,6 1080,4 3677,6 19564,0 4441,9 8490,5 11874,1 3150,0 17455,1 3991,8 5194,8 38448,5 1052,8 477,2 R2 0,9947 0,9970 0,9981 0,9926 0,9911 0,9917 0,9984 0,9994 0,9980 0,9957 0,9941 0,9989 0,9925 0,9983 0,9995 0,9905 0,9975 0,9957 0,9953 0,9923 0,9840 0,9955 0,957 0,9920 0,9951 0,980 0,9991 0,9975 0,9958 0,9964 0,9970 0,9965 0,9973 0,9974 0,9968 0,9964 0,9945 Domaine de linarit (g.L-1) 0,25-2,5 0,5-7,5 0,75-7,5 0,75-7,5 1-12,5 2-12,5 0,1-2,5 0,25-10 0,1-2 0,25-2,5 1-15 0,1-5 0,25-2,5 0,1-5 0,5-7,5 0,1-1 0,1-5 0,1-2,5 0,5-7,5 0,75-12,5 5-15 0,1-1 2-15 0,5-5 1-15 5-15 0,1-5 0,1-10 0,1-1 0,1-1 0,5-7,5 0,1-2,5 0,75-7,5 0,5-7,5 0,1-2,5 0,75-10 1-12,5 LOD (g.L-1) 0,066 0,06 0,11 0,11 0,2 0,41 0,44 0,15 0,028 0,05 0,03 0,05 0,32 0,036 0,07 0,04 0,07 0,38 0,054 0,046 0,14 0,29 0,026 0,12 0,29 0,033 0,1 0,025 0,023 0,11 0,04 0,12 0,1 0,04 0,17 0,27 LOQ (g.L-1) 0,2 0,2 0,36 0,34 0,67 1,38 1,45 0,5 0,09 0,18 0,09 0,18 1,06 0,12 0,24 0,15 0,24 0,13 0,18 0,15 0,45 0,97 0,09 0,41 0,96 0,11 0,33 0,08 0,08 0,36 0,14 0,4 0,34 0,13 0,57 0,92 RSD (%) Maximum 9 5 4,3 11 17 15 10 4,8 8,5 4,8 14 7,7 11,6 10 7,6 6,5 9,6 12,9 15 7,4 11,7 11 11,6 4,9 9,1 11,8 10,6 7,5 4,5 7,6 10,6 7,3 7,4 9,2
172
Pesticide Haloxyfop Iprodione Isoproturon Isoxaben Lenacile Linuron MCPAa Mecoprop Mefenoxam Metamitrone Metazachlore Methomyl Monocrotophos Napropamide Norflurazon Oryzaline Oxadiazon Oxyfluorfene Pendimethaline Pirimicarbe Prometryne Propiconazole Propyzamide Prosulfocarbe Pymetrozine Quizalofop-p-ethyl Simazine Sulfosulfurona Tau-fluvalinate Tebuconazole Triclopyr a Non inclus dans le plan A.
tR (min) 12,2 15,1 10,0 11,9 10,1 11,8 7,1 9,3 9,9 3,7 9,9 2,3 2,3 14,8 10,3 14,0 19,2 18,7 19,9 9,5 14,6 16,9 12,6 18,6 2,1 18,9 8,1 8,8 20,5 16,3 8,1
b0 615,2 45,5 475,6 4865,5 -1758,5 132,0 3025,6 458,7 -11,8 540,8 357,7 430,3 705,1 319,5 932,0 429,0 173,6 510,4 464,5 591,6 144,8 6,3 1277,5 384,5 833,7 123,9 533,7 -225,1 118,3
s(b0) 101,4 132,8 173,8 925,6 485,8 69,6 624,1 255,2 67,6 216,5 184,0 131,6 202,2 122,2 266,6 149,9 53,7 228,7 232,0 399,3 78,1 68,5 410,0 241,5 232,9 76,3 85,2 189,3 15,4
b1 5862,8 722,0 21423,2 34526,5 6752,1 1392,3 24773,8 25959,2 963,6 31905,3 18695,1 18801,1 18094,9 13156,2 16173,3 7945,7 282,7 5022,7 48805,8 34021,0 2316,4 1918,2 16393,0 9547,6 22463,5 4180,6 2788,0 6866,3 286,1
R2 0,9991 0,9907 0,9961 0,9992 0,9967 0,9963 0,9980 0,9943 0,9945 0,9973 0,9970 0,9970 0,9966 0,9977 0,9951 0,9936 0,9901 0,9913 0,9987 0,9977 0,9952 0,9981 0,9919 0,9970 0,9971 0,9980 0,9978 0,9993 0,9951
Domaine de linarit (g.L-1) 0,25-7,5 2,5-15 0,1-1 0,5-12,5 0,75-15 0,5-10 0,25-7,5 0,1-1 0,75-10 0,1-1 0,1-2 0,1-1 0,1-2 0,1-2 0,1-2,5 0,1-2,5 2-15 0,5-5 0,1-1 0,1-2,5 0,5-5 0,5-10 0,25-2,5 0,5-5 0,1-2 0,25-5 0,5-7,5 0,25-15 0,75-7,5
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
LOD (g.L-1) 0,05 0,6 0,024 0,08 0,22 0,15 0,08 0,08 0,029 0,21 0,02 0,03 0,02 0,03 0,03 0,05 0,06 0,6 0,14 0,014 0,04 0,1 0,11 0,08 0,08 0,03 0,05 0,15 0,09 0,08 0,16
LOQ (g.L-1) 0,17 1,84 0,81 0,27 0,72 0,5 0,25 0,25 0,1 0,7 0,07 0,1 0,07 0,11 0,09 0,16 0,19 1,9 0,46 0,05 0,12 0,34 0,36 0,25 0,25 0,1 0,18 0,5 0,31 0,28 0,54
RSD (%) Maximum 4,7 9 9,6 8,9 6 9,4 5,3 8,5 14,2 7,3 10,9 14,7 9,4 14,2 7,4 12 15 8,8 10,8 8,3 13,2 9,4 8,4 4,9 11,4 8,7 6 4,7 7,3
Tableau 29.
Rsultats du plan dexprience de type A
Compte tenu des rsultats du Tableau 29, la mthode danalyse a dmontr suffisament de sensibilit pour tre applique lanalyse quantitative de pesticides dans lhuile essentielle de lavandin. Les domaines de linarit, LODs et LOQs exposs dans le Tableau 29 se rfrent la transition de quantification et aux concentrations finales dinjection. En considrant le facteur de dilution au 1/10e, 9 des 70 pesticides admettent une LOQ infrieure ou gale 1 g.L-1. De plus, 44 substances actives montrent une LOQ comprise entre 1 et 5 g.L-1, 9 entre 5 et 10 g.L-1 et 5 entre 10 et 20 g.L-1. Trois pesticides nont pas pu tre valids cause dun problme de linarit (R < 0,99) : la clopyralide, le dicamba et la cyhalothrine- . La rptabilit de la mthode, exprime par le coefficient de variation ou RSD (Relative Standard Deviation), a t calcule sur la base des cinq rplicats effectus pour chaque concentration. Le Tableau 29 rapporte que le RSD maximum observ sur le domaine de linarit de chaque pesticide est acceptable, puisque tous les RSDs sont infrieurs 17 % (aclonifen). De plus, une linarit satisfaisante a t observe pour tous les pesticides, au moins sur le domaine dtalonnage dfini. Par consquent, si une quantification prcise des pesticides est requise, la mthode des ajouts doss devrait tre applicable. En complment de cette validation, la mthode a t applique lanalyse de cinq chantillons rels.
173
IV. Analyse dchantillons rels dhuile essentielle de lavandin

Trois chantillons de lavandins dorigines diffrentes fournis par lOral (lot A, B et C), ainsi quun chantillon de lavandin bio et un chantillon de lavande AOC achets dans le commerce, ont t analyss avec la mthode analytique prcdemment valide. La quantification a t ralis au moyen de points de gamme matrice prpars dans lhuile essentielle de lavandin bio mais galement avec la mthode des ajouts doss.
De manire quantifier les teneurs en pesticides prsents dans les chantillons, trois points de calibration matrice aux concentrations de 1, 10 et 100 g.L-1 ont t prpars partir de lchantillon dhuile essentielle de lavandin bio ayant servi lors de la validation. HE Lavandin bio surcharg 100 g.L-1 : 970 L dhuile essentielle de lavandin tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 bio + 10 L de 3 mlanges 10 mg.L-1 contenant les 70 substances actives. HE Lavandin bio surcharg 10 g.L-1 : 450 L dhuile essentielle de lavandin bio + 50 L dhuile essentielle de lavandin bio surcharg 100 g.L-1. HE Lavandin surcharg 1 g.L-1 : 450 L dhuile essentielle de lavandin bio + 50 L dhuile essentielle de lavandin bio surcharg 10 g.L-1. Les ajouts doss ont t prpars en surchargeant les chantillons avec 10 L dun mlange de pesticides 1 mg.L-1 dans 990 L dchantillon de manire obtenir une surcharge en pesticides gale 10 g.L-1. Les chantillons, ainsi que les huiles essentielles surcharges (points de gamme et ajouts doss), ont t dilus au 1/10e en mlangeant 100 L dhuile essentielle avec 900 L de mthanol acidifi avec 1 % dacide actique. Sur les cinq huiles essentielles, deux chantillons se sont rvls positifs. Le premier est le lot C pour lequel le chlorpyrifos-thyl (Tableau 29 : LOQHE = 9,7 g.L-1) a pu tre dtect et quantifi, comme le montre le Tableau 30.
Sample Name: "T-" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 3:13:01 PM
Modified: Yes
Tmoin
19.85
85 80
19.54
Sample Name: "1 ppb" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 4:08:58 PM
Point matrice 10 g.L-1

300 290 280 270 260 250 240 230 220 210
19.57
Sample Name: "aguzon" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 11 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 7:25:20 PM
Lot C
19.58
250 240 230 220 210 200 190 180
Sample Name: "aguzon + 10 ppb" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 12 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 7:53:24 PM
Ajout dos Lot C

19.62
420 400 380 360 340 320 300
75 70 65 60 55
20.06
200 190
170 160
280
50
19.38
170 160 150 140 130

19.78
140 130 120 110
19.86
180
150
260 240 220 200 180
45
19.21 19.33
40 35 30 25 20 15 10 5 0
120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

19.36 19.98 19.91
100 90
20.13
160
19.92
80 70
19.21
140 120
19.84
60 50 40
19.97
100
20.02
80 60
19.33
30 20 10
40 20
17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 Time, m in 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0 21.2 21.4
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6 19.8 Time, m in
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6 Tim m e, in
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
0 17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6 19.8 Tim m e, in
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
Aire = 1670 S/N = 14 Tableau 30.
Aire = 2080 S/N = 18
Aire = 3920 S/N = 37
Chromatogrammes du chlorpyrofos-thyl dans le tmoin et lchantillon lot C
174
Les concentrations en chlorpyrifos-thyl, calcules partir du point de gamme matrice 10 g.L-1 ou de lajout dos 10 g.L-1, sont trs proches, respectivement gales 12,4 g.L-1 et 11,3 g.L-1. Dans lhuile essentielle de lavande AOC, cest la substance active diflufenican (Tableau 29 : LOQHE = 3,3 g.L-1) qui a t dtecte et quantifie (Tableau 31).
Sample Name: "T-" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "diflufnicanil -1" Mass(es): "395.1/265.8 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 3:13:01 PM
Modified: Yes
Tmoin
18.24
44 42
18.04
Sample Name: "1 ppb" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "diflufnicanil -1" Mass(es): "395.1/265.8 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 4:08:58 PM
Point matrice 10 g/L

18.13
1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950 900
Sample Name: "lavande aoc" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "diflufnicanil -1" Mass(es): "395.1/265.8 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 15 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 9:17:34 PM
Lavande AOC
18.13
1550 1500 1450 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000
Sample Name: "lavande aoc + 10 ppb" Sample ID: "" File: "echantillons.wiff" Peak Name: "diflufnicanil -1" Mass(es): "395.1/265.8 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 16 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/28/2009 Acq. Time: 9:45:39 PM
Ajout dos Lavande AOC

18.14
2200 2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400
40 38 36 34 32 30
17.77 18.68
850
28
26
17.71 18.36
750 700 650 600 550
900 850 800 750 700 650 600 550 500 450
18.67
800
950
1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 Time, m in 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0
24 22 20 18
17.91 17.95 18.51 18.56
500 450
16 14 12 10 8 6
150 400 350 300 250 200
18.58
400 350 300 250 200 150 100 50

16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 Tim m e, in 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0
4 2 0 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 17.6 17.7 17.8 17.9 18.0 18.1 18.2 18.3 Tim m e, in 18.4 18.5 18.6 18.7 18.8 18.9 19.0 19.1 19.2 19.3 19.4 19.5
100 50 0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
18.0 18.2 Time, m in
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
20.0
Aire = 9810 S/N = 270 Tableau 31.
Aire = 13300 S/N = 220
Aire = 21600 S/N = 285
Chromatogrammes du diflufenican dans le tmoin et lchantillon lot C
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
De mme que pour le chlorpyrifos-thyl, la concentration en diflufenican selon quelle soit calcule par rapport au point de gamme matrice ou lajout dos est sensiblement la mme, respectivement gale 13,5 g.L-1 et 16,0 g.L-1.
V. Conclusion
Ltude des conditions chromatographiques dans le cas dune injection dans un solvant organique pur a permis dtablir les conditions danalyse optimales. Ainsi, il a pu tre mis en vidence que lacidification des phases mobiles avec 0,1 % dacide actique conduisait aux meilleurs rsultats. Concernant linjection, un volume de 20 L de mthanol acidifi avec 1 % dacide actique semble tre le compromis le plus adapt. Aprs avoir mis en vidence la manifestation deffets matrice, les limites de dtection et de quantification de 67 des 70 substances actives ont pu tre valides statistiquement dans lhuile essentielle de lavandin grce lapplication dun plan dexprience de type A. Sur ces 67 pesticides, 62 admettent une limite de quantification infrieure 10 g.L-1 et 5 entre 10 et 20 g.L-1. La mthode analytique a ensuite t applique quatre chantillons rels dhuile essentielle de lavandin et un chantillon de lavande AOC. Lanalyse de ces chantillons a rvl la prsence de deux substances actives des teneurs suprieures leur limite de quantification : le chlorpyrifos-thyl a t dtect une
175
concentration de 11,3 g.L-1 dans lchantillon lot C et le diflufenican une concentration de 16 g.L-1 dans lchantillon de lavande AOC. Il est particulirement intressant de noter que le diflufenican est une substance active rfrence par lACTA comme tant applique sur les cultures de lavande et lavandin. Cette tude a permis de dmontrer la faisabilit de la mise en place dune mthode danalyse multi-rsidus dans les huiles essentielles consistant en une dilution au 1/10e suivie dune injection directe en LC-MS/MS.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
176
C)
Analyse dhuiles essentielles peu solubles dans le mthanol : le cas de lhuile essentielle de citron
Certaines varits dhuiles essentielles, telles que celles provenant des hesprids, posent un problme de solubilit dans le mthanol du fait de la prsence de fractions lourdes comme les cires. En effet, la dilution de lhuile essentielle de citron, par exemple, provoque la formation de microbulles en suspensions. Cest pourquoi plusieurs mthodes de purification ont t testes sur cette huile essentielle en vue dliminer les cires et dobtenir un extrait bien homogne. La non-solubilit de lhuile essentielle de citron dans le mthanol pourrait avoir plusieurs consquences sur les rsultats. En plus des ventuels problmes de rptabilit lors des injections dus lhtrognit de la solution, se pose la question de savoir si une partie tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 des pesticides ne sadsorbent pas sur les cires, ce qui pourrait occasionner un biais dans le dosage. Lajout dune tape de purification visant liminer les cires a donc t mise en place travers le test de quatre protocoles. Une fois la prparation dchantillon dtermine, la mthode a t applique aux dosages de fractions dhuiles essentielles de citron et dune huile essentielle dorange dans le cadre dun essai interlaboratoire.
I.
Mise en place dune mthode de purification adapte

Le procd envisag pour retirer les cires de lhuile essentielle de citron est dabaisser la
temprature de la solution afin de faire prcipiter les cires. Deux types de conglations ont t tests : la conglation dans lazote liquide et la conglation classique environ -18C. Paralllement ces deux mthodes, une simple centrifugation et une injection aprs dilution ont galement t exprimentes pour valuer lutilit de la conglation. Les expriences ont t conduites sur 32 substances actives. I.1 Protocole
En vue de comparer les quatre mthodes de prparation dcrites dans la Figure 86, le protocole suivant a t tabli. Lhuile essentielle de citron a t surcharge 100 g.L-1 en mlangeant 2,450 mL dhuile essentielle de citron avec 25 L de deux mlanges contenant lensemble des substances actives 10 mg.L-1.
177
Huile essentielle de citron
Dilution 1/10e dans MeOH 1%
Azote liquide (4 minutes)
Conglation -18 C (1 nuit)
Centrifugation (5 minutes froid)
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Injection LC-MS/MS
Figure 86.
Protocole des essais de purification sur lhuile essentielle de citron
Cinq taux de rcupration et un tmoin ont t raliss pour chacune des mthodes. Le tmoin a permis de prparer des points de gamme matrice et ainsi calculer le taux de rcupration des pesticides. Trois points de gamme 10 g.L-1 (90 L de tmoin + 10 L tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dun point solvant 100 g.L-1) ont t systmatiquement effectus afin dvaluer linfluence de la prparation du tmoin sur la rptabilit. Il est important de remarquer que la quantit de cires prcipite est visuellement plus importante dans le cas de lazote liquide dun facteur de lordre de 1,5 3 par rapport la conglation et la centrifugation. I.2 Rsultats et discussion
Les quatre mthodes de prparation ont t compares au moyen de ltude de la rptabilit des points de gamme, des taux de rcupration, et de limportance des effets matrice. La rptabilit des points de gamme a t value partir des coefficients de variation des aires des pesticides, obtenues pour les trois points de gamme des quatre mthodes de prparation (Tableau 32). Pour chaque pesticide, le meilleur CV obtenu parmi les quatre procds est surlign en bleu.
Abamectine Acephate Acibenzolar-S-mthyl Aclonifen Acrinathrine Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Buprofzine Butraline Carbtamide Chloridazone Chlorpyrifos Cycloxydime Cyhalothrine-( ) CVazote 1,9 1,1 2,8 5,4 6,6 0,6 1,2 4,3 1,1 4,4 0,2 0,3 5,3 3,3 3,3 CVconglation 8,3 9,1 4,9 13,4 6,4 4,3 5,6 6,9 5,4 4,8 5,8 4,3 12,1 8,8 4,0 CVcentrifugation 4,1 5,3 3,1 13,2 2,1 3,4 1,6 1,7 3,0 2,1 2,0 3,2 3,4 0,8 14,1 CVdilution 6,7 3,9 4,7 7,0 6,4 5,4 3,3 2,7 2,0 5,5 2,8 4,3 6,5 3,3 8,3
178
Dimethenamid Ethoprophos Fluazifop-p-butyl Iprodione Isoxaben Lnacile Linuron Mfnoxam Mtamitrone Monocrotophos Napropamide Norflurazon Prometryn Pymetrozin Simazine Tau-fluvalinate Tebuconazole Nombre de meilleur CV
CVazote 0,1 1,5 1,2 3,4 1,9 0,1 4,6 1,7 6,2 2,3 2,0 1,1 1,3 2,2 2,8 12,3 1,1 17
CVconglation 8,0 5,3 4,9 4,6 4,5 6,6 5,9 5,9 6,7 5,9 7,7 6,0 5,4 10,9 4,5 12,2 4,2 0
CVcentrifugation 3,9 1,4 0,6 9,6 6,1 2,0 4,6 1,5 7,6 2,8 1,1 1,7 2,7 1,8 0,9 12,3 3,7 10
CVdilution 0,7 1,5 2,5 6,4 1,0 4,4 2,2 1,7 2,0 2,3 1,4 4,4 3,0 3,6 0,6 6,0 3,4 5
Tableau 32.
Rptabilit des points de gamme exprime en CV (%) en fonction du procd de purification
Les points de gammes prpars avec le tmoin azote assurent pour la majorit des tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 substances actives une meilleure rptabilit qui peut tre attribue une homognit suprieure de la solution. Les taux de rcupration moyen (TRmoy) calculs pour les quatre procds partir des cinq rptats sont exposs dans le Tableau 33 avec leur CV correspondant.
azote 105,6 109,1 93,7 99,7 88,0 107,7 100,8 92,3 106,2 101,1 107,8 105,9 91,2 101,0 106,4 97,1 96,4 106,3 94,3 106,5 114,1 111,6 98,7 80,4 109,1 110,2 103,3 106,2 111,7 97,0 100,4 94,5 TRmoy (%) conglation centrifugation 102,8 111,1 100,4 100,5 96,9 96,9 79,9 108,9 99,7 96,0 106,2 114,2 94,5 98,6 92,8 101,6 102,1 110,7 107,8 112,6 106,3 107,7 104,7 111,1 92,1 103,8 102,6 108,7 99,4 95,6 94,6 98,4 90,3 97,3 102,3 106,4 97,1 105,7 105,8 112,1 104,4 115,7 101,5 108,8 93,5 98,3 100,7 74,9 107,7 111,0 100,5 108,0 99,6 107,1 103,6 108,6 104,6 108,5 94,2 99,3 95,9 107,7 96,1 99,6 dilution 113,5 105,7 93,3 83,5 98,4 109,3 96,6 95,8 107,7 107,5 105,8 107,4 96,4 101,2 87,2 96,5 92,9 105,4 92,9 110,1 107,7 107,2 97,8 71,6 107,6 103,4 106,3 106,4 110,2 95,2 92,7 95,0 azote 1,6 2,7 1,8 5,0 5,4 3,4 2,5 3,6 3,1 3,0 2,7 4,1 4,7 5,1 6,3 2,0 2,3 3,0 6,2 3,7 3,1 4,3 2,7 3,9 2,5 1,6 2,6 2,8 2,0 1,8 6,4 3,0 CV (%) conglation centrifugation 1,8 2,1 1,7 4,4 3,4 4,1 13,1 8,3 6,9 6,7 1,7 2,1 2,4 2,6 1,9 3,5 2,8 2,7 3,3 4,3 1,9 2,1 1,8 4,2 4,1 1,8 2,4 6,2 8,0 9,6 1,0 3,2 3,0 3,5 1,9 2,2 10,7 7,1 3,6 3,4 3,9 4,8 2,5 1,8 1,3 1,2 1,4 7,3 2,7 1,1 1,9 2,5 2,1 2,7 2,3 0,7 2,3 1,7 2,9 1,0 6,3 8,1 2,3 2,6 dilution 4,6 5,0 2,9 1,5 2,9 0,5 1,4 3,0 2,0 3,1 1,5 1,9 7,0 1,4 7,7 1,0 2,9 2,2 4,7 2,2 2,5 2,6 1,5 3,2 1,2 2,4 2,8 1,2 1,7 3,3 9,4 2,0
Abamectine Acephate Acibenzolar-S-mthyl Aclonifen Acrinathrine Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Buprofzine Butraline Carbtamide Chloridazone Chlorpyrifos Cycloxydime Cyhalothrine-( ) Dimethenamid Ethoprophos Fluazifop-p-butyl Iprodione Isoxaben Lnacile Linuron Mfnoxam Mtamitrone Monocrotophos Napropamide Norflurazon Prometryn Pymetrozin Simazine Tau-fluvalinate Tebuconazole
Tableau 33.
TRmoy et CV en % obtenus pour chaque pesticide en fonction du procd de purification
179
Les taux de rcupration et les coefficients de variation sont conformes au guide SANCO.252 Ils sont en effet inclus dans lintervalle 70-120 % pour les TRs et infrieurs 20 % pour les CVs et ce, pour toutes les mthodes. La trs grande majorit des TRs sont dailleurs compris entre 95 et 105 %. Seuls quatre composs possdent des rendements un peu plus faibles, qui dpendent du procd de purification. Il sagit de : laclonifen (conglation : 79,9 % ; dilution : 83,5 %) ; lacrinathrine (azote : 88 %) ; la cyhalothrine- (dilution : 87,2 %) ; la mtamitrone (azote : 80,4 % ; centrifugation : 74,9 % ; dilution : 71,6 %). Il faut bien mentionner que ces rsultats ne mettent pas en vidence la supriorit dune mthode par rapport une autre. Les quatre mthodes sont adaptes lanalyse des pesticides tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dans lhuile essentielle de citron. Au vue de ces rsultats, il semblerait donc que ladsorption des pesticides par les cires soit minime et ne concernerait que quelques substances. Toutefois, les TRsmoy et CVs obtenus pour ces molcules sont tout de mme satisfaisants et assurent dune bonne quantification. La mthode de purification a donc peu dinfluence sur la quantification. Nanmoins, pour des rsultats quivalents, il est prfrable de privilgier une purification car linjection de cires peut causer un encrassement du systme LC-MS/MS, de mme quavoir une influence sur les effets matrice. Dans le but dvaluer linfluence de la mthode de purification, les effets matrice observs suite une purification dans lazote liquide ont t compars ceux des autres mthodes. Les effets matrice ont t calculs pour chaque pesticide laide de la relation (90).
EM (%) [ Aire du po int de gamme matrice10 g .L 1 ] 100 [ Aire du po int de gamme solvant 10 g .L 1 ]
(90)
Pour chaque substance active leffet matrice le plus faible, entre les deux mthodes compares, a t surlign en bleu dans le Tableau 34. Seule une diffrence suprieure 5 % entre les effets matrice a t considre comme significative.
180
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Abamectine Acphate Acibenzolar-S-mthyl Aclonifen Acrinathrine Amidosulfuron Azoxystrobine Bifenthrine Buprofzine Butraline Carbtamide Chloridazone Chlorpyrifos Cycloxydime Cyhalothrine-( ) Dimethenamid Ethoprophos Fluazifop-p-butyl Iprodione Isoxaben Lnacile Linuron Mfnoxam Mtamitrone Monocrotophos Napropamide Norflurazon Promtryne Pymtrozine Simazine Tau-fluvalinate Tbuconazole Nbr dEM plus faibles
EM azote 26,9 7,3 21,4 -38,8 -9,0 16,6 11,3 31,2 -0,6 10,2 9,6 9,9 22,1 -8,0 7,9 7,1 -20,5 -3,9 -1,3 18,9 10,4 0,0 17,4 4,8 8,8 -15,7 -17,7 -17,6 10,9 13,3 -85,8 7,9 10
EM dilu 21,7 12,1 21,2 -33,2 -19,5 19,2 27,3 21,5 -0,6 4,1 18,3 11,8 15,4 -11,4 15,8 14,3 -16,5 -3,4 11,6 17,9 15,4 2,6 23,9 8,5 13,5 -10,8 -24,5 -14,4 15,4 15,9 -84,1 8,2 5
EM azote 26,9 7,3 21,4 -38,8 -9,0 16,6 11,3 31,2 -0,6 10,2 9,6 9,9 22,1 -8,0 7,9 7,1 -20,5 -3,9 -1,3 18,9 10,4 0,0 17,4 4,8 8,8 -15,7 -17,7 -17,6 10,9 13,3 -85,8 7,9 8
EM centri 26,5 19,4 17,8 -33,9 -12,9 15,6 23,4 29,7 -2,4 0,4 14,8 7,9 11,5 -13,3 14,9 12,8 -19,4 -3,2 0,0 18,2 11,0 3,4 22,6 6,9 11,3 -11,9 -21,6 -17,3 16,6 11,9 -85,9 6,7 2
EM azote 26,9 7,3 21,4 -38,8 -9,0 16,6 11,3 31,2 -0,6 10,2 9,6 9,9 22,1 -8,0 7,9 7,1 -20,5 -3,9 -1,3 18,9 10,4 0,0 17,4 4,8 8,8 -15,7 -17,7 -17,6 10,9 13,3 -85,8 7,9 9
EM cong 32,6 22,5 17,3 -33,9 -12,0 19,6 23,3 29,7 3,7 5,7 14,9 12,8 23,8 -7,3 13,2 13,3 -15,2 0,0 -0,2 19,8 15,8 8,3 25,0 8,7 12,5 -10,0 -16,8 -15,0 21,0 17,5 -84,9 7,9 2
Tableau 34.
Etude de linfluence de la mthode de purification sur les effets matrice (EM) en %
Globalement, les rsultats du Tableau 34 mettent en vidence des effets matrice moins levs dans le cas o lhuile essentielle de citron est purifie dans lazote liquide. A noter limportance de leffet matrice dans le cas du tau-fluvalinate qui admet une diminution de son signal denviron 85 % quelque soit la mthode. I.3 Conclusion
Compte tenu des rsultats obtenus, la mthode de prparation de lhuile essentielle de citron la plus approprie est la conglation des extraits dans lazote liquide. Cette tape de purification permet de faire prcipiter les cires de lhuile essentielle en quantit plus importante que les autres mthodes testes, notamment la conglation -18 C qui ncessite de surcrot, davantage de temps (une nuit). Le traitement lazote liquide semble avoir une influence sur les effets matrice qui sont dans lensemble moins prononcs et prvient surement de lencrassement de la colonne chromatographique et/ou du spectromtre de masse, point trs important dans le cadre danalyse de routine.
181
Les taux de rcupration sont trs satisfaisants puisque compris entre 90 et 115 % lexception de deux molcules. Lacrinathrine et la mtamitrone admettent en effet des TRs infrieurs 90 %, respectivement 88 % et 80 %. Ces TRs restent nanmoins trs corrects. Daprs les TRs admis par lensemble des pesticides, leur ventuelle adsorption sur les cires ne se rvle pas significative. La mthode de prparation pour lhuile essentielle de citron, qui sera probablement tendue toutes les huiles essentielles dhesprids, est rsume dans la Figure 87.
Huile essentielle de citron
Dilution 1/10e MeOH 1% AcAc

(100 L HE + 900 L MeOH 1% AcAc)
Prcipitation dans l azote liquide

(4 minutes)
Centrifugation froid -18 C

(5 minutes/4000 rpm)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Injection LC-MS/MS
(Vinj = 20 L)
Figure 87.
Synopsis de la mthode de prparation pour lanalyse de lhuile essentielle de citron
La centrifugation froid -18 C qui fait suite la conglation dans lazote liquide permet de garder compactes les cires au fond du vial et de faciliter le prlvement du surnageant. Cette mthode a ainsi pu tre teste sur deux types dchantillons rels : des fractions dhuiles essentielles de citron ayant subi diffrents traitements et sur une huile essentielle dorange provenant dun essai inter-laboratoire FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme).
II. Application lanalyse dchantillons rels

Quatre fractions dhuile essentielle de citron ont t analyses avec la mthode analytique prcdemment dcrite. Les fractions, naturellement contamines en pesticides, proviennent de diffrents traitements de lhuile essentielle de citron : HE 1 : huile essentielle de citron sans traitement ; HE 2 : fraction volatile correspondant au distillat de lhuile essentielle de citron obtenue lissue dune distillation. HE 3 : fraction correspondant au surnageant de lhuile essentielle de citron aprs une prcipitation par glaage ; HE 4 : fraction correspondant au surnageant de lhuile essentielle de citron aprs homognisation et repos.
182
Ces fractions ont fait lobjet de deux sries danalyse, la premire pour dtecter et estimer la concentration des pesticides, la seconde pour valuer linfluence dune agitation avant le prlvement sur la rptabilit du dosage. Lors de ces analyses, le screening de pesticides tait constitu denviron 200 substances actives (Annexe 13). II.1.1. Analyse par LC-ESI/sSRM Paralllement lanalyse des fractions, quatre points de gamme extraits ont t prpars partir de lhuile essentielle de citron bio. Une douzaine de pesticides ont t dtects dans les fractions (0). Les concentrations en g.L-1 ont t calcules partir du point de gamme le plus proche de la concentration estime 0,1, 0,5, 1, 5 g.L-1.
Pesticides
Azimphos mthyl Buprofzine Carbaryl Chlorpyrifos Fnazaquin Fenthion sulfoxide Hexythiazox Malathion Mthidathion Phosmet Tbuconazol Endosulfan sulfate
HE 1 (normale)
4 12,5 2,7 34 16,8 6,7 5,1 5,5 76 1,52 4,9 1,06
HE 2 (distillation fraction volatile)

< LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD
HE 3 (glac+prcipitation)
4,42 13,8 3,16 35 15,4 6,9 4 7,3 70 1,78 4,1 1,14
HE 4 (Homognisation Repos + surnageant)

4,60 10,5 3,2 31,2 12,3 6,6 4,9 7,2 73 1,6 4,1 1,14
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 35.
Concentrations en g.L-1 des pesticides dtects dans les fractions dhuiles essentielles de citron
Les substances actives en blancs ne font pas parties de la liste des molcules fournie par LOral. Le Tableau 36 prsente le bilan de la dtection pour cette liste de molcules dtectes lors dune analyse ralise par un laboratoire x.
Substances actives rechercher Azimphos mthyl Bromopropylate Chlorpyrifos methyl Chlorpyrifos ethyl Diazinon Dicofol Dimthoate Diphnylamine Fnitrothion Fenthion Malathion Mthidathion Ortho-phenylphenol Parathion mthyl Parathion thyl Pendimthaline Phosalone Pipronyl butoxide Quinalphos Sulfotep Trifluraline Etat de la dtection Quantifie (0) Non analys Non dtect (LOQ~100ppb) Quantifie (0) Non dtect (LOQ~5 ppb) Non analys Non dtect (LOQ~5 ppb) Non dtect (LOQ~50 ppb) Non analys Le mtabolite sulfoxide a t Quantifie (0) Quantifie (0) Quantifie (0) Non analys Non analys Non dtect (LOQ~50 ppb) Non dtect (LOQ~5 ppb) Non dtect (LOQ~5 ppb) Non dtect (LOQ~5 ppb) Non dtect (LOQ~10 ppb) Non dtect (LOQ~5 ppb) Non analys
Tableau 36.
Bilan de la dtection concernant la liste des substances actives rechercher fournie par lOral
183
Suite ces rsultats qui diffrent de ceux attendus en termes de pesticides dtects mais aussi de concentrations, la question de la rptabilit de lanalyse sest pose. En effet, les diffrentes fractions ne prsentent pas le mme aspect, certaines ont beaucoup plus de matires en suspension que les autres. La question de limpact de lhomognit de la solution lors du prlvement sest alors pose, conduisant la mise en place dun protocole pour tudier son influence. II.1.2. Seconde srie danalyse : valuation de la rptabilit du prlvement Les quatre fractions HE1, HE2, HE3 et HE4 ont t analyses de deux faons diffrentes. Trois rptats ont t effectus avec un prlvement avant agitation, et trois avec un prlvement aprs agitation, suivant le protocole illustr dans la Figure 83.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 88.
Illustration du protocole permettant dvaluer limpact de lhomognit de lhuile essentielle sur les concentrations dtectes et sur la rptabilit de lanalyse
Les concentrations des pesticides dtects (en g.L-1), ainsi que leur CV (en %), calculs partir des concentrations dtectes pour les trois rptats, sont rports dans le Tableau 37. Les rsultats concernant lHE2 ne sont pas exposs puisquaucun rsidu na t dtect. Lendosulfan sulfate nest pas prsent non plus car les essais nont t injects quen mode ESI+.
HE1
Sans agitation Moyenne CV 7,2 2,9 15,3 1,9 3,6 2,5 33,1 3,7 23,9 5,5 6,0 3,5 6,7 5,9 7,7 3,7 157,3 5,1 2,6 2,2 3,5 0,0 Avec agitation Moyenne CV 6,6 4,8 13,9 4,8 3,5 1,3 29,8 25,7 25,3 3,1 5,8 4,3 6,5 6,2 8,0 10,8 159,7 4,4 2,4 4,7 3,4 8,6
HE3
HE4
Azimphos mthyl Buprofzine Carbaryl Chlorpyrifos Fenazaquin Fenthion sulfoxide Hexythiazox Malathion Mthidathion Phosmet Tbuconazole
Tableau 37.
Concentration en pesticides (g.L-1) et rptabilit (CV en %) en fonction de lagitation ou non de lextrait
184
Il est difficile de tirer une tendance gnrale des rsultats obtenus au cours de ces essais. Les concentrations dtectes sont comparables avec ou sans agitation mme si une baisse des concentrations est observe dans chaque cas pour les prlvements avec agitation. En fait, les concentrations ont tendance diminuer de la gauche vers la droite du tableau, ce qui correspond lordre dinjection des fractions dhuile essentielle. Cette baisse peut tre due un encrassement de la colonne et/ou du spectromtre de masse. La rptabilit de lanalyse, exprime par les CVs ne semble pas tre influence par lagitation de lhuile essentielle avant le prlvement. En effet, aucune variation significative des CVs pour lensemble des pesticides favorisant lune ou lautre des mthodes nest constate. La modification des CVs en fonction du prlvement et de la fraction nest pas unilatrale pour un mme pesticide. C'est--dire que, dans une fraction dhuile essentielle, une augmentation du CV peut avoir lieu en cas dagitation (ex : HE1 buprofzine) et dans une tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 autre fraction, linverse sera observ (ex : HE3 : buprofzine). A lexception de quelques coefficients de variation levs (surligns en bleu), la rptabilit des concentrations dtectes est gnralement satisfaisante quel que soit le mode de prlvement, avec des CV infrieurs 10 %. II.1.3. Conclusion Lanalyse des fractions dhuile essentielle a montr que la distillation permettait de traiter efficacement les pesticides puisquaucun rsidu na pu tre dtect dans la fraction HE2. Concernant les trois autres fractions, douze pesticides ont t dtects des teneurs quivalentes. Il faut remarquer que les substances actives dtectes au GIRPA sont sensiblement diffrentes de celles a priori retrouves par le laboratoire x (Tableau 36). Plusieurs cas sont distinguer selon que les substances actives aient t dtectes par les deux laboratoires, uniquement par le laboratoire x ou uniquement par le GIRPA. Les pesticides dtects par les deux laboratoires sont lazimphos mthyl, le chlorpyrifos, le malathion, le mthidathion et peut tre le fenthion puisque le mtabolite sulfoxide de ce dernier est dtect. Quinze pesticides ont t uniquement dtects par le laboratoire x. Parmi eux, on distingue les pesticides bromopropylate, dicofol, fnitrothion, parathion mthyl et trifluraline qui nont pas t analyss lors de cette tude puisque ces composs sont ddis lanalyse GC-MS. Ensuite, les molcules de chlorpyrifos mthyl, diphnylamine et parathion mthyl admettent des LOQs relativement hautes (LOQ > 50 g.L-1) avec la mthode dveloppe. Il est donc tout fait possible que le laboratoire x les ait dtectes. En revanche sept molcules (diazinon,
185
dimthoate, pendimthaline, phosalone, pipronil butoxide, quinalphos et sulfotep) nont pas t dtectes lors de ces analyses alors quelles possdent des LOQs relativement basses (< 10 g.L-1) et il est peut probable que lautre laboratoire dispose dune mthode avec des LOQ infrieures celles-ci. Finalement, il faut signaler que sept autres pesticides ont t dtects par le GIRPA alors quils ne sont pas prsents dans la liste demande. Il sagit de la buprofzine, du carbaryl, du fnazaquin, de lhexythiazox, du phosmet, du tbuconazole et de lendosulfan sulfate. Les concentrations en rsidus dtects sont comparables entre les deux sries danalyse. Une nette diffrence est cependant observe pour le mthidation. Elle provient srement dun problme de quantification d la contamination du tmoin par cette molcule. Les rsultats nont cependant pas t confirms par la technique des ajouts doss. Lhomognisation de lhuile essentielle ne semble pas tre une tape obligatoire. Les concentrations et les CVs sont tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 en effet quivalents, que lhuile soit prleve avant ou aprs son agitation. De manire valuer la justesse de la mthode par rapport dautres laboratoires, nous avons procd lanalyse dune huile essentielle dorange distribue par lorganisme FAPAS lors dessais inter-laboratoire.1 II.2 Analyse dune huile essentielle dorange Dans notre cas, une huile essentielle dorange commerciale naturellement contamine a t soumise aux analyses dune vingtaine de laboratoire. La liste des substances actives rechercher, donne par le FAPAS, se composait de neuf molcules :
Azoxystrobine Carbendazime Monocrotophos Oxamyl Imidachlorpride Fenbuconazole Pyraclostrobine Trifloxystrobine Spinosad
II.2.1. Analyse par LC-ESI/sSRM Une premire analyse de lhuile essentielle dorange, mene avec la mthode de prparation dveloppe pour lhuile essentielle de citron, a conduit aux rsultats reports dans le Tableau 38.
La participation des essais inter-laboratoire est une des conditions ncessaires lobtention de laccrditation ISO 17025. Ces tests permettent de comparer les rsultats analytiques de diffrents laboratoires, obtenus partir dun mme chantillon gnralement surcharg avec une quantit connue de pesticides. 186
Substance active dtecte Azoxystrobine Carbendazime Pyraclostrobine Trifloxystrobine

Tableau 38.
Substance active non dtecte Monocrotophos Oxamyl Imidachlopride Fenbuconazole Spinosade
Substances actives dtectes et non dtectes par rapport la liste de pesticides fournie par le FAPAS
La concentration de ces substances actives a t estime avec un point de gamme ralis partir dun tmoin dhuile dessentielle de citron bio. Ces teneurs ont permis deffectuer des ajouts doss lors de la seconde analyse. II.2.2. Rsultats et discussion dans le contexte dune analyse interlaboratoire Un mlange, contenant les quatre pesticides quantifier, a t prpar de manire surcharger lhuile essentielle avec des teneurs en pesticides quivalentes celles dj tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 prsentes : Azoxystrobine : 1 mg.L-1 Carbendazime : 500 g.L-1 Pyraclostrobine : 1 mg.L-1 Trifloxystrobine : 200 g.L-1
Lhuile essentielle dorange a ensuite t surcharge avec ce mlange de pesticides raison de 100 L dans 900 L dhuile essentielle dorange FAPAS. Lhuile essentielle dorange non surcharge (ch HE) et son ajout dos (ch AJ) ont ensuite t analyss selon le protocole de la Figure 87. Il faut noter que lajout dos a t ralis en duplicat (ch AJ1 et ch AJ2) et que les chantillons ont fait lobjet de trois injections chacun pour sassurer, une fois de plus, de la rptabilit. II.2.3. Rsultats Le Tableau 39 prsente les rsultats obtenus pour les quatre molcules recherches.
Azoxystrobine Aires ch HE (1) ch HE (2) ch HE (3) ch AJ1 (1) ch AJ1 (2) ch AJ1 (3) ch AJ2 (1) ch AJ2 (2) ch AJ2 (3) 5.58E+05 Moyenne CV Carbendazime Aires 7.80E+04 Moyenne CV Trifloxystrobine Aires 1.01E+05 Moyenne CV Pyraclostrobine Aires 1.92E+06 1.93E+06 1.6% Moyenne CV
5.61E+05 5.66E+05 2.0% 7.65E+04 7.64E+04 2.1% 1.05E+05 1.04E+05 2.2% 1.96E+06 5.79E+05 1.28E+06 7.48E+04 1.59E+05 1.05E+05 6.10E+05 1.90E+06 1.90E+06
1.30E+06 1.29E+06 0.9% 1.65E+05 1.63E+05 2.0% 5.94E+05 6.05E+05 1.5% 1.87E+06 1.30E+06 1.30E+06 1.64E+05 1.65E+05 6.10E+05 6.02E+05 1.95E+06 1.89E+06
1.91E+06
2.1%
1.31E+06 1.31E+06 0.4% 1.60E+05 1.62E+05 1.6% 6.12E+05 6.07E+05 0.8% 1.90E+06 1.31E+06 1.61E+05 6.06E+05 1.94E+06
1.91E+06
1.4%
Tableau 39.
Rsultats obtenus lors de lanalyse de lhuile essentielle dorange non surcharge (ch HE) et des ajouts doss (ch AJ1 et ch AJ2) exprims en aires, moyenne des aires et CV, pour les quatre pesticides recherchs
187
Les rsultats exposs dans le Tableau 39 permettent, une nouvelle fois, de dmontrer la rptabilit de lanalyse aussi bien en termes de prparation (Aires ch AJ1 et AJ2) que dinjection (CVs 2,1 %). A lexception de la pyraclostrobine, les aires des trois autres pesticides correspondant aux ch AJ sont plus leves dau moins un facteur deux compare lch HE . La constance des aires observe pour le pic de pyraclostrobine pourrait tre explique par une saturation de dtecteur due lintensit leve du signal. Cette hypothse na malheureusement pas t vrifie. A partir du Tableau 39, les teneurs initiales en pesticides dans lhuile essentielle dorange ont pu tre calcules et compares celles publies par la FAPAS. En fonction des rsultats envoys par lensemble des laboratoires, le FAPAS tablit une concentration moyenne laquelle est associ un cart standard cible pour le test tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
P
(Target Standard Deviation). En
fonction de ces deux termes, un z-score peut tre calcul pour chaque participant et chaque substance active tel que :
(x - X )
p
(91)
Dans lquation (91), x est la concentration rapporte par le laboratoire participant, X la valeur moyenne et
P
lcart standard de dviation. Pour tre qualifi de recevable, le z2.
score doit satisfaire z
Le Tableau 40 prsente les concentrations en pesticides reportes par le FAPAS, auxquelles sont compares celles retrouves par le GIRPA avec son z-score associ.
Substance active Azoxystrobine Carbendazime Trifloxystrobine Pyraclostrobine
Tableau 40.
FAPAS 108 47 39 /
GIRPA 72,5 40,5 20,4 /
z-score -1,49 -0,63 2,16 /
Concentrations en pesticides (g.L-1) reportes par le FAPAS et le GIRPA
Les rsultats concernant les substances actives azoxystrobine et carbendazime sont en adquation avec ceux donns par le FAPAS ( z
2 ). En revanche, le z-score de la
trifloxystrobine est suprieur 2. Cependant, il faut remarquer ce sujet que le rapport FAPAS prcise quil existe une grande incertitude sur la valeur moyenne de la concentration en trifloxystrobine qui peut affecter le z-score des participants. Ces derniers ne sont donc communiqus qu titre informatif. Concernant la pyraclostrobine, aucune valeur moyenne
188
na pu tre dfinie tant donn la grande variabilit des rsultats communiqus par les laboratoires. En plus de ces quatre substances actives, seize autres pesticides ont t dtects dans lhuile essentielle dorange parmi lesquels trois lont galement t par dautres laboratoires. Quatre substances actives parmi les seize ont pu tre quantifies du fait de leur prsence dans les mlanges de surcharge.
Pesticide Bifenthrine Buprofezine Carbofuran Clomazone Difenoconazole Dimethoate Etofenprox Famoxadone Fenthion sulfoxide Flufenoxuron Hexythiazox Malathion Methidathion Phosmet Propargite Pyriproxyfen
Tableau 41.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Concentration (g.L-1) 16 Non quantifi Non quantifi Non quantifi Non quantifi 2,65 Non quantifi 43 Non quantifi Non quantifi Non quantifi Non quantifi Non quantifi Non quantifi Non quantifi 19,2
Dtect par dautres laboratoires
X X
Pesticides dtects non inclus dans la liste de substances actives rechercher
II.2.4. Conclusion Lanalyse de lhuile essentielle dorange a permis dvaluer la capacit de la mthode analytique dtecter les pesticides. Elle a aussi contribu comparer ses performances par rapport aux analyses proposes par dautres laboratoires. Ainsi, il apparat que les limites de quantification proposes varient gnralement entre 10 et 500 g.L-1 selon les laboratoires. En fait, si deux laboratoires avancent des limites de quantification infrieures 10 g.L-1 pour un ou deux pesticides, leurs rsultats ne semblent pas satisfaisants compte tenu de leur z-score. Concernant les rsultats obtenus au GIRPA (non communiqus au FAPAS), plusieurs points positifs sont noter. Parmi la liste des molcules rechercher, seules les substances actives bien prsentes ont t dtectes. Rappelons quil sagit de lazoxystrobine, de la carbendazime, de la trifloxystrobine et de la pyraclostrobine. La quantification des deux premires est en adquation avec les concentrations rapportes par le FAPAS. Par contre, il est difficile de conclure sur la trifloxystrobine et la pyraclostrobine qui ont toutes les deux pos des problmes danalyse aux laboratoires et sur lesquelles les donnes dlivres par le FAPAS ne le sont qu titre informatif. En consquence, puisque les critres de satisfaction de
189
cet essai taient bass sur lidentification des quatre pesticides cibls, ainsi que sur la quantification de lazoxystrobine et de la carbendazime, on peut conclure quils ont t remplis par la mthode danalyse dveloppe au GIRPA. En fait, il faut savoir que sur les 20 laboratoires participants cet essai, seuls 5 dentre eux (25 %) ont rempli ces conditions. Un autre point positif concerne les trois substances actives dtectes par les autres laboratoires qui ont galement t identifies au sein du GIRPA. En plus de ces trois molcules, treize autres substances actives pour un total de seize, ont t dtectes lors de lanalyse de lhuile essentielle dorange. Au cours de cet essai inter-laboratoire, notre mthode analytique a dmontr sa capacit identifier et quantifier correctement les pesticides. Elle a aussi permis de mettre en vidence sa polyvalence importante en nombre de rsidus analyss au vu des substances actives supplmentaires dtectes. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
190
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Chapitre V
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Vers un Screening Plus Etendu de Pesticides dans les Huiles Essentielles, Plus Sensible et Plus Fiable
Ltude des huiles essentielles de lavandin et de citron a permis de mettre en vidence les performances de la mthode danalyse mise au point prcdemment. Elle consiste en une dilution au 1/10e, suivie ou non dune purification, et enfin dune injection directe en LCESI/sSRM. Elle a conduit dtecter et quantifier environ soixante-dix substances actives dans des huiles essentielles surcharges. Ce dernier chapitre se propose, non seulement dappliquer la mthode prcite la dtection et la quantification de 250 substances actives, mais aussi de comparer une nouvelle mthode de prparation base sur une vaporation des huiles essentielles sous azote. Il est en effet possible denvisager une amlioration des limites de dtection avec cette technique. Lanalyse de matrices complexes telles que les huiles essentielles en LC-ESI/sSRM se traduit par la prsence de nombreux interfrents qui peuvent, dans certains cas, tre la source de faux positifs, cest pourquoi une mthode de confirmation en mode SRM-EPI a t dveloppe dans une seconde partie. Enfin, dans une ultime partie, les performances et la fiabilit de la mthode analytique dveloppe tout au long de ce manuscrit seront values travers lanalyse dchantillons rels dhuiles essentielles.
192
Chapitre V. Vers un screening plus tendu de pesticides dans les huiles essentielles, plus sensible et plus fiable
A) Lvaporation sous azote comme mthode ad-hoc denrichissement en pesticides

Les huiles essentielles, de part leur composition, sont des extraits relativement volatils. Comme dcrit la fin du chapitre prcdent, il apparat ainsi possible, grce un procd de distillation, de recueillir une fraction volatile sous forme de distillat qui ne contient aucun pesticides. La question dvaporer les composs volatils des huiles essentielles une temprature plus basse que celle utilise pour la distillation sest alors pose. Elle permettrait de concentrer les pesticides avant de les reprendre dans le solvant dinjection. En effet, une concentration de ce type conduirait, a priori, une amlioration de la sensibilit de la mthode analytique. Dans un premier temps, la faisabilit dune vaporation sous azote tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 assiste par chauffage a t teste sur les huiles essentielles de citron et cyprs. Dans un second temps, les performances de cette mthode ont t compares avec celles de la simple dilution.
I.
Mise au point de la mthode vaporation sous azote

Les huiles essentielles de citron et cyprs ont t choisies pour tester lvaporation sous
azote, car ces deux huiles admettent un point clair relativement bas, en moyenne de lordre de 35 C264 et 46 C.79 Lapplication dune temprature de cet ordre, associe un flux dazote, devrait donc permettre dvaporer ces huiles essentielles. I.1 Protocole exprimental
Pour chacune des deux huiles essentielles, deux surcharges dun volume de 1 mL ont t ralises partir dun mlange de pesticides une concentration de 1 mg.L-1. Les taux de surcharge 10 et 50 g.L-1 ont respectivement t prpars en mlangeant 990 L dhuile essentielle avec 10 L dun mlange de pesticides 1 mg.L-1 et 950 L dhuile essentielle avec 50 L du mme mlange de pesticides. Le millitre a ensuite t rparti dans trois vials, raison de 300 L par vial pour tester trois volumes de reprise diffrents (300 L, 600 L et 900 L) aprs lvaporation. Les 100 L restants ont servi raliser une analyse classique (dilution au 1/10e) pour servir de comparaison. Un tmoin a galement t prpar pour chacun des volumes de reprise afin de
193
calculer au plus juste les taux de rcupration. Le protocole mis en place est illustr par le Schma 15.
Huile essentielle surcharg VHE= 1mL
Essai 1 (RE = 1) Vial 1 : V HE = 300 L Evaporation 55 min 35 C

Reprise 300 L MeOH 1%
Essai 2 (RE = 0,5) Vial 1 : VHE = 300 L Evaporation 55 min 35 C

Essai 3 (RE = 0,33) Vial 1 : VHE = 300 L Evaporation 55 min 35 C

Dilution 100 L HE + 900 L MeOH 1%
Citron
Azote liquide (4 minutes)
Prlvement du surnageant Cyprs
Injection LC/MS/MS
Schma 15.
Schma du protocole de mise au point de la mthode dvaporation sous azote
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Concernant lhuile essentielle de cyprs, si une simple dilution au 1/10 e dans le MeOH 1 % conduit une solution homogne qui ne ncessite pas dtape de purification dans lazote liquide, ce nest pas le cas lorsque cette huile est traite par vaporation. En effet, dans ce cas, la reprise dans le solvant donne une solution trouble qui, lorsque la purification lazote liquide est employe, mne la formation dun rsidu visqueux au fond du vial. Ce dernier ne se rvle pas problmatique pour prlever le surnageant. Lobjectif de ce protocole est, dans un premier temps, dvaluer si une amlioration significative de la sensibilit est apporte par lvaporation sous azote compare la dilution et, si cest le cas, de dterminer dans un second temps le volume de reprise et donc le RE le plus adapt. I.2 Rsultats et discussion
Etant donn que le but principal de cette exprience est dordre qualitatif, les rsultats ne sont pas autant dtaills que pour les tudes prcdentes. Ils se focalisent sur les points essentiels, savoir les taux de rcupration des substances actives dun point de vue global et lvolution des rapports S/N. I.2.1. Lhuile essentielle de citron Les taux de rcupration sont satisfaisants pour la majorit des composs. Des rendements entre 80 et 110 % sont obtenus pour une reprise dans 900 L. Ces TRs sont un peu plus faibles dans le cas dune reprise dans 600 L (60-80 %) et 300 L (60-90 %). Un compos admet un TR trs faible, il sagit du thiophanate-mthyle dont le rendement natteint que 5 %.
194
Cependant, ce pesticide se dgrade en carbendazime qui est galement une substance active analyse, le problme est donc limit. La rcupration des pesticides ne semble donc pas tre un facteur limitant de lvaporation sous azote. Mais cette technique a-t-elle un impact sur le rapport S/N ? Pour estimer son intrt, regardons lvolution du rapport S/N de quelques composs dont les limites de quantification ne sont pas trs satisfaisantes avec une simple dilution. Le Tableau 42 prsente lvolution du rapport S/N pour les substances actives abamectine, parathion thyl et chlorpropham en fonction du volume de reprise et donc du facteur de dilution. Les concentrations prcises dans le Tableau 42 correspondent la concentration de ces pesticides dans lhuile essentielle. Les chromatogrammes obtenus avec la dilution au 1/10e servent de tmoin.
Sample Name: "10 ppb d10" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "Abamectine -1" Mass(es): "890.5/305.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 1:24:55 PM
RE = 0,1 (Dilution 1/10e)

20.55
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
290 280 270 260 250 240 230 220 210 200 190
Sample Name: "10 ppb 900" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "Abamectine -1" Mass(es): "890.5/305.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 8 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 3:44:56 PM
RE = 0,33 (reprise dans 900 L)

20.58
1100 1050 1000 950 900 850 800 750
Sample Name: "10 ppb 600 ?" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "Abamectine -1" Mass(es): "890.5/305.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 13 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 6:05:03 PM

20.56
Modified:
Yes
1050 1000 950 900 850 800 750
RE = 1 (reprise dans 300 L)

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200
20.54
20.78
Abamectine (10 g.L-1)
180
700
700
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

20.08 20.22 20.92
650 600 550

20.68
20.78
650 600 550 500 450
1100 1000 900 800 700
500 450 400 350 300 250 200 150 100

20.05
400 350 300 250 200

300 200
20.78
600 500 400
150 100
20.36 20.99
20.27
50
10 0
50 0 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 Tim m e, in 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4
100 0
0
18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 Time, m in 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6 Time, m in
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
21.8
22.0
22.2
22.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6 Time, m in
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
21.8
22.0
22.2
22.4
Aire S/N
Sample Name: "50 ppb d10" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "Abamectine -1" Mass(es): "890.5/305.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 1:52:55 PM
/ < 10
20.59
7710 36
3100 3000 2900 2800 2700 2600 2500 2400 2300 2200 2100 2000
20.57
1000 950 900 850 800 750 700 650
Sample Name: "50 ppb 600 ?" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "Abamectine -1" Mass(es): "890.5/305.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 14 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 6:33:05 PM
8940 70
20.54
4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800
12700 73
20.58
5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400
Abamectine (50 g.L-1)
1900
2600
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
20.37 20.90
1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000
18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 Time, m in 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4
3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
700 600 500 400 300 200 100

18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 Time, m in 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4
400 200 0 800 600
200 0 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 Time, m in 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6 Tim m e, in
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
21.8
22.0
22.2
22.4
Aire S/N
Sample Name: "50 ppb d10" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "parathion ethyl -1" Mass(es): "292.1/236.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 1:52:55 PM
8810 75
16.05
230 220 210 200 190 180 170 160 150
Sample Name: "50 ppb 900" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "parathion ethyl -1" Mass(es): "292.1/236.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 9 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 4:12:56 PM
22800 200
750
15.96
Sample Name: "50 ppb 600 ?" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "parathion ethyl -1" Mass(es): "292.1/236.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 14 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 6:33:05 PM
25800 240
15.90
1100 1050 1000 950 900 850 800 750 700
Sample Name: "50 ppb 300" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "parathion ethyl -1" Mass(es): "292.1/236.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 18 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 8:25:13 PM
36300 371
15.92
Modified:
Yes
1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200
700
650
600
550
500
Parathion thyl (50 g.L-1)
650 600 550 500 450 400
140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

15.31 15.53 15.48 15.66 16.29 16.23 15.37 15.90
450
1100 1000 900 800 700 600 500
400
350
300
250
15.32
350 300 250
200
150
400
200
15.43
15.72
100
300
150
15.32 15.34 15.43
100
50
200 100 0
15.40 16.16
10 0 14.2 14.4 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 Time, m in 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0
0 14.0 14.2 14.4 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 Time, m in 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8
50 0 14.0 14.2 14.4 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 Time, m in 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8
14.0
14.2
14.4
14.6
14.8
15.0
15.2
15.4
15.6
15.8 16.0 Time, m in
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
Aire S/N
Sample Name: "50 ppb d10" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 1:52:55 PM
/ < 10
12.83
290 280 270 260 250 240 230 220 210 200 190
Sample Name: "50 ppb 900" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 9 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 4:12:56 PM
6030 20
1150 1100 1050 1000 950 900 850 800 750 700
12.82
Sample Name: "50 ppb 600 ?" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 14 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 6:33:05 PM
8070 43
12.75
1500 1450 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100
Sample Name: "50 ppb 300" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "chlorpropham -1" Mass(es): "231.1/172.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 18 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 8:25:13 PM
14700 67
12.73
2800 2700 2600 2500 2400 2300 2200 2100 2000 1900 1800
Modified:
Yes
12.21
1050 1000 950

Chlorpropham (50 g.L-1)
180
170 160 150

13.05 12.70
900 850 800 750 700 650 600 550 500
650 600 550 500
12.18 12.44
1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500
12.15
140 130 120 110

12.15 12.26 12.57 12.63
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 Time, m in 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6
12.22 12.55
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 Tim m e, in 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6
450 400 350 300

12.40 12.63
250 200 150 100 50 0 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2
400 300 200 100

12.4 12.6 12.8 Time, m in 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6
12.18
0 10.8
11.0
11.2
11.4
11.6
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8 Time, m in
13.0
13.2
13.4
13.6
13.8
14.0
14.2
14.4
14.6
Aire S/N Tableau 42.
/ < 10
8780 24
14000 39
24300 50
Evolution du rapport S/N de labamectine, parathion thyl et chlorpropham en fonction de rapport dextraction
195
Les chromatogrammes exposs dans le Tableau 42 mettent en vidence une augmentation du rapport S/N pour les trois substances actives avec laugmentation du RE. Laccroissement du rapport S/N nest cependant pas strictement proportionnel au rapport entre les RE, c'est-dire que le gain par exemple dun facteur trois nest pas toujours observ entre les rapports S/N des pics correspondant un RE de 0,33 (reprise dans 900 L) et 1 (reprise dans 300 L). Ce constat peut sexpliquer par une augmentation de lintensit qui nest pas proportionelle au RE mais galement une concentration des composs de la matrice qui cause un accroissement du bruit de fond. Dans certains cas, aucune variation du rapport S/N nest observe, limage de la mtrafnone dont les chromatogrammes sont exposs dans le Tableau 43.
Sample Name: "10 ppb d10" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "metrafenone -1" Mass(es): "409.1/209.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 1:24:55 PM

17.55
5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400
Sample Name: "10 ppb 900" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "metrafenone -1" Mass(es): "409.1/209.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 8 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 3:44:56 PM

17.52
1.05e4 1.00e4
Sample Name: "10 ppb 600 ?" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "metrafenone -1" Mass(es): "409.1/209.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 13 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 6:05:03 PM

1.25e4 1.20e4 1.15e4 1.10e4 1.05e4 1.00e4 9500.00 9000.00
17.49
Sample Name: "10 ppb 300" Sample ID: "" File: "Evapo citron.wiff" Peak Name: "metrafenone -1" Mass(es): "409.1/209.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 17 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 6/10/2010 Acq. Time: 7:57:11 PM
RE = 1 (reprise dans 300 L)

17.47
1.6e4
1.5e4
9500.00 9000.00 8500.00 8000.00 7500.00 7000.00

1.4e4
1.3e4
1.2e4
8500.00
1.1e4
8000.00
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Mtrafnone (10 g.L-1)
3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800

17.06 17.89
6000.00 5500.00 5000.00 4500.00
7000.00 6500.00 6000.00 5500.00 5000.00
17.03 17.86
3200
6500.00
7500.00
1.0e4
9000.0
8000.0
7000.0
4000.00
17.89
4500.00
17.04
6000.0
3500.00
17.14
4000.00
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0
5000.0
3000.00 2500.00 2000.00 1500.00
3500.00 3000.00 2500.00
4000.0
17.25 17.83 17.88
3000.0
2000.00 1500.00
2000.0
1000.00 500.00 0.00
1000.00
1000.0
500.00
15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 Time, m in 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4
0.00
17.2
17.4
17.6 Time, m in
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
15.6
15.8
16.0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6 Time, m in
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
0.0
15.6
15.8
16.0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6 Time, m in
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
39600 14
87200 14
93300 15
114000 20
Evolution du rapport S/N de la mtrafnone en fonction du rapport dextraction
Le mme profil chromatographique ainsi quun rapport S/N presque constant est observ pour la mtrafnone quelle que soit la mthode de prparation. Entre la simple dilution et lvaporation sous azote (RE = 0,33), une augmentation de laire du pic chromatographique de 39600 87200 est bien constate. Cependant la ligne de base, reprsentative du bruit de fond, volue dans les mmes proportions, ce qui explique que le rapport S/N reste constant. De plus, les aires relatives aux diffrents RE ne progressent que trs peu (87200 pour un RE = 0,33 114000 pour un RE = 1) en conservant un bruit de fond constant. Ce phnomne pourrait tre la consquence deffets matrice suppresseurs plus levs avec laugmentation du RE. Le bilan de cette exprience concernant lhuile essentielle de citron se rvle trs positif puisque lvaporation sous azote permettrait damliorer la sensibilit dune bonne partie des molcules sans en dfavoriser dautres, exception faite du thiophanate-mthyle qui admet un TR de seulement 5 %. I.2.2. Lhuile essentielle de cyprs Concernant lhuile essentielle de cyprs, seuls les vials correspondant un RE = 0,33 et RE = 0,5 ont t injects. Les rsultats sont relativement similaires ceux de lhuile
196
essentielle de citron. Des taux de rcupration de lordre de 60 90 % sont obtenus par les substances actives pour une reprise dans 900 L et plutt de lordre de 50 80 % avec une reprise dans 600 L. Quelques pesticides tels que le bifnazate et le thiophanate-mthyle admettent de faibles TR de lordre de 10 % pour le premier et 30 % pour le second. Cependant, tant donn la bonne sensibilit de ces composs, des LOQs denviron 10 g.L-1 devraient pouvoir tre atteintes. Du point de vue de lvolution du rapport S/N, des conclusions analogues celles tablies pour lhuile essentielle de citron peuvent tre faites. Le Tableau 44 prsente les chromatogrammes relatifs au trichlorfon.
Sample Name: "50 ppb" Sample ID: "" File: "reinj cypres evapo.wiff" Peak Name: "Trichlorfon -1" Mass(es): "274.0/256.7 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/8/2010 Acq. Time: 7:11:10 PM

3.33
2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300
Sample Name: "50 ppb 900" Sample ID: "" File: "reinj cypres evapo.wiff" Peak Name: "Trichlorfon -1" Mass(es): "274.0/256.7 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 9 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/8/2010 Acq. Time: 9:31:11 PM
RE = 0,33 (reprise dans 900L)

3.36
4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000
Sample Name: "50 ppb 600" Sample ID: "" File: "reinj cypres evapo.wiff" Peak Name: "Trichlorfon -1" Mass(es): "274.0/256.7 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 14 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 7/8/2010 Acq. Time: 11:51:15 PM

3.39
6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Trichlorfon (50 g.L-1)
1200 1100 1000 900 800
2800 2600 2400 2200 2000 1800
1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 Time, m in 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2
3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200
700 600 500 400 300
1600 1400 1200 1000 800 600
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
200 100 0
400 200 0
200 0 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 Time, m in 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4 Time, m in
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
18500 50
48400 90
60900 101
Evolution du rapport S/N du trichlorfon dans lhuile essentielle de cyprs en fonction du rendement dextraction
Les chromatogrammes du Tableau 44 mettent bien en vidence une amlioration du rapport S/N du trichlorfon en fonction du volume de reprise. I.3 Conclusion
Lobjectif de ces essais tait dvaluer lintrt de mettre en place une tape dvaporation sous azote afin de limiter la dilution de lchantillon et daccrotre ainsi la sensibilit. Les premiers rsultats obtenus dans les huiles essentielles de citron et cyprs sont encourageants. Les taux de rcupration des pesticides sont dans lensemble satisfaisants (gnralement suprieurs 70 %) avec cependant des rendements faibles pour certains (bifenazate, thiophanante-methyle). Une amlioration du rapport S/N est note dans un bon nombre de cas, ce qui permettrait dabaisser les LOQs. Le volume de reprise le plus adapt semble tre celui conduisant un RE gal 1. Il est nanmois important de noter que la concentration des constituants de la matrice entrane une nette augmentation du bruit de fond de certaines transitions SRM (mtrafnone : Tableau 43). Ils sont, de plus, probablement responsables dun accroissement de la suppression du signal au niveau de lionisation electrospray qui expliquerait une certaine stagnation de lintensit du signal malgr une dilution plus faible des extraits.
197
Le matriel utilis lors de ces premiers essais ntait pas trs adapt pour matriser toutes les conditions opratoires telles que la temprature de chauffage ou le dbit dazote. Un appareil plus adapt a donc t command afin de pouvoir poursuivre ces manipulations dans de meilleures conditions et permettre de tester cette mthode sur des huiles essentielles de moindre volatilit (lavandin, mlisse) et ainsi, de pouvoir comparer la sensibilit admise par les mthodes dilution et vaporation sous azote .
II. Quantification de 250 pesticides dans 4 huiles essentielles :

comparaison des mthodes de dilution et dvaporation sous azote
Lobjectif est, ici, de comparer les mthodes de dilution et dvaporation sous azote sur quatre huiles essentielles de composition et de volatilit diffrentes : citron,79 tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 cyprs,264 lavandin265 et mlisse. Paralllement, la rptabilit de lvaporation sous azote a t teste travers la ralisation de cinq taux de rcupration deux concentrations de surcharge. II.1 Protocole exprimental Pour chaque huile essentielle, cinq taux de surcharge ont t prpars partir dun mlange de surcharge de pesticides une concentration de 1 mg.L-1 de la manire suivante : Huile essentielle surcharge 50 g.L-1 (V = 3 mL) Mlange de 2850 L dhuile essentielle + 150 L du mlange de pesticides 1 mg.L-1. Huile essentielle surcharge 25 g.L-1 (V = 1 mL) Mlange de 975 L dhuile essentielle + 25 L du mlange de surcharge 1 mg.L-1. Huile essentielle surcharge 10 g.L-1 (V = 3 mL) Mlange de 2970 L dhuile essentielle + 30 L du mlange de surcharge 1 mg.L-1. Huile essentielle surcharge 5 g.L-1 (V = 1 mL) Mlange de 900 L dhuile essentielle + 100 L dHE surcharge 50 g.L-1. Huile essentielle surcharge 1 g.L-1 (V = 1 mL) Mlange de 900 L dhuile essentielle + 100 L d dhuile essentielle surcharge 10 g.L-1. La procdure exprimentale, base sur les protocoles de dilution et dvaporation sous azote tablis prcdemment, est dcrite dans le Schma 16. Elle a t applique lensemble des extraits surchargs et au tmoin (huile essentielle non sucharge).
198
Huile essentielle
Dilution au 1/10e
Evaporation sous azote
Reprise
(500 L MeOH 1%)
Azote liquide
Lavandin Cyprs
Centrifugation Prlvement du surnageant Injection LC/MS/MS
Lavandin
Schma 16.
Protocole exprimental de comparaison des mthodes dilution et vaporation sous azote
Dans le cas de lvaporation sous azote, un rapport dextraction de 1 a t choisi, compte tenu des rsultats prcdents. Ainsi, un volume de 500 L dhuile essentielle est vapor, puis tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 repris dans un volume quivalent de MeOH acidifi. Les concentrations attendues linjection en LC-MS/MS en fonction de la mthode de prparation et du taux de surcharge de lhuile essentielle sont dtailles dans le Tableau 45 :
Surcharge de lhuile essentielle 50 g.L-1 25 g.L-1 10 g.L-1 5 g.L-1 1 g.L-1
Tableau 45.
Dilution au 1/10e 5 g.L-1 2,5 g.L-1 1 g.L-1 0,5 g.L-1 0,1 g.L-1
Evaporation sous azote 50 g.L-1 25 g.L-1 10 g.L-1 5 g.L-1 1 g.L-1
Concentrations attendues dans les extraits injects en LC-MS/MS
Pour valuer la rptabilit de lvaporation sous azote, cinq rptats (5 TRs) ont t effectus pour les huiles essentielles surcharges 10 et 50 g.L-1. Afin de calculer les taux de rcupration de chaque substance active, deux points de gamme matrice 10 et 50 g.L-1 ont t prpars partir de lextrait provenant du tmoin non surcharg. Il faut noter que la dilution des huiles essentielles de lavandin et de cyprs ainsi que lvaporation sous azote de lhuile essentielle de lavandin nont pas ncessit de purification dans lazote liquide. De plus, il est important de remarquer que lvaporation de lhuile essentielle de citron a ncessit lapplication dune temprature de 40 C pendant environ 45 minutes, celle de cyprs 40 C pendant 45 minutes, puis 45 C pendant 15 minutes. Les huiles essentielles de lavandin et de mlisse requirent une temprature bien plus leve, savoir 80 C pendant 30 45 minutes pour le lavandin et 90 C pendant une heure puis 95 C pendant 1/2 heure pour la mlisse.
199
Les extraits issus de la dilution et de lvaporation sous azote dune huile essentielle donne ont t injects successivement le mme jour pour sassurer que le spectromtre de masse soit dans des conditions danalyse identique, notamment, en termes de sensibilit. Afin de faciliter linterprtation des rsultats, les huiles essentielles ont t ordonnes selon la temprature dvaporation applique. Pour chacune delles sont dtaills un bilan gnral des TRs et CVs obtenus avec la mthode dvaporation sous azote, ainsi quun tat des lieux des LOQs en fonction de la mthode de prparation de lhuile essentielle. II.2 Analyse de lhuile essentielle de citron surcharge en pesticides II.2.1. Rsultats et discussion tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Les rsultats concernant lhuile essentielle de citron sont exposs dans le Tableau 46. Les couleurs bleue, verte et rouge se rfrent respectivement aux composs admettant des TRs < 70 %, aux composs dtects dans le tmoin et aux composs non dtects ou prsentant des particularits. Ces derniers seront dtaills ultrieurement.
Pesticide Abamectine Acephate Acetamipride Acibenzolar-S-methyl Aclonifen Alachlore Aldicarbe Aldicarbe sulfone Aldicarbe sulfoxyde Ametryn Amidosulfuron Amitraz Atrazine Azaconazole Azimphos-methyl Azoxystrobine Benalaxyl Bendiocarb Benfuracarbe Benomyl Benoxacore Bifenazate Bifenthrine Bitertanol Boscalid Bromacil Bromuconazole iso1 Bromuconazole iso2 Bupirimate Buprofezine Butraline Carbaryl Carbendazime Carbetamide Carbofuran Carbofuran-3 OH Limite de Quantification (g.L-1) Dilution Evaporation 25 10 5 5 1 1 25 5 50 25 10 10 5 1 5 1 1 1 5 1 10 5 5 5 1 1 / / 10 10 1 1 5 5 1 1 5 1 ND ND 10 5 1 1 25 25 / / 5 1 10 5 10 10 25 10 1 1 1 1 1 1 5 1 D D 5 1 1 1 5 5 Technique approprie Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation / Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation / Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation / Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation TR 10 g.L-1 Moyenne CV 86,2 10,1 80,4 3,1 88,2 2,2 84,6 5,8 89,9 79,5 88,2 86,8 85,0 88,2 89,0 89,1 93,8 87,2 87,0 85,6 86,3 93,3 / 88,7 80,7 85,8 89,7 87,0 95,1 100,5 87,3 89,4 82,4 88,4 / 90,5 89,4 79,0 3,3 3,7 3,9 2,1 1,9 5,2 24,5 1,5 2,7 2,5 1,9 2,4 1,5 3,5 / 2,0 1,8 2,4 1,5 4,0 5,6 6,8 1,8 3,0 2,2 1,5 2,9 2,4 2,3 2,1 TR 50 g.L-1 Moyenne CV 93,4 7,4 84,8 1,7 86,4 1,9 88,0 2,6 84,7 5,8 86,5 4,4 82,1 5,0 90,7 1,9 87,8 1,2 86,7 1,7 87,4 2,3 33,9 30,2 84,5 2,3 89,9 2,5 83,0 1,9 86,2 2,2 85,5 1,5 84,4 1,6 83,8 2,2 / / 86,3 2,8 82,0 2,4 86,5 4,2 81,0 2,3 87,2 1,3 90,3 1,9 86,2 3,2 87,7 3,5 82,3 2,0 84,9 2,4 83,4 2,2 85,7 1,9 / 2,8 88,2 2,4 92,0 1,6 91,2 1,7
200
Pesticide Carbosulfan Carboxin Carfentrazone thyle Chlorfenvinphos iso1 Chlorfenvinphos iso2 Chloridazone Chlorotoluron Chlorpropham Chlorpyrifos Chlorsulfuron Clofentezine Clomazone Coumaphos Cyanazine Cyazofamide Cycloxydime Cymoxanil Cyproconazole-iso1 Cyproconazole-iso2 Cyprodinil Cyromazine Deltamehtrine Desmedipham Diazinon Dichlofluanid Dichlorvos Diethofencarb Difenoconazole Diflufenicanil Dimetachlor Dimethenamid Dimethoate Dimethomorph iso1 Dimethomorph iso2 Diniconazole Disulfoton Diuron Epoxyconazole Ethion (diethion) Ethofumesate Ethoprophos Etofenprox Etoxazol Famoxadone Fnamidone Fenamiphos Fenarimol Fenazaquin Fenbuconazole Fenhexamid Fenoxycarbe Fenpropimorphe Fenpyroxymate Fenthion Fenthion sulfone Fenthion sulfoxide Fipronil Flazasulfuron Fluazifop-p-butyl Flufenacet Flufenoxuron Fluquinconazole Flurochloridone Flusilazol Flutolanil Flutriafol Fomesafen Formetanate Fosthiazate
Limite de Quantification (g.L-1) Dilution Evaporation 1 1 1 1 1 1 25 10 10 10 10 5 5 1 ND 50 / / 5 5 10 10 1 1 10 5 1 1 5 1 5 5 10 5 10 10 10 5 5 5 10 5 ND 50 1 1 5 5 10 5 10 5 5 5 5 5 5 1 10 10 1 1 1 1 5 5 5 5 10 5 50 10 5 1 5 5 10 10 25 10 5 5 25 25 5 5 10 5 1 1 / / 5 5 10 10 10 10 10 5 5 1 / / 5 1 25 10 10 10 / / 25 10 5 1 1 1 1 1 5 5 10 5 25 10 10 5 1 1 10 10 5 5 1 1 1 1
Technique approprie Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation
TR 10 g.L-1 Moyenne CV 111,7 4,4 65,1 2,9 89,1 2,3 80,0 7,4 78,2 3,6 85,1 6,2 85,4 1,9 87,1 85,6 61,0 84,2 86,6 89,4 92,4 68,2 87,8 92,7 88,1 88,2 61,7 / 90,7 90,6 93,9 68,8 87,2 76,2 88,0 83,8 87,5 89,3 88,9 91,3 91,4 79,4 90,2 91,2 99,3 92,8 87,1 / 88,6 85,7 88,3 88,5 89,7 83,6 93,9 88,7 90,6 86,2 85,0 93,4 93,4 91,9 100,2 91,9 86,2 90,4 81,7 86,3 84,3 85,9 90,4 91,3 87,3 92,1 88,6 2,9 3,3 6,4 2,3 3,2 1,9 3,8 4,8 2,4 4,2 2,3 2,8 4,4 / 2,6 1,7 3,6 6,2 2,7 5,9 1,1 18,8 1,9 1,9 2,2 2,1 2,7 1,5 2,6 3,2 8,4 7,5 3,1 / 3,7 10,6 2,9 3,3 3,5 2,6 10,8 3,7 2,5 3,5 3,9 6,5 4,9 1,1 4,3 2,7 2,2 1,2 2,6 4,7 1,7 2,5 2,0 3,1 5,3 5,4 1,5
TR 50 g.L-1 Moyenne CV 87,5 7,5 63,0 6,5 86,2 1,8 85,9 2,9 86,1 2,6 86,7 2,5 86,2 2,8 87,5 3,7 87,2 4,2 87,0 2,2 77,3 19,2 87,7 2,1 85,5 1,7 86,9 2,1 89,6 4,4 64,8 6,5 87,2 3,4 86,3 3,2 85,7 2,5 83,4 0,9 64,6 8,9 81,3 4,5 86,9 2,1 81,8 2,6 87,9 3,5 59,8 9,6 84,7 3,3 86,1 12,9 85,2 3,5 85,2 3,7 86,5 2,1 87,1 1,6 87,1 1,7 87,4 2,2 83,3 1,7 88,6 7,3 86,1 1,6 89,1 2,0 90,9 5,4 86,5 5,4 84,5 3,7 84,6 2,7 87,5 3,6 86,1 4,6 86,3 1,4 84,8 2,0 86,5 3,2 84,0 2,6 83,1 3,7 84,7 3,8 87,4 2,0 89,1 9,1 86,4 1,3 84,7 4,2 89,3 2,4 85,6 1,7 97,0 3,8 87,6 3,4 85,9 2,5 89,6 1,9 84,6 4,1 87,8 2,5 87,5 2,5 86,5 1,5 87,1 1,4 87,4 2,5 85,8 2,9 91,9 3,3 87,8 1,0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
201
Pesticide Furathiocarb Heptnophos Hexaconazole Hexazinone Hexythiazox Imazalil Imidaclopride Indoxacarbe Iprodione Iprovalicarbe Isofenphos Isoproturon Isoxaben Isoxaflutol Kresoxim methyl Lenacile Linuron Lufenuron Malaoxon Malathion Mefenoxam Mepanipyrim Mepronil Mesosulfuron methyl Metamitrone Metazachlore Metconazole Methabenzthiazuron Methamidophos Methidathion Methiocarbe Methiocarbe sulfone Methiocarbe sulfoxide Methomyl Methoxyfenozid Mtobromuron Metolachlor Mtoxuron Metrafenone Metribuzine Mevinphos iso1 Mevinphos iso2 Molinate Monocrotophos Myclobutanil Napropamide Norflurazon Nuarimol Omthoate Oxadiazon Oxamyl Oxycarboxin Paclobutrazol Paraoxon methyl Parathion ethyl Penconazole Pencycuron Pendimethaline Permethrin Phenmedipham Phenthoate Phorate Phosalone Phosmet Phosphamidon Picolanifen Picoxystrobin Piperonyl butoxide Pirimicarbe
Limite de Quantification (g.L-1) Dilution Evaporation 10 10 5 5 5 5 / / / / 10 10 10 5 5 5 50 25 5 5 5 1 1 1 5 1 10 5 5 1 5 1 10 1 25 10 1 1 / / / / 10 10 / / 5 1 25 10 5 1 10 5 5 5 1 1 / / 5 5 5 1 1 1 1 1 5 5 10 5 10 5 5 1 25 25 / / 5 5 5 5 25 5 5 5 5 1 1 1 1 1 5 1 5 1 5 5 / / 5 5 5 1 25 5 ND 25 5 1 5 5 5 5 25 25 5 1 10 5 50 10 5 5 / / 5 1 10 10 1 1 10 10 1 1
Technique approprie Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation / Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation / Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation / Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
TR 10 g.L-1 Moyenne CV 85,6 2,5 87,3 2,1 88,1 2,6 93,1 3,2 83,4 5,0 81,5 4,2 89,4 3,2 87,1 3,5 / / 89,9 1,5 91,5 3,5 84,2 3,3 88,5 2,8 90,4 4,0 92,6 3,0 91,6 2,3 100,8 3,8 73,2 5,6 83,9 1,4 89,1 5,1 87,6 5,1 81,0 7,3 88,1 1,9 85,8 2,1 84,4 5,9 86,6 2,2 87,4 4,6 85,3 1,9 83,1 2,7 97,0 0,9 92,5 2,4 88,9 2,8 86,5 1,8 85,7 2,2 99,1 7,0 90,3 3,9 88,1 3,0 83,4 2,8 93,1 86,2 87,0 94,0 90,9 85,7 90,2 87,8 88,6 83,9 88,1 90,2 90,5 86,3 88,7 / 89,0 89,1 82,9 / 91,0 89,5 96,8 90,2 101,3 86,4 87,2 89,1 95,3 86,5 4,1 2,6 4,0 7,3 1,3 3,9 3,0 3,1 2,7 2,6 7,3 4,9 1,0 3,0 5,1 / 2,9 4,9 1,9 / 2,2 4,7 7,2 4,4 1,8 3,4 8,1 1,9 4,0 2,2
TR 50 g.L-1 Moyenne CV 86,3 1,9 86,3 2,2 81,8 0,8 85,3 3,1 81,7 4,9 89,5 5,5 88,2 2,8 85,4 1,6 81,4 5,8 86,9 2,2 84,3 2,9 84,3 3,5 87,5 2,7 88,0 3,9 81,5 2,0 87,1 1,6 90,2 3,6 86,2 6,0 86,9 2,3 87,7 2,1 87,4 2,6 86,0 2,0 87,9 1,3 87,2 2,9 79,8 2,2 87,8 0,7 82,7 3,0 86,1 1,5 81,0 1,3 89,1 2,9 86,8 1,4 87,2 1,1 90,2 1,6 86,6 1,7 90,8 3,9 88,1 2,2 85,8 2,8 85,1 2,6 86,7 2,5 84,7 2,9 86,5 2,1 92,0 2,1 80,9 3,4 88,2 1,8 86,2 2,4 88,8 3,5 87,2 2,2 85,0 2,7 84,6 1,2 83,4 2,8 93,3 0,6 87,3 2,6 88,1 2,6 89,4 5,3 87,5 5,5 83,8 2,0 82,3 1,6 84,4 2,6 87,5 2,4 90,0 1,9 85,5 2,6 86,5 2,1 86,2 3,2 100,5 1,5 84,6 3,0 78,4 2,5 85,0 1,3 87,3 1,5 86,0 1,7
202
Pesticide Pirimicarbe desmethyl Pirimiphos-thyl Pirimiphos-methyl Prochloraz Profenofos Prometryn Propachlore Propaquizafop Propargite Propazin Propiconazole Propoxur Propyzamide Proquinazid Prosulfocarbe Prosulfuron Pymetrozin Pyraclostrobine Pyridaben Pyridafenthion Pyridate Pyrimethanil Pyriproxyfen Quinalphos Quinoclamine Quinoxyfen Quizalofop-p-ethyl Resmethrin Rimsulfuron Rotenone Sethoxydim Simazine Spinosad A Spinosad D Spiroxamine Sulfosulfuron Sulfotep Tau-fluvalinate Tebuconazole Tebufenozide Tebufenpyrade Terbufos Terbuthylazine Terbutryn Tetraconazole Thiabendazol Thiachlopride Thiametoxam Thiodicarbe Thiophanate methyl Tolyfluanide Triadimefon Triadimenol Trichlorfon Trifloxystrobine Triflusulfuron mthyl Triticonazol Vamidothion Zoxamide 2,4d Bentazone Bromoxynil Chlorfluazuron Cyclanilid Dichlorprop-p Diflubenzuron Dithianon Endosulfan sulfate Fluazinam
Limite de Quantification (g.L-1) Dilution Evaporation 1 1 1 1 10 5 5 1 5 5 5 5 5 5 5 5 10 25 5 5 10 10 10 5 / / 10 5 5 5 25 10 10 5 1 1 5 5 5 5 5 5 10 5 10 10 25 10 50 25 5 5 5 5 25 25 5 1 10 5 5 5 5 5 5 1 10 1 1 1 5 1 10 5 ND ND 5 5 5 5 10 10 50 5 5 1 1 1 / / 5 1 5 5 5 5 5 1 25 ND 5 5 5 1 5 1 25 10 1 1 1 1 5 1 1 1 10 10 25 5 1 1 5 1 5 1 1 1 10 5 25 5 10 10 / / 5 1
Technique approprie Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation / Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation
TR 10 g.L-1 Moyenne CV 75,3 3,7 87,2 1,3 84,3 4,1 87,2 2,5 82,9 3,3 85,6 3,3 77,4 1,8 90,2 6,8 / / 83,4 2,7 91,5 6,5 84,7 1,7 89,9 2,2 83,7 3,0 85,1 3,6 97,5 3,0 89,6 3,8 89,8 1,7 84,0 4,1 86,9 3,2 90,4 3,8 85,8 4,5 83,6 2,4 88,4 8,2 / / 81,4 4,8 85,7 2,3 / / 87,5 2,3 88,8 3,1 70,9 1,3 88,3 1,3 86,9 4,6 95,3 1,7 86,5 1,8 87,2 4,3 84,3 1,9 / / 91,5 3,9 87,8 4,7 86,3 3,4 86,5 12,3 85,8 1,7 88,6 3,0 90,7 2,6 86,7 3,4 87,7 2,0 87,1 6,6 87,7 1,4 / / 86,2 3,8 84,9 4,7 88,1 1,1 96,5 4,5 87,7 1,0 86,5 2,4 89,0 3,3 78,5 2,4 85,7 4,1 100,4 9,0 92,6 1,3 112,7 28,5 92,6 1,8 92,3 1,3 88,7 3,3 94,0 4,8 3,5 13,6 92,9 2,4 95,8 1,3
TR 50 g.L-1 Moyenne CV 75,1 3,5 85,9 2,2 85,5 1,6 85,8 1,1 85,6 1,4 83,7 1,2 84,4 2,7 79,5 2,8 84,5 2,1 84,9 3,1 85,4 1,9 87,1 2,0 88,4 2,1 85,4 2,9 89,5 1,8 87,0 4,1 88,9 1,7 85,3 2,2 84,3 2,2 86,6 2,3 88,3 2,1 85,4 3,8 80,2 3,0 88,3 3,7 78,4 4,3 80,6 2,9 84,9 1,8 96,3 3,9 85,1 2,2 83,9 0,8 71,0 4,7 85,1 2,0 90,6 4,1 90,9 2,2 86,6 2,5 85,2 2,5 82,8 2,0 / / 85,5 3,5 85,9 1,4 83,5 0,7 96,8 3,3 88,1 2,4 85,5 1,6 87,8 1,7 86,9 2,9 88,5 2,5 87,0 1,1 84,9 1,8 / / 85,0 2,6 84,4 2,1 86,6 4,4 85,7 2,2 88,3 2,2 87,6 2,6 87,5 3,2 90,7 1,7 87,4 4,6 88,6 17,8 91,2 0,9 101,8 60,0 89,6 2,2 90,3 1,0 87,9 1,2 111,2 11,2 14,5 9,9 86,9 2,0 87,5 1,3
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
203
Pesticide Fludioxonil Fluroxypyr Haloxyfop-p Hexaflumuron Ioxynil Mcpa Mecoprop Mesotrione Oryzaline Quizalofop Teflubenzuron Triclopyr Triflumuron
Limite de Quantification (g.L-1) Dilution Evaporation 25 5 50 10 10 5 5 1 1 1 25 5 10 5 50 10 10 5 25 5 10 1 25 5 5 1
Technique approprie Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Dilution/Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation Evaporation
TR 10 g.L-1 Moyenne CV 120,8 55,8 87,6 8,9 86,4 3,4 94,5 1,3 91,6 3,4 88,5 3,3 92,6 1,4 99,0 8,1 81,1 3,3 100,9 7,8 90,8 1,4 87,2 7,1 99,1 2,7
TR 50 g.L-1 Moyenne CV 207,7 57,2 87,1 1,9 87,5 1,4 88,0 2,2 89,9 10,6 90,3 1,1 88,5 0,6 84,1 1,4 74,8 8,6 96,6 5,4 88,0 0,6 87,2 5,3 88,0 4,5
Tableau 46.
Rsultats de lanalyse de lhuile essentielle de citron exposant les LOQs obtenues avec les mthodes de dilution
et dvaporation ainsi que les TRs et CVs en % (n=5) issus des surcharges de lhuile essentielle 10 et 50 g.L-1
Les TRs et CVs obtenus dans lhuile essentielle de citron sont trs satisfaisants. A lexception des molcules prsentes dans le Tableau 47, les substances actives admettent des TRs compris entre 70 et 120 %. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
TR 10 g.L-1 Pesticide Carboxin Cycloxydime Cyromazine Dichlorvos Dithianon Thiophanate methyl LOQdilution (g.L-1) 1 5 10 10 10 25 Tableau 47. LOQvaporation (g.L-1) 1 5 5 5 10 ND Substances actives admettant un TR infrieur 70 % Moyenne (%) 65,1 68,2 61,7 68,8 3,5 CV (%) 2,9 4,8 4,4 6,2 13,6 / TR 50 g.L-1 Moyenne (%) 63,0 64,8 64,6 59,8 14,5 CV (%) 6,5 6,5 8,9 9,6 9,9
Bien que prsentant des TRs infrieurs 70 %, les quatre premires substances actives du Tableau 47 sont rcupres correctement, hauteur de 60 70 %. De plus, elles admettent des CVs trs satisfaisants puisquinfrieurs 10 %. Au vu de ces rsultats, la quantification de ces composs peut donc tre assure, dautant que les LOQsvaporation sont infrieures ou gales aux LOQsdilution. II.2.2. Cas des molcules de dithianon, bromoxynil et fludioxonil Le dithianon admet quant lui un TR beaucoup plus faible, entre 3 et 15 % avec des CVs de lordre de 10 %. La diffrence de TR et la variabilit des rsultats des essais 10 et 50 g.L-1 peuvent sexpliquer, en partie, par une dtection du pic la limite de la fentre de dtection du sSRM. Cependant, malgr ce faible rendement, le dithianon est dtect une concentration de 10 g.L-1. Par consquent, si une quantification prcise est ncessaire, elle pourra toujours tre ralise lors dune seconde analyse en utilisant la simple dilution comme mthode de prparation.
204
Les substances actives bromoxynil et fludioxonil prsentent des CVs trs levs ( > 20 %). Ces rsultats ne sont pas dus une mauvaise rptabilit de la manipulation mais, tout comme dans le cas du dithianon, un mauvais calage de la fentre de dtection. II.2.3. Cas du thiophanate-mthyle et de lamitraz Concernant le thiophanate-mthyle, lvaporation sous azote de lhuile essentielle conduit, comme le laissait supposer les essais prliminaires, sa dgradation en carbendazime. En effet, la carbendazime, bien qutant une susbtance active, est galement un mtabolite du bnomyl et du thiophanate-mthyle.124 Pour cette raison, elle na pas t incluse dans le mlange de surcharge, de mme que le bnomyl, pour tudier la dgradation du thiophanatemthyle. Toutefois, cette dgradation semble tre reproductible et linaire en fonction de la concentration (Figure 89). tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Carbendazime
250000
200000 CV = 2.8%
Aire du pic
150000
CV = 2.9%
100000
y = 4589.8x + 2379.6 R = 1
50000
0 0 10 20 30 40 50 60
Figure 89.
Droite talon de la carbendazime reprsentative de la dgradation reproductible du thiophanate mthyl
Mme si la droite talon nest compose que de quatre points, la linarit de la gamme est clairement mise en vidence, de mme que la rptabilit des aires pour des TRs de 10 g.L-1 (CV = 2,9 %) et 50 g.L-1 (CV = 2,8 %). La dtection de la molcule de carbendazime aprs une vaporation sous azote pourrait donc ncessiter une seconde analyse par simple dilution pour dterminer lorigine de la carbendazime : carbendazime, benomyl ou thiophanatemthyle. Les coefficients de variations, calculs sur la base des cinq rptats raliss pour les surcharges 10 et 50 g.L-1, sont tous infrieurs 20 %. A 50 g.L-1, 90 % des substances actives admettent un CV < 5 %. Seuls les rsultats de la molcule damitraz prsentent une variabilit importante.
TR 10 g.L-1 Pesticide Amitraz LOQdilution (g.L-1) 5 LOQvaporation (g.L-1) 5 Moyenne (%) 89,0 CV (%) 24,5 TR 50 g.L-1 Moyenne (%) 33,9 CV (%) 30,2
Tableau 48.
TRs et CVs (n=5) de lamitraz
205
Les donnes du Tableau 48 sexpliquent par une dgradation de lamitraz au cours des injections (Tableau 49).
TR 5 g.L-1 22100 GM 10 g.L-1 26100 TR1 30600 TR 10 g.L-1 TR2 TR3 TR4 27100 22300 19900 TR 50 g.L-1 TR2 TR3 TR4 37400 31700 28200 TR5 16300
TR 25 g.L-1 28100 Tableau 49.
GM 50 g.L-1 98900
TR1 48400
TR5 21700
Evolution de laire du pic chromatographique de lamitraz au cours des injections
La diminution de laire des pics chromatographiques de lamitraz est aisment remarquable pour les cinq TRs raliss 10 et 50 g.L-1. En effet, un facteur environ gal 2 est observ entre laire du premier TR inject et le cinquime. Cette dgradation sexplique par une sensibilit importante de lamitraz au solvant, et notamment lacide, comme le montre la cintique de dgradation de lamitraz ralise 60 C dans cinq solvants : MeOH, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 MeOH 1 %, MeOH/Eau, MeOH/Eau 1 % et ACN.
Amitraz
60000
MeOH eau
50000
MeOH-Eau 1%
MeOH
MeOH 1%
ACN
Aire du pic
40000
30000
20000
10000
0 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Temps en minutes
Figure 90.
Courbes de cintiques de dgradation de lamitraz dans diffrents solvants une temprature de 60 C
La Figure 90 montre, dune part, que lajout dacide acclre significativement la dgradation de lamitraz et, dautre part, que le seul solvant capable de conserver correctement cette molcule parmi les cinq tests est lactonitrile. Le MeOH 1 % nest donc assurment pas le solvant le plus adapt lanalyse de lamitraz. Cependant, cest celui qui a dmontr les meilleures proprits de conservation sur lensemble des 244 substances actives testes, lors de ltude des cintiques de dgradation (Annexe 14). En cas de dtection de lamitraz, une quantification peut tre envisage en utilisant lactonitrile comme solvant de dilution. II.2.4. Bilan des limites de quantification Le Tableau 50 prsente une synthse comparative des performances des mthodes de dilution et dvaporation sous azote pour lanalyse de 250 substances actives dans lhuile essentielle de citron.
206
Huile essentielle de citron Limite de quantification LOQ 1 g.L-1 1 < LOQ 5 g.L-1 5 < LOQ 10 g.L-1 10 < LOQ 25 g.L-1 25 < LOQ 50 g.L-1 ND Total Substance actives non incluses Tableau 50. nombre de substances actives dilution
44 95 58 27 8 6 238 19
vaporation
91 93 38 10 2 4 238 19
Limites de quantification des substances actives dans lhuile essentielle de citron en fonction de la mthode de prparation
Daprs le Tableau 50, lvaporation sous azote permet damliorer significativement les LOQs de nombreuses substances actives. Ainsi, le nombre de molcules dtectes une LOQ tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 1 g.L-1 est doubl lorsquest applique lvaporation sous azote. De mme, cette mthode permet la dtection de 222 substances actives une teneur infrieure ou gale 10 g.L-1 contre 197 pour la dilution. Globalement, 111 substances actives admettent une LOQ infrieure avec lvaporation sous azote, 122 conservent la mme LOQ et seulement 2 montrent une augmentation (Annexe 15). Il sagit du thiophanate-mthyle, dont la cause a dj t aborde, et de la propargite (Tableau 51).
Sample Name: "Dilu 1 ppb" Sample ID: "" File: "Citron dilution esi+.wiff" Peak Name: "propargite -1" Mass(es): "368.1/231.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 12/10/2010 Acq. Time: 10:10:36 PM
10 g.L-1
19.78
7500
Sample Name: "Dilu 2.5 ppb" Sample ID: "" File: "Citron dilution esi+.wiff" Peak Name: "propargite -1" Mass(es): "368.1/231.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 12/10/2010 Acq. Time: 10:38:42 PM
25 g.L-1
19.85
1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4
7000
6500
6000
5500
5000
19.53
4500
1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0
4000
Dilution
3500
3000
2500
2000
1500
20.11
19.59
3000.0 2000.0
1000
19.94
20.18
500
19.41
1000.0 0.0
Sample Name: "Evapo TR 10 ppb 1" Sample ID: "" File: "Citron evaporation esi+.wiff" Peak Name: "propargite -1" Mass(es): "368.1/231.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 12/11/2010 Acq. Time: 1:54:44 AM
0 17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8 Time, m in
19.84
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
2.2e4 2.1e4 2.0e4
Sample Name: "Evapo 25 ppb" Sample ID: "" File: "Citron evaporation esi+.wiff" Peak Name: "propargite -1" Mass(es): "368.1/231.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 11 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 12/11/2010 Acq. Time: 4:14:46 AM
21.6
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8 20.0 Time, min

19.85
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
21.8
5.0e4 4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4
19.64
1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4
1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0

19.99
3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4
Evaporation
20.18
1.8e4 1.6e4
19.66
7000.0
19.41
6000.0 5000.0 4000.0
1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0

20.21 19.41 20.01
3000.0 2000.0 1000.0 0.0 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 Time, m in 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8
6000.0 4000.0 2000.0 0.0 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2
19.4
19.6
19.8 20.0 Tim m e, in
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
21.4
21.6
21.8
Tableau 51.
Chromatogrammes de la propargite obtenus pour une huile essentielle de citron surcharge 10 et 25 g.L-1 et prpares par dilution et vaporation sous azote
Comme le montre les chromatogrammes du Tableau 51, laugmentation de la LOQ de la propargite est due une concentration des interfrents de la matrice.
207
II.3 Lhuile essentielle de cyprs II.3.1. Rsultats et discussion Lensemble des rsultats concernant lhuile essentielle de cyprs sont exposs dans lAnnexe 16. Comme dans lhuile essentielle de citron, les taux de rcuprations des substances actives dans lhuile esssentielle de cyprs sont trs majoritairement compris en 70 et 120 %. Cependant, un nombre lgrement plus important de pesticides admettent des TRs < 70 % (Tableau 52).
TR 10 g.L-1 Pesticide Bifenazate Carbofuran Carboxin* Clofentezine Cycloxydime* Dichlorvos* Disulfoton Fluazinam Sethoxydim Thiophanate methyl* LOQdilution (g.L-1) 5 5 10 5 5 25 25 5 10 10 Tableau 52. LOQvaporation (g.L-1) 5 1 10 25 5 10 10 1 10 25 Moyenne (%) 15,0 36,4 72,2 / 68,2 70,9 63,5 66,1 69,2 / CV (%) 5,9 6,4 2,3 / 6,8 6,9 10,3 8,4 2,7 / TR 50 g.L-1 Moyenne (%) 17,4 39,4 67,5 13,1 66,4 62,7 63,5 60,6 70,5 7,8 CV (%) 4,9 1,8 1,5 15,5 2,1 2,5 7,7 5,7 2,9 8,3
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
*Substance active admettant un TR < 70% dans lhuile essentielle de citron
Substances actives admettant des TR < 70%
En plus de quatre substances actives (carboxin, cycloxidime, dichlorvos, thiophanatemthyle) qui admettent dj des TRs infrieure 70 % dans lhuile essentielle citron, les TRs de six pesticides supplmentaires sont souligner dans lhuile essentielle de cyprs. Trois dentre eux (bifnazate, carbofuran, clofentzine) prsentent, notamment, des TRs < 50 %. Cependant, les CVs de tous ces composs demeurent infrieurs 10 % lexception de la clofentzine (15,5 %). Pour le reste des composs, une nouvelle fois lexception de lamitraz, les CVs sont tous infrieurs 20 % et trs majoritairement infrieurs 5 % (environ 90 % des CVs). II.3.2. Bilan des limites de quantification Le Tableau 53 prsente une synthse comparative des performances des mthodes de dilution et dvaporation sous azote pour lanalyse de 250 substances actives dans lhuile essentielle de cyprs.
208
Huile essentielle de cyprs nombre de substances actives Limite de quantification dilution vaporation 36 78 LOQ 1 g.L-1 88 100 1 < LOQ 5 g.L-1 73 52 5 < LOQ 10 g.L-1 34 10 10 < LOQ 25 g.L-1 -1 13 8 25 < LOQ 50 g.L 7 3 ND 251 251 total 6 6 Substance actives non incluses Tableau 53. Limites de quantification des substances actives dans lHE de cyprs en fonction de la mthode de prparation
Les rsultats du Tableau 53, obtenus pour lhuile essentielle de cyprs, sont relativement similaires ceux obtenus pour le citron. C'est--dire que, dun point de vue gnral, lvaporation sous azote permet damliorer significativement les LOQs, et donc la dtection tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 dun nombre important de molcules. Ainsi 230 substances actives sont dtectes une teneur infrieure ou gale 10 g.L-1 avec lvaporation, contre 197 pour la dilution. Globalement, 114 substances actives admettent une LOQ infrieure avec lvaporation sous azote, 128 conservent la mme LOQ et seulement 2 montrent une augmentation (Annexe 16). Il sagit du thiophanate-mthyle et de la clofentzine qui se caractrisent par des TRs faibles, respectivement de 13,1 % et 7,8 %. II.4 Lhuile essentielle de lavandin II.4.1. Rsultats et discussion Lensemble des rsultats concernant lhuile essentielle de lavandin sont exposs dans lAnnexe 17. Contrairement aux huiles essentielles de citron et cyprs, les taux de rcupration obtenus pour lhuile essentielle de lavandin sont plus problmatiques, avec 45 substances actives prsentant des TR infrieurs 70 %. Parmi elles, une dizaine ne sont plus dtectes (Tableau 54).
Substance active 2,4D Carboxin Clofentezine Cycloxydime Disulfoton Dithianon MCPA Quinoclamine Sthoxydim Thiophanate mthyl Tableau 54. LOQdilution (g.L-1) 25 1 10 5 50 25 10 50 10 10 LOQvaporation (g.L-1) ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
Substances actives non dtectes avec la mthode dvaporation sous azote applique lhuile essentielle de lavandin
209
Les faibles taux de rcupration, reports dans le Tableau 54, sexpliquent par la dgradation et/ou lvaporation des substances actives dues la temprature de chauffage relativement leve ncessaire lvaporation de lhuile essentielle de lavandin (T C = 85 C). Les autres substances actives admettent des TRs et CVs satisfaisants, respectivement entre 70 et 120 %, et infrieurs 20 %. Une lgre augmentation gnrale des CVs est toutefois note puisque seulement 75 % admettent un CVs < 5 % contre 90 % pour les deux huiles essentielles prcdentes. II.4.2. Bilan des limites de quantification Le Tableau 55 prsente une synthse comparative des performances des mthodes de dilution et dvaporation sous azote pour lanalyse de 250 substances actives dans lhuile essentielle de lavandin. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Huile essentielle de lavandin nombre de substances actives Limite de quantification dilution vaporation 28 49 LOQ 1 g.L-1 70 82 1 < LOQ 5 g.L-1 89 77 5 < LOQ 10 g.L-1 37 18 10 < LOQ 25 g.L-1 17 12 25 < LOQ 50 g.L-1 9 12 ND 250 250 total 7 7 Substance actives non incluses Tableau 55. Limites de quantification des substances actives dans lhuile essentielle de lavandin en fonction de la mthode de prparation
Le bilan des LOQs concernant lhuile essentielle de lavandin est plus mitig que pour les deux huiles essentielles prcdentes. En effet, si globalement une amlioration des LOQs est constate avec lutilisation de lvaporation sous azote, le nombre de substances actives non dtectes augmentent paralllement. Nanmoins, lvaporation sous azote permet la dtection de 208 substances actives une teneur infrieure ou gale 10 g.L-1, contre 187 pour la dilution. De faon plus spcifique, 92 substances actives observent une diminution de leur LOQ avec lvaporation sous azote, 139 conservent une LOQ sensiblement gale celle obtenue avec la dilution, et 18 admettent une augmentation de leur LOQ pouvant conduire une non dtection pour une dizaine dentre elles.
210
II.5 Lhuile essentielle de mlisse II.5.1. Rsultats et discussion Lensemble des rsultats concernant lhuile essentielle de mlisse sont exposs dans lAnnexe 18. Lvaporation sous azote de lhuile essentielle de mlisse entrane la dgradation et/ou lvaporation partielle ou totale de prs de la moiti des substances actives (116/250). La temprature leve (90-95 C) ncessaire lvaporation de lhuile essentielle engendre des taux de rcupration globalement infrieurs ceux observs pour les trois huiles essentielles prcdentes. De mme que dans le cas de lhuile essentielle de lavandin, certains pesticides ne sont plus dtects (Tableau 56).
Substance active Butraline Clofentezine* Dichlorvos Pencycuron Dithianon* Fluazinam Mesotrione Tableau 56. LOQdilution (g.L-1) 10 ND 50 5 ND 5 50 LOQvaporation (g.L-1) ND ND ND ND ND ND ND
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
*dtect dans les points de gamme matrice
Substances actives non dtectes cause de lvaporation sous azote
En plus des substances actives dtailles dans le Tableau 56, une quinzaine dautres admettent des TRs infrieurs 20 % qui sont gnralement associes de CVs levs suprieurs 10 voire 20 %. Ces donnes ne permettent pas denvisager une quantification convenable pour ces composs. Nanmoins, le reste des pesticides (environ la moiti) se caractrisent par des TRs et CVs satisfaisants garant dune quantification approprie. II.5.2. Bilan des limites de quantification Le Tableau 57 prsente une synthse comparative des performances des mthodes de dilution et dvaporation sous azote pour lanalyse de 250 substances actives dans lhuile essentielle de mlisse.
Huile essentielle de mlisse nombre de substances actives Limite de quantification dilution vaporation 32 59 LOQ 1 g.L-1 85 72 1 < LOQ 5 g.L-1 57 60 5 < LOQ 10 g.L-1 28 16 10 < LOQ 25 g.L-1 16 15 25 < LOQ 50 g.L-1 23 19 ND 241 241 total 16 16 Substance actives non incluses Tableau 57. Limites de quantification des substances actives dans lHE de mlisse en fonction de la mthode de prparation
211
Lamlioration des limites de quantification par la mise en place dune tape dvaporation sous azote est, dans le cadre de lhuile essentielle de mlisse, nettement moins probante que pour les huiles essentielles prcdentes. Sans tenir compte des problmes de quantification dus aux faibles TRs et aux CVs levs, 191 substances actives admettent une LOQ infrieure ou gale 10 g.L-1 avec lvaporation sous azote, contre 174 pour la dilution. Chacune des deux techniques prsente des avantages et inconvnients en termes de dtection, selon la molcule concerne. Par exemple, lvaporation sous azote est capable de dtecter le chlorpropham et le disulfoton une LOQ de 25 g.L-1, quand la dilution ne le permet pas 50 g.L-1. Inversement la dilution autorise une quantification du pencyuron et du fluazinam des teneurs de lordre de 5 g.L-1, alors que lvaporation sous azote ne permet pas leur dtection, du moins des teneurs infrieures ou gales 50 g.L-1. De faon plus spcifique, 75 substances actives observent une diminution de leur LOQ tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 avec lvaporation sous azote, 132 conservent une LOQ sensiblement gale celle obtenue avec la dilution et 21 admettent une augmentation de leur LOQ pouvant conduire une non dtection pour certaines dentre elles (Annexe 18). II.6 Vrification de la linarit de la rponse En plus de caractriser la mthode dvaporation sous azote en termes de rptabilit, lobjectif de ces essais tait de comparer la sensibilit de cette mthode avec la dilution en dterminant les LOQs de chaque substance active dans quatre huiles essentielles traites avec les deux mthodes. Avant de discuter des avantages et inconvnients de la mise en pratique de lvaporation sous azote, il a fallu sassurer de sa linarit en fonction de la concentration des substances actives. Les quatre graphiques de la Figure 91 reprsentent les droites talons ralises partir des TRs obtenues dans les quatre huiles essentielles pour quatre substances actives.
Fosthiazate
3000000 citron 2500000
y = 50562x + 2712.9 R = 1 R = 0.999
Acphate
700000 citron 600000 500000
y = 13354x - 1751 R = 0.9971 R = 0.9955
Lavandin y = 26544x + 16094 cyprs mlisse

y = 36696x + 4163.9 R = 1 y = 39415x + 11271 R = 0.9988
Lavandin y = 10967x + 20053 cyprs

y = 9081x + 15402 R = 0.9991
R = 0.9943
2000000
Aire du pic
Aire du pic
400000 300000 200000
mlisse y = 7561.2x + 27122
1500000
1000000
500000
100000 0 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Concentration en
g.L-1
212
Bnalaxyl
1400000 citron 1200000 1000000
y = 7298.3x + 1129.4 R = 0.9997
Malathion
450000 400000 350000 300000 citron
y = 7416.1x + 16012 R = 0.9996
R = 0.999
Lavandin y = 15318x + 1846.2

R = 0.9998
Lavandin y = 3789.8x + 1929.6 cyprs mlisse

y = 6566.9x + 243.88 R = 0.9997 y = 5971x - 1048 R = 0.9988
cyprs
y = 23623x + 3444.1 R = 0.9997
Aire du pic
800000 600000 400000
mlisse y = 21618x + 3624.8

R = 0.9988
Aire du pic
250000 200000 150000 100000
200000 0 0 10 20 30 40 50 60
50000 0 0 10 20 30 40 50 60
Concentration en g.L-1
Figure 91.
Droites talons issues de la mthode vaporation sous azote de quatre substances actives en fonction de lhuile essentielle
Les droites talons de la Figure 91 dmontrent une trs bonne linarit (
) de la
rponse LC-MS/MS en fonction de la concentration. Ces graphiques mettent galement en vidence des effets matrice plus ou moins importants selon la substance active et la nature de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 lhuile essentielle considres. Lhuile essentielle de citron occasionne, par exemple, leffet matrice le plus lev des quatre huiles essentielles sur le bnalaxyl et le moins lev sur le fosthiazate. II.7 Conclusion Au vu de lensemble des donnes recueillies au cours de cette exprience, les huiles essentielles peuvent tre classes en deux catgories, en fonction de leur temprature dvaporation. Dun cot se trouvent les huiles essentielles de citron et de cyprs qui se caractrisent par une temprature dvaporation infrieure 45 C et, dun autre cot, les huiles essentielles de lavandin et de mlisse qui admettent une temprature suprieure. Concernant les huiles essentielles de citron et cyprs, la mise en place dune vaporation sous azote assiste par chauffage semble tout--fait adapte et prfrable la dilution. En effet, les taux de rcupration, de mme que la rptabilit exprime en fonction du CV sont satisfaisants. De plus, comparer la simple dilution, lvaporation sous azote permet de diminuer significativement les LOQs de plus dune centaine de molcules. Lapplication de lvaporation sous azote aux huiles essentielles de lavandin et mlisse semble plus dlicate. La temprature leve requise pour vaporer ces huiles essentielle entrane probablement la dgradation ou lvaporation de nombreuses substances actives. Ce phnomne, aux consquences multiples, est dautant plus prononc dans le cas de lhuile essentielle de mlisse du fait dune temprature dvaporation (90-95 C) suprieure celle du lavandin (80 C). La diminution des taux de rcupration, parfois critique (TR < 20 %), et laugmentation des CVs, compliquent la quantification dun certain nombre de molcules.
213
Nanmoins, la comparaison des LOQs avec la dilution montre que lvaporation sous azote prsente un intrt certain, notamment en amliorant la sensibilit dun bon nombre de composs en fonction de lhuile essentielle considre. En fait, si lvaporation sous azote ne peut clairement pas tre applique pour ce type dhuile essentielle en temps que mthode unique, elle se rvle tre complmentaire de la dilution. Les deux mthodes de prparation ntant pas trs coteuses en temps, il est ds lors envisageable danalyser un chantillon dhuile essentielle selon ces protocoles afin dassurer une dtection optimale de lensemble des substances actives.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
214
B) Dveloppement dune mthode de confirmation en mode SRM-EPI

Lanalyse de pesticides avec un spectromtre de masse de type triple quadriple est gnralement ralise par lacquisition de deux transitions SRM, qualifies respectivement de transition de quantification et de confirmation. Lorsquun pesticide est dtect dans un chantillon, la transition de quantification est utilise pour dterminer sa concentration, mais le rsultat est dclar positif si et seulement si la transition de confirmation est galement dtecte. Le ratio entre les intensits des deux transitions peut faire lobjet dun critre supplmentaire de validation. Lun des inconvnients de ce procd provient de la diffrence de sensibilit des transitions SRM qui rend la confirmation des positifs dlicate lorsquil sagit tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 de faibles concentrations. Quelques pesticides ne prsentent dailleurs quun chemin de fragmentation qui conduit une transition SRM unique, cest le cas notamment de lisoxaflutol, du MCPA et du Mcoprop. De plus, dans le cas des huiles essentielles, qui ne subissent pas de purification proprement dite, certaines transitions sont sujettent une augmentation du bruit de fond causant une diminution de leur sensibilit (exemple de lacphate : Tableau 58).
Sample Name: "1 ppb" Sample ID: "" File: "gamme solvant.wiff" Peak Name: "acephate -1" Mass(es): "201.1/143.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.991 ng/mL Acq. Date: 12/2/2009 Acq. Time: 8:48:14 PM
SRM 1 (transition de quantification)

1.87
3400 3200 3000 2800 2600 2400
Sample Name: "1 ppb" Sample ID: "" File: "gamme solvant.wiff" Peak Name: "acephate -2" Mass(es): "201.1/184.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.936 ng/mL Acq. Date: 12/2/2009 Acq. Time: 8:48:14 PM
SRM 2 (transition de qualification)

1.86
Ratio SRM 1/SRM 2
3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400
Aire = 33800 S/N = 132
Aire = 30400 S/N = 20
2200
2200
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Solvant
1,11
1.62
Sample Name: "1 ppb lav" Sample ID: "" File: "gamme lavandin.wiff" Peak Name: "acephate -1" Mass(es): "201.1/143.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.847 ng/mL Acq. Date: 12/3/2009 Acq. Time: 1:00:17 AM
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0 Tim m e, in
1.87
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
Sample Name: "1 ppb lav" Sample ID: "" File: "gamme lavandin.wiff" Peak Name: "acephate -2" Mass(es): "201.1/184.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.810 ng/mL Acq. Date: 12/3/2009 Acq. Time: 1:00:17 AM
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 2.0 Time, m in

1.86
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600
3200
3000
2800
2600
2400
Aire = 30900 S/N = 124
Aire = 28400 S/N = 5

2.12
2200
2400
2000
2200 2000 1800 1600 1400 1200

1.61
Lavandin
1800
1600
1400
1,09
1200
1000
1000
800
800
600
600
400
2.32
400 200
200
0
Sample Name: "1 ppb ctr" Sample ID: "" File: "gamme citron.wiff" Peak Name: "acephate -1" Mass(es): "201.1/143.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.996 ng/mL Acq. Date: 12/3/2009 Acq. Time: 10:20:20 AM
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0 Time, m in
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
0
Sample Name: "1 ppb ctr" Sample ID: "" File: "gamme citron.wiff" Peak Name: "acephate -2" Mass(es): "201.1/184.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Standard Concentration: 1.00 ng/mL Calculated Conc: 0.959 ng/mL Acq. Date: 12/3/2009 Acq. Time: 10:20:20 AM
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 2.0 Time, m in

1.85
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
2600 2500 2400 2300 2200 2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200
1.49
1.86
3100 3000 2900 2800 2700 2600 2500 2400 2300 2200 2100 2000
Aire = 27100 S/N = 80
Aire = 25100 S/N = 8

2.30
1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300
1.57 2.10
Citron
1,08
2.24
200 100
100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Time, m in 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 2.0 Time, m in
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
Tableau 58.
Evolution des transitions SRM de lacphate en fonction de la matrice une concentration de 10 g/L
Lutilisation dun spectromtre de masse de type QqLIT offre la possibilit de fonctionner en mode EPI qui permet dobtenir le spectre de masse caractristique de lion prcurseur
215
assurant, en thorie, une idenfication plus fiable quune seconde transition. Lintrt de cette technique dans le cadre de la confirmation de la prsence de pesticide a donc t prouv.
I.
Principe et spcificit du mode SRM-EPI

Le principe du mode SRM-EPI consiste employer le mode dacquisition SRM en tant
que scan de surveillance qui va permettre le dclenchement dun scan EPI en fonction de critres IDA (Information Dependant Acquisition), le critre de base tant lintensit de la transition SRM. Ainsi, lorsquune transition SRM dpasse un seuil dintensit dfini, le spectromtre de masse passe du mode SRM au mode EPI afin de raliser un spectre de masse de lion prcurseur de la transition, avant de revenir au scan de surveillance SRM (Figure 92).
Scan de surveillance SRM
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Seuil dintensit (critres IDA)
Exclusion dynamique
Scan dpendant EPI
Figure 92.
Principe de fonctionnement du mode SRM-EPI
Idalement, la combinaison de ces deux modes dacquisition devrait permettre de quantifier et confirmer les pesticides au cours dune analyse unique. Cependant la mise en place de ce procd dans le cadre dune analyse multi-rsidus comportant un nombre consquent de molcules (environ 250) se rvle assez dlicate. La principale difficult tient au fait que, contrairement au mode SRM o chaque pesticide est analys selon des critres optimiss, les paramtres de dtection du mode EPI sont communs tous les composs. Lacquisition en mode EPI ncessite donc de dfinir une tension de dclusterisation DP unique et donc commune tous les composs. Une fois lion prcurseur slectionn en Q1 de la mme manire quen SRM, il va subir une fragmentation de type CID dans la cellule de collision q2. Lintroduction du paramtre CES (Collision Energy Spread) permet de raliser un spectre de masse de lion prcurseur rsultant de la somme des donnes obtenues trois niveaux dnergies de collision diffrents. Ce procd permet dobtenir des spectres de masse
216
plus riches en fragments. Ces derniers pntrent ensuite dans la trappe dions linaire dont les principaux paramtres sont le temps de remplissage de la trappe (fill time en ms) et la vitesse dacquisition (scan rate en Da/s) qui vont jouer un rle primordial sur la sensibilit et la rsolution du spectre de masse. Lensemble des paramtres doivent tre dfinis de manire tre applicable un maximum de pesticides. Les principales difficults poses par le mode SRM-EPI consistent : obtenir un spectre de masse au bon moment, c'est--dire vers le sommet du pic chromatographique ; obtenir des spectres de masse rptables ; en un allongement du temps de cycle ; en une sensibilit infrieure au mode SRM. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Il apparat donc compliqu de satisfaire tous ces critres la fois, pour disposer dune analyse qualitative qui permette dobtenir tous les spectres dintrt tout en conservant une analyse quantitative dune sensibilit quivalente au sSRM. Lapproche envisage consiste effectuer une premire injection en mode sSRM avec une transition SRM unique pour chaque pesticide, de reprer les positifs ventuels, puis de construire une mthode SRM-EPI spcifique, avec seulement les transitions SRM relatifs aux pesticides dtects (Figure 93).
Screening sSRM avec 1 transition
Reprer les positifs ventuels
Construction dune mthode SRM-EPI spcifique
Amliorer la rptabilit
Obtenir le spectre au bon moment
Amliorer la sensibilit
Somme de 2 spectres EPI
tR des pesticides
Liste dinclusion
Q0 trapping
Seuil de dtection
Figure 93.
Approche SRM-EPI envisage pour la confirmation des positifs
217
II. Optimisation des conditions de dtection en mode SRM-EPI

En considrant lapproche nonce prcdemment, le nombre de transitions SRM scannes dans la mthode SRM-EPI est considrablement rduit. Le spectromtre de masse dispose donc dun temps nettement suprieur pour effectuer les diffrentes oprations. Il est ds lors possible doptimiser la qualit et la sensibilit des spectres de masse. II.1 Dtermination de la valeur globale optimum de la DP La DP est lun des paramtres les plus influants sur la sensibilit. Or, contrairement au mode SRM o elle est spcifie pour chaque compos, le passage en mode EPI ncessite de dterminer une DP commune. Il est donc vident que certaines molcules subiront une perte de sensibilit non ngligeable. Les DP des 233 substances actives analyses en ESI+ se tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 rpartissent comme suit :
Nombre de s.a. en fonction de la DP 90 80 70
nombre de s.a.
60
50 40 30 20
10
0 DP20 20<DP40 40<DP60
DP (V)
60<DP80
>80
Figure 94.
Rpartition des DP des 233 substances actives analyses en ESI+
Les DP stendent de 1 V pour le bitertanol 111 V pour le fenthion sulfone avec une trs grande majorit des DP comprises entre 40 et 80V. Au vu du graphique de la Figure 94, une DP commune de 40 V semble tre un bon compromis. II.2 Les crittres IDA Les critres IDA permettent de faire le lien entre le mode SRM et le mode EPI, c'est-dire quil dtermine quel moment le spectromtre de masse bascule du mode SRM au mode EPI. Il est ainsi possible de dfinir deux niveaux de critres dont le premier est illustr par la Figure 95.
218
Pic sur lequel sera effectu la 2me exprience (EPI)
Seuil dintensit Paramtres dexclusion
Figure 95.
Illustration du premier niveau de critre IDA
Ces critres permettent de dterminer sur quel(s) ion(s) sera(ont) ralise(s) l(es)exprience(s) EPI en fonction de lintensit des transitions au moment t. Lapplication tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 du Dynamic Background Substract (DBS) permet de ne slectionner que la(es) transition(s) dont l(es) intensit(s) est(sont) en train daugmenter. Cette option vite deffectuer lEPI constamment sur la mme transition. En effet, dans le cas o une transition serait trs intense, le spectromtre de masse neffecturait pas lEPI sur une autre transition dont lintensit serait plus faible. Le second critre est le seuil dintensit des transitions SRM pour lequel lanalyseur doit basculer en mode EPI. Enfin, les derniers paramtres concernent lexclusion dynamique des ions. Ils permettent en effet, aprs avoir effectu un spectre EPI, dexclure ou non un ion pendant une dure dtermine, ou aprs avoir ralis un nombre de spectre dfini. Le second niveau de critre IDA (Figure 96) offre la possibilit dtablir une liste dinclusion ou dexclusion dun certain nombre dions.
m/z de lion tR Fentre de dtection
Seuil dintensit
Figure 96.
Illustration du second niveau de critres IDA
219
La liste dinclusion permet de sassurer quune exprience en mode EPI sera bien effectue pour tous les ions composant cette liste, si la transition SRM correspondante dpasse le nouveau seuil dintensit (Figure 96 : intensit = 100 coups) pendant la fentre de temps, dfinie par le temps de rtention de lanalyte et la largeur de la fentre de dtection. Dans le cadre de notre tude, lobjectif est dtre certain dobtenir un ou plusieurs spectres EPI pour chaque pesticide prsum positif. Par consquent, il a t dcid dinclure lensemble des molcules, pralablement identifies par une premire analyse LC-ESI/sSRM, dans la liste dinclusion avec leur temps de rtention, une fentre de dtection de 90 s et un seuil de dclenchement relativement bas (100 coups). Les critres IDA de premier niveau sont dfinis par un seuil de dclenchement trs haut (10 000 coups) de manire ce que le spectromtre de masse ne perde pas du temps raliser tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 un spectre EPI sur un ion qui ne nous interesse pas. Il a t dcid de ne pas exclure les ions pour avoir un nombre de spectre important sur la dure du pic chromatographique et ainsi tre certain den avoir un vers le sommet du pic. II.3 Optimisation du temps daccumulation des ions dans Q0 Lutilisation dun guide dions Q0 pour laccumulation des ions pendant ltape de scan de la trappe dions amliore le duty cycle qui peut tre exprim selon lquation (92).256
duty cycle
ion trap fill time 100 % total cycle time
(92)
Le principal avantage de la pr-accumulation, prablablement lanalyse de masse, est que Q0 peut stocker les ions provenant de la source pendant que la LIT procde lanalyse de masse.256 Cela permet daccrotre le temps effectif de travail sans pour autant rallonger le temps de cycle total. Pour valuer limpact du temps de remplissage de la LIT sur les spectres de masse, un mlange de 25 pesticides, rprsentatif dune large gamme de masse, une concentration de 5 g.L-1 a t inject en mode SRM-EPI avec cinq valeurs de fill time : 10, 25, 50, 75 et 100 ms. Comme le montre le Tableau 59, le temps de remplissage na pas une influence significative sur lintensit des pics chromatographiques.
220
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Pesticides Flazasulfuron Fluazifop-p-butyl Flucythrinate Flufenacet Flufenoxuron Fluquinconazole Flurochloridone Flusilazol Flutolanil Flutriafol Fonofos Formetanate Fosthiazate Furathiocarb Heptnophos Hexaconazole Hexazinone Hexythiazox Imazalil Imidaclopride Indoxacarbe Iprodione Iprovalicarbe Isofenphos Isoproturon Tableau 59.
10 ms 5.02E+04 4.75E+05 4.45E+03 2.51E+05 4.04E+04 1.24E+04 8.04E+03 2.43E+04 2.58E+05 1.89E+04 1.51E+04 2.52E+05 5.42E+05 3.85E+05 6.74E+04 4.96E+04 7.83E+04 9.07E+04 1.09E+04 1.51E+04 2.73E+04 1.19E+03 4.19E+05 3.64E+05 2.36E+05
Evolution de lintensit des pics chromatographiques en fonction du fill time (ms)
En revanche, limpact sur lallure des spectres de masse est certain mais fonction du compos tudi (flutolanil : Figure 97 et hexaconazole : Figure 98).
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (10): Exp 2, 12.115 m fromSam 2 (10 ms) of Essai Q0 fill tim in ple e.wiff (Turbo Spray) 242.3 Max. 9.3e5 cps.
Flutolanil
9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5

262.2
a) 10 ms
9.7e5 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5
b) 25 ms
262.2
4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 50
4.0e5 3.0e5 2.0e5
173.3 324.2 282.2 130.1 304.4
324.2 111.1 172.9 194.3 282.2 304.3
1.0e5 0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 1.4e6 cps.
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 1.2e6 cps.
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (50): Exp 2, 11.993 m fromSam 4 (50 ms) of Essai Q0 fill tim in ple e.wiff (Turbo Spray) 242.3
Max. 1.1e6 cps.
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (100): Exp 2, 11.997 m fromSam 6 (100 m of Essai Q0 fill tim in ple s) e.wiff (Turbo Spray) 242.3
1.07e6 1.00e6 9.00e5
c) 50 ms
262.2
1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6
d) 75 ms
1.20e6 1.10e6 1.00e6 9.00e5
e) 100 ms
262.3
8.00e5
7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5

173.2 304.3 195.4 282.2 324.1
9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5

324.1 262.2
8.00e5 7.00e5 6.00e5 5.00e5

282.4 324.2
4.00e5 3.00e5
173.2
4.0e5
282.2
3.0e5 2.0e5 1.0e5

110.9 145.1 173.2 217.1 304.3
2.00e5
214.2
1.00e5 0.00 50
111.1
145.4
1.00e5
304.6
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
0.00 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Figure 97.
Spectres EPI du flutolanil en fonction du fill time a) 10 ms b) 25 ms c) 50ms d) 75ms e) 100 ms
Les spectres EPI du flutolanil prsentent une allure similaire, tant au niveau des ions fragments caractristiques que de leur ratio. La seule diffrence notable entre ces spectres est lintensit des ions qui augmente avec la dure de remplissage de la LIT avec, cependant, une possible saturation observe partir de 75 ms. Les intensits des ions obtenus avec un fill
221
time de 100 ms sont en effet du mme ordre que celles observes pour le spectre obtenu avec un fill time de 75 ms. Linfluence du fill time est en revanche plus importante dans le cas de lhexaconazole (Figure 98).
1.00e5 9.00e4 8.00e4

a) 10 ms
2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4

69.8
b) 25 ms
7.00e4 6.00e4 5.00e4 4.00e4 3.00e4 2.00e4 1.00e4 0.00 50
6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 4.0e5 cps.
Max. 1.3e5 cps.
+EPI (314.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (75): Exp 2, 16.913 min fromSample 5 (75 ms) of Essai Q0 fill time.wiff (Turbo Spray) 314.3
Max. 3.7e5 cps.
+EPI (314.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (100): Exp 2, 16.949 m fromSam 6 (100 m of Essai Q0 fill tim in ple s) e.wiff (Turbo Spray) 314.3
1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5

69.7 159.2
c) 50 ms
3.7e5 3.5e5
d) 75 ms
4.0e5 3.5e5
e) 100 ms
3.0e5
3.0e5
2.5e5
9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 50 100 150 200 250 300 350 m Da /z, 400 450 500 550 600
2.5e5 2.0e5 1.5e5

69.7 267.0
2.0e5
1.5e5
69.7
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
1.0e5
125.0 159.2 265.4
1.0e5 5.0e4 0.0 50
159.1
5.0e4
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Figure 98.
Spectres EPI de lhexaconazole en fonction du fill time a) 10 ms b) 25 ms c) 50ms d) 75ms e) 100 ms
En effet, avec un fill time de 10 ms, seul lion fragment de rapport m/z 159 est visible sur le spectre alors que quatre ions (m/z 314, 257, 159, 70) sont observs sur le spectre de masse ralis avec un fill time de 100 ms. Une dure de remplissage de la trappe dions situe entre 75 et 100 ms semble donc tre la meilleure solution. Il faudra, nanmoins, faire attention dventuels phnomnes despace de charge lorsque les spectres seront obtenus des concentrations plus leves. II.4 Optimisation des nergies de collision La combinaison CE/CES permet lacquisition dun spectre de masse cumulant les ions de fragmentation obtenus trois nergies de collision diffrentes. Par exemple, le spectre EPI obtenu pour une CE fixe 35 V et un CES 15 V sera la somme des fragments obtenus pour les trois nergies de collision 20, 35 et 50 V (35 15 V). Lobjectif est de dterminer quelle est la combinaison qui conduit aux spectres de masse les plus fournis.
Un mlange de 25 pesticides, identique au prcdent, a t inject une concentration de 10 g.L-1 avec cinq combinaisons de CE/CES : 35 15 V, 40 15 V, 40 20 V, 45 15 V,
222
45 20 V. Pour tudier limpact de ces paramtres, le formetanate a t choisi comme exemple car cest une molcule de faible poids molculaire qui produit peu dions fragments.
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (50): Exp 2, 1.666 m fromSam 1 (35 15) of Essai CE CES.wiff (Turbo Spray) in ple Max. 2.0e5 cps.
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (40) CES (15) FT (50): Exp 2, 1.642 m fromSam 2 (40 15) of Essai CE CES.wiff (Turbo Spray) in ple 165.2
Max. 2.0e5 cps.
Formetanate
2.0e5 1.8e5 1.6e5
165.2
a) 35 +/- 15 V
222.2
2.0e5 1.8e5 1.6e5
b) 40 +/- 15 V
1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 50
1.4e5
1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 50

120.1
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 2.0e5 cps.
Max. 1.3e5 cps.
Max. 2.0e5 cps.
2.0e5 1.8e5 1.6e5
c) 40 +/- 20 V
1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5
d) 45 +/- 15 V
2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 50
e) 45 +/- 20 V
1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4

103.0 222.1
9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4
6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 50
1.0e4
100 150 200 250 300 350 m Da /z, 400 450 500 550 600
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Figure 99.
Spectre EPI du formetanate en fonction des valeurs de CE/CES a)35 15V b) 40 15V c) 40 20 V d) 45 15 V e) 45 20 V
La Figure 99 montre que les spectres EPI obtenus avec les combinaisons 40 15 V, 45 15 V et 45 20 V ne prsentent pas lion prcurseur de rapport m/z 222. En effet, les spectres de plus basses nergies pour ces combinaisons sont raliss 25, 30 et 25 V respectivement. Lion m/z 222 se fragmente dj de faon importante ces nergies et laddition des deux spectres de plus haute nergie conduit une intensit relative quasiment nulle par rapport aux autres fragments, notamment le m/z 165. La combinaison 40 20 V permet dobtenir un ion caractristique de plus (m/z = 103) que la combinaison 35 15 V.
Pour de nombreuses substances actives, les spectres EPI disposent de plusieurs fragments caractristiques quelle que soit la combinaison. Pour certains composs tel le formetanate, il semblerait que la combinaison 40 20 V soit la plus adapte. II.5 Optimisation de la vitesse dacquisition de la trappe 2D La vitesse dacquisition de la LIT va influer la fois sur la sensilit et la rsolution. Sur le 4000 QTrap, trois vitesses de scans sont proposs : 250, 1000 et 4000 Da/s. La Figure 100 prsente les spectres EPI du flutolanil obtenus pour les vitesses dacquisition 1000 et 4000 Da/s, la vitesse de 250 Da/s na pas t teste car elle imposerait des temps de cycle trop long.
223
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (40) CES (25) FT (100): Exp 2, 11.994 m fromSam 2 (solv 40 25) of nouvelle essai.wiff (Turbo Spray) in ple 324.2
Max. 1.5e6 cps.
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (40) CES (25) FT (100): Exp 2, 11.980 m fromSam 3 (solv 40 25 1000 da) of nouvelle essai.wiff (Turbo Spray... in ple 324.1
Max. 1.9e6 cps.
1.5e6 1.4e6
a)
1.8e6
+EPI (324.10) Charge (+0) CE (40) CES (25) FT (100): Exp 2, 11.994 m fromSam 2 (solv 40 25) of nouvelle essai.wiff (Turbo Spray) in ple 324.2 Max. 1.5e6 cps.
b)
+EPI (324.10) Charge (+0) CE(40) CES(25) FT (100): Exp2, 12.023 m fromSam 3 (solv40 25 1000 da) of nouvelle essai.wiff (Turbo Spray... in ple 324.1 M 2.1e6 cps. ax.
4000 Da/s
1.5e6 1.4e6
1000 Da/s
2.0e6
1.6e6 1.4e6
1.2e6
1.2e6
1.8e6 1.6e6
1.0e6
1.0e6
242.3
1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5
8.0e5
1.2e6 1.0e6 8.0e5

145.0
242.1
6.0e5
0,4Da
8.0e5
4.0e5
0,25 Da
2.0e5
323.6
0.0
6.0e5
262.3
323.5 323.6 323.7 323.8 323.9 324.0 324.1 324.2 324.3 324.4 324.5 324.6 324.7 324.8 m Da /z,
2.0e5
324.5
0.0
323.6
323.7
323.8
323.9
324.0
324.1
6.0e5
4.0e5
324.2 m Da /z,
324.3
324.4
324.5
324.6
324.7
324.8
4.0e5
145.3 282.4 304.3
262.1 173.0
282.1
2.0e5
111.1
173.4 161.2
2.0e5
65.0
304.2 166.1 214.0 187.2
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
0.0 50
110.2
140.1
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Figure 100.
Spectres EPI du flutolanil obtenus avec des vitesses dacquisition de a) 4000 Da/s et b) 1000 Da/s
La rsolution est nettement meilleure lorsque la vitesse dacquisition est plus lente (Figure 100). La largeur mi-hauteur pour lion m/z 324 est effectivement gale 0,25 Da et 0,4 Da pour les vitesses de scan respectives de 1000 et 4000 Da/s, correspondant des rsolutions de tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 1300 et 810. La sensibilit est galement plus leve avec une vitesse de 1000 Da/s, contrairement ce qui tait attendu, car une augmentation de la rsolution est gnralement synonyme de perte de sensibilit. La vitesse dacquisition slectionne pour la suite des expriences est donc 1000 Da/s puisque la rsolution et la sensibilit sont significativement meilleures qu 4000 Da/s. Le seul inconvnient de cette vitesse est quelle engendre un temps de cycle plus long. Nanmoins, cela ne devrait pas tre un problme avec lapproche envisage qui consiste analyser en mode SRM-EPI seulement les pesticides possiblement positifs, leur nombre sera donc assez restreint. De mme que pour la LIT, linfluence de la rsolution de Q1 a t value. II.6 Etude de limpact de la rsolution du filtre quadripolaire Q1 sur la concordance des spectres EPI La slection de lion prcurseur peut tre effectue avec trois niveaux de rsolution unit , high et low qui correspondent respectivement des largeurs mi-hauteur de 0,7 u, 0,5 u et 1 u. La rsolution sur la slection de lion parent peut avoir une importance pour viter les interfrents isobares provenant de la matrice. Afin dvaluer son impact, deux mlanges de 15 pesticides une concentration de 10 g.L-1 ont t prpars : le premier dans le solvant MeOH 1 % et le second dans lhuile essentielle de citron. Les mlanges ont t injects successivement en mode SRM-EPI avec les trois niveaux de rsolution disponibles pour Q1. Les spectres EPI obtenus dans le solvant servent de rfrence.
224
La Figure 101 prsente les spectres EPI du mthabenthiazuron obtenus dans le solvant avec une rsolution unit pour Q1 et dans lhuile essentielle de citron pour les rsolutions low , unit et high .
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 10.339 m fromSam 3 (ctr 10 ppb low 1tr) of MRM EPI reinj.wiff (Turbo Spray), ... in ple 165.0 Max. 4.4e6 cps.
4.4e6 4.0e6 3.5e6
b)
HE Citron : Q1 low
223.1
3.0e6
150.0
2.5e6 2.0e6 1.5e6 1.0e6

98.9
Fit : 94 % RevFit : 52 % purity : 52 %

191.1 204.1 169.0
5.0e5 0.0 50
95.9 91.0 108.9
123.0
159.0 162.9
177.0 209.0
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 1.7e6 cps.
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 10.391 m fromSam 1 (ctr 10 ppb unit 1tr) of MRM EPI reinj.wiff (Turbo Spray), ... in ple
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 10.380 m fromSam 1 ( sol 10 ppb unit 2tr) of MRM EPI.wiff (Turbo Spray), Cen... in ple 165.0 Max. 7.2e6 cps.
7.0e6 6.5e6 6.0e6

150.0
a)
a) Solvant : Q1 unit
1.7e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6
150.0 165.0
c)
HE Citron : Q1 unit Fit : 87 %
222.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
5.5e6
5.0e6 4.5e6 4.0e6 3.5e6 3.0e6 2.5e6 2.0e6

222.0
8.0e5 6.0e5
RevFit : 80 % purity : 76 %
1.5e6 1.0e6 5.0e5 0.0 50

80.0 95.9 122.9 109.0
4.0e5 2.0e5
86.9 96.0 92.0 108.0 164.0 187.0 122.0 140.9 176.0 204.1
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Max. 2.5e6 cps.
+EPI (222.10) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 10.371 m fromSam 2 (ctr 10 ppb high 1tr) of MRM EPI reinj.wiff (Turbo Spray), ... in ple 165.0
2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6
d)
HE Citron : Q1 high Fit : 94 % RevFit : 81 %
222.0
1.6e6
150.0
1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5

80.0 95.8 92.0 120.1 123.1 204.1 169.0 164.0 187.0
purity : 79 %
0.0 50
100
150
200
250
300 350 m Da /z,
400
450
500
550
600
Figure 101.
Spectres EPI du mthabenzthiazuron en fonction de la rsolution de Q1 gauche a) dans le solvant et droite dans lhuile essentielle de citron b) Q1 low c) Q1 unit d) Q1 high
La concordance des spectres EPI obtenus dans lhuile essentielle de citron avec celui du solvant est exprime travers les Fit, RevFit et Purity.
Le Fit mesure la concordance entre le spectre de la librairie et le spectre inconnu. Il ne tient pas compte des pics prsents dans le spectre inconnu et absents de celui de la librairie. Un Fit parfait donnera un score de 100 %. Les spectres EPI du mthabenzthiazuron dans lhuile essentielle de citron admettent tous un Fit trs satifaisant (Fit 87 %). En effet, les
225
principaux ions caractristiques du mthabenzthiazuron du spectre de rfrence (solvant) savoir les ions m/z 96, 123, 150, 165 et 222 sont galement prsents dans les spectres obtenus dans lhuile essentielle de citron dans des ratios similaires. Le Fit lgrement plus faible observ pour le spectre ralis avec Q1 en rsolution unit peut sexpliquer par une intensit importante de lion m/z 160. Globalement, la rsolution de Q1 ne semble pas avoir dinfluence significative sur le Fit. En revanche, une amlioration du RevFit est constate avec laugmentation de la rsolution.
Le RevFIT mesure la concordance du spectre inconnu avec le spectre de la librairie. Il ne tient pas compte des ions prsents dans le spectre de la librairie et absents du spectre inconnu. Un RevFit parfait donnera un score de 100 %. Concernant le mthabenzthiazuron, le RevFit varie effectivement de 52 % en low 80 % et 81 % en unit et high respectivement. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Cette volution sexplique par un bruit de fond plus important dans le cas de la rsolution low constitu des ions provenant de la matrice et due la large fentre douverture du quadriple. Lion m/z 223 est, par exemple, uniquement observ dans ce spectre. La diffrence de RevFit entre les modes unit et high nest pas rellement significative (1%). Cependant, lallure du spectre en rsolution high semble plus propre quen unit . La Purity mesure le taux de non concordance d aux pics additionnels prsents sur lun ou lautre des spectres et est fonction du Fit et RevFit. Si le Fit et le RevFit sont gaux 100 %, la Purity sera aussi gale 100 %. Dans le cas contraire, la purity sera infrieure 100 %. Il est donc logique de trouver une valeur de Purity nettement plus faible pour la rsolution low , la meilleure Purity tant observe pour la rsolution high . Le meilleur taux de concordance entre le spectre du mthabenzthiazuron dans lhuile essentielle de citron et le spectre de rfrence ralis dans le solvant est donc obtenu pour une rsolution high de Q1. Les rsultats obtenus pour les 14 autres pesticides confirment cette observation.
226
Pesticide Aldicarbe Acibenzolar-S-methyl Dichlorvos Methabenzthiazuron Acetamipride Imidaclopride Bromacil Napropamide Pendimethaline Butraline Methidathion Diniconazole Malathion Isoxaben Fipronil Tableau 60.
Ion prcurseur (m/z) 208,0 211,1 220,8 222,1 223,1 256,2 261,1 272,3 282,1 296,0 303,0 326,0 331,0 333,1 453,9
Q1 Low Q1 Unit (Fit/RevFit/Purity) (Fit/RevFit/Purity) 95/80/78 84/87/76 77/23/22 75/24/22 80/34/30 67/73/55 94/52/52 87/80/76 69/65/61 77/78/74 55/19/18 53/40/36 91/88/85 90/93/89 69/33/32 71/38/36 72/24/24 63/43/41 93/41/41 91/65/61 54/4/3 73/62/54 44/17/17 46/30/26 78/28/26 75/40/36 80/40/40 74/65/63 76/70/68 70/64/62
Q1 High (Fit/RevFit/Purity) 92/92/88 81/33/28 76/85/76 94/81/79 72/78/70 46/38/34 93/95/91 70/43/41 71/44/42 90/55/52 70/72/53 61/52/48 75/40/33 74/67/65 39/43/33
Concordance des spectres EPI obtenus dans lhuile essentielle de citron avec le spectre EPI de rfrence (solvant) pour 15 pesticides
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
De mme que pour le mthabenzthiazuron, les donnes du Tableau 60 montrent des rsultats comparables en termes de Fit pour les trois rsolutions, mais une nette amlioration du RevFit et, par consquent, de la Purity avec les rsolutions unit et high compares au low . Sur les 15 pesticides, 10 admettent un RevFit lgrement plus lev avec la rsolution high , 3 avec la rsolution unit et 2 le mme RevFit quelque soit la rsolution. La rsolution high sera donc prfre la rsolution unit .
Les Fit obtenus avec une rsolution high sont suprieurs 70 % pour 12 des 15 pesticides, ce qui est un score satisfaisant. Les RevFit sont, quant eux, plus variables de 33 % 95 % et, gnralement moins bons que les Fit. La rsolution high ne permet donc pas totalement de saffranchir de la matrice. Les scores obtenus pour la Purity ne sont, par consquent, pas toujours trs satisfaisants. En effet, 7 des 15 pesticides admettent une Purity infrieure 50 %. Cependant, si les scores refltent effectivement la concordance statistique entre deux spectres, linterprtation de lutilisateur reste primodiale. Par exemple, dans le cas du napropamide, qui admet une purity de 41 %, lobservation des spectres exposs dans la Figure 102 montrent la prsence des cinq ions majoritaires du spectre de rfrence dans le spectre matrice avec des ratios similaires.
227
+EPI (272.30) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 14.897 m fromSam 1 ( sol 10 ppb unit 2tr) of MRM EPI.wiff (Turbo Spray), Cen... in ple 272.1
Max. 3.9e6 cps.
3.9e6 3.5e6
171.0
a)
199.0
3.0e6
2.5e6
152.0
2.0e6
1.5e6
128.0
1.0e6
5.0e5
100.0 114.0 116.9 143.0 129.0 145.0 153.3 162.0 236.2 240.0 57.9 71.9
0.0
60
80
100
120
140
160
180 m Da /z,
200
220
240
260
280
300
Max. 1.4e6 cps.
+EPI (272.30) Charge (+0) CE (40) CES (20) FT (80): Exp 2, 14.759 m fromSam 2 (ctr 10 ppb high 1tr) of MRM EPI reinj.wiff (Turbo Spray), ... in ple 91.0
1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6

171.0 107.0
203.1
b)
272.1
1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5 4.0e5

79.0
93.0
135.0 199.1 152.0 105.0 95.0 128.1 119.0 143.0 78.3 81.0 58.1 84.7 109.1 103.0 114.0 133.0 139.0 148.0 161.0 159.0 177.0 212.1 221.0 237.1 240.1 254.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 60
77.0
80
100
120
140
160
180 m Da /z,
200
220
240
260
280
Figure 102.
Spectres EPI du napropamide dans a) le solvant et b) lhuile essentielle de citron
Malgr les mauvais scores reports dans le Tableau 60 pour le napropamide, il faut remarquer quune comparaison des spectres a) et b) de la Figure 102 pourrait conduire lutilisateur valider la prsence de ce compos dans lhuile essentielle de citron. En effet, on observe sur le spectre b) les ions fragments dintrts aux m/z attendus et avec des intensits relatives en accord avec le spectre de rfrence.
III. Rsum des principaux paramtres de la mthode SRM-EPI

Les essais prcdemment dcrits ont permis de dterminer les paramtres de dtection optimum dans le cadre de notre tude (Tableau 61).
Critres dacquisition
DP Q0trapping/fill time CE/CES Vitesse dacquisition de la LIT Rsolution de Q1
Tableau 61.
Critres de slection IDA

40V 80 ms 40 20 V 1000 Da/s high Slection de lion le plus intense partir dune liste dinclusion comprenant les pesticides positifs avec leur temps de rtention et un seuil dintensit de dclenchement.
Rsum des paramtres dacquisition en mode SRM-EPI
Compte tenu des rsultats obtenus lors de ce dveloppement, la mthode dacquisition SRM-EPI semble tre en mesure de pouvoir confirmer la prsence de pesticides dans les huiles essentielles.
228
C)
Application lanalyse dchantillons dhuile essentielle
Les diffrentes expriences, dtailles tout au long de ce mmoire, ont permis de mettre en vidence plusieurs points critiques, tant au niveau de la prparation de lchantillon que de lanalyse LC-ESI-MS/MS. Cette partie a pour objectif de faire un point sur la mthodologie analytique mettre en uvre dans le cadre danalyse dchantillons rels dhuile essentielle, avant de lappliquer sur des chantillons dhuiles essentielles de marjolaine, de citron et dorange.
I.
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Description de la mthodologie analytique

I.1 Mthodologie sur la prparation de lchantillon
La mthode de prparation applique lhuile essentielle va essentiellement dpendre de son point clair ainsi que de sa solubilit dans le solvant dinjection. Ces donnes permettront de choisir la mthode de prparation, savoir la dilution ou lvaporation sous azote. Elles conduiront aussi proposer la mise en place dune purification dans lazote liquide si celle-ci est requise. Le Schma 17 prsente une synthse du protocole exprimental mettre en uvre.
Point claire < 45oC
Huile Essentielle
Point claire > 45oC
Dilution
Prise dessai
500 L dHE
Prise dessai
100 L dHE

T C = 45 C Temps = 30-45 min
o o
Dilution
100 L dHE + 900 L MeOH 1%
Reprise
500 L de MeOH 1% Non soluble dans le MeOH 1%
Homognisation
60 s
Homognisation
60 s
Purification Conglation dans lazote liquide

Temps = 4-5 min
Centrifugation froid
T C<0 C Temps = 5 min Vitesse = 4000 rpm
o o
au moins 400 L
Injection LC-ESI/sSRM Vinj = 20 L
Injection LC-ESI/sSRM Vinj = 20 L
Schma 17.
Synopsis de la prparation dun chantillon dhuile essentielle
229
I.2
Analyse LC-ESI-MS/MS de 250 substances actives
Ce paragraphe a pour but de dfinir le screening de substances actives avec leur limite de quantification, deffectuer un rappel sur les analyses LC-ESI-MS/MS et enfin, de discuter de la mthodologie appliquer pour quantifier les substances actives. I.2.1. Limites de quantification de 250 substances actives La comparaison des sensibilits des mthodes de dilution et dvaporation sous azote sur les quatre huiles essentielles de citron, lavandin, cyprs et mlisse, a permis de slectionner un screening de 250 substances actives analyses en LC-ESI-MS/MS et dtablir leur limite de quantification (Tableau 62).
2,4D Abamectine Acephate Acetamipride Acibenzolar-S-methyl Aclonifen Alachlore Aldicarbe Aldicarbe sulfone Aldicarbe sulfoxyde Ametryn Amidosulfuron Amitraz Atrazine Azaconazole Azimphos-methyl Azoxystrobine Benalaxyl Bendiocarb Benfuracarbe Benomyl Benoxacore Bentazone Bifenazate Bifenthrine Bitertanol Boscalid Bromacil Bromoxynil Bromuconazole Bupirimate Buprofezine Butraline Carbaryl Carbendazime Carbetamide Carbofuran Carbofuran-3 OH Carbosulfan Carboxin Carfentrazone thyle Chlorfenvinphos Chlorfluazuron Chloridazone Chlorotoluron Chlorpropham Chlorpyrifos Chlorsulfuron Clofentezine Clomazone Multi-rsidus Huiles Essentielles 250 substances actives LC/MS/MS Coumaphos Fluazinam Methiocarbe sulfone Cyanazine Fludioxonil Methiocarbe sulfoxide Cyazofamide Flufenacet Methomyl Cyclanilid Flufenoxuron Methoxyfenozid Cycloxydime Fluquinconazole Mtobromuron Cymoxanil Flurochloridone Metolachlor Cyproconazole Fluroxypyr Mtoxuron Cyprodinil Flusilazol Metrafenone Cyromazine Flutolanil Metribuzine Deltamethrine Flutriafol Mevinphos Desmedipham Fomesafen Molinate Diazinon Formetanate Monocrotophos Dichlofluanid Fosthiazate Myclobutanil Dichlorprop-p Furathiocarb Napropamide Dichlorvos haloxyfop-p Norflurazon Diethofencarb Heptnophos Nuarimol Difenoconazole Hexaconazole Omthoate Diflubenzuron Hexaflumuron Oryzaline Diflufenicanil Hexazinone Oxadiazon Dimetachlor Hexythiazox Oxamyl Dimethenamid Imazalil Oxycarboxin Dimethoate Imidaclopride Paclobutrazol Dimethomorph Indoxacarbe Paraoxon methyl Diniconazole Ioxynil Parathion ethyl Disulfoton Iprodione Penconazole Dithianon Iprovalicarbe Pencycuron Diuron Isofenphos Pendimethaline Endosulfan sulfate Isoproturon Permethrin Epoxyconazole Isoxaben Phenmedipham Ethion (diethion) Isoxaflutol Phenthoate Ethofumesate kresoxim methyl Phorate Ethoprophos Lenacile Phosalone Etofenprox Linuron Phosmet Etoxazol Lufenuron Phosphamidon Famoxadone Malaoxon Picolanifen Fnamidone Malathion Picoxystrobin Fenamiphos MCPA Piperonyl butoxide Fenarimol Mecoprop Pirimicarbe Fenazaquin Mefenoxam Pirimicarbe desmethyl Fenbuconazole Mepanipyrim Pirimiphos-thyl Fenhexamid Mepronil Pirimiphos-methyl Fenoxycarbe Mesosulfuron methyl Prochloraz Fenpropimorphe Mesotrione Profenofos fenpyroxymate Metamitrone Prometryn Fenthion Metazachlore Propachlore Fenthion sulfone Metconazole Propaquizafop Fenthion sulfoxide Methabenzthiazuron Propargite fipronil Methamidophos Propazin flazasulfuron Methidathion Propiconazole fluazifop-p-butyl Methiocarbe Propoxur 1 < LOQ < 10 g.L-1 10 < LOQ < 50 g.L-1 LOQ = 50 g.L-1 Propyzamide Proquinazid Prosulfocarbe Prosulfuron Pymetrozin Pyraclostrobine Pyridaben Pyridafenthion Pyridate Pyrimethanil Pyriproxyfen Quinalphos Quinoclamine Quinoxyfen Quizalofop Quizalofop-p-ethyl Resmethrin Rimsulfuron Rotenone Sethoxydim Simazine Spinosad Spiroxamine Sulfosulfuron Sulfotep tau-fluvalinate Tebuconazole Tebufenozide Tebufenpyrade Teflubenzuron Terbufos Terbuthylazine Terbutryn Tetraconazole Thiabendazol Thiachlopride Thiametoxam Thiodicarbe Thiophanate mthyl Tolyfluanide Triadimefon Triadimenol Trichlorfon Triclopyr Trifloxystrobine Triflumuron Triflusulfuron mthyl Triticonazol Vamidothion Zoxamide
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 62.
Screening de 250 substances actives analyses dans les huiles essentielles par LC-ESI-MS/MS
230
Etant donn la variabilit des huiles essentielles en termes de composition et les protocoles de prparation mis en place, la sensibilit de la mthode analytique pour les 250 pesticides reste, dans une certaine mesure, dpendante de la nature de lhuile essentielle. Cest pourquoi les limites de quantification donnes ne sont pas fixes et sont prsentes sous forme dchelles. Nanmoins, aucune molcule du Tableau 62 nadmet de limite de quantification suprieure 50 g.L-1. I.2.2. Analyse par LC-ESI/sSRM et LC-ESI/SRM-EPI Une fois la prparation de lchantillon termin, lextrait est inject une premire fois en LC-ESI/sSRM en mode ESI+ et ESI- dans des conditions rappeles en Annexe 10. Lanalyse en mode ESI+ ne comprend quune seule transition pour chaque pesticide afin doptimiser la dtection. En revanche lanalyse en mode ESI-, ne comportant que 24 molcules, est opre tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 avec les deux transitions de chaque pesticide. Dans le cas o des pesticides seraient dtects, une analyse de confirmation LC-ESI/SRMEPI est effectue avec une liste dinclusion compose de lensemble des pesticides dtects lors de la premire analyse. Les spectres EPI obtenus partir des chantillons sont ensuite compars avec des spectres de rfrence raliss dans le solvant. Il est galement possible de procder une analyse supplmentaire en LC-ESI/sSRM comportant les deux transitions des pesticides dtects lors de la premire analyse. I.2.3. Quantification des substances actives Compte tenu de la diversit des huiles essentielles en termes de composition chimique, mme au sein dhuiles essentielles provenant dun matriel vgtal de nature similaire, il apparat compliqu de disposer dun tmoin parfaitement reprsentatif de chaque huile essentielle. Par consquent, la quantification partir dune gamme matrice semble compromise. La solution qui parat la plus mme de quantifier les pesticides dans les huiles essentielles savre tre la mthode des ajouts doss. Elle consiste ajouter une concentration connue en pesticide de lordre de la concentration suppose dans lchantillon. Evidemment, une quantification prcise ncessite destimer pralablement la concentration prsente dans lchantillon. Pour se faire, la mthodologie envisage consiste effectuer systmatiquement, pour chaque chantillon, un ajout dos une concentration de 5 g.L-1 ou 50 g.L-1 en fonction de la mthode de prparation utilise. Ces concentrations correspondent respectivement aux limites de quantification hautes des extraits, aprs prparation de
231
lchantillon avec la mthode de dilution ou dvaporation sous azote. Ce procd prsente plusieurs avantages. En premier lieu, il permet de sassurer de la dtection de tous les composs aux limites de quantification annonces. Ensuite, il permet de mettre en vidence la prsence dinterfrents lexemple de la substance active dithofencarbe dans une huile essentielle deucalyptus globulus (Figure 103).
Sample Name: "11-1296" Sample ID: "" File: "s110330 esi+.wiff" Peak Name: "diethofencarb -1" Mass(es): "268.0/226.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/30/2011 Acq. Time: 7:26:53 PM
Modified: No Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 1.00 min Peak-Split. Factor: 3 Report Largest Peak: Yes Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 11.4 min Use Relative RT: No Int. Type: Base To Base Retention Time: 11.6 min Area: 3.44e+004 counts Height: 4.65e+003 cps Start Time: 11.5 min End Time: 11.9 min
11.63
4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000
a)
2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Sample Name: "11-1296+50ppb" Sample ID: "" File: "s110330 esi+.wiff" Peak Name: "diethofencarb -1" Mass(es): "268.0/226.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/30/2011 Acq. Time: 7:54:56 PM
Modified: Yes Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 1.00 min Peak-Split. Factor: 3 Report Largest Peak: Yes Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 11.4 min Use Relative RT: No Int. Type: Manual Retention Time: 11.4 min Area: 6.77e+005 counts Height: 9.81e+004 cps Start Time: 11.2 min End Time: 11.6 min
10.90
10.95
11.00
11.05
11.10
11.15
11.20
11.25
11.30
11.35
11.40 11.45 Time, m in

11.43
11.50
11.55
11.60
11.65
11.70
11.75
11.80
11.85
11.90
11.95
12.00
9.5e4 9.0e4 8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4
5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0
11.63
I n t e r f r e n t
b)
10.90
10.95
11.00
11.05
11.10
11.15
11.20
11.25
11.30
11.35
11.40 11.45 Time, m in
11.50
11.55
11.60
11.65
11.70
11.75
11.80
11.85
11.90
11.95
Figure 103.
Signal relatif la transition 268,0226,1 du dithofencarbe dtect dans a) lhuile essentielle deucalyptus globulus et b) lajout dos 50 g.L-1
En effet, le signal obtenu au tR = 11,63 min dans lhuile essentielle deucalyptus (Figure 103 a)) laisserait supposer la prsence de la molcule de dithofencarbe dans lchantillon. Linjection de lajout dos 50 g.L-1 permet daffirmer que ce pic est issu dun interfrent. En effet, le chromatogramme de la Figure 103 b) rvle que le dithofencarbe a, en ralit, un tR = 11,43 min et que le pic observ dans lchantillon est toujours prsent dans lajout dos avec un tR = 11,63. Ce signal provient donc bien dun interfrent de la matrice. Enfin, le dernier avantage de ce procd est quil permet de quantifier directement tous les pesticides prsents dans lchantillon des teneurs comprises dans une gamme denviron 10 100 g.L-1 avec un ajout dos de 50 g.L-1. Il permet galement destimer la concentration des autres pesticides afin dajuster la concentration de lajout dos ou denvisager la dilution de lchantillon en cas de signal trop intense.
232
II. Analyse dchantillons rels dhuile essentielle

Les rsultats prsents ci-dessous concernent lanalyse de cinq chantillons dhuiles essentielles produites par les techniques de distillation (marjolaine) et dexpression (citron et orange). Parmi ces cinq huiles essentielles, trois sont dorigine bio et deux non bio . II.1 Analyse dune huile essentielle de marjolaine dorigine bio Une huile essentielle de marjolaine dorigine bio a t analyse selon le protocole dcrit prcdemment. Le point clair de la marjolaine tant environ gal 60 C, il se situe dans une zone qui na pas t tudie au cours du dveloppement. Cest pourquoi il a t dcid dappliquer les deux mthodes de prparation, savoir la dilution et lvaporation sous azote. tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Pour contrler la mthode dvaporation sous azote, un taux de rcupration une concentration de 50 g.L-1 a t ralis, les rsultats sont prsents en Annexe 19. A lexception du dithianon qui nest pas du tout rcupr et des substances actives clofentzine (TR = 10,7 %), dichlorvos (TR = 23,5 %), fluazinam (TR = 44,5 %), msotrione (TR = 62,8 %), molinate (TR = 68,5 %), oryzaline (TR = 43,1 %), pencyuron (TR = 62,2 %) et thiophanate-mthyle (TR = 56,2 %), lensemble des substances actives sont rcupres des taux satisfaisants (70-120 %). La premire analyse LC-ESI/sSRM a mis en vidence la dtection de 12 substances actives. Il sagit de lazoxystrobine, du chlorpyrifos, du diazinon, du disulfoton, de lthion, de lhexazinone, du malathion, du mfnoxam, du pipronil butoxide, du pirimicarbe, du profnofos et du sulfotep. Afin de confirmer la rponse positive de ces molcules et de dterminer leur concentration, des injections supplmentaires, impliquant pour certaines molcules des dilutions de lchantillon, ont t ncessaires. II.1.1. Concentration et confirmation des 12 substances actives dtectes Pour chacune des substances actives, les rsultats sont prsents au travers dun tableau type, organis selon le Tableau 63 :
Concentration en pesticide Chromatogramme de lchantillon Chromatogramme de lajout dos [pesticide] = x g.L-1 Confirmation EPI Spectre EPI de lchantillon Spectre EPI de rfrence (solvant) Fit/RevFit/Purity
Tableau 63.
Tableau type de prsentation des rsultats pour les molcules dont la prsence est suspecte dans lchantillon
233
Le Tableau 64 prsente les rsultats de lazoxystrobine.

Sample Name: "Marjolaine d10" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 6:17:27 PM
11.13
4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4
Sample Name: "Marjolaine d10 AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "azoxystrobine -1" Mass(es): "404.0/372.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 6:45:31 PM
11.09
1.4e5 1.3e5 1.3e5 1.2e5 1.2e5 1.1e5 1.1e5 1.0e5 9.5e4 9.0e4 8.5e4
Concentration en pesticide
8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4
2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0
11.57
5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4

11.37
[azoxystrobine] = 21,0 g.L-1
2.0e4 1.5e4 1.0e4
2000.0 0.0
5000.0 0.0
9.4
9.6
9.8
10.0
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0
11.2 11.4 Time, min
11.6
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0
13.2
9.2
9.4
9.6
9.8
10.0
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0 11.2 Time, min
11.4
11.6
11.8
12.0
12.2
12.4
12.6
12.8
13.0
Unknown's MS 372.1
azoxystrobine solv's MS cps. Max. 3.6e6
Max. 2.7e5 cps. 372.1
100 90 80 70 60 50 40
156.0
100 90 80 70 60 50
172.0 329.1
Confirmation EPI
R e l. In te n s ity , %
172.0 329.0
40 30
156.0 344.1
Fit/RevFit/Purity 87/92/84 PRESENCE CONFIRMEE
30 20
273.0 183.0 344.1
20
183.1 210.0 199.1 145.0 134.0 129.0 169.0 216.1 177.1 245.1 247.1
272.1 300.1
10 0 50
133.0
209.9 199.0
301.1
171.0 145.0 245.0 167.0 185.0 206.1 226.1 275.1 284.0 316.1 404.1 362.6
10
550 050
275.1
287.1
316.1 312.1 362.7
404.1
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
600 100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 64.
Chromatogrammes et spectres EPI de lazoxystrobine dans lhuile essentielle de marjolaine
La concentration en azoxystrobine a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 21,0 g.L-1 est confirme par le spectre EPI de lazoxystrobine dans lchantillon.
Le Tableau 65 prsente les rsultats concernant le chlorpyrifos.

Sample Name: "marjo evapo d100" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 5 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 5:03:29 PM 19.85
Sample Name: "marjo evapo d100 evapo 50 ppb" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "Chlorpyrifos -1" Mass(es): "349.9/198.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 6 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 5:31:34 PM
19.85
5.0e4 4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4
2.6e4 2.5e4 2.4e4 2.3e4 2.2e4 2.1e4 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4
1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0
3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4
[Chlorpyrifos] = 5,2 mg.L-1
7000.0
1.2e4
6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 Time, m in 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6
1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 Time, m in 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6
Unknown's MS 197.9
Chlorpyrifos solv's MS
Max. 3.0e7 cps.
Max. 5.1e5 cps. 197.9
100 90 80 70 60 50 40 30 20
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Confirmation EPI
96.9 114.9 179.9 321.9 293.8 349.9
Fit/RevFit/Purity 94/95/92
96.8 349.9 114.9 179.9 293.8 321.8 106.9 150.9 144.0 177.8 231.0 213.9
213.9 106.9
10
133.9 78.9 110.9 150.9 162.0 211.8 275.8
PRESENCE CONFIRMEE
400 450 500 550 600
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
275.8
318.0
100 600
150
200
250
300 350 m/z, Da
Tableau 65.
Chromatogrammes et spectres EPI du chlorpyrifos dans lhuile essentielle de marjolaine
Du fait de la teneur trs leve en chlorpyrifos, sa concentration a t dtermine partir dune dilution au 1/100e de lextrait issu de lvaporation sous azote et dun ajout dos 50
234
g.L-1 ralis sur lextrait dilu. La teneur de 5,2 mg.L-1 est confirme par le spectre EPI du chlorpyrifos dans lchantillon.
Le Tableau 66 prsente les rsultats concernant le diazinon.

Sample Name: "marjo evapo d10" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "Diazinon -1" Mass(es): "305.1/169.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:07:27 PM 17.27
4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4
Sample Name: "marjo evapo d10 evapo 50 ppb" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "Diazinon -1" Mass(es): "305.1/169.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:35:26 PM
17.26
1.15e5 1.10e5 1.05e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4
2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 Time, m in 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0
7.00e4 6.50e4 6.00e4 5.50e4 5.00e4 4.50e4 4.00e4 3.50e4 3.00e4 2.50e4 2.00e4 1.50e4 1.00e4
[Diazinon] = 344 g.L-1
5000.00 0.00 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 Tim m e, in 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0
Unknown's MS 305.1
Diazinon solv's MS
Max. 5.1e7 cps.
Max. 3.3e5 cps. 305.1
100 90 80 70 60
169.1
100 90 80 70 60 50
169.0
Confirmation EPI
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
50 40 30
277.1 287.2 153.1
40 30
153.0 277.0
249.0
20 10 0 50
269.3 96.9 114.9 91.0 79.0 105.0 100.0 135.0 149.1 201.2 231.1 259.3 249.1 273.2
20 10
96.9 114.9
PRESENCE CONFIRMEE
300 350 m/z, Da 400 450 500 550 600
92.9 100.0
137.1
231.0
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
0 50 450
500
100 550
150 600
200
250
Tableau 66.
Chromatogrammes et spectres EPI du diazinon dans lhuile essentielle de marjolaine
La concentration en diazinon a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 344 g.L-1 est confirme par le spectre EPI du diazinon dans lchantillon.
Le Tableau 67 prsente les rsultats concernant le disulfoton.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Disulfoton -1" Mass(es): "275.0/89.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
17.92
7000
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Disulfoton -1" Mass(es): "275.0/89.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
9500 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000
17.88
6500
6000
5500
5000
4500
5500 5000 4500 4000 3500
4000
3500
3000
2500
3000
[Disulfoton] = / g.L-1
18.34 18.22
2000
2500 2000
18.38 18.27
1500
1500 1000
1000
500
500 0
16.0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8 18.0 Time, m in
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
16.0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8 18.0 Time, m in
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4
19.6
19.8
Unknown's MS 275.1
Disulfoton solv's MS
Max. 6.9e6 cps.
Max. 3.6e5 cps. 275.1
100 90 80 70 60 50 40
257.2
100 90 80 70 60 50 40 30 20
Confirmation EPI
89.0
30 20
91.0
10
81.0 77.0
105.0 119.0 143.0 161.1 155.0 187.1 205.0 217.2 239.1
10
98.9
PRESENCE NON CONFIRMEE

193.0 217.0
109.0
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 500 50
550 100
600 150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 67.
Chromatogrammes et spectres EPI de disulfoton dans lhuile essentielle de marjolaine
235
La prsence de la substance active disulfoton dans lhuile essentielle de marjolaine nest pas confirme. Le bon Fit est d la prdominance de lion prcurseur m/z 373,0 dans les deux spectres. En revanche, les ions produits sont trs diffrents et ne permettent pas de confirmer la prsence de cette molcule dans lchantillon. Il sagit trs probablement dun interfrent. Lil de lutilisateur est donc un critre non ngligeable. Le Tableau 68 prsente les rsultats concernant lthion.
Sample Name: "marjo evapo d10" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "ethion (diethion) -1" Mass(es): "385.0/199.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:07:27 PM
3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5
19.42
Sample Name: "marjo evapo d10 evapo 50 ppb" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "ethion (diethion) -1" Mass(es): "385.0/199.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:35:26 PM
19.42
8.0e5
Modified: No Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Noise Percentage: 50 Base. Sub. Window: 1.00 min Peak-Split. Factor: 1 Report Largest Peak: No Min. Peak Height: 0.00 cps Min. Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: 3 points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 19.3 min Use Relative RT: No Int. Type: Base To Base Retention Time: 19.4 min Area: 2.08e+006 counts Height: 3.85e+005 cps Start Time: 19.3 min End Time: 19.8 min
7.5e5
7.0e5
6.5e5
6.0e5
5.5e5
5.0e5
2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4
4.5e5
4.0e5
3.5e5
3.0e5
[Ethion] = 410 g.L-1
2.5e5
2.0e5
1.5e5
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
6.0e4 1.0e5 4.0e4 2.0e4 0.0 5.0e4
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
Unknown's MS 142.9
19.2 19.4 Time, m in
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
0.0
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
Ethion solv's MS
Max. 2.4e7 cps.
19.2 19.4 Time, min
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
Max. 7.0e5 cps.
100 90
100 90
170.9
142.9
Confirmation EPI
198.9
70 60
385.2
80
80 70 60 50 40 30 20
385.2 170.9 96.9
50 40 30 20 10
202.9 94.9 107.0 135.1 153.0 174.8 185.0 78.9 230.9 215.0 292.9 325.1 367.3 96.9 114.9
198.9
114.9

230.9
10
78.9 124.9 174.8 202.9
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 500 50
292.9
550 100
600 150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 68.
Chromatogrammes et spectres EPI de lthion dans lhuile essentielle de marjolaine
Du fait de la teneur leve en thion, sa concentration a t dtermine partir dune dilution au 1/10e de lextrait issu de lvaporation sous azote, et dun ajout dos 50 g.L-1 ralis sur lextrait dilu. La teneur de 410 g.L-1 est confirme par le spectre EPI de lthion dans lchantillon. Le Tableau 69 prsente les rsultats concernant lhexazinone dont la prsence, limage du disulfoton, na pas t confirme par le spectre EPI ralis dans lhuile essentielle de marjolaine.
236
Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "hexazinone -1" Mass(es): "253.2/71.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
8.00
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "hexazinone -1" Mass(es): "253.2/71.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
7.99
1.4e5 1.4e5 1.3e5 1.3e5 1.2e5 1.2e5 1.1e5 1.1e5 1.0e5 9.5e4
7.5e4
7.0e4
6.5e4
6.0e4
5.5e4
5.0e4
9.0e4
8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4
4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
5.5e4 5.0e4
[Hexazinone] = / g.L-1
2.5e4
4.5e4 4.0e4
2.0e4
3.5e4 3.0e4
1.5e4
2.5e4 2.0e4 1.5e4
1.0e4
5000.0
1.0e4 5000.0
0.0 6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
Unknown's MS
8.0 Time, m in
8.2
8.4
8.6
8.8
9.0
9.2
9.4
9.6
9.8
0.0 6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
Hexazinone solv's MS
Max. 4.7e6 cps.
8.0 Time, m in
8.2
8.4
8.6
8.8
9.0
9.2
9.4
9.6
9.8
Max. 5.8e5 cps. 171.0
100 90 80 70
99.0
235.1
100 90 80 70 60 50 40 30 20
Confirmation EPI
60 50 40
95.0 91.0
159.1
193.1 217.1
253.1
253.1
175.1
Fit/RevFit/Purity 60/6/6 PRESENCE NON CONFIRMEE
30
119.0
199.1
20 10
105.0 81.0 76.9 109.0 141.0 135.0 67.0 71.0 97.0 129.0 157.0 177.1 173.1 189.1
10
209.0 221.0
69.6 85.0
156.8 163.0 197.0
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
100 600
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 69.
Chromatogrammes et spectres EPI de lhexazinone dans lhuile essentielle de marjolaine
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Le spectre EPI de la matrice (Tableau 69 droite) est compltement diffrent de celui de rfrence (Tableau 69 gauche). La prsence de lhexazinone dans lhuile essentielle de marjolaine nest donc pas confirme.
Le Tableau 70 prsente les rsultats concernant le malathion.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "malathion -1" Mass(es): "331.0/127.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
9.0e4 8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4
12.47
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "malathion -1" Mass(es): "331.0/127.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
12.49
1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.3e5 1.3e5 1.2e5 1.2e5 1.1e5 1.1e5 1.0e5 9.5e4
9.0e4 8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4
5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0
[Malathion] = 88 g.L-1
5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 Time, m in 12.8 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 0.0 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 Time, min 12.8 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4
Unknown's MS 98.9
Malathion solv's MS
Max. 5.8e6 cps.
Max. 1.0e6 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50
100 90 80 70 60 50 40 30
98.9
Confirmation EPI
331.1
331.2 124.9 78.9 210.9 118.9 126.9 142.9 249.1 257.0 285.0
124.9 142.9 78.9 118.9 127.0 210.9 195.0 257.0 271.0 313.2
20 10 0 500 50
PRESENCE CONFIRMEE
200 250 300 350 m/z, Da 400 450 500 550 600
71.0
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
550 100 600 150
Tableau 70.
Chromatogrammes et spectres EPI de malathion dans lhuile essentielle de marjolaine
La concentration en malathion a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 88 g.L-1 est confirme par le spectre EPI du diazinon dans lchantillon.
237
Le Tableau 71 prsente les rsultats concernant le mfnoxam.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "mefenoxam -1" Mass(es): "280.2/220.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
9.93
5.2e4 5.0e4 4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "mefenoxam -1" Mass(es): "280.2/220.2 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
6.4e5 6.2e5 6.0e5 5.8e5 5.6e5 5.4e5 5.2e5 5.0e5 4.8e5 4.6e5 4.4e5 4.2e5 4.0e5
9.93
3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 Time, min 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8
3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 Time, m in 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.6 11.8
[Mfnoxam] = 4,1 g.L-1
Unknown's MS
Mefenoxam's MS
Max. 5.4e5 cps.
Max. 4.7e5 cps. 160.1 220.1
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
132.0 143.9 192.1 248.0
280.1
100 90 80 70 60 50 40
144.1
192.1
Confirmation EPI
248.1
280.1
220.1
30 20
105.0
134.1 145.1
162.1 130.0 117.0 91.0 118.0 107.0 121.0 150.1 188.1 212.0
149.9 171.0 183.2
10 0 50 550
PRESENCE CONFIRMEE
200 250 300 350 m/z, Da 400 450 500 550 600
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
600 100
150
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Tableau 71.
Chromatogrammes et spectres EPI de mfnoxam dans lhuile essentielle de marjolaine
La concentration en mfnoxam a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La faible valeur du Fit admis par le spectre EPI matrice compar celui de rfrence sexplique par la prdominance de lion prcurseur m/z 280,1 dans le spectre matrice. Les principaux ions caractristiques sont, cependant, prsents dans des ratios similaires. Compte tenu de ces observations, la prsence de la molcule de mfnoxam dans lhuile essentielle de marjolaine est confirme.
Le Tableau 72 prsente les rsultats concernant le pipronil butoxide.

Sample Name: "marjo evapo d10" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "piperonyl butoxide -1" Mass(es): "356.2/177.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:07:27 PM
19.47
Sample Name: "marjo evapo d10 evapo 50 ppb" Sample ID: "" File: "marjo ajouts doses 50 ppb d10 et d20.wiff" Peak Name: "piperonyl butoxide -1" Mass(es): "356.2/177.1 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 4 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/21/2011 Acq. Time: 4:35:26 PM
2.6e6 2.5e6 2.4e6 2.3e6 2.2e6 2.1e6 2.0e6 1.9e6 1.8e6 1.7e6
19.47
7.0e5
6.5e5
6.0e5
5.5e5
5.0e5
4.5e5
1.6e6
1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6
4.0e5
3.5e5
3.0e5
2.5e5
9.0e5 8.0e5
[Pipronil butoxide] = 180 g.L-1
2.0e5
7.0e5 6.0e5
1.5e5
5.0e5 4.0e5
1.0e5
3.0e5
5.0e4
2.0e5 1.0e5
0.0
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4 Tim m e, in
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
0.0
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
18.4
18.6
18.8
19.0
19.2
19.4 Time, m in
19.6
19.8
20.0
20.2
20.4
20.6
20.8
21.0
21.2
Unknown's MS 177.0
Max. Piperonil butoxide solv's MS 3.0e7 cps.
Max. 5.6e5 cps. 177.0 149.0
100 90 80 70 60
91.0 149.0
100 90 80 70
119.0
Confirmation EPI
60 50 40
91.0
50 40 30 20 10 0 50
119.0
135.1
117.0
107.0 95.0 93.0 147.0
30 20
90.4
81.0 77.0 104.2 123.1 151.1 89.4 133.1 165.1 185.1 356.2 203.0 243.1 285.1 303.2 338.3
10
77.0 103.0
129.0 146.2 132.0 150.5 203.0 247.2 356.2
66.9
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 550 50
600 100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 72.
Chromatogrammes et spectres EPI du pipronil butoxide dans lhuile essentielle de marjolaine
238
La concentration en pipronil butoxide a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 180 g.L-1 est confirme par le spectre EPI du pipronil butoxide dans lchantillon.
Le Tableau 73 prsente les rsultats concernant le pirimicarbe.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Pirimicarbe -1" Mass(es): "239.2/72.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
9.55
8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Pirimicarbe -1" Mass(es): "239.2/72.0 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
9.55
5.4e5 5.2e5 5.0e5 4.8e5 4.6e5 4.4e5 4.2e5 4.0e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5
5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4
3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5
[Pirimicarbe] = 10 g.L-1
1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0
1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4

7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 Time, m in 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4
0.0
7.6
7.8
8.0
8.2
8.4
8.6
8.8
9.0
9.2
9.4
9.6 Time, min
9.8
10.0
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0
11.2
11.4
Unknown's MS 239.1
pirimicarb solv's MS
Max. 7.9e6 cps.

239.1
Max. 4.2e5 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50
182.1
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
69.4 195.1 109.0 85.0 152.0 166.0 182.1
Confirmation EPI
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

250 300 350 m/z, Da 400 450 500 550 600
72.0 91.0 69.2 109.1
137.0 152.0 161.1 195.1
221.1
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
100 600
150
200
Tableau 73.
Chromatogrammes et spectres EPI de pirimicarbe dans lhuile essentielle de marjolaine
La concentration en pirimicarbe a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 10 g.L-1 est confirme par le spectre EPI du pirimicarbe dans lchantillon.
Le Tableau 74 prsente les rsultats concernant le profnofos.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Profenofos -1" Mass(es): "372.9/302.9 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
18.78
1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.3e5 1.3e5 1.2e5 1.2e5 1.1e5 1.1e5 1.0e5
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Profenofos -1" Mass(es): "372.9/302.9 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
18.76
2.2e5 2.1e5 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5
9.5e4 9.0e4
1.4e5
8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 Time, min 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6
1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 Time, m in 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6
[Profnofos] = 78 g.L-1
Unknown's MS 373.2
Profenofos solv's MS
Max. 1.4e7 cps.
Max. 3.3e5 cps. 302.8
100 90 80 70 60
302.8
100 90 80 70 60 50 40
158.9 186.9 220.8 128.0 187.9 143.9
Confirmation EPI
344.9
50 40 30 20 10
78.8 93.0 96.9 127.9 158.9 114.9 176.9 135.0 205.9 237.0 143.9
373.0

400 450 500 550 600
344.9
30 20
141.9 96.8 114.9 204.9
222.9 235.8 330.9 266.8 286.9 170.9 250.9
186.9
220.8 222.9 266.8 286.9 330.9 355.3
10 0 50 550
176.9
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
100 600
150
200
250
300 350 m/z, Da
Tableau 74.
Chromatogrammes et spectres EPI de profnofos dans lhuile essentielle de marjolaine
239
La concentration en profnofos a t dtermine partir des aires des pics chromatographiques de lchantillon et de lajout dos. La teneur de 78 g.L-1 est confirme par le spectre EPI du profnofos dans lchantillon.
Le Tableau 75 prsente les rsultats concernant le sulfotep.

Sample Name: "Marjolaine evapo" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Sulfotep -1" Mass(es): "323.0/114.9 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 2 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 4:53:24 PM
16.24
8000
Sample Name: "Marjolaine evapo AJ 50 ppb" Sample ID: "" File: "analyse esi+.wiff" Peak Name: "Sulfotep -1" Mass(es): "323.0/114.9 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: 3 Sample Type: Unknown Concentration: N/A Calculated Conc: 0.00 ng/mL Acq. Date: 3/18/2011 Acq. Time: 5:21:24 PM
16.24
6.5e4
7500
7000
6.0e4
6500
5.5e4
6000
5.0e4
5500
4.5e4
5000
4.0e4
4500
3.5e4
4000
3500
3.0e4
3000
2.5e4
[Sulfotep] = / g.L-1
2500
2.0e4
2000
1.5e4
1500
1.0e4
1000
5000.0
500
14.4
14.6
14.8
15.0
15.2
15.4
15.6
15.8
16.0
Unknown's MS
16.2 16.4 Time, min
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
0.0
14.4
14.6
14.8
15.0
15.2
15.4
15.6
15.8
16.0
Sulfotep solv's MS
Max. 2.9e6 cps.
16.2 16.4 Time, min
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
18.0
18.2
Max. 8.7e5 cps.
100 90 80 70
287.2
100 90 80 70 60 50 40
96.9
114.9
Confirmation EPI
305.2
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
60
269.1
323.2
50 40 30 20 10
77.0 117.0 123.0 91.0 81.0 95.0 114.9 159.0 153.0 161.1 179.9
323.0
Fit/RevFit/Purity 58/13/11 PRESENCE NON CONFIRMEE

400 450 500 550 600
30
262.9
119.0 147.0 171.0 229.1 199.1 203.0 213.1 233.1 259.3 277.1 295.0
20
96.2
170.9 142.9 164.9 294.9
10
238.8 110.9 266.9 277.0
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
100 600 150
200
250
300 350 m/z, Da
Tableau 75.
Chromatogrammes et spectres EPI du sulfotep dans lhuile essentielle de marjolaine
La prsence de la substance active sulfotep dans lhuile essentielle de marjolaine nest pas confirme. Le spectre EPI obtenu dans la matrice est clairement diffrent de celui de rfrence. II.1.2. Conclusion Le Tableau 76 prsente une synthse des teneurs en pesticides dtects dans lhuile essentielle de marjolaine ainsi que les rsultats de la confirmation de ces molcules par SRMEPI.
Substance active Azoxystrobine Chlorpyrifos Diazinon Disulfoton Ethion Hexazinone Malathion Mfnoxam Pipronil butoxide Pirimicarbe Profenofos Sulfotep
Tableau 76.
Concentration (g.L-1) 21 5200 344 / 410 / 88 4,1 180 10 78 /
Confirmation EPI (Fit/RevFit/Purity) Confirm (87/92/84) Confirm (94/92/92) Confirm (91/63/62) Non confirm (92/43/11) Confirm (91/82/81) Non confirm (60/6/6) Confirm (82/80/73) Confirm (49/71/47) Confirm (76/64/60) Confirm (95/82/80) Confirm (81/50/43) Non confirm (58/13/11)
Bilan des teneurs en pesticides dtectes dans lhuile essentielle de marjolaine
240
Sur les 12 substances actives dtectes lors de la premire analyse LC-ESI/sSRM, 9 dentre elles ont pu tre confirmes par la mthode LC-ESI/SRM-EPI. Les concentrations dtectes varient de 4,1 g.L-1 pour le mfnoxam 5 200 g.L-1 pour le chlorpyrifos. Les pourcentages de concordance admis par les spectres EPI raliss dans lchantillon sont satisfaisants. A lexception du mfnoxam qui admet un Fit de 47 % pour des raisons expliques prcdemment, les Fit et RevFit sont strictement suprieurs 75 % et 50 %, conduisant des Purity gnralement suprieures 50 %. Concernant les molcules de disulfoton, hexazinone et sulfotep, les spectres EPI obtenus dans lhuile essentielle de marjolaine ne correspondent pas avec ceux de rfrences. Ils conduisent alors, infirmer la prsence de ces molcules dans lchantillon. Les spectres EPI des substances actives hexazinone et sulfotep obtenus pour les ajouts doss montrent bien un mlange entre les ions fragments issus de(s) linterfrent(s) et ceux issus de la molcule tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 recherche (Tableau 77).
Hexazinone solv's MS
Hexazinone
171.0
Sulfotep solv's MS
Max. 5.8e5 cps.
Sulfotep
Max. 8.7e5 cp
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
85.0 69.6
100 90 80 70 60 50 40
96.9
114.9
Rfrence
253.1
323.0
30
262.9
20
96.2
170.9 142.9 164.9 294.9
10
238.8 110.9 266.9 277.0
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 50 500
Unknown's MS
100 550
150 600
200
250
Max. 4.7e6 cps.
300 350 m/z, Da

287.2
400
450
500
550
600
Max. 2.9e6 cp
100 90 80 70
99.0
235.1
100 90 80 70
305.2
60 50 40
95.0 91.0
159.1
193.1 217.1
253.1
60
269.1
323.2
Echantillon
50 40 30 20
91.0 81.0 95.0 114.9 159.0 77.0 117.0 123.0 153.0 161.1 179.9
175.1
30
119.0
199.1
20 10
105.0 81.0 76.9 109.0 141.0 135.0 67.0 71.0 97.0 129.0 157.0 177.1 173.1 189.1
119.0
147.0 171.0 229.1 199.1 203.0 213.1 233.1 259.3 277.1 295.0
10
209.0 221.0
156.8 163.0 197.0
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 50 500
Unknown's MS
100 550
150 600
200
250
Max. 1.6e7 cps.
300 350 m/z, Da

287.2
400
450
500
550
600
Max. 2.9e6 cps.
100 90 80
171.0
100
114.9
90
323.1
80
96.9
70
253.1
70 60
269.2 305.2
60 50 40 30
235.1
Ajout dos
50 40 30
91.0 107.0
171.0
20 10 0 50
91.0 99.0 85.0 69.4 66.7 77.0 105.0 121.0 95.0
159.1 193.1 199.1 157.0 177.1
217.1 175.1
20
79.0
93.0 119.0
142.9 135.0 121.0 159.1 173.0 165.0 198.9 179.1 294.9 201.1 213.1 227.2
119.0
10 0 500 50
76.9 98.9
259.2 267.0 291.1
209.1
67.0 73.0
131.0
217.2 249.1 257.1
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
550 100
600 150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 77.
Spectres EPI des substances actives hexazinone et sulfotep obtenus dans le solvant (rfrence), lchantillon dhuile essentielle de marjolaine et lajout dos
241
Les ions entours en bleu sur les spectres EPI du Tableau 77 correspondent aux ions fragments issus de la substance active, les autres ions provennant de la matrice. Les spectres EPI de lajout dos mettent bien en vidence que, malgr la prsence dinterfrents, les ions fragments issus de la substance active se distinguent de ceux de la matrice. Donc, mme si les spectres contiennent du bruit de fond, il est nanmoins possible de confirmer la prsence de ces molcules. En revanche, le seuil de concentration partir duquel il est possible de confirmer le rsultat positif est certainement plus lev quen labsence de bruit de fond. II.2 Analyse de deux huiles essentielles de citron Deux huiles essentielles de citron, la premire dorigine bio et provenant dItalie et la seconde non bio originaire dEspagne, ont t analyses selon le protocole dcrit prcdemment. Le point clair de lhuile essentielle de citron se situant autour des 46 C, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 cest la mthode dvaporation sous azote qui a t employe. Les injections des extraits dhuiles essentielles de citron ont t suivies des injections dajouts doss 50 g.L-1, prpars partir de ces mmes extraits. II.2.1. Analyse dun chantillon dhuile essentielle de citron bio Lors de lanalyse LC-ESI/sSRM de lhuile essentielle de citron, une vingtaine de transitions ont rpondu positivement. Les concentrations correspondantes en pesticides ont t estimes partir de lajout dos et sont prsentes dans le Tableau 78.
Substance active Azaconazole Buprofzine Carbaryl Chlorpyrifos Cyproconazole Dimthomorphe Diuron Ethoprofos Fnamiphos Fnarimol
Tableau 78.
Concentration estime (g.L-1) 110 0,7 0,3 11 130 0,8 0,5 1,9 1,2 2
Substance active Hexythiazox Linuron Malathion Mfnoxam Mthamidophos Mthidathion Oxamyl Propyzamide Rotnone Ttraconazole
Concentration estime (g.L-1) 0,7 3 3 4,0 1,8 3 0,9 5,6 3,3 0,5
Concentrations en pesticides estimes partir de lajout dos lors de lanalyse LC-ESI/sSRM
Sur les vingts pesticides du Tableau 78, seuls deux dentre eux ont t confirms lors de lanalyse LC-ESI/SRM-EPI, il sagit du diuron et du mfnoxam. En plus des spectres EPI du diuron et du mfnoxam, le Tableau 79 prsente galement, titre dexemples, les spectres
242
EPI de lazaconazole et de la buprofzine qui ont permis dinfirmer la prsence de ces composs dans lhuile essentielle de citron.
Diuron's MS
Spectre EPI de rfrence

233.0
Unknown's MS
Spectre EPI de lchantillon

Max. 4.3e5 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
72.0 76.9 109.0 132.9 159.9 169.0 173.0
100 90 80 70 60 50 40 30 20
233.1
Fit /RevFit/Purity 90/70/63
Diuron
218.0
10
76.9 91.0
141.0 105.1 145.0 116.2 159.0 173.1 217.9 205.1
147.9 189.1
0 50
Mefenoxam's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 50 500
Unknown's MS
100 550
150 600
Max. 4.7e5 cps.
200
250
300 350 m/z, Da

280.2
400
450
500
550
100 90 80 70 60 50 40
144.1
160.1 220.1
100 90 80 70
220.1 160.0
192.1

192.1
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
60 50 40 30
Mfnoxam
248.1
30 20
105.0
134.1 145.1 280.1 162.1 130.0 117.0 91.0 118.0 107.0 121.0 150.1 188.1 212.0
148.0
20 10
81.0 105.0
248.0 144.0
10 0 50
Azaconazole's MS
132.1
162.0 263.0 203.0
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 50 500
Unknown's MS
100 550
150 600
200
250
Max. 6.3e5 cps. 231.9
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
100 90 80 70 60 50
158.9
100 90 80 70 60 50 40
189.1 176.1
231.0
Azaconazole
204.1
300.1
300.0
40 30 20
230.9
30 20 10
89.0 160.1
188.1
216.1 258.1
10
122.9
272.1 146.1 76.0 104.0 119.0 173.1 163.1 202.1 192.1 218.1 244.0 205.5
172.9
0 50
Buprofezine's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 500 50
Unknown's MS
550 100
600 150
Max. 4.5e5 cps.
200
250
300 350 m/z, Da

306.2
400
450
500
550
100 90 80
106.0
100 90 80 70 60 50 40 30 20
204.0 288.2 271.1
306.1
70 60 50 40 30 20 10
59.9
201.0
Buprofzine
250.1 79.0 116.0 145.0 208.0 204.0 264.0
10
79.0
91.0 105.0 93.1 148.1 133.8
202.9 169.0 189.0 220.2 228.2 256.3
0 50
85.9 103.0
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
0 500 50
550 100
600 150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
Tableau 79.
Comparaison des spectres EPI issus de lchantillon avec ceux de rfrence pour quatre substances actives
243
Compte tenu des spectres de masse prsents dans le Tableau 79, un lger doute peut tre mis concernant la confirmation du diuron. En effet, les pourcentages de concordance, bien que trs satisfaisants, sont essentiellement dus la prpondrance de lion prcurseur m/z 233,1. Cependant, en plus de lion prcurseur, trois ions communs sont prsents dans des proportions relativement similaires : m/z 218, 173, 76,9. Lanalyse de cet chantillon met une fois de plus en vidence que malgr la trs grande spcificit du mode SRM, il nest pas rare de dtecter des interfrents. Ces derniers pourraient tre reports en tant que positif des concentrations relativement importantes pour certaines substances actives (exemple : [Azaconazole] 110 g.L-1). II.2.2. Analyse dun chantillon dhuile essentielle de citron non bio Lors de lanalyse LC-ESI/sSRM de lhuile essentielle de citron non bio , trente-deux tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 transitions ont rpondu positivement. Les trente-deux substances actives correspondantes ont t rparties en deux tableaux suivant les rsultats de lanalyse de confirmation LC-ESI/SRMEPI. Le Tableau 80 et le Tableau 82 prsentent respectivement les pesticides dont la prsence a t infirme et confirme. Dans chacun des tableaux sont prsentes les concentrations estimes partir de lajout dos (et ventuellement des dilutions supplmentaires), ainsi que les pourcentages de concordance entre les spectres EPI de lchantillon et ceux de rfrence, de mme que la conclusion sur la positivit de la substance active.
Pesticide Azaconazole Bnalaxyl Carbaryl Diazinon Diflufnican Fnamiphos Fnarimol Mthamidophos Oxamyl propargite Sulfotep Trifloxystrobine
Tableau 80.
Concentration estime 137 1,57 1,2 7,34 2,1 2 0,7 4,2 4,3 34 7 0,2
Fit/RevFit/Purity 50/14/13 15/18/11 39/34/27 53/49/47 48/56/43 38/14/9 15/16/7 18/7/2 43/25/14 58/25/24 60/4/3 22/44/18
Confirmation Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non
Concentrations (g.L-1) en pesticides estimes partir de lajout dos ou de dilutions lors de lanalyse LCESI/sSRM et infirmes par lanalyse LC-ESI/SRM-EPI
Lanalyse LC-ESI/SRM-EPI a permis dinfirmer la prsence des douze substances actives cites dans le Tableau 80. Pour certaines dentre elles comme le diazinon ou le diflufenican, les scores de corrlation obtenus entre les spectres de lchantillon et ceux de rfrence pourraient laisser supposer une contamination de lhuile essentielle par ces substances actives.
244
Cependant, linterprtation de ces spectres par lutilisateur ne laisse aucun doute (Tableau 81). Aucune concordance nest en effet souligne avec les spectres de rfrence.
Diazinon solv's MS
Diazinon
305.1
Unknown's MS
Max. 3.3e5 cps.
Diflufnican
395.2
Max. 6.7e6 cps.
100 90 80 70 60 50
169.0
100 90 80 70 60 50 40 30
Rfrence
40 30 20 10
100.0 137.1 231.0 153.0 277.0 96.9 114.9 249.0
20 10
131.0 189.0 221.0 266.1
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da

305.1
400
450
500
0 50 550
335.2
363.2
100 600
Max. 2.3e7 cps.
150
200
250
Diflufenican's MS
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Max. 2.6e5 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30
147.0
100 90 80 70 60 50
238.0
266.0 395.1
Fit /RevFit/Purity
Echantillon
53/49/47
203.0
246.0
40 30 20
169.0
218.0
183.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
20 10 0 50
190.0
91.0 77.0 95.0 119.0 131.0 159.0 169.0 288.1
10 0 50
133.0 145.0 163.0
210.0 233.0 198.0 284.0 298.2 335.2 375.1
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550 100
600 150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 81.
Spectres EPI de rfrence et de lchantillon des substances actives diazinon et dilfufenican
De plus, parmi ces douze substances actives infirmes, il faut noter une fois de plus que, dans le cas de la prsence suspecte de lazaconazole, le signal dtect correspondrait une concentration du mme ordre que dans lhuile essentielle de citron biologique. Les spectres EPI de lazaconazole obtenus respectivement dans le solvant (rfrence), lhuile essentielle biologique et non biologique sont prsents dans la Figure 104.
Azaconazole's MS
c) Spectre EPI de rfrence

158.9
Max. 6.3e5 cps.
100 90 80 70 60 50
300.0
40 30 20
230.9
10
122.9
172.9
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
rfrence
chantillon
Unknown's MS
a) Spectre EPI dans lHE bio

231.9 231.0
Max. 4.8e7 cps.
Unknown's MS
b) Spectre EPI dans lHE non bio

100 90 80 70 60 50 40 30 20
176.0 300.0 204.0 232.0
Max. 3.8e7 cps.
100 90 80 70 60 50 40
189.1 176.1
82/96/82
204.1 300.1
30 20 10
89.0 160.1
188.1
Fit /RevFit/Purity
216.1 258.1 272.1 146.1 76.0 104.0 119.0 173.1 163.1 202.1 192.1 218.1 244.0 205.5
189.0
10
91.0
160.0 217.1 145.0 104.0 258.0 243.0 272.1
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Figure 104.
Spectres EPI de linterfrent dtect dans a) HE bio b) HE non bio et compars c) au spectre de rfrence de lazaconazole
245
Compte tenu des scores de corrlation obtenus entre les diffrents spectres de la Figure 104 et, notamment de celui obtenu entre les spectres EPI des deux huiles essentielles de citron, il semblerat que ce soit le mme interfrent qui engendre une rponse lors de lanalyse LC-ESI/sSRM des deux chantillons dhuile essentielles de citron. Si la dtection dune douzaine de pesticides na pas t confirme par lanalyse LCESI/SRM-EPI, la prsence de dix-huit substances actives a pu tre confirme par cette mthode (Tableau 82). Les molcules dendosulfan sulfate et dhexaflumuron nont pas fait lobjet danalyse SRM-EPI car ces substances actives sont analyses en ESI- avec deux transitions SRM, leur deuxime transition a confirm leur prsence dans lchantillon.
Pesticide Azoxystrobine Buprofezine Carbendazime Chlorpyrifos Etoxazole Fnazaquin Fenpyroxymate Hexythiazox Linuron Mfnoxam Mthidathion Myclobutanil Pirimiphos methyl Prochloraz Pyrimthanil Pyriproxyfen Terbutylazine Thiabendazole Endosulfan sulfate Hexaflumuron
Tableau 82.
Concentration estime 25,4 1300,0 Non dtermine 8200,0 60,0 56,6 98,0 490 3 13,4 144 792 127 11000 60,4 2300 256 28 7 3,7
Fit/RevFit/Purity 94/96/93 96/93/93 96/93/91 90/91/87 83/83/74 97/67/67 93/69/67 89/56/54 81/67/63 89/90/86 80/70/60 91/87/86 96/93/92 80/66/65 96/95/93 80/67/66 98/97/96 96/85/84 Non analys Non analys
Confirmation Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui (2 transitions) Oui (2 transitions)
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Concentrations (g.L-1) en pesticides estimes partir de lajout dos ou de dilutions lors de lanalyse LCESI/sSRM et confirmes par lanalyse LC-ESI/SRM-EPI
Les substances actives du Tableau 82 admettent respectivement des Purity strictement suprieures 50 % et des Fit suprieurs 80 %, scores se rvlant trs satisfaisants. Les teneurs calcules varient de 3 g.L-1 pour le linuron 11 000 g.L-1 pour le prochloraz. La carbendazime a t dtecte et confirme, mais non quantifi, car cette molcule ntait pas prsente dans le mlange de surcharge. Il faut noter dans cet chantillon la prsence de quatre substances actives des teneurs relativement lves, suprieures au mg.L-1. Il sagit de la buprofzine (1,3 mg.L-1), du
246
chlorpyrifos (8,2 mg.L-1), du prochloraz (11 mg.L-1) et du pyriproxyfen (2,3 mg.L-1) dont les spectres EPI sont exposs dans le Tableau 83.
Chlorpyrifos solv's MS
Chlorpyrifos
197.9
Buprofezine's MS
Max. 5.1e5 cps.
Buprofzine
Max. 4.5e5 cp
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50
Unknown's MS
100 90 80
106.0
306.1
70 60 50 40 30
201.0
Rfrence
96.8
349.9
114.9
179.9
293.8 321.8
20 10
250.1 79.0 59.9 116.0 145.0 208.0 204.0 264.0
106.9 150.9 144.0 177.8
213.9
231.0
275.8
318.0
100
150
200
197.9
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
100 90 80 70 60 50 40 30
85.9 103.0
100600
Max. 3.8e7 cps.
106.0
150
200
250
Unknown's MS
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Max. 4.4e7 cps
100 90 80 70 60 50 40
96.9 114.9
Fit /RevFit/Purity
Fit /RevFit/Purity
306.1 201.1
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Echantillon
90/91/87
96/93/93
321.9 349.9 293.8
30 20
180.0 213.9
105.3
20
250.1 79.0 116.0 208.0
10
98.9
106.9 133.9 150.9 171.0
275.8 226.0 234.0 303.9
10
59.9 86.0 95.0 102.1 145.0 204.0 264.1
110.9
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
288.2
100 600
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
prochloraz's MS
Prochloraz
308.0
Pyriproxyfen's MS
Max. 3.2e5 cps.
Pyriproxyfen
Max. 5.5e5 cps
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
70.0 166.9 194.9 161.9 179.9 202.0 244.0 237.9 265.9
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
77.0
376.1
96.0
322.1
Rfrence
185.0
227.1
78.0 91.0 94.3 90.3 119.0 141.0 134.0 157.0 199.0 186.0 209.0 129.0
280.0
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da

307.8
400
450
500
0 50 550
100 600
Max. 5.8e7 cps.
150
200
250
Unknown's MS
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Max. 1.0e8 cp
100 90 80 70 60
266.1
100 90 80 70 60
95.4
Fit /RevFit/Purity
80/66/65
185.1
Echantillon
50
167.0 244.1 280.1
50
77.5 227.1
322.1
40 30
162.0 376.2 195.0 202.1
40
91.1
30
115.0 129.0 199.1 93.2 76.5
20 10
69.9 180.1 159.1 175.0 132.9 67.6 125.0 168.5 143.0 163.2 188.1 197.0
223.1 238.1 209.2 240.1 216.1 344.2
20 10
105.0 88.7 84.1 97.0 141.1 136.0 157.1 181.1
73.7
209.1 194.1
165.1 186.1
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
0 50 550
140.2 147.2
100 600
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 83.
Spectres EPI de rfrence et issus de lchantillon pour les quatre substances actives dtectes des teneurs suprieures au mg.L-1
247
Les spectres EPI du Tableau 83 mettent en vidence une trs bonne corrlation entre les spectres issus de lchantillon dhuile essentielle et les spectres de rfrence et, ce malgr des concentrations en pesticides leves. II.3 Analyse de deux huiles essentielles dorange douce Deux huiles essentielles dorange douce, la premire dorigine bio et provenant du Costa Rica et la seconde non bio originaire dEspagne, ont t analyses selon le protocole dcrit prcdemment. Le point clair de lhuile essentielle dorange se situant autour des 43C,266 cest la mthode dvaporation sous azote qui a t employe. Les injections des extraits dhuiles essentielles dorange ont t suivies des injections dajouts doss 50 g.L-1, prpars partir de ces mmes extraits. II.3.1. Analyse dun chantillon dhuile essentielle dorange bio tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 Lors de lanalyse LC-ESI/sSRM de lhuile essentielle dorange, seule la transition du fenthion a rpondu positivement et a conduit supposer une concentration de 41 g.L-1. La prsence du fenthion a t confirme en LC-ESI/SRM-EPI comme le montrent les spectres EPI du Tableau 84.
Fenthion's MS
Fenthion
279.1
Max. 3.6e5 cps.
100 90
148.9
80 70 60 50 40 30 20 10
77.0 98.9 152.9 105.0 121.0 173.0 91.0 158.9 137.0 183.1 171.0 219.0 201.0 168.9 247.0
Rfrence
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
279.0
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Max. 1.5e6 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30
201.0 148.9
Echantillon
20
98.9 171.0
10
79.0 121.0
173.0 154.0 159.0 183.0
219.0 247.0 265.0
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 84.
Spectres EPI de rfrence et issu de lhuile essentielle dorange pour la substance active fenthion
248
Les scores de corrlations entre le spectre EPI de rfrence et celui de lchantillon sont trs satisfaisants. Aux regards des deux spectres, il est ais de voir que lensemble des ions fragments caractristiques du fenthion sont prsents dans le spectre de lchantillon, dans des ratios similaires au spectre de rfrence. II.3.2. Analyse dun chantillon dhuile essentielle dorange non biologique Lors de lanalyse LC-ESI/sSRM de lhuile essentielle dorange, trente-neuf transitions ont rpondu positivement. Lensemble de ces substances actives, lexception du chlorfluazuron, diflubenzuron et endosulfan sulfate analyses en ESI- avec deux transitions, ont fait lobjet dune confirmation en LC-ESI/SRM-EPI dont les rsultats sont prsents dans le Tableau 85.
Pesticide
Bifenthrine Carbosulfan Deltamthrine Dimthoate Diuron Ethion Etoxazole Famoxadone Hexazinone Pipronil butoxide Prochloraz Profnofos Pyridaben Tbuconazole Ttraconazole Amtryn Atrazine Azoxystrobine Buprofzine Carbaryl Carbendazime Carbofuran Chlorpyrifos Clomazone Diazinon Difnoconazole Etofenprox Fenthion sulfoxide Flufenoxuron Malathion Mthidathion Propargite Pyraclostrobine Pyridafenthion Pyriproxyfen Trifloxystrobine Chlorfluazuron Diflubenzuron Endosulfan sulfate Tableau 85.
Concentration estime
14,9 0,8 20,0 2,5 5,4 2,2 2,4 9,3 20,1 0,7 1,2 1,3 3,2 19,5 2,3 1,3 2,0 22,2 8,2 6,7 Non dtermine 14,8 320,0 4,3 10,3 15,1 76,3 1,9 16,8 49,1 1950,1 883,3 186,4 6,8 9,8 28,7 0,5 8,8 22,9
Fit/RevFit/Purity
21/11/11 35/33/25 64/62/45 51/29/15 60/23/20 27/22/20 59/29/26 20/15/11 38/41/16 34/14/11 6/4/3 18/19/5 24/18/17 87/68/61 37/50/18 86/80/72 88/56/53 97/82/80 80/57/55 67/50/45 93/84/81 83/95/81 74/70/55 61/81/50 87/73/70 86/72/71 83/79/78 76/83/67 88/68/66 80/86/77 80/76/70 94/92/90 96/92/92 85/73/70 81/48/46 90/87/83 Non analys Non analys Non analys
Confirmation
Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Non Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui Oui (2 transitions) Oui (2 transitions) Oui (2 transitions)
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Bilan des substances actives dtectes dans lhuile essentielle dorange avec leur concentration estime et les rsultats de lanalyse de confirmation LC-ESI/SRM-EPI
249
Lanalyse de confirmation par LC-ESI/SRM-EPI a permis dinfirmer la prsence de 15 substances actives. Bien que les scores concernant la deltamthrine et le tbuconazole soient relativement corrects, linterprtation des spectres EPI conclut la prsence dinterfrents et non des substances actives (Tableau 86).
Deltamethrine's MS
Deltamthrine
521.4
Max. 1.9e5 cps.
Tebuconazole's MS
Tbuconazole
308.1
Max. 3.2e5 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
91.1 154.2 198.9 243.0 250.8 344.9 181.1
100 90 80 70 60 50 40 30
69.9
278.9
Rfrence
171.9
20 10
125.0 116.0
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Max. 3.1e6 cps.
0 50
Unknown's MS
100
150
200
250
300 350 m/z, Da

308.1
400
450
500
550
600
Max. 5.5e5 cps.
100 90 80 70 60 50 40 30 20
347.2
521.4
100
Fit /RevFit/Purity
90 80 70 60 50
153.0
64/62/45

152.0
tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012
Echantillon
40 30 20
180.0
10
91.0 135.0 172.0 189.1 195.0 209.1 243.1 261.1 291.0 319.0 329.0 392.4 503.4
10
159.3
209.1
237.0
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
0 50
100
150
200
250
300 350 m/z, Da
400
450
500
550
600
Tableau 86.
Spectres EPI de rfrence et issu de lchantillon dhuile essentielle dorange des substances actives deltamthrine et tbuconazole
Malgr linfirmation dune quinzaine de pesticides, il savre que lchantillon dhuile essentielle dorange non biologique est contamin par vingt-quatre substances actives dont vingt-et-une ont t confirmes par SRM-EPI et trois par une deuxime transitions lors de lanalyse LC-ESI/sSRM en mode ESI-. Les concentrations en pesticides varient de 0,5 g.L-1 (chlorfluazuron) 1950,1 g.L-1 (mthidathion). Une fois de plus, des teneurs relativement leves de plusieurs centaines de g.L-1 sont dtectes : chlorpyrifos (320,0 g.L-1), mthidation (1 950,1 g.L-1), propargite (883 g.L-1), pyraclostrobine (186 g.L-1).
250
III. Conclusion
Lanalyse de cinq chantillons dhuiles essentielles a permis dprouver la capacit de la mthode danalyse multi-rsidus LC-ESI-MS/MS dtecter, quantifier mais galement confirmer la prsence ou non de 250 rsidus de pesticides dans les huiles essentielles. Le Tableau 87 prsente la synthse des teneurs en substances actives dtectes et confirmes lors de lanalyse des cinq chantillons dhuiles essentielles.
Pesticide Ametryn Atrazine Azoxystrobine Buprofzine Carbaryl Carbendazime Carbofuran Chlorfluazuron Chlorpyrifos Clomazone Diazinon Difnoconazole Diflubenzuron Diuron Endosulfan sulfate Ethion Etofenprox Etoxazole Fenazaquin Fenpyroxymate Fenthion Fenthion sulfoxide Flufenoxuron Hexaflumuron Hexythiazox Linuron Malathion Mfnoxame Mthidathion Myclobutanyl Pipronil butoxide Pirimicarbe Pirimiphos methyl Prochloraz Profenofos Propargite Pyraclostrobine Pyridafenthion Pyrimthanil Pyriproxyfen Therbutylazine Thiabendazole Trifloxystrobine Nombre de substances actives sur un total de 44 Marjolaine Citron bio Citron non bio Orange bio Orange non bio 1,3 2,0 22,2 8,2 6,7 Non dtermine 14,8 0,5 320,0 4,3 10,3 15,1 8,8 22,9 76,3 60,0 56,6 98,0 41,0 1,9 16,8 3,7 490,2 3,1 88 4,1 49,1 4,0 13,4 144,0 790,0 1 950,1
21,0
25,4 1 300 Non dtermine
5 200 344
8 200
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0,5 7 410
180 10 127 11 000 78 883,3 186,4 6,8 60,4 2 300 256 28 9,8
28,7 9 2 20 1 24
Tableau 87.
Synthse des teneurs en substances actives en g.L-1 dtectes dans les cinq chantillons dhuiles essentielles
Lanalyse des cinq huiles essentielles a mis en vidence la prsence 44 substances actives diffrentes : 9 substances actives ont t dtectes dans lhuile essentielle de marjolaine bio , 2 et 20 dans les huiles essentielles de citron bio et non bio , 1 et 24 dans les
251
huiles essentielles dorange bio et non bio . Mme si le nombre dchantillons rels analyss et prsents dans cette partie est relativement restreint, plusieurs conclusions peuvent cependant tre proposes. La premire est que lorigine bio des huiles essentielles nassure pas labsence de rsidus de pesticides mme si, dans le cas des hesprids, le nombre et la concentration des substances actives sont bien moins levs dans les huiles essentielles bio . Deuximent, les concentrations en pesticides dtects peuvent tre considrables en atteignant plusieurs mg.L-1 dhuile essentielle. Ainsi, lhuile essentielle de marjolaine admet 5,20 mg.L-1 de chlorpyrifos, lhuile essentielle dorange non bio admet 1,95 mg.L-1 de mthidathion et lhuile essentielle de citron non bio admet 1,3 mg.L-1 de buprofzine, 2,3 mg.L-1 de pyriproxyfen, 8,2 mg.L-1 de chlorpyrifos et 11 mg.L-1 de prochloraz. Par ailleurs, il faut noter que la substance active chlorpyrifos est dtecte dans trois des cinq chantillons tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 des concentrations repectives de 5,2 mg.L-1 (marjolaine), 8,2 mg.L-1 (citron) et 0,32 mg.L-1 (orange). Le dernier point concerne le nombre important de substances actives dtectes simultanment dans une huile essentielle et, notamment, dans celles des hesprids non bio pour lesquelles ont t retrouvs 20 (citron) et 24 (orange) pesticides. Ce constat tmoigne du nombre consquent de traitements que subissent ces vgtaux.
252
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CONCLUSION GENERALE
254
Conclusion Gnrale
Ce travail a dmontr les solutions analytiques apportes, la fois par lutilisation dun systme de type triple quadriple quip dune cellule LINAC et par la mise en place du mode Scheduled SRM (sSRM), dans le contexte dune analyse multi-rsidus de 242 pesticides dans un chantillon constitu dun solvant dinjection LC classique. Ltude bibliographique a conclu sur le lien entre huiles essentielles et produits phytosanitaires. Elle a aussi montr que peu de rsultats taient disponibles dans la littrature sur la recherche de pesticides dans les huiles essentielles. Ceci est d au fait que ces matrices sont considres comme difficiles traiter dans le contexte danalyse multi-rsidus, cause des processus dextraction dont elles sont issues, et de leur caractre apolaire. Dailleurs, pour appliquer la mthode danalyse multi-rsidus au cas concret de la dtection de pesticides dans les huiles essentielles, plusieurs difficults sont apparues. Il a dabord t ncessaire dadapter les conditions dinjections LC, puis linfluence de la nature de la matrice sest rvele. En effet, si dans le cas de lhuile tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 essentielle de lavandin, une simple dilution au 1/10e dans du mthanol acidifi tait suffisante, il a t ncessaire de dvelopper une mthodologie plus complexe dans le cas de lhuile essentielle de citron. Dans ce cas, une prcipitation des cires par immersion dans de lazote liquide a t mise en place avant prlvement du surnageant et introduction dans le dispositif analytique. Toutes ces prcautions ont permis de disposer dune mthode danalyse applicable la dtection de pesticides dans diffrents types dhuiles essentielles sucharges. Afin damliorer la sensibilit de la mthode, il a t montr quune tape dvaporation sous azote peut tre considre comme une procdure ad-hoc denrichissement de pesticides pour la quantification de 250 substances actives, potentiellement prsentes dans des huiles essentielles caractrises par des points clairs relativement bas, comme celles exprimes partir des hesprids. Enfin, dans le but de disposer dune mthode la fois plus sensible et plus fiable, un nouveau mode dacquisition mlangeant la dtection sensible du mode SRM et la confirmation rapide du mode EPI, a t test. Elle implique deux injections, la premire couvre une large gamme de pesticides pour leur dtection sensible en sSRM et la seconde sattache proposer une identification des transitions rvles dans le premier cas en mode SRM-EPI. Cette mthodologie a t directement applique lanalyse de cinq chantillons rels dhuiles essentielles. Ces analyses ont rvel la prsence dune quarantaine de substances actives des concentrations variant de quelques microgrammes plusieurs milligrammes par litre dhuile essentielle. Le nombre de pesticides dtects au sein dun mme chantillon peut se rveler consquent, puisque 20 et 24 pesticides ont pu tre quantifis, respectivement dans les huiles essentielles de citron et dorange dorigine non bio . De plus, mme si le nombre
255
Conclusion Gnrale
de pesticides et les concentrations sont bien moins importants, il faut noter que lorigine bio dune huile essentielle nassure pas pour autant labsence de pesticides. Ces rsultats mettent en vidence limportance de disposer dune mthode danalyse multi-rsidus de pesticides afin de contrler leurs teneurs dans les huiles essentielles. En effet, il faut rappeler quen plus des nombreuses applications des huiles essentielles, entre autres dans les domaines industriels et laromathrapie, ces extraits sont accessibles auprs du grand public pour un usage personel. Ce travail a donc abouti la mise au point dune mthode danalyse multi-rsidus permettant la dtection et la quantification de 250 pesticides dans les huiles essentielles par par LC-MS/MS une teneur moyenne dune dizaine de microgramme par litre. Toutefois, malgr la trs grande polyvalence de cette technique, certains pesticides ne peuvent pas tre analyss par LC-MS/MS. Cest pourquoi une mthode danalyse GC-MS/MS comportant une tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 vingtaine de composs a t dveloppe paralllement. La mthode analytique dveloppe au cours de ce projet autorise dsormais le contrle dune multitude de pesticides dans les huiles essentielles. Elle pourrait notamment se rvler trs utile dans le cadre de la mise en place dune tude sur lvaluation des facteurs de concentration des pesticides au cours des procds dextraction des huiles essentielles. Une telle tude pourrait ventuellement aboutir ltablissement de limites rglementaires sur les concentrations en pesticides autorises dans les huiles essentielles. Enfin, mme si la mthode analytique dveloppe autorise la dtection dun grand nombre de pesticides, elle reste nanmoins soumise au principe de on ne trouve que ce que lon recherche . Il est donc probable quune amlioration significative de la mthode soit apporte dans un futur proche grce lavnement de nouveaux spectromtres de masse de type QqTOF. Pour linstant limits par leur sensibilit et leur gamme dynamique, ces appareils sont en voie de proposer la dtection de la quasi-totalit des composs dun chantillon des sensibilits quivalentes au QqLIT utilis dans ce projet.
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REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
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Rsum et Abstract
ABSTRACT
Nowadays, about 3000 essential oils are produced and used worldwide in various application fields related to pharmaceutical, agronomic, food and perfume industries. These oils are extracted from citrus or medicinal and aromatic plants. Due to the use of pesticides in plant cultivation, the presence of such residues cannot be ruled out. The variety of pesticides used and the widespread use of essential oils necessitate the development of a multi-residue analytical method to ensure consumers health. The state of the art of analytical methods related to this issue has revealed a clear lack of performance both in terms of detection limit as well as in the number of analyzed pesticides. This manuscript proposes the development of a multi-residue analytical method of pesticides in essential oils by coupling liquid chromatography and mass spectrometry, tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 technology which is, considering the bibliography, the best dedicated to answer this problematic. After demonstrating the performance of the new acquisition mode Scheduled SRM, available on the mass spectrometer 4000 QTrap, for the detection and quantification of 250 pesticides in a determined solvant, the importance of considering the nature of matrix in samples preparation as well as during the samples analysis has further been proved by the study of two representative essential oils (lavandin and lemon). Finally, the multi-residue LCMS/MS analysis method has been applied to the research of pesticides in real essential oils. This method has demonstrated its ability to detect, quantify and identify pesticides in these matrices through the use of a coupled acquisition mode SRM-EPI making use of the hybrid mass spectrometers specificities and especially its linear ion trap. Moreover this work has shown the importance of having such a method, considering the number of detected pesticides and their relatively high concentrations. These ones can indeed reach a level higher than one milligram per liter in the analyzed essential oils.
Keywords: pesticide, essential oil, multi-residue analysis, mass spectrometry, LC-MS/MS, Scheduled SRM, linear ion trap, electrospray, 4000 QTrap.
266
Rsum et Abstract
RESUME
De nos jours, environ 3000 huiles essentielles sont produites et utilises dans le monde avec des champs dapplication aussi varis que la cosmtique, la parfumerie lagroalimentaire, la pharmacie et laromathrapie. Ces huiles sont extraites des hesprids ou des plantes aromatiques et mdicinales. tant donn que la culture de ces matires premires implique gnralement lapplication de pesticides, la prsence de tels rsidus dans les huiles essentielles ne peut pas tre carte. Compte tenu du nombre important de pesticides employs et des nombreux champs dapplication des huiles essentielles, il apparat ncessaire, afin dassurer la sant du consommateur, de disposer dune mthode danalyse multi-rsidus capable de doser les pesticides dans les huiles essentielles. Ltat de lart des mthodes danalyse li cette problmatique a rvl un manque vident de performance des mthodes tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012 actuelles aussi bien en termes de limite de dtection que du nombre de pesticides analyss. Ce mmoire propose donc la mise au point dune mthode danalyse multi-rsidus de pesticides dans les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide et de la spectromtrie de masse, technologie la plus mme de rpondre la problmatique au vue de la bibliographie. Aprs avoir mis en vidence les performances du nouveau mode dacquisition Scheduled SRM, disponible sur le spectromtre de masse 4000 QTrap, pour la dtection et la quantification de 250 pesticides dans un solvant dtermin, limportance de considrer la nature de la matrice, aussi bien dans les mthodes de prparation que lors de lanalyse de lchantillon, a ensuite t dmontre en tudiant deux huiles essentielles reprsentatives (lavandin et citron). Enfin, la mthode danalyse multi-rsidus LC-MS/MS a t applique la recherche de pesticides dans des chantillons rels dhuiles essentielles. Elle a dmontr sa capacit dtecter, quantifier et identifier les pesticides dans ces matrices au travers de lutilisation dun mode dacquisition coupl SRM-EPI faisant appel aux spcificits du spectromtre de masse hybride et notamment de sa trappe dion linaire. Ce travail a de plus rvl limportance de disposer dune telle mthode au regard du nombre de pesticides dtects dans les chantillons et de leurs concentrations relativement leves. Celles-ci peuvent en effet atteindre des teneurs suprieures au milligramme par litre dans les huiles essentielles analyses.
Mots cls : pesticide, huile essentielle, analyse multi-rsidus, spectromtrie de masse, LCMS/MS, Scheduled SRM, trappe dions linaire, electrospray, 4000 QTrap.

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ANNEE 2010-2011 N DORDRE 1147

Devant le jury ci-dessous :

Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Membre invit

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ANNEE 2010-2011 N DORDRE 1147

Devant le jury ci-dessous :

Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Membre invit

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Table des Matires

TABLE DES MATIERES

CHAPITRE I Etude Bibliographique Les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Les Huiles Essentielles ______________________________________________________ 7

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Les Produits Phytosanitaires ________________________________________________ 30

Table des Matires

La source dionisation par electrospray ESI ___________________________________ 57

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La Spectromtrie de Masse _________________________________________________ 75

Table des Matires

CHAPITRE III Mise au Point de la Mthode d'Analyse Multi-Rsidus LC-ESI/MS/MS

Optimisation des paramtres de dtection en spectromtrie de masse _____________ 107

Cahier des charges impos par le couplage LC-MS/MS _________________________ 119

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Table des Matires

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Table des Matires

208 209 209 210 211 211 211 212 213

Dveloppement dune mthode de confirmation en mode SRM-EPI ______________ 215

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Application lanalyse dchantillons dhuile essentielle ________________________ 229

tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

Liste des communications crites et orales

LISTE DES COMMUNICATIONS ECRITES ET ORALES

tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

Liste des Abrviations

LISTE DES ABREVIATIONS

tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

Liste des Abrviations

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tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

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mth - mmes mth

Vmatrice (mL) Vsolvant (mL)

Quantit finale en pesticide 100 Quantit initiale en pesticide

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Etude Bibliographique Les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

A) Les Huiles Essentielles

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Gnralits sur les huiles essentielles

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

tel-00675561, version 1 - 1 Mar 2012

Cannelle (corce) Figure 2.

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Photographie dune coupe transversale dun citron

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Photographie dcrivant le principe de la FMC-in-line

Reprsentation schmatique du principe dhydrodistillation traditionnelle

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Chapitre I. Etude Bibliographique : les Huiles Essentielles et les Produits Phytosanitaires

Huile essentielle Phase aqueuse Systme deau reflux