Analyses Biologiques

Contrle microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech Dpartement STIA.
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ACADEMIE DE MONTPELLIER UNIVERSITE MONTPELLIER II - SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC -----
Dpartement
Sciences et Technologies des Industries Alimentaires
MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS
Professeur Jean-Louis CUQ
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I. GENERALITES
Ce document contient des informations de basesur lesquelles les Ingnieurs des Industries agroalimentaires que vous serez trs prochainement pourront sappuyer pour crer et/ou utiliser un laboratoire danalyses microbiologiques. Il devrait ainsi vous permettre de raliser les diffrentes analyses et les divers contrles indispensables la matrise de la qualit des produits alimentaires mais aussi de la qualit hyginique de lenvironnement de production et de distribution. A - INTERET DE LA BACTERIOLOGIE ALIMENTAIRE. Le contrle de la qualit microbiologique de nos aliments a t pendant longtemps limit aux contrles des produits finis, le plus souvent par rapport une norme. Ces analyses ont t souvent lapanage de laboratoires spcialiss car il est bien connu que lvaluation de la qualit hyginique de nos denres alimentaires ncessite beaucoup de matriel, un personnel qualifi et reste encore lourde, longue et coteuse. En consquence, cette valuation est encore difficilement applicable un nombre dchantillons reprsentatifs dun lot ou dune production. La matrise de la qualit microbiologique (hyginique obligatoire et marchande souhaite par le fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de dmarches qui vont du contrle des matires premires brutes, en cours de transformation ou de laliment fini, aux pratiques de bonnes fabrications en passant par lidentification des principaux points critiques du systme de production / distribution, le plus souvent par une dmarche HACCP. Ces analyses prennent aujourdhui largement place dans la plupart des usines et des rseaux de distribution et permettent, par la ralisation de contrles judicieux, une bonne valuation de la qualit et une mise en vidence dventuelles contaminations, les actions correctives qui en dcoulent sans pour autant trop alourdir les charges. Dans ce contexte lanalyse microbiologique traditionnelle des produits finis reste encore indispensable car elle permet avec une certaine inertie dviter, dans le cas o des produits dangereux ou non conformes seraient fabriqus, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrle souvent pratiqu par des laboratoires officiels (DGCCRF: Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes , Laboratoires des Services Vtrinaires, etc.) nest pas prventif et ne permet pas de matriser la qualit microbiologique des produits fabriqus. Utilis seul, il se rvle sans grand intrt et souvent mme inutile si sa mise en uvre est longue et sans suite. Le contrle en cours de production doit permettre de dterminer les points critiques. Il faut donc choisir une mthode danalyse qui permette, aprs interprtation, de ragir sur la fabrication en amont par un vritable feed-back quand un dfaut dorigine microbienne est dtect. On comprend donc lintrt que portent les microbiologistes aux mthodes danalyse rapides ou ultrarapides quand on sait que 24 heures plus de quinze jours sont parfois indispensables pour obtenir des donnes quant la qualit du produit ou de ses drivs. Les mthodes danalyse mises en uvre doivent tre rapides, fiables, reproductibles et si possible simples (et peu coteuses) ; elles consistent en une recherche et/ou une numration des principaux germes microbiens rencontrs dans nos aliments afin den matriser leur prsence ou absence (dans le cas de germes dangereux responsables de maladies infectieuses) et leur nombre (dans le cas de
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germes peu dangereux, contaminants ou htes normaux des matires premires composant la denre). (ne jamais perdre de vue quil faut absolument garantir la scurit des consommateurs en permettant la dtection des microorganismes dangereux ou ventuellement de mtabolites toxiques ou de toxines microbiennes et assurer au produit une bonne qualit et une bonne conservation). Au plan sanitaire la liste des bactries dangereuses responsables de maladies aprs consommation daliments contamins a tendance saccrotre : aux Salmonella diverses, Shigella, Staphylococcus aureus entrotoxinognes et Clostridium perfringens sont venus sajouter Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli entropathognes ou encore des bactries des genres Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, Brucella etc. Le contrle microbiologique de routine dun produit alimentaire solide ou liquide consiste le plus souvent, en absence dinformation sur lventuelle implication de ce produit une maladie infectieuse, une toxi-infection ou une intoxination, en : - un contrle de strilit pour des produits soumis des traitements antimicrobiens de stabilisation (temprature, additifs, etc.) - une estimation du nombre des contaminants (flore arobie msophile totale, coliformes, anarobies sulfito-rducteurs) ou leur dtection - identification (Salmonella, Listeria etc). Ce contrle est actuellement long (plusieurs jours), ce qui implique souvent : - de stocker le produit en attendant la rponse (impossible pour les produits trs prissables) - de diffuser le produit sans connatre sa qualit bactriologique avec tous les risques que cela comporte. B . LES RISQUES AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE Il est clair que les risques lis la manipulation de microorganismes, dont lidentit et le pouvoir pathogne sont souvent inconnus dans les premires tapes de leur analyse doivent tre parfaitement matriss par des pratiques et un environnement sans dfaut. Il faut que le microbiologiste soit toujours conscient des risques lis la manipulation de bactries et un degr moindre de levures et moisissures, en particulier aprs leur amplification ncessaire 9 10 leur tude. Rappelons quune colonie est constitue denviron 10 10 cellules et quune turbidit 8 apprciable dun milieu de culture liquide correspond environ 10 cellules par ml. La matrise du risque microbiologique passe par la parfaite connaissance : - des germes manipuls ou recherchs - des voies de pntration de ces germes dans lorganisme - des meilleures mthodes de manipulation pour minimiser ce risque. Les microorganismes sont classs en 4 groupes en fonction des risques potentiels quils reprsentent. Le groupe 1 comprend des microorganismes peu dangereux pour le microbiologiste et son environnement. Le groupe 2 correspond des germes faisant courir des risques modrs aux manipulateurs et des risques limits la communaut. Le groupe 3 est constitu de microorganismes haut risque pour le manipulateur et risque modr pour la communaut. Le groupe 4 correspond de microorganismes trs dangereux pour le manipulateur et son environnement. Les voies de linfection sont essentiellement : - buccale (ingestion) : pipetage, port la bouche des doigts ou dobjets contamins comme des cigarettes, des stylos, des aliments etc. Ce type de contamination rsulte dun travail aseptique incorrect ou encore de projections, renversements ou actions diverses non contrls. - arienne (trache artre, poumons) par des arosols (particules liquides ou non en suspension dans lair et porteuses de germes). Ces arosols peuvent tre gnrs par des oprations classiques (homognisateur, centrifugeuse, etc.) et leur pouvoir de contamination est trs grand.
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- par contact cutan (Brucella, Staphylococcus ou encore Pseudomonas par exemple) ou au niveau de muqueuses ou dorganes comme les yeux. - par pntration sous-cutane accidentelle (par piqre ou au niveau dune plaie). C - LE LABORATOIRE Le laboratoire danalyse microbiologique doit tre mme de raliser des analyses de routine (contrle de qualit par rapport une norme, valuation de la qualit des matires premires), mais aussi de permettre lvaluation de la qualit des oprations de transformation ou de prparation, la recherche et matrise des ventuels points critiques (HACCP), lvaluation de lefficacit des traitements antimicrobiens de conservation, demballage ou de nettoyage etc. Les microorganismes susceptibles dtre rencontrs appartiennent pour la plupart aux groupes 1, 2 et ventuellement 3. Ceci impose donc des rgles fondamentales de conception et de fonctionnement du laboratoire danalyse microbiologique. Le laboratoire doit tre compos de trois parties principales : - le laboratoire proprement dit o sont ralises les analyses - la salle de prparation des milieux de culture - la laverie qui traite les produits et matriels utiliss pour lanalyse et qui fournit la verrerie et le matriel propre et strile. La laverie et la salle de prparation peuvent ne constituer quune seule pice.
Echantillonnage prlvement Matriel usage unique Ensemencement Etuvage
Echantillons analyser
LABORATOIRE Salle de manipulations
Lecture
matriels contamins Stockage des milieux et matriels striles
Verrerie sale non contamine
Autoclavage (121 , 20 mn) C
Lavage
strilisation - autoclave - filtration
prparation des milieux
Cotonnage Dchet poubelle
Strilisation four Pasteur (180 10 60 mn) c,
Le laboratoire danalyse doit disposer : - dun espace suffisant avec une circulation limite. Deux ou trois parties sont souhaitables mais non ncessaires. - de murs, plafonds et sol dsinfecter. lisses mais non glissants, non absorbants, faciles nettoyer et
- dun clairage naturel ou artificiel de bonne qualit. Les fentres coulissantes avec montants aluminium quipes de volets roulants conviennent bien.
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- de plans de travail lisses et rsistants. - de lampes UV disposes au plafond et quipes dune minuterie au moins dans la salle de travail. Le plan prsent sur la figure 1 est une proposition type de conception du laboratoire. Il ne faut pas perdre de vue que le bon fonctionnement du laboratoire requiert, en particulier aux niveaux des manipulations, des personnels qualifis. Propret et rgles dhygine strictes doivent y rgner.
documentation bibliographie bain-marie viers four Pasteur rangements produits divers viers tagres paillasses
bureaux frigo
lave-vaisselle
autoclave prparation de milieux tuves 25 -30 (37)-44 C hottes flux laminaires
souchier
figure 1 . Schma type dun laboratoire danalyse microbiologique
D. MATERIEL MICROBIOLOGIQUE
DEQUIPEMENT
DU
LABORATOIRE
DANALYSE
Lquipement dun laboratoire de microbiologie alimentaire diffre peu de celui dun laboratoire de bactriologie mdicale. Il faut disposer ainsi dune rserve de produits chimiques les plus courants et de milieux ou de composants de milieux de culture (deshydrats si possible) et de colorants. En microbiologie alimentaire, la frquence des tudes quantitatives et qualitatives et leur varit font quil est ncessaire de disposer dun nombre lev de milieux de culture et de matriels divers (tubes essai, erlenmeyers, botes de Ptri, pipettes, etc). Il est indispensable de disposer dun certain nombre dquipements et de matriels tels que : D . 1 . Systmes de strilisation / dsinfection et zones striles: 1) Lautoclave vertical ou horizontal pour la strilisation en milieu vapeur des milieux, des dchets est indispensable. La strilisation est gnralement ralise 115 ou 120 C pendant 10 30 minutes. 2) Le four Pasteur permet la strilisation sec du matriel en verre ou en mtal et doit pouvoir atteindre une temprature de 170 - 180C. 3) Les systme de micro ou ultra filtration membrane sont utiliss pour les milieux de culture liquides non autoclavables et pour lanalyse e liquides (eau par exemple).
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4) Les lampes UV germicides munies dune minuterie et installes dans la pice principale de manipulation ainsi que dans les hottes flux laminaires. Leur effet sur un germe donn est fonction de la puissance de la lampe, de la longueur donde du rayonnement UV, de la distance et du temps dirradiation. Elles sont efficaces sur les zones claires . Il est essentiel de se protger vis--vis dune exposition directe, la muqueuse oculaire tant particulirement sensible. 5) Les rcipients contenant par exemple de lhypochlorite de sodium pour recueillir les matriels souills tels que lames tats frais, les pipettes, les cnes usage unique etc. La rcupration des milieux contamins aprs lecture peut se faire dans des sacs en polypropylne qui ne seront limins quaprs autoclavage. 6) Les zones de travail sont situes dans la zone de protection de becs Bunsen avec dclenchement par bouton pied et/ou dans des hottes flux laminaires qui selon leur fonctionnement protgent avec efficacit soit le produit (figure 2), soit loprateur (figure 3), soit les deux (figure 4), ces hottes tant classes en trois catgories en fonction de leur fonctionnement. Elles sont utilises pour la distribution aseptique des milieux et le remplissage de botes de Ptri. Un flux dair strilis par filtration est dirig sur la zone de travail soit horizontalement, soit verticalement avec ou non un recyclage. Il ne sagit pas de zones de scurit et les hottes de classe I ne peuvent pas tre employes seules pour les manipulations des microorganismes ; dans ce cas, le travail strile est ralis dans la zone de protection dun bec de gaz, ce dernier prsentant nanmoins linconvnient de perturber le flux dair dans le systme. lampe UV lumire HOTTES DE CLASSE I Protection du produit
turbine
filtre polyamide d' efficacit de rtention de 90 % pour des particules de d> 5 m filtre absolu d' efficacit de rtention de 99,999 % pour des particules de d > 0,3 m
figure 2 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du produit
HOTTES A FLUX LAMINAIRE horizontal de classe I Protrection du manipulateur pas du produit
figure 3 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du manipulateur
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HOTTE DE CLASSE II flux vertical Protection du produit et du manipulateur
figure 4 . Hotte flux laminaire vertical de classe II avec protection du manipulateur et du produit
Les hottes de classe III protgent avec une trs grande efficacit produit et manipulateur mais restent dune utilisation difficile. Il sagit en fait de botes gants tanches et striles (figure 5).
HOTTE DE CLASSE III
igure 5. Hotte flux laminaire de classe III
Dans ces hottes la vitesse linaire de lair est voisine de 0,25 1 m.sec-1. La dcontamination de ces hottes doit tre effectue quotidiennement (surface de travail et cts). Le formol est certainement le meilleur dsinfectant car il assure la strilisation la plus homogne; les phnols laissent des rsidus, et lhypochlorite est trs corrosif. Ltanchit de la hotte doit tre contrle ainsi que lintgralit du filtre strilisant HEPA. Si ce dernier filtre doit tre chang, il faut le faire aseptiquement et placer immdiatement le filtre dans un emballage en polypropylne tanche. Fabrication du formol Le formol peut tre gnr par bullition dune solution de formaldhyde 40 %. Sa concentration -3 dsinfectante optimale est de 50 mg.m qui sont par exemple obtenus par bullition de 25 ml de formol 40 % dans une hotte de 0,35 m3.Le formol peut aussi tre gnr partir du chauffage sec de paraformaldhyde (3 g par hotte) ou par addition de 6 g de permangante de potassium 25 ml de formol 40 % temprature ambiante. Il est galement possible de gnrer la quantit de formol ncessaire la strilisation de la hotte par mlange de 4 g de paraformaldhyde, 8 g de permanganate de potassium et 10 ml deau. La dure de ce type de traitement doit tre dune dizaine dheures et le systme de ventilation mis en marche au moins une demi-heure avant rutilisation.
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D . 2 . Matriels dincubation et de prparation des milieux Il faut disposer dtuves bactriologiques qui doivent pouvoir tre rgles avec prcision entre 25 et 55C. Trois tempratures dtuvage sont gnralement utilises en microbiologie alimentaire. Deux jarres anarobies et leur ncessaire de contrle de latmosphre (catalyseur, gnrateur dhydrogne et de gaz carbonique, indicateur au bleu de mthylne) sont indispensables ltude des germes anarobies stricts. Deux bains-marie sont ncessaires pour rgnrer les milieux de culture (100C) et les maintenir en surfusion (45 47 C). Une diminution de lmission de vapeur deau est obtenue par recouvrement de la surface par des petits morceaux de polystyrne. Un four microondes permet de rduire la dure des traitements thermiques des milieux (prparation chaud, rgnration). Deux balances (porte 1 2 kg au 1/10 de g et porte denviron 200 g au 1/10 de mg) sont indispensables la prparation des milieux et de lchantillon. Il faut toujours disposer de nombreux tubes essai en verre de 16 x 160 ou 18 x 180 mm (rutilisables aprs lavage et bouchs au coton card ou avec des bouchons thermostables en polypropylne) ou des tubes en polycarbonate striles et usage unique (tubes hmolyse) et de rcipients de volumes varis et strilisables (flacons, erlenmeyers, bchers etc). Des pipettes striles usage unique, et des systmes de pipetage automatiques cnes strilisables en propylne et usage unique sont Un agitateur magntique chauffant (barreaux tflons) et une seringue de Cornwall rpartiteur volumtrique sont ncessaires la prparation est la distribution des milieux. D . 3 . Prparation des chantillons et culture microbienne Les chantillons sont amens au laboratoire dans leur emballage dorigine sil sagit de produits finis ou dans des flacons ou rcipients striles sil sagit de produits en vrac ou de prlvements. Il faut parfois disposer de matriels permettant le prlvement daliments dans des emballages solides (poinons, ouvre-botes) ou encore de matriels indispensables au prlvement daliments solides ( cautrisateurs, pipettes harpons, etc). Le premier traitement auquel sont soumis la plupart des produits consiste, aprs prlvement dune partie aliquote, en une homognisation . Celle-ci est ralise au moyen de mortiers ou par des broyeurs couteaux (Virtis par exemple) ou des appareils de Potter ou encore par un Stomacher (figure 6). Cette opration doit permettre la mise en suspension homogne des microorganismes prsents sur ou dans le produit analys en vitant cependant toute contamination externe ou une inactivation des germes par des conditions trop drastiques (ultra turrax avec chauffement par exemple). Une centrifugeuse atteignant 3 4000 g permet, en peu de temps, de dcanter les microorganismes prsents dans les liquides. Des tubes bouchs sont indispensables pour viter la contamination arienne. Un vortex permet dhomogniser les suspensions bactriennes prsentes dans les tubes, en particulier au moment des dilutions ou des prlvements. Avec cet appareillage, il faut engendrer un nud de vibration entre pouce et index une hauteur du tube qui est en dessous du niveau du coton card. ou un
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mortier et pilon
Broyeur de POTTER
broyeur type VIRTIS
homognisateur type Stomacher
figure 6 . Schma des divers systmes de broyage / homognisation
Un trs grand nombre matriels usage unique (si possible) comme des botes de Ptri en polycarbonate de 90 mm de diamtre ou plus, de tubes essai et hmolyse, des pipettes gradues striles (1 et 10 ml) ou de pipettes automatiques (de 0,1 ou 1 ml) cnes en polypropylne strilisables, des pipettes Pasteur, des cannes de verre, des anses de platine etc. Un ensemenseur spiral et un compteur de colonies laser ou par analyse dimage ne simposent que si le nombre danalyses raliser quotidiennement est lev. Pour faciliter la numration des colonies dans les botes de Ptri il est possible dutiliser un systme du type stylo-compteur. Un systme complet de filtration doit faire partie intgrante de lquipement de base du laboratoire. D . 4 . Microscopie Bien que non prioritaire parmi les quipements, le microscope et son environnement de lames, lamelles, colorants et ractifs divers, constitue un outil important du laboratoire danalyse microbiologique. Pour un agrment dutilisation avec un minimum de fatigue et une meilleure image il est souhaitable dadopter les systmes binoculaires. De nombreux fabricants proposent un choix important de tels quipements; il faut veiller la qualit des optiques, mais aussi de la partie mcanique de lappareil. Les oculaires x10 sont les plus communs et il faut disposer dobjectifs x10, x 40 sec et x100 immersion. Lentretien des parties optiques du microscope doit tre ralis avec soin (xylne et papier joseph); il est aussi ncessaire de vrifier priodiquement le centrage de la lampe avant le condenseur. Pour lanalyse en DEFT, il faut disposer dun microscope adapt (pifluorescence). Lvolution des techniques immuno-microbiologiques avec dtection de marquage par anticorps fluorescents requiert galement des appareils adapts. Les microscopes quips de platines motoriss et dune camro vido permettant la saisie et le traitement des images (au moyen de logiciels de plus en plus perfectionns et accessibles); ils constitueront un outil performant dans la mesure ou lautomatisation et le traitement de limage seront simples et performants. Les ractifs colorants les plus utiliss sont ceux qui permettent la coloration de Gram (thanol, violet de gentiane, lugol, fuchsine) ou des colorations simples (bleu de mthylne phniqu). Ces ractifs sont disponibles prts lutilisation chez bon nombre de fournisseurs de produits. Veiller
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ne pas colorer la peau (doigts en particulier), certains de ces colorants ragissant avec les protines ou les acides nucliques. La prsence dune loupe binoculaire (x 100 par exemple) permet, entre autre, de bien caractriser les colonies. E . TECHNIQUES GENERALES Leau les matires premires et bon nombre de denres alimentaires ne sont pas, quelques exceptions prs comme le lait strilis, les conserves par exemple, des produits striles. La qualit marchande des produits dpend beaucoup du contrle de la flore prsente par des moyens physiques (temprature, pH, activit de leau par exemple) ou chimiques (additifs effets antimicrobiens) et par des rgles de bonne fabrication. Le microbiological guideline comporte en effet des rgles appliquer avant, pendant et en fin de prparation, pour la distribution et le stokage; ces recommandations sont fondes sur le respect de bonnes pratiques professionnelles (BPP). Les diverses tapes de ces BPP se situent au niveau des ateliers (construction, matriels et machines, outillages, facilit de nettoyage etc.), de la qualit microbiologique des matires premires et de leau , du personnel au niveau de son comportement et de son ducation hyginiques, de la pertinence et de lefficacit des traitements antimicrobiens appliqus aux produits ou aux systmes potentiellement dangereux et enfin de la mise en place dun ensemble de conditions de distribution les plus favorables au maintien de la qualit. Les spcifications microbiologiques sont des critres applicables pendant et aprs la prparation afin de sassurer que lhygine et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la rglementation. Les parties prenantes dun march y trouveront des garanties. Les normes sont des spcifications microbiologiques adoptes par la lgislation qui sadressent au produit fini et fixent les limites acceptables de prsence de microorganismes donns dans des produits bien dfinis. Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux (OMS, FAO, ISO, ICMSF, CEE, AFNOR, CNERNA , DGCCRF, services vtrinaires, etc.) qui se proccupent de ltablissement de critres de qualit microbiologique de nos aliments. La qualit hyginique dpend surtout de la nature mais aussi souvent du nombre de la flore microbienne prsente dans le produit. Si cette flore est compose de microorganismes susceptibles dengendrer des maladies aprs consommation (maladies infectieuses, toxi-infections, intoxinations ) le produit est dangereux et ne doit en aucun cas tre commercialis. Il appartient alors au microbiologiste de dtecter le ou les points critiques affectant cette qualit hyginique pour laquelle la norme zro dfaut doit tre un objectif prioritaire de lensemble du systme de production. En bactriologie alimentaire il nest donc pas ncessaire de rechercher, de compter et didentifier systmatiquement toutes les bactries, levures et moisissures prsentes dans le produit. Il suffit souvent deffectuer : 1) une tude quantitative de la flore microbienne : - soit par dnombrement dune flore microbienne donne caractrise par un ensemble de proprits physiologiques communes comme par exemple numration de la flore arobie msophile revivifiable sur un milieu du type glose nutritive ordinaire (germes htrotrophes peu exigeants, msophiles si la temprature dincubation est voisine de 30C avec une dure dincubation gnralement infrieure 72 heures, neutrophiles si le pH est voisine de 7, arobie ou aro-anarobie si lincubation est ralise lair), la numration des levures et moisissures confondues (germes acidophiles, arobies pour la plupart, msophiles bas etc.), la numration des
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anarobies sulfito-rducteurs (germes htrotrophes, rduisant les sulfites en sulfure dhydrogne, msophiles, anarobies stricts). La prsence de bactries dorigine fcale ou tellurique tmoigne dans nos aliments dun manque dhygine et dun dfaut de rigueur technique et peut laisser craindre la prsence concomittante dans le produit de bactries entropathognes en nombre difficilement dtectable ou aprs un temps danalyse important. - soit par dnombrement dun groupe bactrien pouvant correspondre une contamination dtermine: coliformes thermotolrants et/ou streptocoques du groupe D pour la mise en vidence dune contamination dorigine., staphylocoques pour la mise en vidence dune contamination dorigine cutane, germes indolognes, germes putrides , etc... 2) une recherche oriente de certaines bactries pathognes telles que Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc.... Cette recherche exige lutilisation de mthodes spcifiques hautement slectives. Le plus souvent, ces analyses ne diffrent dun produit alimentaire un autre que par certains dtails dexcution. Parmi les analyses communes tous (ou presque tous) les produits alimentaires on peut citer par exemple les numrations des coliformes ou de la flore totale. La bonne qualit microbiologique (hyginique et marchande) est donc fonction de trs nombreux facteurs ; le microbiologiste se doit nanmoins de dfinir le plus rapidement possible la notion quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses matires premires (microorganismes habituelset tolrables), et dune flore contaminante dont le seuil de tolrance sera dfini en fonction du risque que fait courir cette flore un type donn de consommateur. E . 1 . Prlvements Les modalits des prlvements ont fait lobjet dun arrt publi au J.O. du 19 janvier 1980. Trs schmatiquement, la taille de lchantillon dun produit de mme nature rparti en portions unitaires doit tre au moins de 5 units (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 units pour les conserves. Le laboratoire doir disposer denviron 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant tre fournis par une ou plusieurs pices. Si le prlvement de 5 chantillons savre trop lev par rapport la production il est procd un talement dans le temps des prlvements. Ces prlvements doivent avant tout respecter des rgles daseptie et de reprsentativit. La prise dessai destine la prparation de la suspension mre et de ses dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes notamment pour les produits en tranche, hachs, diviss et les plats cuisins par exemple. Pour les produits liquides elle est effectue sur le produit homognis ou sur les parties superficielles et profondes. Dans le cas dexamens microbiologiques faisant suite une maladie de type TIA il faut rechercher les germes dangereux (pathognes, toxinognes) et leurs toxines aussi bien dans les prlvements de surface que dans la masse. Il faut tenir compte, pour un produit donn, des disparits possibles de fabrication et des disparits qui existent au niveau des rsultats fournis par le laboratoire (il est gnralement admis que la variabilit atteint une puissance de 10 ou mme plus ce niveau) . E - 1 - a . Echantillonnage Il sagit l dune tape fondamentale souvent dlicate. Les ouvrages consacrs lchantillonnage sont nombreux et des rgles prcises par produit ou milieu ont t dicts par lAFNOR et la DGCCRF; si les chantillons ne sont pas correctement prlevs et manipuls ou ne sont pas reprsentatifs dun lot ou dune production, les rsultats danalyse nauront aucune signification.
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Un chantillonnage reprsentatif est essentiel quand lanalyse a pour but de dtecter la prsence de germes pathognes ou de toxines qui peuvent tre distribus de faon htrognes dans laliment ou quand la commercialisation dun produit dpend de la qualit microbiologique en relation avec les normes imposes par la lgislation. 1) Mthode dchantillonnage prconise par lICMSF (Internation Commission on Microbiological Specifications for Foods) La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denres alimentaires a dfini des mthodes dchantillonnage pour lanalyse systmatique des produits alimentaires. Le principe de base est le suivant : un chantillon analys donne des rsultats non satisfaisants sil renferme des microorganismes dangereux ou sil contient des germes en nombre suprieur une limite au-del de laquelle il devient potentiellement dangereux. Dans cette mthode le symbole m reprsente la limite permettant de rpartir les chantillons en 2 groupes: les acceptables (valeur m) et les inacceptables (valeur m). Pour certains microorganismes dangereux m peut tre gal 0. Quand un microorganisme donn est tolr dans un aliment 3 catgories dchantillons sont dfinies : - catgorie 1 (acceptables sans rserve) - catgorie 2 (acceptables mais avec une limite) - catgorie 3 (inacceptables). m spare la 1re et la 2me catgories et M la 2me et la 3me (figure 7).
m
1
M
3
rpartition des chantillons
acceptables
(satisfaisants)
acceptables
(selon le nombre)
inacceptables
(non satisfaisants)
figure 7. Distribution des chantillons daprs lICMSF
Il existe deux types de plan dchantillonnage qui sont applicables des systmes aliments - germes - consommateurs bien identifis. - Plan dchantillonnage 2 classes Ce plan donne des rsultats permettant de dterminer 2 classes de contaminations. Ce type de plan naccepte aucune tolrance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le rsultat est bon et le produit jug satisfaisant) ou encore prsence dans (le rsultat est mauvais et le produit est dclar impropre la consommation). Avec un plan dchantillonnage 2 classes (catgories 1, 3), n reprsente le nombre dchantillons examins. Il existe deux possibilits pour ce type de plan : - utiliser la notion de prsence ou absence
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- dterminer la tolrance ou non des numrations suprieures la valeur critique m Le symbole c reprsente le nombre dchantillons tolrs au-del de la valeur seuil, nombre qui permet de juger le lot comme satisfaisant. Exemple : Pour les viandes de volailles contamines en surface par Salmonella m=0 n=5 c=1 Pour la plupart des autres produits on a avec cette bactrie et dautres microorganismes trs dangereux (Listeria, Brucella , etc ) m = 0, n = 5 et c = 0. Pour les viandes de boucherie conditionnes sous vide ou non, rfrigres ou congeles on a pour la Flore Arobie Msophile m = 5.104 n=5 c=0 La rigueur du plan dpend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donne de c, meilleure sera la qualit des lots accepts. A linverse, si pour une valeur donne de n, c augmente, la rigueur du plan diminue. - Plan dchantillonnage 3 classes Ce plan est bas sur la reconnaissance de 3 catgories dchantillons en fonction de leur niveau et nature de contamination : celle infrieure ou gale m, celle comprise entre m et le seuil M, celle suprieure M. La valeur S constitue le seuil de toxicit. Avec un plan dchantillonnage 3 classes (catgories 1, 2, 3), les symboles n et c ont la mme signification mais il existe pour c un facteur de prcision supplmentaire qui est le nombre dchantillons tolrs dont les charges microbiennes sont comprises entre m et M. La prsence dchantillons entre m et M nest pas souhaitable mais tolre. Pour les valeurs suprieures M les lots ne peuvent pas tre accepts pour la commercialisation en ltat. Ce plan 3 classes permet de dterminer par des calculs appropris la probabilit selon laquelle un lot sera accept ou refus en fonction du nombre dchantillons dfectueux quil contient. Sil ny a pas dchantillon avec une valeur suprieure M on est ramen au plan 2 classes. Le plan est choisi en fonction de lestimation du risque pour la sant et du mode dutilisation de laliment. Les germes sont classs en fonction du risque quils font courir au consommateur en : - germes entranant un risque svre (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi, Shigella dysenteriae, Vibrio comma , Brucella melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virus de lhpatite A). - germes entranant un risque moyen avec possibilit de large diffusion (Staphylocoques entrotoxinognes,Salmonella typhimurium et les autres srotypes, autres Shigella, Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli entropathognes, Streptocoques b hmolytiques). - germes entranant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella abortus, Clostridium perfringens,Salmonella arizonae, Francisella tularensis,Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni , etc...). Choix du plan : le plan 3 classes est le plus souvent adopt; la valeur de m est dtermine par les rsultats de lanalyse de nombreux chantillons sur des lots jugs satisfaisants. La valeur de M est plus difficile fixer et est fonction du produit, de la bactrie recherche et de la mthode employe.
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Les valeurs de n et c sont choisies en fonction du niveau souhait dacceptabilit ou de rejet des lots. Il est vident que plus n sera grand et plus c sera petit et meilleur sera le contrle ralis (tableau I).
conditions prvisibles de manipulation et de consommation aprs chantillonnage , dans les conditions normales d' emploi
utilit ou risque
rduction du risque
pas d' influence sur le risque

cas n2 3 classes n = 5 c = 2 cas n5 3 classes n = 5 c = 2 cas n8 3 classes n = 5 c = 1 cas n11 2 classes n = 10 c = 0
augmentation du risque
cas n3 3 classes n = 5 c = 1 cas n 6 3 classes n = 5 c = 1 cas n9 3 classes n = 10 c = 1 cas n 12 2 classes n = 20 c = 0
pas de risque direct pour la cas n1 sant. Utilit : vie commerciale 3 classes n = 5 c = 3
risque pour la sant
faible , indirect moyen , direct diffusion limite moyen , direct large diffusion possible svre , direct
cas n4 3 classes n = 5 c = 3 cas n7 3 classes n = 5 c = 2 cas n 10 2 classes n = 5 c = 0 cas n13 2 classes n = 15 c = 0
cas n 14 cas n 15 2 classes n = 30 c = 0 2 classes n = 60 c = 0
tableau I. Choix des valeurs de n et c et du type de plan en fonction des risques sur la sant et les modalits dutilisation du produit
Exemple dapplication : contrle de labsence de Salmonella dans des laits en poudre (cf aussi p. 14). Les caractristiques de risque produit sont classes en : a) produits contenant des ingrdients suspects b) pas dapplication au produit de traitements antimicrobiens efficaces sur le germe considr c) possibilit de croissance en cas derreur (composition du produit, pH, temprature, aeau etc.) A partir de ces caractristiques 5 catgories daliments sont dterminables: Catgorie I : aliments destins aux enfants sujets malades ou dficients, vieillards Catgorie II : aliments comportant les 3 catgories de risque Catgorie III : aliments comportant 2 catgories de risque Catgorie IV : aliments comportant 1 catgorie de risque Catgorie V : aliment ne comportant aucune caractristique de risque Il est alors possible de dfinir un plan dacceptation bas sur lanalyse dchantillons unitaires de 25 grammes et sur les cas n 13, 14 et 15 (tableau I). Ce plan drastique est mis en uvre pour le contrle de ce type de produit destin lexportation aux USA (tableau II).
catgorie du produit nombre d' units testes pas plus de 0 positif 1 positif 60 ( 1500 g) 30 ( 750 g ) 15 (375 g) 95 ( 2375 g) 48 ( 1200 g) 24 (600 g) signification : probabilit 95 %qu' n' ait pas plus de 1 il y Salmonella dans 500 g 250 g 125 g
I II III , IV , V
tableau II . Plan dchantillonnage pour Salmonella dans du lait en poudre
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RESUME DUTILISATION DUN PLAN A TROIS CLASSES

VALEURS NUMERIQUES DES CRITERES D' PLAN A TROIS CLASSES UN m : fix par dcret ( surtout fonction du germe , du consommateur type et de l' aliment) tous les rsultats gaux ou infrieurs m sont considrs comme satisfaisants M : seuil limite au-del duquel les rsultats ne sont pas considrs satisfaisants sans que le produit soit dangereux . Les valeurs de M sont fixes : M = 10 m quand les dnombrements sont raliss en milieux solides M = 30 m pour des numrations en milieu liquide n : nombre d' units composant l' chantillon c : nombre d' units de l' chantillon donnant des valeurs entre m et M QUALITE DU LOT satisfaisante ou acceptable : aucun rsultat ne dpasse M satisfaisante : les valeurs dtermines sont infrieures : 3 m lors de numrations en milieu solide 10 m lors d' emploi de milieu liquide acceptable : les valeurs dtermines cont comprises entre : 3 m et 10 m en milieu solide 10 m et 30 m en milieu liquide avec c / n 2,5 (avec le plan n = 5 et c = 2) non satisfaisant : des valeurs suprieures M sont observes ou avec c / n > 2,5
Exemples de plan dchantillonnage 3 classes

ALIMENT cacao chocolat oeufs lait en poudre crme glace BACTERIE n 10 10 10 5 5 5 10 5 5 c 0 0 0 1 3 1 2 2 2 m 0 0 0 5.104 5.104 10 2 5.102 102 M 0 0 0 7,5.104 105 50 10 1,5.103 103
Salmonella Salmonella Salmonella flore arobie msophile flore arobie msophile coliformes eau minrale coliformes fromage (past.) coliformes Staphylococcus
2) Cas particulier des conserves
Les conserves doivent satisfaire des preuves permettant de vrifier leur stabilit / strilit. Ces preuves consistent en deux tuvages de 5 chantillons 37C pendant 7 jours (ou 30C pendant 10 jours) et 55C pendant 7 jours. A lissu de ces preuves on observe lventuel bombage ou fuitage (il faut aussi que le pH entre les units tuves et les units tmoins ne dpasse pas 0,5).
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Par microscopie (aprs talement dun volume donn voisin de 10 l de produit puis fixation et coloration au bleu de mthylne par exemple) on compte sur 20 champs le nombre de germes respectivement observs partir de la bote incube (n) et de la bote tmoin (n). n / n doit tre infrieur 100.
3) Mthode dchantillonnage pour rechercher un nombre peu lev de micro-organismes
On peut dterminer le nombre dchantillons analyser dans un lot en fonction du degr de sret recherch log ( 1 - p ) n= log ( 1 - d) p est la probabilit de dceler le micro-organisme (en gnral p = 0,95) d est le pourcentage de dfauts admis pour le lot entier (souvent infrieur 0,05). On peut galement raliser un chantillonnage satisfaisant au point de vue statistique avec n = N dans laquelle n est le nombre dchantillon analyser et N le nombre total de divisions du produit analyser. Cependant cette mthode conduit souvent un nombre trop lev danalyses, en particulier quand n est suprieur 10.
4) Choix des chantillons
- au hasard (tables de nombres) - on calcule N/n = a et on prlve la aime et ainsi de suite - on calcule n = b et on prlve le bime, puis le (b - 1)ime et ainsi de suite.
E - 1 - b. frquence des prlvements

Lchantillonnage doit tre rparti dans le temps, et ce, en fonction du niveau de production et des risques de contamination.
E - 1 - c. Conditions du prlvement
Les conditions essentielles respecter pour le prlvement sont dabord le respect des rgles dasepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores prsentes dans le produit. Dans la mesure du possible, les chantillons du produit analyser doivent tre amens au laboratoire dans leur conditionnement dorigine, ce qui vite certaines contaminations. Si le produit se prsente sous forme de grands volumes (rservoirs lait etc...) sassurer de la bonne homognit de la rpartition des micro-organismes ; une partie reprsentative du produit sera prleve strilement. Il est parfois ncessaire de raliser des prlvements divers niveaux de laliment (surface, profondeur dun aliment solide) ou aprs broyage et homognisation. Les manipulations effectues au cours du prlvement ne doivent en aucun cas tre lorigine dune contamination : ncessit dutiliser des instruments striles et de travailler strilement. Certains instruments doivent tre striliss sur les lieux du prlvement. Le trempage dans lalcool et le flambage sont parfois insuffisants car la temprature atteinte nest pas assez leve. Il est ncessaire dutiliser des flacons propres, secs, tanches, col large striliss au four Pasteur (160C - 10 mn) ou par autoclavage 121C pendant 30 min ou encore usage unique et striles ; leur taille doit tre adapte au volume de lchantillon. Les rcipients peuvent tre en verre, en mtal ou
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en matire plastique (polythylne, polycarbonate, polypropylne); dans ce dernier cas il sagit de rcipients usage unique dont la strilisation est obtenue froid (radiations ou ). Dans tous les cas les rcipients de prlvement doivent possder un systme de fermeture hermtique. Le prlvement dun produit non emball doit tre ralis dans la zone de strilit dun bec bunsen ou dun systme quivalent.
1) Prlvement en surface
- Ecouvillonnage
Un couvillon de coton hydrophile est immerg dans une solution strile de Ringer au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionn de Tween (0,5/). Le prlvement est effectu par frottement sur la surface du produit ; lcouvillon est alors immerg dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. Lanalyse est ralise partir de la suspension ainsi obtenue. - Rinage: cette mthode est utilise dans le cas de rcipients ou de tuyauteries; un volume connu de solution strile est introduit dans le matriel analyser. Aprs agitation, le liquide est rcupr et soumis lanalyse. - Mthode des empreintes : un ruban adhsif pralablement strilis par les UV est appliqu sur la surface tudier. Aprs quelques secondes de contact il est retir et appliqu sur la surface dun milieu glos appropri. Aprs quelques heures de contact la temprature dincubation dsire il est retir et la bote est incube jusqu apparition des colonies. - Mthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqu sur la surface analyser; on y introduit alors quelques ml de diluant strile et aprs quelques secondes de contact, le diluant est retir et analys.
2) Prlvement de produits liquides

La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut nanmoins toujours sassurer de la parfaite homognisation du liquide (agitateurs) avant de prlever la pipette (ou avec un flacon lest strile ou autre) le volume ncessaire lanalyse.
3) Prlvement de produits solides

Selon le produit, le prlvement sera effectu au scalpel, la sonde (fromages et produits mous) ou la pipette harpon. La surface est souvent limine avant de procder au prlvement. Si le produit est htrogne (plats cuisins, conserves etc.) il faut sassurer de la bonne reprsentativit du prlvement.
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E . 2. Traitement de lchantillon E - 2 - a. Transfert de lchantillon au laboratoire

Quand le prlvement aseptique a t ralis il faut identifier immdiatement le produit avec une tiquette ou une rfrence. Il est souhaitable de ne pas utiliser de crayons feutres sur des films plastiques (PVC) car lencre peut pntrer et perturber lanalyse. Noter la temprature initiale, lheure du prlvement, la date et la temprature de transport. Amener alors les chantillons le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit. Lanalyse devrait tre ralise dans lheure qui suit le prlvement. Ds rception au laboratoire lchantillon accompagn de sa fiche signaltique est enregistr (nature, date, heure, provenance du prlvement, nom du prleveur, analyses demandes, autres indications utiles). Si lchantillon doit tre transport il faut rduire au maximum le dlai avant lanalyse. Il est souvent ncessaire de rfrigrer (mais non congeler) le produit au cours de son transport; certains germes fragiles peuvent disparatre au cours de cette rfrigration. Si un produit est dshydrat ou en conserve il ne doit pas tre rfrigr. Pour un produit congel sassurer quil ny ait pas de dconglation pendant le transport (ce produit peur tre gard pendant 1 mois avant dtre analys). Les dispositions relatives lanalyse des produits congels sont indiques dans le JO du 19 janvier 1980. La conglation dun produit provoque une diminution plus ou moins importante du nombre de germes quil contient. Il faut veiller ce que la temprature du produit prlev soit au moins gale -18C, transporter le produit cette temprature et dcongeler lair ambiant temprature voisine de 20C pendant un temps infrieur 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le prlvement.
E - 2 - b. Prparation de lchantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, lanalyse microbiologique seffectue toujours partir dune suspension. Aprs ouverture aseptique, lchantillon sera homognis (liquide) ou broy dans un volume connu de diluant strile (solide) ce qui constitue en fait la premire dilution. Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en prsence de billes de verre permet dobtenir une homognit satisfaisante. Pour les produits solides diverses techniques de broyage sont utilisables : 1) broyage manuel au Potter ou en en prsence de sable strile ou de billes de verre (mortier) 2) broyage mcanique - avec un broyeur lectrique couteaux de type VIRTIS . Au cours du broyage les germes doivent tre disperss mais non dtruits; la temprature ne doit pas trop slever (le rcipient peut tre plac dans de la glace). Le broyage seffectue en gnral avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 volume de produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant strile). Le diluant peut tre de leau distille, de leau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-sel , etc. . - avec un broyeur du type STOMACHER. Cet appareil permet de disperser dans des conditions relativement douces laliment dans le diluant. De plus il nest pas ncessaire, comme dans le cas de lutilisation dun broyeur de type Virtis, de striliser les rcipients entre deux utilisations. En effet, le Stomacher (digesteur) utilise des sacs plastiques striles usage unique. La prise dessai est le plus souvent de 10 g (ou 25) daliment et de 90 ml (ou 250) de diluant.
E - 3. Les diluants
Au cours de la prparation des chantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent tre inhibs ou mme altrs par le changement du milieu li laddition de diluant (changement de pH mais surtout de force ionique). Leffet bactricide de certains diluants est connu: ainsi
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Staphylococcus aureus est tu en quelques heures dans de leau distille de mme que la plupart des entrobactries (E.coli); il en est de mme pour Streptococcus pyogenes dans du srum physiologique ou dans du Ringer au 1/4 et pour Escherichia coli dans de leau sale 8,5. Actuellement il parat souhaitable, sauf indication affrente un type donn daliment, de raliser les prparations et les dilutions des chantillons analyser dans une solution de tryptone sel. En absence dinformation le choix se fera en fonction de la composition du produit analyser: si le produit est riche en protine et en minraux, Ringer ou eau physiologique suffisent et mme une solution de phosphate 2 % et pH 7,4 dans le cas des fromages frais, crmes fraches et casinates .
tryptone sel Ringer (solution mre) Eau physiologique NaCl 9g eau D 1000 ml Eau peptone tamponne bacto peptone 20 g NaCl 5g Na2 HPO4 9g K H2 PO 4 eau D pH = 7,2 1,5 g 1000 ml
NaCl 9g tryptone 1 g KCl 0,42 g NaCl 8,5 g 0,48 g eau D 1000 ml CaCl2 pH = 7 NaHCO3 0,2 g eauD 1000 ml
Tous ces diluants sont striliss 121C pendant 20 minutes. Il faut noter que les milieu tryptone-sel et eau peptone tamponne permettent, dans des conditions particulires (temprature, temps), de raliser une revivification. Leau peptone tamponne est utilise avec certains produits acides au fort pouvoir tampon comme les yaourts.
E - 4. La revivification
Les micro-organismes sont souvent endommags mais non tus au cours des traitements technologiques (dshydratation, chaleur, froid etc.) appliqus aux produits alimentaires ou par suite de leur vieillissement. Ces altrations se refltent dans certaines de leurs proprits physiologiques en particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmente ou de leurs besoins nutritionnels ou encore quant leur sensibilit aux conditions de milieu dfavorables (pH, sels biliaires, colorants, sels etc.). En gnral ces altrations sont rversibles et aprs leur disparition les bactries rcuprent leurs proprits initiales, en particulier au niveau de leur croissance ou de leur pouvoir pathogne. La ncessit de faciliter le rtablissement des cellules ayant subi des altrations sub-ltales, cest-dire leur ranimation ou encore leur revivification, simpose avant de les soumettre des milieux slectifs souvent peu favorables la croissance du fait de la prsence dinhibiteurs. En effet, la prsence de cellules endommages peut entraner des variations dans les numrations ou porter croire quil ny a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le consommateur. Ceci est particulirement important quand il sagit de dterminer si des micro-organismes pathognes ou indicateurs sont prsents ou non.
E - 4 - a. Revivification en milieu liquide

La revivification peut tre ralise ds la premire tape de lanalyse au cours de laquelle le produit est additionn de diluant. Il suffit alors de choisir un diluant de composition favorable et dincuber le tout la temprature optimale de croissance du germe rechercher pendant un temps qui variera
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en fonction du type danalyse ralis, temps qui est le plus souvent voisin du temps de latence du germe normal. Si la dure de revivification est suprieure au temps de latence, il se produira une multiplication des germes non altrs ce qui conduira, selon les techniques de numration utilises par la suite, une survaluation du nombre de germes. Aprs cette phase pralable de revivification la numration est ralisable soit en milieu liquide soit en milieu solide.
temps d' incubation temps de latence + temps de doublement
dilutions numration
homognat en milieu de revivification

Dans les preuves du type prsence ou absence, la revivification est obtenue par un prenrichissement dans un milieu favorable (ex. recherche des Salmonella ). La dure dincubation peut tre relativement longue car la multiplication des germes rechercher est dans ce cas trs souhaitable.
temps d' incubation >> temps de latence + temps de doublement
recherche sur milieu slectif
homognat en milieu de revivification

Dans le cas o la numration des germes doit tre ralise deux autres mthodes sont encore envisageables : - Quand la numration est effectue en milieu liquide, la revivification est ralisable dans des milieux non slectifs ensemencs partir des diffrentes dilutions. Cest partir de ces milieux que sont ensuite ensemencs les milieux slectifs (de tube tube).
dilutions en milieu de revivification homognat en milieu de revivification temps d' incubation >> temps de latence
milieu slectif (incubation)
Le dcret publi au JO du 19 janvier 1980 fixe les conditions de revivification : lexclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique ou sil a t congel ou encore sil renferme des sels pouvant exercer une action inhibitrice (NaCl, NaNO2...) aprs homognisation,
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laisser le flacon la temprature du laboratoire (202C) pendant trente quarante cinq minutes (optimum quarante minutes) .
E - 4 - b. Revivification sur milieu solide

- Quand la numration est effectue sur milieu solide, la revivification peut tre obtenue par une pr-culture sur une glose non slective favorable avec un temps dincubation suprieur au temps de latence, mais ne permettant pas la formation de colonies macroscopiques visibles. Aprs revivification, la surface de la glose est recouverte de glose slective.
talement en surface milieu de revivification temps d' incubation > temps de latence homognat dilutions incubation milieu slectif
- Quand la numration est ralise aprs filtration sur membrane, la membrane sur laquelle se trouvent les germes est dabord place la surface dun milieu de revivification pendant un temps permettant ventuellement plusieurs divisions cellulaires normales puis le filtre est plac la surface dun milieu slectif. A titre dexemple, les conditions optimales de revivification par cette mthode de germes stresss sont les suivantes : Traitement Germe Revivification temps (h) t (C) 5 4 4,5 4 2 4 35 35 35 35 25 25
chaleur conglation acide schage
coliformes coliformes entrocoques coliformes coliformes entrocoques
E - 5. Techniques de dilution
Elles ncessitent la prsence de nombreux tubes essais contenant le plus souvent 9 ml de diluant strile et de nombreuses pipettes striles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent tre remplaces par des systmes de pipetage automatique munis de cnes usage unique. Toutes les manipulations sont effectuer avec toutes les prcautions dasepsie exiges en microbiologie. Lintroduction ventuelle dun contaminant ou la contamination de loprateur doivent ne jamais se produire. Le rcipient contenant le liquide diluer est agit manuellement avec prcaution pour viter les projections pendant une dizaine de secondes. On prlve strilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois avant le prlvement) que lon introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant strile. Le tube est agit par des mouvements de rotation ou au moyen dun Vortex. On obtient ainsi
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une dilution au 1/10. Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prlve 1 ml de cette dilution que lon introduit dans un nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusquau niveau de dilution recherch.
E - 6. Principales techniques de numration

En microbiologie alimentaire lintrt de ltude la fois quantitative et qualitative de la flore prsente dans un aliment est considrable. Bien que de nombreuses techniques de numration soient utilisables, il nexiste pas lheure actuelle de technique parfaite. Certaines mthodes ne permettent pas de diffrentier les germes vivants des germes morts, dautres savrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associes (Staphylococcus, Streptococcus , myclium etc..) et permettent dvaluer des units formant colonies (UFC) ou des units formant trouble (UFT).
E - 6 - a. les mthodes gnrales directes

1) Comptage direct
Il seffectue au microscope laide de microchambres gradues de volume connu (cellules de Thoma, de Malassez, de Nageotte, de Salimbni Cloup etc...) aprs dilution en eau physiologique pour les germes morts, en eau formole 10 % pour les germes vivants. Ce type de comptage peut tre automatis (compteurs de particules). Il est galement possible destimer au microscope le nombre de micro-organismes dun produit donn aprs talement et coloration dune quantit connue du produit (de lordre de quelques microlitres) sur une lame. Enfin, un comptage direct est ralisable aprs filtration du produit (ou de ses dilutions) sur membrane, coloration de la membrane et observation microscopique. Cette dernire technique permet lvaluation, aprs coloration par lacridine orange et observation en pifluorescence, des micro-organismes vivants et morts (DEFT). Ce colorant est un intercalant des acides nucliques avec lesquels il forme des complexes fluorescents verts (ADN) ou orange (ARN) currentpoint
N(CH3)2 N N(CH3)2 currentpoint
2) Dtermination du poids sec, ou dosage des protines microbiennes ou dosage des acides nucliques (aprs sonication par exemple et/ou extraction en milieu alcalin) 3) Nphlomtrie
La turbidit dun milieu est, dans certaines conditions, proportionnelle au nombre de microorganismes prsents dans ce milieu. Ainsi labsorbance dune suspension microbienne une longueur donde suprieure ou gale 540 nm varie linairement jusqu des valeurs infrieures ou gales 0,8 avec le nombre de germes. Il est par ailleurs possible de comparer visuellement la turbidit du milieu avec une gamme talon dalbumine (mthode de Mestrezat : ainsi lopacit dune suspension de 5.109 staphylocoques par ml est identique celle dune suspension dalbumine 0,5 g par litre).
4) Systme lucifrine - lucifrase

Cette mthode permet le comptage des micro-organismes vivants par dosage de lATP intracellulaire, la teneur en ATP intracellulaire tant sensiblement constante pour un microorganisme donn ; cette teneur est gale 0 si le germe est mort. Aprs lyse de la cellule (SDS) lATP est dos par voie enzymatique selon le schma suivant :
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currentpoint
OH
N S
S N COOH + ATP
lucifrase Mg2+ , O 2
OH
N S
S N O
lucifrine
oxylucifrine
+ PP + CO 2 + AMP + hv currentpoint
Le nombre de photons mis 562 nm mesur par un compteur scintillations est proportionnel la quantit dATP, elle-mme fonction du nombre de cellules vivantes.
E - 6 - b. Les mthodes gnrales indirectes

consomm. 1) Dosage dun mtabolite primaire synthtis, ou dosage de la quantit dun substrat
Ces mthodes ne sont applicables que dans des conditions bien dfinies (phase exponentielle de croissance, temprature, milieu etc...). 2) Rduction dun colorant Certains micro-organismes modifient le potentiel doxydo-rduction des milieux dans lesquels ils se trouvent ; la vitesse de cette modification est la fois fonction du nombre de micro-organismes, de leur activit mtabolique (rductrice le plus souvent) et dautres paramtres tels que la nature du milieu, le germe, la temprature etc... Parmi les indicateurs disponibles le bleu de mthylne et la rsazurine sont les plus utiliss. La modification de couleur intervient quand Eh = Eo - 0,05 V. currentpoint
CH3 CH3 N S N CH3 N
+
CH3
CH3 CH3 N S N
CH3 N CH3
+ 2H Eo = + 0,011 V
+ H Cl currentpoint
bleu de mthylne (bleu)
leucodriv incolore
Avec la rsazurine la rduction est suivie par des variations de coloration du bleu au lilas puis au mauve, au rose et enfin lincolore. currentpoint
O N O
OH
Ocurrentpoint
3) Dilution et culture
Cette technique permet en principe la numration des germes vivants. La culture est ralise soit en milieu liquide (1 germe ou un groupe de germes donne aprs inoculation et incubation 1 culture positive) soit en milieu solide (1 germe ou un groupe de germes donne naissance une colonie). Dans ce dernier cas lensemencement peut se faire dans la masse de la glose ou en surface.
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E - 7. Numration partir dun milieu solide : UFC

Cette mthodologie est le plus frquemment ralise dans des botes de Ptri. Elle repose sur le principe que toute bactrie vivante introduite dans la masse ou en surface dun milieu glos favorable donne en principe naissance aprs incubation une colonie macroscopique. Le nombre total de colonies correspond alors au nombre dUFC prsents dans linoculum. De nombreuses critiques cette mthode peuvent tre formules. Ainsi, les bactries arobies strictes se dveloppent mal dans la masse de la glose, tandis que les bactries anarobies strictes ne sy dvelopperont que dans des conditions dincubation appropries (jarre anarobie par exemple). Il peut aussi exister certains antagonismes bactriens (bactriocines etc...). Par ailleurs si la temprature de mlange du milieu glos mlange linoculum est suprieure 45 - 47C , il peut y avoir inactivation de microorganismes. Cette mthode de culture dans la masse conduit nanmoins des dispersions homognes dans la glose et donc une distribution homogne des colonies. Dans cette mthode des germes se trouveront dans la masse et dautres en surface, les colonies formes tant, compte tenu des contraintes striques imposes par le rseau glifi, alors diffrentes pour un mme micro-organisme. Cet inconvnient est limin par la technique de la double couche. La numration en surface nest ralisable que sur une surface de milieu parfaitement sche. Lopration dtalement au rteau reste matriser (adsorption de germes sur le rteau) et le volume dinoculum dpos ne peut en aucun cas excder 0,5 ml avec des botes de 9 cm de diamtre (des volumes suprieurs ne sont pas absorbs par le gel dagar et leau qui reste en surface rend impossible toute numration en raison de la formation dune nappe). Cette mthode donne de bons rsultats avec les germes arobies et aro-anarobies.
E - 7 - a. Technique de numration dans la masse de la glose

Les milieux gloss (rpartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liqufis au bain-marie bouillant ou mieux au four micro-ondes, puis maintenus en surfusion dans un bain-marie 45 1C. 1 ml du liquide dans lequel on veut connatre le nombre de micro-organismes est introduit au centre de la bote de Ptri pose bien plat dans la zone de protection du bec Bunsen. Linoculum peut tre rparti en gouttes sur le fond de la bote. Afin de nutiliser quune seule pipette strile pour toutes ces oprations il est recommand de commencer lensemencement par la dilution la plus grande pour terminer avec le liquide non dilu. Noter avec soin sur chaque bote lorigine de lanalyse, le milieu utilis et la dilution correspondante (sur le ct de faon ne pas tre gn par la suite pour le comptage). On procde de la mme faon pour chaque dilution en ralisant, dans la mesure du possible, deux essais par dilution. Le milieu glos en surfusion dans lequel linoculum sera incorpor doit tre 45C1C. Si sa temprature est suprieure cette valeur il se produira une destruction partielle de la flore ; au contraire, si sa temprature est infrieure 45C le milieu se solidifiera irrgulirement et ne se mlangera pas de faon homogne avec linoculum. Pour raliser lintroduction du milieu glos : retirer le milieu du bain marie 45C, essuyer le rcipient, louvrir aseptiquement, flamber son ouverture et couler le milieu dans la bote de Ptri contenant linoculum aprs lavoir entrouverte dans la zone strile. Ne pas appuyer le rcipient sur la bote. Mlanger rapidement par agitations circulaire et alternative horizontales ; viter les mouvements brusques qui risquent de projeter le milieu inocul sur les bords ou mme lextrieur de la bote. Laisser refroidir les botes bien plat jusqu solidification complte (environ 30 minutes). Retourner les botes et les placer ltuve dans cette position la temprature requise.
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Pour viter la formation de colonies de grande taille en surface (par rapport celles qui se dvelopperont dans la masse de la glose) on peut couler la surface de la glose ensemence une fine couche de milieu de culture identique celui dj prsent dans la bote ou couler la surface une mince couche de glose non nutritive (technique de la double couche).
E - 7 - b. Technique de numration en surface de la glose

100 500 microlitres (pipette gradue ou mieux pipette automatique) du milieu analyser sont dposs la surface de la glose et immdiatement rpartis de faon uniforme la surface du milieu au moyen dun ensemenceur strile du type pipette rteau. La pipette rateau est strilise entre deux talements par immersion dans de lthanol, lthanol adsorb sur le verre tant ensuite enflamm (cette opration ne dforme pas lensemenseur).
E - 8. Numration en milieu liquide : UFT

Cette mthode prsente certains avantages tels que la possibilit dtudier un caractre biochimique du germe difficilement mis en vidence sur milieu glos comme la production de gaz (cloche) ou encore deffectuer facilement la numration avec une phase de revivification. Cette mthode repose sur le fait quun inoculum contenant au minimum 1 germe (UFT) donnera, aprs introduction dans un milieu liquide donn, une culture positive. Dans cette technique, la disponibilit des nutriments pour le micro-organisme est excellente.
E - 8 - a. fractionnement de grands volumes liquides

Pour viter laccumulation de produits de dgradation qui pourraient avoir une action inhibitrice, on ensemence 1 ml dinoculum dans 100 ml de milieu de culture. Ce milieu est ensuite rparti aseptiquement dans 10 tubes essais raison de 10 ml par tube, puis incub. En supposant une distribution homogne des micro-organismes, on peut conclure la prsence de 1 10 microorganismes dans linoculum initial de 1 ml. Si tous les tubes cultivent.........plus de 10 germes/ml Si 9 tubes cultivent.................. plus de 9 germes/ml .................................................................. Si 1 tube cultive....................... plus dun germe/ml.
E - 8 - b. Mthode de Mac Grady (technique du nombre le plus probable NPP)

McGRADY, MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results. Public Health J., Toronto, 9, 201-210. Cette mthode permet de rvler de plus faibles quantits de germes que la plupart des mthodes de numration en milieu solide. Elle repose sur une analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus probables (NPP). Il existe de nombreuses variantes la mthode en fonction de la charge microbienne valuer. Cette mthode suppose que le micro-organisme est normalement distribu dans le milieu et donc quun mme volume dchantillon contient en moyenne le mme nombre de microorganismes (en ralit il en contient un peu plus ou un peu moins) ; le nombre le plus probable correspond la valeur moyenne. Si le nombre de micro-organismes est faible lcart par rapport la moyenne peut tre lev et inversement.
Des prlvements de 10 ml contiennent en moyenne 10 germes avec des tubes plus de 10 et peu moins de 1. Des prlvements de 1 ml contiennent en moyenne 1 germe avec des tubes plus de 1 et des tubes ngatifs. Des prlvements de 0,1 ml conduisent 1 tube positif pour 10 tubes et de nombreux tubes sont ngatifs.
Exemple : un produit liquide contient 100 micro-organismes / 100 ml
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La distribution de ces populations est schmatise sur la figure 8.

Frquence de la distribution moyenne 0,1 ml/ tube 1 ml /tube
10 ml /tube
10 nombre de microorganismes
figure 8 . Distribution de la population microbienne dans une numration en milieu liquide
Numration de charges microbiennes comprises entre 0 et environ 15 pour 100 ml Dans ce cas 50 ml de produit sont introduits dans un erlenmeyer avec 50 ml de milieu de culture adapt double concentration, et 5 fois 10 ml introduits dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu de culture galement double concentration. Aprs incubation les tubes positifs sont identifis et le NPP pour 100 ml de produit est dtermin en utilisant la table suivante : Erlenmeyers positifs 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 tubes de 10 ml positifs NPP / 100 ml 0 0 1 1 2 2 3 4 4 5 5 7 0 2 1 3 2 6 3 9 4 16 5 + de 18
Numration de charge microbiennes comprises entre 0 et 100 germes par ml Dans ce cas 1 ml de la suspension mre puis de ses dilutions est introduit dans des tubes contenant le milieu de culture choisi mais en ralisant chaque essai en double (ou en triple ou plus suivant le niveau de prcision souhait). Avec lessai comportant deux tubes ensemencs par dilution on note, aprs incubation, les rponses positives ou ngatives et on affecte : - le chiffre 2 deux tubes positifs ensemencs avec la mme dilution - le chiffre 1 si lun des deux tubes donne une rponse positive une dilution donne - le chiffre 0 si la culture est ngative pour les deux tubes.
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Exemple
produit pur -1 dilutions -2 10
10
10 -3
10 -4
rsultat aprs incubation affectation nombre par dilution nombre de trois chiffres
tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2
+
1 2
+
1
+
1 2 221
+
1
+
1 1
0 1
+
1
0 0
211
110
Les chiffres adjacents sont groups par 3; on obtient des nombres de 3 chiffres qui sont 221, 211, 110. Le nombre le plus petit et pour lequel, si possible, le chiffre des units est un 0 (110 ici) est choisi. Pour ce nombre, la table de Mac Grady donne le nombre le plus probable de bactries par ml ou de produit pur et ce videmment pour lessai deux tubes par dilution. Le chiffre des centaines (1 dans le cas de 110) correspond la dilution considrer pour donner le NPN par ml de produit. Ainsi dans lexemple choisi 110 correspond la dilution -2 ce qui donne, daprs la table de Mac Grady, 1,3 bactries (UFT) par ml. Ce NPP correspond donc la dilution 10-2, soit un NPP de 130 bactries (UFT) par ml de produit non dilu. Il existe des tables de Mac Grady pour les essais 3 ou 5 tubes avec des volumes dinoculum de 1 ou 10 ml et mme 50 ml. Table de Mac Grady (essai 2 tubes) nombre de 3 chiffres Nombre dUFT par ml (NPP/ml) 000 001 010 100 101 110 111 120 200 201 210 211 212 220 221 222 0 0,45 0,46 0,6 1,2 1,3 2 2,1 2,3 5 6,2 13 21 24 70 110 et plus
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E - 9. Numration par filtration

Cette mthode consiste faire passer un certain volume dchantillon ou de ses dilutions au travers dune membrane filtrante (par exemple une membrane Millipore ou Sartorius ou ...de 47 mm de diamtre et dont la porosit moyenne est de 0,45 mm 0,22 m) sur laquelle sont retenus les microorganismes recherchs. Aprs filtration, on rince lentonnoir suprieur avec de leau distille strile ou avec une solution tamponne strile afin de rcuprer la totalit des germes et dliminer du filtre lui-mme dventuels agents microbicides. Le filtre est alors pos sur la surface dun milieu de numration imbibant un filtre adquat ou sur un milieu glos spcifique du germe rechercher, face portant les micro-organismes vers le haut. Aprs incubation, comme dans le cas de la numration en milieu glos, on compte les colonies formes la surface du filtre.
rservoir suprieur pince
milieu glos
liquide analyser membrane disque poreux ( fritt) face suprieure de la membrane ayany retenu les bactries
vide (trompe eau)
numration aprs incubation
Cette mthode prsente certains avantages par rapport aux mthodes dj crites. Ainsi, le temps dincubation est gnralement plus court (18 heures au lieu de 24 heures), le volume dchantillon analysable plus grand (jusqu plusieurs litres, ce qui permet de raliser des numrations de germes dans des liquides en contenant trs peu tels que certaines eaux) ; il ny a aucune interfrence entre micro-organismes (spars la surface du filtre et nourris par diffusion du milieu de culture au travers des pores) et les agents microbicides associs au produit sont limins (chlore, antibiotiques, conservateurs etc.). Les diffrences existant entre les rsultats des numrations spcifiques dun micro-organisme donn ont le plus souvent comme origine la nature du milieu de culture choisi ainsi que la mthode utilise, la temprature et la dure de lincubation sans omettre les variations lies au manipulateur.
E - 10. Interprtation des numrations E - 10 - a. Calcul de la charge microbienne du produit

Il faut, partir du nombre dunits formant colonies ou du NPP dtermin pour une dilution donne, remonter au produit analys.
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Dans le cas dun produit liquide, cela ne prsente aucune difficult puisquil suffit de multiplier le nombre ou le NPP trouv une dilution donne par linverse de celle-ci. Si par exemple 256 colonies ont t comptes dans la bote ensemence partir de 0,1 ml de dilution 10-3 du produit, le nombre dUFC par ml de produit est gal : 256 x 1 / 0,1 x 1 / 10-3 soit de 256.104 UFC / ml. Dans le cas dun produit solide, le broyage ou la mise en suspension initiale est considre comme une dilution dont il faut tenir compte. Si par exemple 10 g de produit ont t mis en suspension dans 90 ml de bouillon tryptone-sel, on considre que 1 ml de cette suspension correspond 0,1 g de produit. Il sagit l dune approximation car en toute rigueur, il faudrait procder la mise en suspension en prenant un poids donn de produit et en compltant un volume prcis par du diluant . Il est possible parfois de prendre en considration la teneur en eau du produit. Lapprciation quantitative dune flore microbienne donne prsente dans un aliment ou dans leau est souvent imprcise. Cette imprcision, outre les alas biologiques, tient surtout linvitable htrognit du produit et des dilutions, htrognit donnant lieu des prlvements dont la richesse en micro-organismes est variable. En effet les germes sont distribus de faon alatoire et non uniforme, mme aprs homognisation parfaite. Leur rpartition seffectue suivant la loi de POISSON1,ce qui permet destimer la grandeur et la probabilit des variations. En milieu liquide, la mesure seffectuant par lapprciation prsence ou absence, limprcision est plus grande. 1) La loi de Poisson est la loi suivie par une variable alatoire x qui peut prendre toutes les valeurs entires positives (1,2,3...k) avec une probabilit P gale : k a -a P= .e k! La loi est discontinue, la moyenne est a, la variance est aussi a
La densit microbienne dun produit, exprime par le nombre de germes par ml ou par g, est dfinie comme la moyenne du nombre de germes de toutes les fractions de 1 ml ou 1 g du produit: il sagit du nombre total de germes prsents dans le volume ou le poids total, divis par ce volume ou ce poids. La prcision des dnombrements est mesure par un paramtre de dispersion : le coefficient de variation V. V est le rapport,exprim en %, de lcart type la moyenne des rsultats obtenus par rptition de lanalyse du mme produit. Lcart type est la racine carre de la moyenne des carrs des carts par rapport la moyenne de la population.
= (x i - x) n
2
Lestimation du nombre de germes peut tre limite par un intervalle de confiance (par exemple dans lequel on a 95 chances sur 100 de trouver la vraie valeur).
V = x 100 x
E - 10 - b . numration en milieu solide

La valeur de la densit microbienne de laliment est obtenue en multipliant le nombre de colonies observes (par comptage manuel ou automatique) par un facteur tenant compte du volume ensemenc et de la dilution. Exemples : - pour du lait (liquide) 150 colonies sont comptes dans une bote de Ptri ensemence avec 1 ml dune dilution 10-3. La densit microbienne sera de 150.103 UFC par ml de lait. - pour un aliment solide il faut en toute rigueur tenir comte de leau quil contient ou raliser la premire dispersion partir de x g de produit et rajouter le diluant en quantit suffisante pour y ml.
Le coefficient de variation V et les limites de confiance exprimes en % de lestimation sont indpendants du facteur de dilution.
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Le dnombrement obissant la loi de Poisson se caractrise par un cart type gal la racine carre de la moyenne ( = x ). Ainsi, si la densit microbienne du produit, la dilution et le volume ensemence sont tels que lon obtienne une moyenne x de colonies dans le milieu glos, on aura :
V= 100 x
Les limites de confiance 95 % sont :
IC 95 % =
Le rsultat sexprime alors de la faon suivante :
1,96 N n
N 1,96 N n n
avec N nombre total de colonies comptes une dilution donne et n = nombre de botes comptes cette dilution. Si n = , on a un intervalle de confiance 95 % qui est gal :
N 1,96 N s oit N 2 N
Remarque : le calcul de lintervalle de confiance ne peut tre ralis qu partir des colonies rellement comptes. La prise en compte du facteur de dilution nest ralise quaprs.
Les coefficients de variation et les intervalles de confiance pour un nombre donn de colonies comptes sont indiqus ci-aprs. nombre de colonies 10 20 30 50 100 200 300 400 500 coefficient de variation 31 22 18 14 10 7 5,7 5 4,4 Intervalle de confiance 95 % 4 11 19 36 80 172 265 360 455 16 29 41 64 120 228 335 440 545
Lvaluation visuelle du nombre de colonies dans une bote de Ptri de 9 cm de diamtre se limite aux environs de 300 units. Lutilisation dun analyseur dimage ou dun compteur laser permet destimer jusqu 1000 colonies par bote et donc damliorer la prcision. Pour obtenir, par la mthode dapprciation visuelle, un nombre lev de colonies et donc une bonne prcision dans sa mesure, il est possible densemencer plusieurs milieux gloss partir dune dilution considre; N se rapporte alors aux germes prsents dans lensemble des gloses et peut atteindre des valeurs leves gage dune bonne prcision. Il apparat ici clairement que le coefficient de variation et lintervalle de confiance dpendent du nombre de colonies prsentes dans la glose et quil convient donc deffectuer les numrations partir de botes dans lesquelles le nombre de bactries est compris entre 30 et 300 (pour une bote et plus pour n botes). Au-dessous de 30, V est trop grand; au-dessus de 300 par bote, le comptage devient trs difficile).
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Il faut encore signaler que cette tude au cours de laquelle on estime que les micro-organismes sont distribus selon la loi de Poisson na de signification que dans des conditions idales (distribution au hasard dans le produit, prises parfaitement aliquotes, toute bactrie produit une colonie, comptage ralis sans erreur etc...).
E - 10 - c. Numration en milieu liquide
Lestimation de la variabilit des rsultats obtenus par ces mthodes est plus dlicate car les formules utilises dans ce cas sont trs complexes et font appel des lois statistiques qui sappliquent ds la dtermination du NPP . La principale difficult de cette technique de numration rside dans le fait que les tables des nombres les plus probables (NPP) sont le fruit de calculs mathmatiques et statistiques et quelles ne reprsentent quune probabilit de rsultat. Il faudrait donc que le NPP soit toujours associ aux limites de confiance (par exemple 95 %).
1) Numration avec une seule dilution dans n tubes

Il sagit ici dun systme peu courant en microbiologie alimentaire . Lestimation du nombre probable moyen par portion de liquide inocul est gale : n N = NPP = Ln n-p avec p = nombre de tubes positifs. Le coefficient de variation V dpend de N et de n. Pur une valeur donne de n il atteint son minimum (gal 124 n) pour un N attendu de 1,6 (ou 80 % de tubes positifs). Lintervalle de confiance est tir de tables. N 3 5 10 20 0,15 155 120 85 60 0,5 1 1,6
72 51 36
41 29
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Valeurs du coefficient de variation en fonction de N et n. Lintervalle de confiance peut tre calcul ou trouv dans des tables. Ainsi, pour un intervalle de confiance 95 % on a par exemple: n 3 5 p 2 4 NPP 1,1 1,61 Intervalle de confiance 95 % 0,1 0,3 4,8 5,3
Dans cette technique la numration est obtenue systmatiquement avec des excs de lordre de 20, 13, 7 et 5 % respectivement avec les essais 3, 5, 10 et 20 tubes. Cette erreur reprsente lexcs de la moyenne de tous les NPP possibles par rapport la valeur vraie.
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2) Numration avec plusieurs dilutions dcimales de n tubes

Lensemencement dune dilution unique risque de dboucher sur une srie entirement positive (NPP = ) ou entirement ngative (NPP = 0) ou tout au moins sur un V lev. En labsence dinformation sur la densit microbienne estimer on effectue plusieurs dilutions. Cest cette approche qui est frquemment utilise en microbiologie alimentaire. Lestimation du NPP ncessite lemploi de tables. V est ici plus stable pour un n donn (entre certaines limites de densit microbienne). Pour quatre dilutions dcimales de n tubes chacunes, si la premire reoit par exemple 1 ml par tube et la dernire 1.10-3 ml par tube, la densit microbienne la premire dilution devra tre comprise entre 1 et 103 germes par ml. Dans ce cas on a : V = 100 e
1,61 n
-1
2,5
et les limites de confiance 95 % sont gales :

N PP. e 1 n
Les valeurs de V et les limites de confiance 95 % pour des essais 2 , 3 , 5 et 10 tubes sont indiques dans le tableau ci-aprs : intervalle de confiance 95% 0,17.NPP - 5,85.NPP 0,24.NPP - 4,23.NPP 0,33.NPP - 3,06.NPP 0,45.NPP - 2,20. NPP
n 2 3 5 10
V 110 84 62 42
Tableau des intervalles de confiance dans la numration en milieu liquide
E - 10 - d. Exemple dexploitation statistique de rsultats exprimentaux
Analyse dun plat cuisin : 25 g homogniss dans 225 ml de bouillon tryptone-sel (homognat appel produit). Des dilutions dcimales sont ralises dans le mme diluant. Les coliformes totaux sont compts en milieu solide (VRBL, 1 ml par bote, 2 botes par dilution) et en milieu liquide dans des milieux BLBVB (essai 2 tubes, 1 ml par tube).Les rsultats sont les suivants :
produit -1 10 DCL 325 378 + + + 29 39 + dilution 10 5 2 + + + -2 10 1 1 -3 10 0 0 -4
BLBVB
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Le nombre significatif pour le BLBVB est de 210 , ce qui donne un NPP de 6,2 UFT de coliformes / ml pour la dilution 10-2. Lintervalle de confiance 95 % autour de ce NPP est : 6,2.0,17 UFT/ ml 6,2. 5,85 UFT / ml soit de 1,05 36,3 UFT / ml la dilution 10-2. Le rsultat est alors :
NPP de coliformes gal 6,2.103 UFT / g avec un IC 95% compris entre 1,05.103 UFT /g 36,3 .103 UFT / g.
Le nombre total de colonies partir du produit est de 703 colonies. Le nombre dUFC de coliformes est de 703 / 2 soit de 351 UFC / ml de produit. Lintervalle de confiance 95 % est gal :
2. 2 703 = 26,5
Ramen au plat cuisin on a alors : N = 3,5.103 UFC coliformes / g avec un IC 95% gal 0,265.103 UFC coliformes / g soit de 0,3.103 UFC coliformes / g. Le nombre total de colonies comptes partir de la dilution -1 est de 68. Le nombre dUFC est de 68 /2 soit de 34 UFC / ml de dilution -1. Lintervalle de confiance 95 % est gal :
2. 2 68 = 8,2
Ramen au plat cuisin on a alors : N = 3,4.103 UFC coliformes / g avec un IC 95% gal 0,82.103 UFC coliformes / g . Si on prend en compte les rsultats obtenus avec les deux dilutions on a alors : N = (3,5 + 3,4).103 UFC coliformes par g / 2 soit N = 3,45.103 UFC coliformes par g avec un IC 95% qui est gal (0,265.103 + 0,82.103 ) / 2 = 0,54.103 UFC coliformes / g . Si on schmatise les rsultats trouvs et leur intervalles de confiance on obtient :
1 10 NPP N ( produit) N (dilution) N (intgr) 3 6,2.10 3 36.10 3
Il nest pas tonnant de trouver autour du NPP un IC 95% trs grand car lessai nest qu 2 tubes.
E - 10 - e. Conclusions
La numration en milieu liquide est accompagne dune erreur systmatique et cette technique est moins prcise que la numration en milieu solide. Pour obtenir un mme coefficient de variation dans les deux cas (14 % en milieu solide, N = 50), il faudrait utiliser en milieu liquide des galeries de 82 tubes. Cette conclusion pourrait faire abandonner la technique en milieu liquide ; cependant cette dernire peut possder une spcificit sans quivalent en milieu solide, ou encore tre beaucoup plus sensible (1 2 germes par ml ou 10 ml). En milieu solide, il faut noter que ltalement en surface conduit des valeurs uniformment infrieures celles enregistres aprs inoculation dans la masse (du fait de ladhsion des bactries lensemenceur).
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E - 11. Le contrle de conformit par rapport une norme
Le concept de norme guillotine a longtemps prvalu et utilisait les rsultats fournis par la laboratoire abusivement : toute valeur qui dpassait un seuil fix, cest dire la norme ou le critre, tait considre comme une faute. Ce comportement rpressif reposait sur la certitude accorde au rsultat. Or, les causes de variabilit (ou derreurs) sont nombreuses et se situent au niveau : -de lchantillon : sans plan dchantillonnage les normes nont pas de signification. Il faut que lchantillon soit reprsentatif pour extrapoler lensemble du lot - du traitement de lchantillon ( modalits de dconglation , htrognit ) - des mthodes dhomognisation - des suspensions mres et des dilutions - des milieux de culture - de lincubation - de la lecture - de la nature de la flore ( comptition etc) - de la qualit de travail de loprateur - de lexistence de germes stresss Il faut donc analyser les rsultats en sappuyant sur une rglementation qui fixe n 5 et c 2 et qui tolre un cart entre m et M de 1 log. Le plan 3 classes est universellement adopt sauf pour Salmonella qui est recherche par un plan 2 classes de type prsence ou absence. Si on dsire dclarer un aliment conforme une norme ou non (ou encore laccepter ou le refuser) on adopte une dmarche dans laquelle un critre de conformit ou nombre dacceptation c est choisi. Le raisonnement le plus simple est de choisir la norme et de la comparer avec lestimation de la densit microbienne. Or il se peut que limprcision de la mthode fasse rejeter des aliments tout juste conformes et il devient ncessaire de fixer une marge de tolrance en dplaant vers la droite le nombre dacceptabilit. On dfinit alors : - une probabilit a (risque du producteur) pour quun aliment tout juste conforme soit refus (mesure suprieure au critre) - une probabilit (risque du consommateur) pour que soient accepts les aliments (mesure infrieure au critre) de degr de non conformit donn. Dans la pratique on adopte un nombre dacceptation tel que le producteur ne soit expos qu un risque raisonnable (5 % par exemple) en sefforant de choisir un mode opratoire qui rduise au maximum les risques pour le consommateur. La protection du consommateur qui est lie lefficacit du contrle peut svaluer (avec un nombre dacceptation c fix) par le rapport : avec R = 100 N1 / N2
N1 = N 0,05 : le nombre de germe donne lieu une probabilit de refus de 5% N2 = N 0,1 : le nombre de germes donne lieu une probabilit dacceptation de 10 %. Ainsi, pour un contrle ralis en milieu solide, on fixe dabord le nombre dacceptation c (ou nombre maximum tolr de colonies dans le milieu glos). R augmente avec c, mais on choisit une valeur de c gnralement comprise entre 50 et 100.
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Avec un c gal 50 on a N1 = 39,7 N2 = 59,9 et R = 66,3. Pour un aliment tout juste conforme (avec une norme T de 100 germes par ml ou g) il faut procder de telle sorte que la glose prsente N1 (39,7) germes en moyenne; cest en effet la condition pour que cet aliment nait que 5 chances sur 100 dtre refus. Il faut donc dposer sur la glose lquivalent de N1/T = 39,7 / 100 (ml ou g) du produit. La valeur N 2 . T 100 T = 151 germes / ml ou g = R N1 nous indique la densit microbienne dun aliment qui a encore 10 chances sur 100 dtre accept. La mme dmarche est applicable au contrle en milieu liquide.
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II. GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

Tous les germes pathognes qui peuvent tre transmis par les aliments et les espces de microorganismes capables daltrer les aliments sont considrer. Il en est de mme des produits toxiques rsultant de la prsence des microorganismes (toxines, mtabolites toxiques). Parmi les germes importants en microbiologie alimentaire on peut citer, sans entrer dans le dtail* les germes suivants : (*pour plus de dtails se rfrer au document Maladies microbiennes lies la consommation daliments )
A. Clostridium botulinum
Ce germe fait courir un trs grand risque de contamination bactrienne de nombreux aliments, notamment les conserves (botes et bouteilles) qui subissent un traitement thermique insuffisant. Cependant les tests de routine permettant de le rechercher ne sont que trs rarement raliss : il ne peut exister aucun plan dchantillonnage satisfaisant pour assurer une protection adquate, et ce, en raison de la trs grande toxicit de lexotoxine synthtise par le germe. Le contrle est obtenu au moyen de spcifications effectuer en cours de fabrication ou pendant lentreposage (caractres de laliment tels que pH, activit de leau, addition de nitrites, strilisation si possible, temprature dentreposage, etc). Le germe peut tre recherch dans un aliment souponn dtre lorigine dune intoxination. Laliment est mis en culture et on value la toxicit du filtrat (ou du surnageant de centrifugation) par injection la souris, en utilisant les antitoxines appropries pour les tests de protection. Cette mthode dangereuse demande beaucoup de temps. Actuellement la recherche des germes au moyen danticorps fluorescents est au point et la mise en vidence de la toxine peut tre effectue par lectro-immunodiffusion. Nanmoins si le microbiologiste/technologue est amen rechercher ce germe, cest quil na pas matris lensemble des points critiques concernant ce germe.
B - Salmonella sp
Les nombreuses espces de Salmonelles diffrent normment entre elles quant leur pouvoir pathogne. Bien que la plupart des espces puissent se retrouver dans les aliments, les normes visent en gnral celles qui sont lorigine de toxi-infections plutt que celles qui sont lorigine des maladies infectieuses graves (fivres typhodes et paratyphodes). La recherche des germes est complexe et il nexiste pas encore de technique standard rapide. Ainsi la nature du milieu de pr-enrichissement, celle du milieu denrichissement, la temprature dincubation de ces milieux, la nature de la glose slective et les mthodes didentification biochimique sont encore lobjet de nombreuses controverses. De plus, certains plans dchantillonnage requirent lexamen dune cinquantaine dchantillons. Ces chantillons peuvent tre mlangs et soumis au pr-enrichissement ; si c > 0, ils doivent tre traits individuellement. Parmi les nouvelles mthodes disolement et didentification (non encore retenues) on peut citer : lutilisation du phage gnral pour Salmonella (Felix 0-1), lusage de srums polyvalents pour les tests dagglutination, la technique dimmunofluorescence ou immunoenzymatique et enfin les techniques par hybridation ADN-ADN dj commercialises sous forme de kits qui semblent trs prometteuses.
C - Shigella sp
Ces germes sont souvent traits avec Salmonella en ce qui concerne les normes. Ces bactries sont cependant plus souvent prsentes que les Salmonella dans leau et les lgumes frais exposs une contamination fcale.
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D - Escherichia coli entropathogne
Ce germe est bien connu comme tant lagent de maladies transmissibles par les aliments. Il nexiste cependant pas de techniques et de tests de pathognicit standardiss. Le srotype O157 H7 provoque une colite hmorragique svre.
E - Les entrobactries
Quatre groupes bactriens de cette famille sont utiliss comme germes indicateurs de contamination fcale: les coliformes, les coliformes fcaux assimils souvent aux coliformes thermotolrants, Escherichia coli et les entrobactries. Cependant, si les coliformes et E. coli sont des indicateurs valables de la pollution bactrienne des eaux, ils sont utiliss diffremment pour les tests applicables aux aliments. La recherche de E. coli et des coliformes fcaux est ralise pour surveiller la contamination dorigine fcale daliments nayant pas subi de traitements destins dtruire les entrobactries : les crustacs et les mollusques par exemple. La recherche des coliformes fcaux est souvent prfre celle dE. coli en raison de sa rapidit. Il faut signaler ici que le groupe des coliformes fcaux est dfini administrativement et non sur des bases taxonomiques ; ils ne sont pas forcment E. coli et E. coli ne reprsente pas forcment lensemble des coliformes fcaux. La recherche des coliformes est actuellement effectue dans des aliments transforms (produits pasteuriss etc...). Elle permet de mettre en vidence linsuffisance du processus ou de mauvaises conditions de fabrication (recontamination par exemple). Pour leur recherche dans le lait la temprature dincubation est abaisse 30C pour inclure davantage despces dorigine non fcale. Lacceptation du terme fcal peut tre large et la recherche des coliformes peut constituer un indicateur de la prsence de germes Gram ngatif (les bactries Gram positif et lactose ngatif sont exclues). La recherche des entrobactries dans laquelle ne sont exclues que quelques bactries Gram ngatives mais tous les bacilles et coques Gram positifs est souvent ralise. Dans cette recherche le milieu contient du glucose (et non du lactose) et on dnombre ainsi certains germes lactose ngatifs (Salmonella, Shigella) et certaines souches dE. coli entropathognes qui ne sont pas retrouves par colimtrie. Inversement cette preuve permet de dtecter des souches de Salmonella lactose positives qui chappent la plupart des mthodes de recherche de Salmonella. Pour le contrle de la conformit aux normes, la numration de ces germes se fait en milieux solide (DCL) ou liquide (BLBVB et estimation du NPP). Trois sries de milieux sont utilises pour les preuves des coliformes, des coliformes fcaux et de E. coli . Parmi les milieux liquides, le bouillon lactos bili au vert brillant (BLBVB) et le bouillon tryptose au lauryl sulfate sont les plus utiliss. Dans les recommandations de lICMSF de 1974, les valeurs de m pour les coliformes sont de moins de 3 103 par ml ou g daliment, ce qui rend difficile lutilisation de milieux solides.
F - Staphylococcus aureus et lentrotoxine staphylococcique
Ce germe Gram positif halophile est souvent isol ou dnombr dans des milieux fortement sals (Chapman). Cependant on sait depuis peu que les cellules stresses au cours des traitements technologiques ne sont pas rcupres quantitativement sur les milieux sals (liquides ou solides) ce qui a conduit ladoption dautres milieux comme le milieu de BAIRD PARKER. Les Staphylococcus aureus coagulase positive souvent recherchs ne sont pas forcment entrotoxinognes; par contre ceux qui sont coagulase ngative ne synthtisent souvent pas de toxine. Le nombre de staphylocoques tolrs dans les aliments est gnralement peu lev, ce qui ncessite lutilisation de milieux liquides (milieux de GIOLOTTI CANTONI ou bouillon de soja - trypticase 10 % NaCl). La recherche de lentrotoxine devrait tre effectue dans des produits o la production de toxines est suivie de la mort des staphylocoques. On estime lheure actuelle quil faut au moins 5.105
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staphylocoques par g ou ml de produit pour engendrer une maladie. Pour dceler les entrotoxines on utilise les techniques de diffusion en milieu glos (sur lame) ; il faut dans une premire tape concentrer la toxine de plus de 100 fois. Les preuves radioimmunologiques peuvent tre utilises dans les analyses de routine (mthode coteuse), de mme que la technique ELISA. Ces mthodes sont spcifiques des diverses toxines et il est possible que certaines entrotoxines naient pas encore t identifies. Toute norme devrait donc prciser les toxines rechercher. La recherche dune ADNase thermostable pourrait constituer une indication de la prsence de staphylocoques entrotoxinognes.
G - Vibrio
1 - VIibrio choler Le cholra est une maladie grave qui, est le plus souvent, transmise par leau. La recherche de ce germe ne se fait que dans des aliments souponns dtre lorigine de la maladie ou dans des rgions risque lev. 2 - VIibrio parahmolyticus Ce germe dorigine marine est de plus en plus largement reconnu comme responsable dune toxi infection alimentaire par suite de la consommation de produits de la mer. La recherche de ce germe halophile est ralisable aprs enrichissemnet (bouillon sal la colistine); pour sa numration on utilise un milieu glos (glose saccharose, aux sels biliaires, au citrate et au thiosulfate : TCBS). La raction de KANAGAWA (mise en vidence dune -hmolyse sur milieu de WAGATSUMA additionne de chlorure de sodium) permet la mise en vidence du germe. 3 - VIibrio sp non agglutionnants La maladie attribue ces vibrions inspire des proccupations croissantes en rapport avec des aliments provenant de certaines rgions dextrme Orient. Aucune norme visant ces germes nest encore envisage.
H - Brucella sp
La brucellose est une maladie infectieuse grave lie la consommation daliments bien particuliers , le fromage de chvre tant souvent mis en cause. Elle ne poserait aucun problme si le lait destin leur fabrication tait pasteuris. La recherche de cette bactrie se fera par hybridation ADN-ADN, alors que la recherche des anticorps anti-Brucella dans les produits laitiers se fait par le ring test.
I. Clostridium perfringens
Ce germe tellurique anrobie strict est trs largement rpandu dans lenvironnement et est responsable de toxi-infections. Les viandes sont frquemment contamines; ce germe ne prsente dans la plupart des cas de risques pour le consommateur quaprs mauvaise manutention/gestion dun aliment aprs cuisson. Ce germe produit au cours de sa sporulation une entrotoxine qui est libre au moment de sa germination. Cette toxine est dcelable par diverses mthodes (anticorps fluorescents, hmagglutination). Actuellement on ralise surtout lisolement ou la numration des formes vgtatives et des spores de ce microorganisme. Parmi les principaux milieux utiliss on peut citer : la glose au sang au sulfate de nomycine, la glose tryptone sulfite la nomycine et la glose sulfite la polymyxine et la sulfadiazine (SPS). C. perfringens est tolr dans les aliments en nombre relativement faible (entre 1 et 100 par g ou ml). Le recours des mthodes denrichissement est envisag pour certains produits (aliments dittiques et de rgime). Des mthodes de recherche par hybridation ADN-ADN sont au point.
J - Bacillus cereus
Ce germe est trs largement rpandu dans lenvironnement. Les risques lis la prsence de ce germe apparaissent quand laliment est mal manutentionn au cours de sa prparation finale avant
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consommation. Pour sa numration, on utilise la polymyxine comme agent slectif. Lobservation de ses caractres lcithinase + et de mannitol - permet une numration slective.
K - Streptococcus sp
Les maladies provoques par les streptocoques hmolytiques sont frquemment transmises par les aliments, mais leur frquence est faible. Ainsi les normes visant Streptococcus pyogenes sont rares. Il est peu courant que les streptocoques fcaux soient impliqus dans des maladies dorigine alimentaire. Les entrocoques sont des indicateurs de contamination fcale en particulier dans les aliments congels o ils survivent plus longtemps et mieux que les coliformes.
L - Listeria monocytogenes
La listriose est une maladie provoque par la consommation de lait et surtout de fromages contamins mal pasteuriss. Ce germe est capable de survivre longtemps dans des conditions dfavorables et son caractre cryophile le rend particulirement dangereux dans les produits rfrigrs. La recherche du germe par les mthodes traditionnelles est fastidieuse et longue. La recherche par hybridation ADN-ADN, les mthodes immuno-enzymatiques ralises aprs enrichissement sont des techniques de recherche actuelles et dont la modernisation est continue.
M - Campylobacter jejuni
La campylobactriose est une maladie trs rpandue provoque par cette bactrie qui est un hte normal de lintestin de nombreux animaux comme le poulet ou la dinde dans lintestin desquels la charge microbienne est de lordre de 106 et plus. Ce sont surtout les aliments dorigine animale (volailles plus particulirement) mal cuits qui sont lorigine de la maladie. Ce germe est sensible aux traitements thermiques et ne se multiplie pas en-dessous de 30C.
N - Yersinia enterocolytica
La yersiniose est une maladie provoque par cette bactrie ingre le plus souvent avec des aliments crus (lait , coquillages , viandes , volailles). Seules certaines souches sont pathognes; ce germe est trs sensible la chaleur et est facilement dtruit par cuisson ou pasteurisation.
L - Levures et moisissures
Les levures et moisissures sont des agents importants de dtrioration des aliments acides ou faible activit deau. Les mycotoxines quils excrtent et prsentes dans les aliments inspirent des proccupations croissantes. Ces microorganismes sont souvent isols et dnombrs sur des milieux acidifis (glose glucose la pomme de terre, glose lextrait de malt). Le pH bas de ces milieux ninhibe pas toutes les bactries et il peut mme inhiber certaines levures ou moisissures. Certains milieux contiennent des antibiotiques ou autres agents antibactriens (glose glucose loxyttracycline et extrait de levure (OGA) et glose la chlorttracycline et au rose de bengale (RBC). Linterprtation du comptage des levures dans les aliments est simple. Par contre la signification des dnombrements des moisissures est considrablement influence par les traitements dhomognisation et la forme principale sous laquelle se prsente la moisissure : dveloppement myclien ou au contraire sporulation vigoureuse.
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III. PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES MICROORGANISMES DANS LES ALIMENTS
Lanalyse microbiologique des aliments est rglemente et au cours du contrle qui peut tre effectu par des laboratoires dEtat ou des laboratoires agrs une distinction est faite entre produit non conforme et produit toxique. Ainsi les normes microbiologiques appliques un aliment donnent en gnral les limites de conformit et de toxicit de mme que les mthodes utiliser (normes de lAssociation Franaise de Normalisation par exemple). Le plus souvent ces normes imposent que laliment soit exempt de tout germe pathogne ou de toxine microbienne et que la flore totale soit peu abondante (au point de vue sanitaire, la flore totale nest pas considre dans le cas des produits ferments). Gnralement lanalyse dun aliment nest pas systmatique et elle peut reposer sur des prsomptions. Le contrle de la qualit sanitaire est bas sur la numration des germes totaux (flore htrotrophe arobie msophile totale) de laliment et sur la recherche de germes indicateurs de contamination fcale tels que les coliformes (souvent associs des flores pathognes comme les Salmonella ou les Shigella ), les entrocoques, les phages fcaux actifs sur la flore intestinale , de germes indicateurs dune contamination tellurique comme les anarobies sulfito rducteurs ou encore et en fonction de la nature du produit sur la recherche de germes ubiquitaires et dorigine humaine ou animale comme les Staphylococcus . Certains germes dangereux appartenant aux genres Salmonella , Vibrio , Brucella, Listeria, Campylobacter, Yersinia ou encore Mycobacterium sont parfois recherchs dans des produits risques. Les rsultats obtenus permettent dliminer les produits suspects ou contamins et surtout damliorer la qualit de fabrication par limination des points critiques. Parmi les mthodes de recherche et de numration des microorganismes dans les aliments dans les matires premires , dans leau et dans les units de production et de distribution (matriels, conditions de travail, manipulateurs, conditions de traitement, modalits dentreposage etc) on peut citer :
A - LA NUMERATION DES GERMES TOTAUX (ou flore totale ou germes arobies msophiles htrotrophes neutrophiles)
Le dnombrement des germes totaux concerne surtout les bactries arobies msophiles revivifiables aprs 72 h dincubation 30C dans un milieu de culture bien dfini ; il est en effet presque impossible de raliser en un seul test le dnombrement de la flore totale relle (composition du milieu, temprature dincubation, atmosphre etc...). Ce dnombrement effectu dans lanalyse type dun aliment constitue un indicateur de la qualit sanitaire et reflte lHISTOIRE du produit naturel. La plupart des aliments dorigine animale ou vgtale non soumis des traitements de conservation sont normalement porteurs de certains germes. Il est ainsi possible de prdire les types microbiens que lon a le plus de chance de rencontrer tout au long de leur histoire. Ce nombre de germes totaux pourra reprsenter ltat de fracheur ou ltat de dcomposition du produit. Sur le produit manipul ou soumis divers traitements technologiques, le dnombrement des germes totaux permettra de juger de la qualit des oprations de production, transport, entreposage etc. Il est trs important de savoir quun nombre peu lev de germes peut ne pas correspondre un produit sain (prsence de germes pathognes, prsence de toxines actives dans des conditions pour lesquelles les cellules qui les ont produites nont pas survcu) ; par ailleurs un nombre
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trs lev de germes totaux peut correspondre un produit sain (laits ferments, choucroute, etc...). Ce dnombrement est gnralement ralis en milieu solide.
A - 1 . Mthodologie
1 ml de la suspension mre et de ses dilutions est ensemenc dans la masse du milieu glos de numration (15 ml de milieu en surfusion 45-47C , 12 ml suffisent pour le lait). Il est recommand de ne pas attendre plus de 15 minutes entre la prparation de la suspension mre et ses dilutions et le moment o la glose est coule. Il est galement recommand de couler la surface du milieu ensemenc (aprs solidification) une mince couche de glose blanche ou glose non nutritive (4 ml de glose 1,5 %). Cette numration peut tre ralise par talement en surface au moyen dun rteau, de 100 l du produit et de ses dilutions; ltalement au moyen du rateau doit tre effectu immdiatement avant que ces 100 l ne soient absorbs en totalit dans la glose. Remarque : la strilisation du rteau entre chaque talement est effectue par son immersion rapide dans de lalcool thylique immdiatement suivie dun passage dans une flamme pour enflammer lalcool rsiduel dont la combustion assurera la strilisation sans chauffement excessif ni dformation.
A - 2 . Milieux prconiss
Milieu peptone-extrait de (PCA) lAFNOR (1973) peptone 6g extrait de levure 3 g glose 15 g eau D 1000 ml pH final 7,2
milieu prconis par lAmerican Public Health peptone pancratique de casine 5g extrait de levure 2,5 g glucose 1g glose 18 g eau D 1000 ml pH final 7,2
milieu prconis par levure Association hydrolysat pancratique de casine 5g extrait de levure 2,5 g glucose 1g glose 15 g eau D 1000ml pH final 7,0
Les milieux sont striliss 121C pendant 15 20 minutes. La lecture se fait aprs 72 heures dincubation 30C. Ces milieux ne conviennent pas pour les Lactobacillus et pour certaines espces osmophiles. Pour la numration des thermophiles 1 ml dinoculum est mlang 20 ml de milieu en surfusion avant incubation. REMARQUE : Cette numration peut tre ralise par la mthode de filtration (pour leau en particulier). Dans ce cas le filtre au travers duquel est pass un volume donn dchantillon ou de sa dilution est dpos sur le milieu de culture pralablement coul dans la bote de Ptri, surface porteuse des germes vers le haut et les colonies formes sont comptes aprs 48 72 heures dincubation 30C (bote retourne pour viter les phnomnes de condensation).
A - 3 . Dnombrement de la flore totale arobie au moyen du Ptrifilm (Laboratoires 3 M Sant, 40, rue G. CRIE, 92245 Malakoff Cedex, tl. 0146 57 12 34
Il sagit dun systme de culture / numration usage unique qui peut tre utilis dans le cas danalyses microbiologiques peu nombreuses. Le Ptrifilm SM contient les lments nutritifs du PCA, ainsi quun agent glifiant soluble dans leau froide. Le film infrieur est revtu du milieu et dun agent glifiant; le film
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suprieur sert de support un agent glifiant et du chlorure de triphnylttrazolium qui est un indicateur rdox facilitant la lecture par sa rduction en formozan rouge. Pour raliser la numration, il faut dposer le film sur une surface plate et dans une zone strile, soulever le film suprieur et dposer lentement 1 ml de lchantillon ou de ses dilutions au centre du film infrieur. Celui-ci est alors recouvert dlicatement avec le film suprieur en vitant lintroduction de bulles dair. La rpartition homogne de linoculum est obtenue au moyen dun applicateur avec lequel on excerce une lgre pression sur le diffuseur. Le film est alors incub horizontalement, le film suprieur vers le haut (il est possible dempiler une vingtaine dunits). Aprs 48 72h d incubation 30C, le comptage des colonies est effectu.
dpt de l' chantillon
recouvrir avec le film suprieur
uniformiser le dpt par pression avec le diffuseur incuber
compter , isoler
Pour isoler des colonies destines par exemple une identification , on soulve le film suprieur sur lequel on effectue le prlvement dans le gel. Aprs utilisation le systme est autoclav avant mise la poubelle. Le film se conserve environ 1 an 4C dans son emballage dorigine. Dautres systmes faciles dutilisation existent. Il vous appartient de vous tenir informs et de moderniser sans arrt les mthodes utilises en veillant leur validation AFNOT ou ISO par exemple.
A - 4 . Interprtation des rsultats
(Cf tableaux des critres microbiologiques de quelques aliments (fin du document). Il ne faut pas perdre de vue que cette numration est faussement qualifie de totale car les germes anarobies, les germes thermophiles, cryophiles, acidophiles etc. ne cultivent pas dans les conditions adoptes. Nanmoins, ces conditions permettent la croissance dun grand nombre de germes dangereux et/ou susceptibles dinduire des dgradations. On admet gnralement quune charge microbienne 3.108 par g (exception faite des produits ferments) caractrise un produit dgrad et impropre la consommation. En cas dexpertise consulter la norme AFNOR V 08-011.
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B - RECHERCHE DUNE CONTAMINATION DORIGINE FECALE B - 1 . La colimtrie
Les coliformes sont des entrobactries (bacilles gram -, asporuls, glucose+ (F), oxydase-, nitrate rductase+, arobies anarobies facultatifs) qui fermentent le lactose avec production de gaz 30C. Il sagit dun groupe disparate non dfini sur le plan taxonomique qui comprend les genres Escherichia (avec les espces coli, intermedium, freudii ), Citrobacter, Enterobacter et Klebsiella . Les coliformes fcaux, donc dorigine intestinale, sont des coliformes qui fermentent le lactose avec production de gaz 44C (Tests de MAC CONKEY, 1901 ou dEIJKMAN, 1904). On les assimile souvent aux coliformes thermotolrants.
Escherichia coli dont il existe de nombreux srotypes, certains tant entropathognes, est identifiable dans le groupe des coliformes fcaux par le test de MACKENZIE (production dindole 44C). Cette bactrie est le seul coliforme rsistant au phnol 0,85 .
Le dnombrement des coliformes totaux est encore considr comme un indice de contamination fcale. Or sil savre que leur prsence dans leau constitue un bon indice de contamination fcale rcente, leur survie tant de courte dure dans ce milieu, il nen est pas de mme dans de nombreux aliments. Ainsi des coliformes ont t retrouvs dans dautres sources que les matires fcales. Le dnombrement des coliformes fcaux (ou thermotolrants) considrs comme des germes indicateurs de la qualit hyginique de laliment, constitue par contre un bon indice de contamination partir des matires fcales de lhomme et des animaux. Ces bactries sont souvent associes des entrobactries pathognes comme les Salmonella et les Shigella. Ces coliformes reprsentent environ 1 % de la flore intestinale et ne provoquent gnralement pas de maladie chez lhomme adulte ; leur nombre est voisin de 108 par g de matire fcale. La croissance de certains de ces germes est possible sur un trs grand nombre de milieux ou daliments entre -2 et 50C, entre pH 4,4 et 9. La rsistance des coliformes et des coliformes fcaux aux conditions extrieures dfavorables est faible (traitements technologiques divers, entreposage, etc.). Ainsi leur nombre au moment de lanalyse ou fourni par lanalyse nest pas toujours proportionnel limportance de la contaminaton ; leur prsence dans un aliment cuit ou pasteuris signifie que la contamination est postrieure au traitement thermique. Il reste alors trouver lorigine de la contamination (manipulateurs, plans et instruments de travail, contact avec des produits crus). De plus, ces germes peuvent se multiplier dans certains produits quand les conditions sont favorables. La plupart de ces germes nest gnralement pas, sauf en cas de prolifration abondante, dangereuse au point de vue sanitaire (attention au type de produit et de consommateur). Leur prsence peut tre un bon indice des mauvaises conditions de manipulation ou de traitement des aliments (pasteurisation insuffisante par exemple). Le test de diffrenciation entre les coliformes totaux et les coliformes fcaux (Test de Mac Conkey ou dEijkman) repose sur lincubation des milieux deux tempratures (30 et 44,5C). Leffet inhibiteur de la temprature sur la croissance et le mtabolisme des coliformes (non fcaux) 44,5C implique des composants cellulaires du mtabolisme fermentatif et arobie du lactose ; la permabilit membranaire est trs diminue chez ces coliformes 44,5C. Dans la plupart des analyses systmatiques, la numration des coliformes fcaux et la recherche dE. coli par le test de MAC KENZIE sont ralises. Il faut cependant signaler que
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la mise en vidence dE. coli par cette mthode peut tre erronne car certaines bactries (Klebsiella oxytoca et certaines espces de Citrobacter ) donnent une raction positive. Il faut alors identifier E. coli par la recherche de son biotype (galerie classique ou systme de type API 20E ou 40E) et de son srotype. La numration dEscherichia coli est un bon indice de contamination fcale. Ce germe peut tre associ des germes pathognes. Cependant cette mesure ne permet pas de connatre, sils sont prsents, la nature et le nombre de ces germes pathognes. La recherche dE. coli entropathognes ou entrotoxinognes est trs importante au point de vue sanitaire. Ces germes sont capables de provoquer des diarrhes graves, en particulier chez les jeunes enfants avec des syndrmes ressemblant au cholra. Les E. coli en entropathognes adhrent lpithlium au niveau du colon et leur multiplication intracellulaire se traduit par un syndrme ressemblant la dysenterie (ulcrations et formation locale de lsions conduisant la prsence de sang, mucus et cellules dans les excrtas). Ces germes adhrent aux cellules de lpithlium de lintestin grle et laborent des entrotoxines (thermostables, thermolabiles ou les deux). La recherche et la numration de ces bactries est actuellement ralisable (pour plus de dtails voir par exemple: I.J. MEHLMAN et A. ROMERO, 1982, Enteropathogenic E. coli : methods for recovery from foods, Food Technology, March, 73-79. Signalons enfin que la recherche et/ou la numration des entrobactries comme indicatrices des mauvaises conditions de manipulation et de fabrication est parfois ralise.Le milieu utilis est le milieu VRBG (violet cristal, rouge neutre, bile, glucose, cf p.46) ; aprs ensemencement de 1 ml ralis dans 13 ml de milieu 47C, 9 ml de milieu sont couls en double couche. Lincubation dure 24 heures 30C. Les entrobactries donnent des colonies rouges dun diamtre O,5 mm. La colimtrie, cest dire la numration des coliformes, peut tre ralise soit en milieu liquide, soit en milieu solide (par ensemencement dans la glose ou aprs filtration). On tolre en gnral un nombre de coliformes infrieur 100 par g ou ml du produit, cette tolrance tant fonction entre autre, de la nature du produit et du consommateur. Des normes bien prcises sont donc dfinies pour chaque type daliment ainsi que les valeurs de n , c , m et M (cf p14). En cas dexpertise se rapporter aux normes AFNOR V 08-015 et V-08-016
B - 1 - a . Dnombrement en milieu liquide (AFNOR, 1974)
La numration des coliformes est ralise par ensemencement de 1 ml de laliment (ou de sa suspension mre) et de ses dilutions dans un bouillon lactos bil au vert brillant (BLBVB). Les essais sont effectus en double ou en triple et les rsultats analyss par la mthode de Mac Grady (cf page 24 et 29 ). Milieu BLBVB (utilis pour la plupart des produits alimentaires) Peptone pancratique de casine 10 g Lactose 10 g Bile de buf dshydrate 20 g Vert brillant 13,3 mg Eau D 1000 ml pH 7,2. Rpartir raison de 10 ml par tube et striliser 121C pendant 15 min. Chaque tube est pralablement muni dun petit tube essai renvers (cloche de DURHAM) destin piger la formation ventuelle de gaz.
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Le vert brillant inhibe les germes Gram+, et la bile, par son fort pouvoir tensioactif li la prsence de sels biliaires, inhibe la plupart des germes qui ne sont pas dorigine intestinale. Aprs ensemencement, les milieux sont incubs 30C pendant 24 h puis 48 h. Sont considrs comme positifs les tubes dans lesquels il y a croissance et une production notable de gaz (1/10 au moins du volume de la cloche).
tube initial
rponses ngatives
rponse positive
La numration des coliformes fcaux (ou E. coli prsomptifs) est effectue avec le mme milieu mais aprs 48 heures dincubation 44,5C.
Test de Mac KENZIE : une se dun tube positif est inocule dans un tube de BLBVB avec cloche , et une autre dans un tube deau peptone ; si aprs incubation 44C pendant 48h il y a production de gaz (BLBVB) et dindole (mis en vidence par addition de ractif de Kovacs dans le tube deau peptone) on peut souponner la prsence d E. coli.
Ces recherches peuvent tre confirmes par lisolement et lidentification des bactries productrices de gaz ( isolement sur EMB par exemple). Quelques fois les milieux de culture sont utiliss double concentration dans le but de prserver une composition finale adquate au milieu aprs addition dun volume dinoculum gal au volume du milieu. Ceci permet la numration dun nombre peu lev de coliformes. Milieu BCP : bouillon lactos au pourpre de bromocrsol (colimtrie de leau) peptone 5g extrait de viande 2 g lactose 5g pourpre de bromocrsol 25 mg eau D 1000 ml , pH 6,9 Rpartir raison de 10 ml par tube avec cloche de Durham. Strilisation 115C pendant 20 minute . Pour une analyse standard deau ,: 2 tubes avec 10 ml de bouillon double concentration + 10 ml deau analyser 2 tubes de bouillon normal + 1 ml deau analyser 2 tubes de bouillon normal + 1 ml des diverses dilutions Lincubation est de 48 heures 30C. Les tubes positifs (trouble et gaz) peuvent tre soumis au test de Mac KENZIE .
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B - 1 -b . Dnombrement en milieu solide
La numration des coliformes peut tre effectue par ensemencement de 1 ml de produit (ou de la suspension mre) et de ses dilutions dans 15 ml de milieu glos bili au cristal violet et au rouge neutre (VRBL) prconis par lAFNOR (1974) ou en milieu glos dsoxycholate citrate - lactose (DCL).
Milieu VRBL Extrait de levures peptone pancratique de casine dsoxycholate de sodium lactose NaCl rouge neutre cristal violet glose eau D pH = 7,4.
3g 7g 1,44 g 10 g 5g 30 mg 2 mg 11g 1000 ml
3 g pour VRBG 0,5 g pour VRBG 10 g glucose pour VRBG
Porter 1 litre deau bullition pendant 10 minutes et la ramener la temprature ambiante ; ajouter lentement 37,5 g du mlange et attendre 5 minutes. Faire chauffer lentement en agitant jusqu bullition. Ajuster le pH si ncessaire. Refroidir 45C pour lensemencement. NE PAS AUTOCLAVER. Ce milieu doit tre utilis rapidement aprs sa prparation. 1 ml de produit et de ses dilutions sont introduits dans une bote de Ptri dans laquelle on ajoute alors et en mlangeant 13 ml de milieu 45C . Aprs refroidissement, 5 8 ml de ce mme milieu strile et 45C sont couls la surface et, aprs solidification, la bote est incube retourne 24 h 30C (ou 37C selon les rglements). Sur ce milieu le dveloppement de la plupart des bactries nappartenant pas la famille des entrobactries est inhib par le cristal violet et le sel biliaire; il en est de mme avec les Proteus . Lutilisation du lactose est mise en vidence par le virage au rouge de lindicateur dans la colonie. Lecture : les colonies considrer sont violettes rose-rouges, dun diamtre voisin de 0,5 1 mm, et entoures dun halo rougetre de prcipit de sels biliaires quand ceux-ci sont modifis. Les colonies lactose- sont incolores .
Milieu DCL bactopeptone 10 g lactose 10 g NaCl 5g K2HP04 2 g (facultatif) citrate ferrique 1 g (facultatif mais alors prendre 2 g de citrate de sodium) citrate de sodium 1 g dsoxycholate de Na 0,5 g rouge neutre 30 mg glose 13 g eau D 1000 ml pH = 7,2.
Porter bullition de leau distille pendant 10 minutes. Refroidir 25C. Ajouter 40,5 g de mlange pour 1 litre de cette eau ; attendre 5 minutes et faire chauffer lentement en agitant et ce, jusqu bullition . Il est conseill de NE PAS AUTOCLAVER.
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Mode opratoire : 1 ml de produit et de ses dilutions sont mlangs 13 15 ml de milieu maintenu 45C. Aprs solidification 4 6 ml de milieu strile en surfusion sont ajouts en surface. Aprs nouvelle solidification le milieu ensemenc est incub 30C (ou 37C) pendant 24 h pour la numration des coliformes totaux et 44C pendant 24 heures pour compter les coliformes fcaux . Les coliformes donnent des colonies rouges dont le diamtre et suprieur 0,5 mm . Les entrobactries lactose - (Salmonella , Shigella , Proteus ) et Pseudomonas donnent des colonies incolores. Dans les botes ensemences par talement en surface E. coli donne des colonies rouges lenticulaires avec halo de prcipit dacide biliaire ; Enterobacter , Citrobacter et Klebsiella donnent des colonies ples avec centre rose et halo de prcipit .
B - 1 - c . Identification dEscherichia coli (ou du coliforme total dominant ou du coliforme fcal)
Une deux ses du milieu BLBVB sont inocules sur un milieu EMB coul dans une bote de Ptri (isolement par la mthode des cadrans). Aprs 24 h dincubation 37C, la ou les colonies lactose + sont identifies par la mthode classique (Kligler, citrate, mannitol-mobilit, ure-indole, Clark et Lubs) ou par une mthode du type API. On considre comme E. coli toute souche glucose+ lactose + donnant les caractres indole+, RM+, VP-, citrate-, Gaz+, mannitol+ et urase-.
B - 1 - d . Colimtrie par filtration (cf chapitre E.9)
Il est possible de raliser la colimtrie par la mthode de numration aprs filtration . Il est ainsi possible de raliser la numration des coliformes ou des coliformes fcaux. Les milieux les plus souvent utiliss sont : la glose lactose au TTC et au tergitol ou le milieu dENDO ou autre. Glose lactose au tergitol et au TTC peptone 10 g extrait de viande 5g lactose 20 g bleu de bromothymol 50 mg glose 13 g eau D 1000 ml
pH 7,2
Mlanger 47,8 g de milieu et 1 litre deau D 20 C, attendre 5 minutes et mlanger. Chauffer lentement jusqu dissolution bullition. Ramener 45C et ajouter : - 50 ml dune solution de chlorure de 2-3-5 triphnylttrazolium 50 mg pour 100 ml deau D, solution pralablement strilise par filtration sur membrane 0,45 m - 50 ml dune solution de tergitol 7 0,2 % deau D . Mlanger , et couler raison de 15 ml par bote de Ptri de 90 mm. Dposer la membrane sur la glose et incuber 24 h 37C (coliformes totaux) ou 24 h 44C (coliformes fcaux). Lecture : colonies violettes : rduisent le TTC. Colonies jaunes: non rductrices. Un halo jaune autour de la colonie indique la fermentation du lactose, il est bleu avec les germes lactose -
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Milieu ENDO peptone 10 g hydrognophosphate de K 3,5 g sulfite de sodium 2,5 g lactose 10 g glose 15 g Fuchsine 10 % dans lthanol 4 ml eau D 1000 ml, pH 7,5 Striliser 120C pendant 15 minutes. Les coliformes donnent sur ce milieu des colonies rouges clat mtallique dor. Les bactries lactose - donnent des colonies incolores.
B - 1 - e . Colimtrie par le systme Ptrifilm VRB
Le milieu infrieur contient un glifiant froid associ un milieu bili au cristal violet et au rouge neutre. Le film suprieur sert de support un agent glifiant froid et du chlorure de triphnylttrazolium. La fermentation du lactose par les coliformes saccompagne de production de gaz. Celui-ci pig par le film suprieur saccumule autour des colonies de coliformes qui sont colores en rouge. La numration des coliformes totaux et celle des coliformes fcaux est ralisable par incubation respective 37 et 44C.
B - 1 - f . Rsultats
Les rsultats sont exprims en nombre de coliformes totaux ou de coliformes fcaux, ou dEscherichia coli ou dentrobactries par ml ou par g daliment. Cf critres microbiologiques par aliment.
B - 2 . Numration des streptocoques du groupe D de Lancefield
Les streptocoques du groupe D ou streptocoques fcaux font partie de la flore intestinale de lhomme et des animaux ; leur nombre varie de 105 107 par g de matire fcale. Ces germes sont par ailleurs abondamment rpandus dans la nature (vgtaux etc...) et de ce fait leur prsence dans un aliment nindiquera pas forcment une contamination dorigine fcale.
Ces germes ne sont pratiquement recherchs que dans les produits de la pche et leau.
Parmi les streptocoques du groupe D on rencontre les espces suivantes : Streptococcus faecalis, S. faecalis varit liquefaciens , S. faecalis var. zymogenes , S. faecium et S. durans . Certains auteurs ont propos dinclure les espces S. bovis, S. equinus et S. mitus dans le groupe des stretpocoques fcaux. De toutes les bactries non sporognes, ces germes sont parmi ceux qui rsistent le mieux des conditions de milieu dfavorables. Ces germes rsistent mieux que les coliformes et E. coli la rfrigration, la conglation, au chauffage, la salaison, la dessiccation et un sjour dans leau. De ce fait ces bactries peuvent se multiplier dans un grand nombre daliments (produits acides, sals, rfrigrs etc..) quelles peuvent ainsi altrer. Les streptocoques fcaux sont moins souvent associs aux germes pathognes que les coliformes fcaux. Leur croissance est faible sur les milieux de culture (colonies de petit diamtre) ; elle est possible entre 0 et 50C, entre pH 5 et 9,6, en prsence de bile (40 %) et de chlorure de sodium (6,5 %). Ces germes sont microarophiles.
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Le groupe des streptocoques D ne renferme pas despce considre pathogne au point de vue alimentaire. Cependant, aprs prolifration abondante dans laliment, ces germes peuvent tre lorigine de toxi infections bnignes qui sont toutefois exceptionnelles. De ce fait on tolre en gnral moins de 103 streptocoques fcaux par g ou ml daliment , tant entendu que cette tolrance doit tre ajuste la nature de laliment et au type de consommateur . Remarque : le rapport coliformes fcaux / streptocoques fcaux est en gnral suprieur 1 si la contamination est dorigine humaine, et infrieur 1 si elle est dorigine animale.
B - 2 - a . Numration en milieu liquide
Cette numration se fait en deux tapes :
1) test prsomptif
Ce test est effectu par ensemencement dun milieu de ROTHE (surtout pour lanalyse de leau : circulaire du 21 janvier 1960). Ce milieu contient de lazide de sodium (NaN3) qui inhibe la plupart des microorganismes (inhibiteur des phnomnes respiratoires). Ce milieu est peu favorable la croissance des Streptocoques fcaux et la plupart des autres bactries ny cultivent pas. Le milieu de ROTHE est cependant moins slectif que le milieu de LITZKY, ce qui le fait utiliser dabord , les germes adapts leffet inhibiteur de lazide tant ensuite mme de sadapter la prsence dthyl violet. Milieu de ROTHE peptone 20 g glucose 5g NaCl 5g KH2PO4 2,7 g K2HPO4 2,7 g azide de sodium 0,2 g eau D 1000 ml pH = 6,8. Striliser 121C pendant 20 minutes. 1 ml de la suspension mre (et de ses dilutions) est ensemenc dans 10 ml de milieu. Aprs 24 h (ou 48 h) dincubation 37C, on considre comme positif tout tube prsentant un louche bactrien. Ces tubes sont soumis au test confirmatif.
2) test confirmatif
Laddition dthyl violet au milieu de Rothe le rend slectif des seuls streptocoques fcaux. Le milieu de LITZKY utilis est en fait de milieu de Rothe additionn de 0,5 mg dthyl violet par litre. Ce milieu est ensemenc partir dune se prleve dans les milieux de Rothe positifs. Aprs 24 h dincubation (ou 48 h) 37C, on considre comme positif tout tube prsentant un louche bactrien avec parfois formation dun culot violet (dans le cas o il se forme un culot violet , le trouble peut tre trs lger). Pour identifier lespce, procder un isolement partir dune se prleve sur milieu de Litzky ou de Rothe sur un milieu de BARNES.
B - 2 - b . Numration en milieu solide
Cette mthode nest utilisable quen prsence dun grand nombre de streptocoques fcaux.
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milieu de SLANETZ et BARTLEY (mthode par filtration) peptone trypsique de casine 20 g extrait de levure 5g Na2HPO4 4g azide de sodium 0,4 g chlorure de triphnylttrazolium 0,1 g glucose 2g glose 10 g eau D 1000 ml pH = 7,2. Dissoudre le milieu chaud. NE PAS AUTOCLAVER et ne pas refondre. Aprs inoculation, incuber 24 h ( ou 48 h ) 37C. Les streptocoques fcaux donnent sur ce milieu des petites colonies rouges ou marron avec ou sans aurole blanche. Pour revivifier les streptocoques D stresss procder une incubation en deux temps : 4 heures 37C et 48 heures 44C . Milieu KF streptocoque protose peptone extrait de levure NaCl glycrophosphate de sodium maltose lactose azide de sodium pourpre de bromocrsol glose eau D pH = 7,2. 10 g 10 g l5 g 10 g 20 g 1g 0,4 g 15 mg 20 g 1000 ml
Le milieu est strilis par autoclavage 121C pendant 10 minutes. Avant utilisation ajouter au milieu ramen 50C, 10 ml de chlorure de triphnylttrazolium 1 %. Les streptocoques fcaux donnent des colonies rouge fonc ou des colonies centre rouge ou noir aprs 24 heures dincubation 37C.
B - 2 - c . isolement
Milieu de BARNES INGRAM peptone extrait de viande glucose glose eau D 10 g 10 g 15 g 1000ml 10 g pH = 6
Aprs strilisation 120C pendant 15 minutes, ajouter 1 ml dactate de thallium 5 % et 1 ml de chlorure de triphnylttrazolium 1 % Aprs ensemencement lincubation seffectue 37C pendant 24 heures. Lecture : Lactate de thallium inhibe les germes Gram- sauf Proteus hauseri . Micrococcus et Lactobacillus peuvent cultiver sur ce milieu. Les streptocoques fcaux rduisent de triphnylttrazoium en formozan rouge :
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currentpoint
N N N N+
Cl +
2H
N N
N H
+ H Cl
clorure de triphnyl ttrazolium (incolore)
formozan ( rouge vif) currentpoint
Les caractristiques des colonies dont diamtre est infrieur ou gal 1 mm sont indiques ci aprs. Lobservation avec une loupe binoculaire des colonies est souhaitable pour valuer ces caractristiques. S. faecalis : colonie centre rouge, aurole blanche S. faecium : colonie blanche ou rose S. durans : colonie blanche S. bovis : trs petite colonie rose ou pas de croissance S. lactis : colonie rouge trs fonc sans aurole. Milieu D - Coccosel Ce milieu permet lisolement slectif des entrocoques Bio-trypticase 17 g Bio-thione 3g extrait de levure 5g bile de boeuf 10 g chlorure de sodium 5g citrate de sodium 1g esculine 1g citrate de fer ammoniacal 0,5 g azide de sodium 0,25 g glose 13,5 g eau D 1000 ml, pH 7,1. Autoclaver 15 minutes 120C. Les streptocoques du groupe D donnent de petites colonies translucides entoures dun halo noir correspondant lhydrolyse de lesculine (le driv phnolique libr forme un complexe noir avec les ions ferreux).
OHOH CH2 OH O OH O OH O O OHOH CH2 OH O OH
OH -D-glucose + OH OH O O
esculine O Fe O (noir) O O Fe++
Les Staphylococcus cultivent sur ce milieu en donnant des colonies volumineuses, opaques, sans halo noir. Il en est de mme avec certaines levures et pour quelques germes gram ngatif. Il apparat un lger brunissement autour des colonies dEnterobacter ou de Serratia . Les Listeria cultivent bien sur ce milieu .
B - 2 - d . Rsultats
Ils sont exprims en nombre de streptocoques fcaux par g ou ml du produit.
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C - RECHERCHE ET NUMERATION DES ANAEROBIES SULFITOREDUCTEURS (CLOSTRIDIUM surtout)
Ces bactries anarobies sulfito-rductrices sont des htes normaux de lintestin de lhomme et des animaux, mais on les rencontre frquemment dans la nature et en particulier dans le sol (bactries telluriques) et dans les matires organiques en cours de putrfaction. Ces germes sont trs rsistants en raison de leur caractre sporul. Ils sont souvent, quelques fois avec dautres germes sporuls, les seuls survivants dune contamination ancienne de laliment. Parmi les Clostridium sulfito-rducteurs, C. perfringens occupe une place trs importante: en effet, ce germe est trs souvent lorigine de toxiinfections dorigine alimentaire. Il est possible de raliser une numration slective des spores ou des formes vgtatives (les spores rsistent bien un traitement thermique de 5 10 minutes 80 ou 85C). La prsence de ces germes dans un aliment reflte, quand ils ne sont pas associs ni aux coliformes ni aux streptocoques fcaux, une contamination dorigine organique, plus rarement tellurique. Les aliments cuits constituent dexcellents milieux pour ces germes car la teneur en oxygne est faible et leur survie sous forme sporule est slective aprs limination des autres germes prsents sous leur forme vgtative.
C - 1. Dnombrement des spores et des formes vgtatives
Ce dnombrement est ralis en anarobiose (en tube ou dans une jarre) et repose sur lapprciation de la rduction du sulfite en H2S dont la mise en vidence est obtenue par addition au milieu de sels de fer. La raction est la suivante : currentpoint 26 H+ + 6e- + SO32currentpoint 3 H2O S + S2+ Fe++
currentpoint currentpoint FeS (noir)
C - 1 - a . milieu viande-foie sulfit (VF)
base viande foie glucose amidon glose eau D pH = 7,2.
30 g 2g 2g 11 g 1000 ml
Striliser 15 minutes 110C. Rpartir en tubes visss raison de 20 ml par tube. A 20 ml de milieu rgnr et ramen 50 C ajouter 0,5 ml dune solution aqueuse de sulfite de sodium 5 % strilise par filtration ou par bullition de 10 minutes et 0,2 ml dune solution aqueuse de citrate de fer ammoniacal 5 % strilise par filtration.
C - 1 - b . milieu de WILSON -BLAIR
bouillon nutritif glucose glose pH = 7,5.
1000 ml 20 g 30 g
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Rpartir raison de 25 ml / tube. Autoclaver 15 minutes 110C. Aprs rgnration (10 minutes 100C) et refroidissement 55C, ajouter chaque tube 1 ml de sulfite de sodium 10 % strilis par filtration et 4 gouttes dalun de fer 5 %. Mlanger par retournement le tube bien viss.
C - 1 - c . ensemencement
0,1 ml (ou 1 ml) de milieu ou de ses dilutions est introduit dans le tube en surfusion 45C. Le tube est alors viss et le mlange effectu par retournement lent. Il faut viter doxygner le milieu au cours de cette phase. Ds quun tube est ensemenc, il faut le refroidir par immersion dans leau froide. Les tubes sont alors incubs 37C pendant 18 24 heures.
C - 1 - d . lecture
Les colonies des bactries sulfito-rductrices sont trs nettement noires; leur taille varie selon lespce. Clostridium perfringens produit des colonies de grande taille en houpe noire de 3 5 mm de diamtre.
C - 1 - e . rsultats
Le nombre des bactries anarobies sulfito-rductrices est exprim pour 1 g (ou 100) ou ml du produit alimentaire.
C - 2 . Numration des spores
La suspension mre analyser est chauffe 80C pendant 5 ou 10 minutes au bain marie. Il y a, dans ces conditions , destruction des formes vgtatives. Les techniques dj dcrites sont alors applicables cette suspension (dilutions puis ensemencement) et permettent le dnombrement slectif des spores des bactries anarobies sulfito-rductrices.
D. RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE Clostridium perfringens
Il sagit dun bacille Gram+, sporul, anarobie strict. La bacille (4 m x 1 m) se prsente isol, par paires ou en courtes chanettes. Il est immobile et capsul. Le germe possde un pouvoir rducteur lev (rduction rapide du sulfite en H2S). La rsistance de sa spore est trs grande dans le sol, leau, leau de mer, lair, les viandes, les lgumes, les semi-conserves etc. La sporulation intervient peu dans les milieux de culture utiliss pour leur numration ou dans les aliments. Cest un germe que lon rencontre frquemment dans les produits cuits puis refroidis lentement . Parmi les milieux de numration, le milieu TSN et le milieu TSC sont les plus utiliss. Ces milieux sont rendus slectifs par laddition dantibiotiques tels que la nomycine, la polymyxine B ou la D cyclosrine.
D - 1 . Milieux de numration D -1 - a . Milieu trypticase - sulfite - nomycine (TSN)
Ce milieu incub 46C est le milieu qui donne les meilleurs rsultats qualitatifs et quantitatifs pour la numration ou lisolement de Clostridium perfringens .Ce germe donne des colonies entoures dune aurole noire caractristique.
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Peptone de casine 15 g extrait de levure 10 g sulfite de sodium 1g citrate de fer ammoniacal 0,5 g sulfate de polymyxine B 50 mg sulfate de nomycine 20 mg glose 13,5 g eau D 1000 ml pH = 7,2. Le milieu est autoclav 12 minutes 118C. Si le milieu doit tre incub, aprs ensemencement en conditions arobies (tubes de 18 X 180 mm), il faut y adjoindre 25 ml dune solution tamponne de thioglycolate de sodium strilise par filtration contenant 2 g de K2HPO4, 1 g de NaHCO3 et 2 g de thioglycolate. Si lincubation est ralise dans des jarres anarobies 46C, il faut lire les botes dans la demi-heure qui suit leur sortie de la jarre car le noircissement peut disparatre par oxydation lair.
D - 1 - b . Milieu tryptose - sulfite - cyclosrine (TSC)
Ce milieu est utilis pour la numration des ASR et de Clostridium perfringens (galement par filtration). La tryptone et la soytone et lextrait de levure assurent aux Clostridium dexcellentes conditions de culture, tandis que la D-cyclosrine assure une bonne slectivit (meilleure quavec la kanamycine ou la polymyxine) et diminue la taille des auroles noires diffuses et parfois gnantes autour des C.perfringens. Le sulfite et le sels de fer permettent la mise en vidence de lactivit sulfitorductase. tryptone 15 g extrait de levure 5g soytone 5g citrate ferrique ammoniacal 1 g mtabisulfite de sodium glose 20 g eau D 900 ml pH = 7,6. Striliser 121C pendant 10 minutes.
1g
Rpartir en tubes de 18 x 180 mm raison de 18 ml par tube. Aprs rgnration ajouter au milieu ramen 60C, 40 ml de D-cyclosrine 1 % strilise par filtration. Pour lensemencement en tubes, ajouter au milieu complet 47C 1 ml dinoculum et mlanger doucement par retournement aprs stre assur de ltanchit de la fermeture. Pour lensemencement en bote de Ptri, 10 ml de milieu 45C ajouter 0,1 ml de suspension mre (ou des dilutions). Aprs solidification ajouter 5 ml de milieu. Les colonies noires sont comptes aprs 24 h dincubation 45C en jarre anarobie. Laddition de 8 ml de jaune doeuf dilu au 1/2 par de leau physiologique pour 100 ml de milieu permer de visualiser lactivit lcithinase du germe (halo opaque). Dans ce cas le produit et ses dilutions sont tals raison de 100 l par bote la surface dun milieu pralablement coul en bote de Ptri et incub en anarobiose (jarre).
D - 1 - b . milieu de WILLIS
Ce milieu permet disoler et de compter les Clostridium Lactose+ et Lactose- et de dtecter leur lcithinase.
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Peptone NaCl extrait de viande extrait de levure lactose cystine HCl rouge neutre glose eau D
10 g 5g 3g 5g 10 g 0,4 g 30 mg 20 g 1000 ml
pH = 7,2. Striliser 10 minutes 115C.
Au milieu rgnr ajouter 10 % de suspension strile de jaune duf dilue au 1/2 avec de leau D. Couler 15 ml de milieu par bote et taler sur une moiti de la bote 1 goutte de srum anti Clostridium perfringens A 6000 units/ml. Cet talement sur la 1/2 bote de lantisrum nest ncessaire quen cas disolement ralis en vue dune identification. Rpartir le germe de faon uniforme sur le milieu. Aprs 24 h dincubation 37C ( ou mieux 45C) en anarobiose, les colonies de C. perfrigens lactose + sont jauntres (les bactries lactose- sont blanches). Lactivit lcithinase se traduit par la prsence dune zone de prcipitation blanche opaque autour des colonies. Si on est en prsence de C. perfringens A , il ny a pas ce phnomne sur la moiti de la bote contenant lantisrum. Il est possible de raliser la recherche spcifique dautres types de cette bactrie par le choix dantisrum adapt .
D - 2 . Tests de confirmation
A partir dune colonie prleve sur TSN ou TSC ou Willis, procder des repiquages sur les milieu viande-levure, glatine-lactose et nitrate mobilit.
D - 2 - 1 . milieu viande-levure peptone 10 g NaCl 5g extrait de levure 6g extrait de viande 3g cystine HCl 0,3 g glucose 2g glose 6g eau D 1000 ml pH = 7,5. Striliser 10 minutes 115C.
Le milieu en surfusion rparti en tube de 8 x 160 mm est ensemenc par piqre centrale avec une canne de verre tire et boutonne. Aprs 24 h dincubation 37C, la croissance dans la zone profonde du tube indique que le germe est anarobie strict.
D - 2 - 2 . milieu glatine-lactose tryptose 15 g extrait de levure 10 g lactose 10 g Na2HPO4 5g glatine 120 g rouge de phnol 50 g eau D 1000 ml pH = 7,5. Striliser 10 minutes 115C.
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Le milieu rpartir en tube de 16 x 160 mm est ensemenc par piqre centrale. Aprs 24 heures dincubation 37C en anarobiose, la prsence de gaz, lacidification (jaunissement) et la liqufaction de la glatine sont mises en vidence avec C. perfringens.
D - 2 - 3 . milieu nitrate-mobilit extrait de viande 3g peptone 10 g KNO3 1g glose 4g eau D 1000 ml pH = 7,4. Rpartir raison de 8 ml/tube et striliser 15 minutes 121C.
Aprs ensemencement par piqre et incubation 37C pendant 24 h en anarobiose, C. perfringens immobile cultive le long de la ligne densemencement. Ajouter 5 gouttes de ractif de GRIESS pour la recherche des nitrites (acide sulfanilique et a-naphtylamine dans lacide actique 5 N) ; une coloration rouge vif traduit une rponse positive . Clostridium perfringens est nitrate rductase+ Les bacilles immobiles anarobies stricts, Gram +, qui donnent des colonies noires en milieu TSN ou TSC ou Willis, lcithinase +, rduisant les nitrates en nitrites, lactose+, glatinase+ sont considrs comme C. perfringens. On peut raliser la recherche du srotype par sroagglutination sur lame avec chacun des 13 srums correspondants aux srotypes dfinis par HOBBS.
D - 3 . Milieu de sporulation
La sporulation de ces bactries est ralisable sur des milieux contenant de lamidon et des cations mtalliques tels que le magnsium et parfois le manganse. milieu de ELLNER polypeptone 10 g extrait de levure 3g Ce milieu est strilis amidon 3g 120C pendant 20 minutes. MgSO4 0,1 g La sporulation intervient dans ce KH2PO4 1,5 g milieu aprs 24 h (ou plus) Na2HPO4,7H2O 50 g dincubation 37C eau D 1000 ml.
D - 4 . Numration de Clostridium perfringens par titrage de l - toxine
Les cellules vgtatives de C. perfringens sont peu rsistantes aux conditions dfavorables de milieu externe. Elles meurent rapidement par exemple au cours de la rfrigration, de la conglation et aprs pasteurisation. Des numrations de C. perfringens aprs entreposage de laliment basse temprature ne sont donc pas possibles. L-toxine produite au cours de la croissance du germe est stable au froid et sa production est sensiblement proportionnelle au nombre de cellules initiales. On peut donc lextraire quantitativement et obtenir une relation avec le maximum de population initialement prsente. mthode 1 - broyer 25 g daliment dans 100 ml de tampon HEPES pendant 2 minutes tampon : N-2-hydroxythylpiprazine N-2-thane sulfonique 6g NaCl 11,7 g eau D 1000 ml Le pH et ajust 8 avec NaOH 2 N 2 - centrifuger 20 minutes 20000 g et 5C. 3 - le surnageant par filtration.
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4 - transfrer le filtrat dans un sac dialyse. Concentrer 5 ml contre 400 ml de polythylne glycol (MM 20000). 5 - le concentrat est ajust 7 ml. 6 - prparer 10 tubes de 13 x 100 mm avec 0,5 ml de NaCl 0,85 % sauf le 1er et le dernier. 7 - ajouter 0,5 ml dextrait au 1er et au 2me tube ; mlanger le 2me tube et transfrer 0,5 ml de ce tube au 3me et ainsi de suite (dilutions 1, 1/2, 1/4, .... 1/256) 8 - mlanger 0,25 ml dextrait, 0,25 ml de NaCl 0,85 % et 0,1 ml dantitoxine A. 9 - prparer une glose au sang 10 - faire des trous dans la glose lemporte-pice (3 mm de diamtre) espacs de 3 cm 11 - remplir chaque trou avec lextrait en commenant par la plus grande dilution 12 - incuber 24 h 35C et mesurer lhmolyse. Lextrait additionn dantitoxine doit tre ngatif 13 - ajouter au liquide restant des tubes 0,5 ml lextrait de jaune duf (1 jaune duf + 250 ml de NaCl 0,85 %, centrifuger 20 minutes 14000 g 5C; le surnageant est filtr sur filtre 0,45 mm). Labsence dactivit de la lcithinase est indique par une opacit des solutions. Lextrait additonn dantitoxine doit donner une raction ngative.
TOXINE hmolyse + lcithinase + non dilu 1/2 1/4 1/8 1 / 16 1 / 32 1 / 64 1 / 128 1 / 256 population de C. Perfringens en 10 /6g 1,2 2,5 6,5 9,5 25 80 150 210 450
E - RECHERCHE ET NUMERATION DE Staphylococcus aureus
Tous les staphylocoques prsents dans les aliments ne sont pas entrotoxinognes. Ce nest que depuis peu que lon admet le rle de S. aureus comme germe indicateur de contamination humaine (ou animale ou originelle) dans les aliments (aliments crus en particulier). Cette notion permet donc daccepter des staphylocoques en petit nombre dans les aliments. Ces germes sont naturellement prsents sur la peau et les muqueuses de lhomme et des animaux avec des charges qui peuvent largement dpasser les 100 000 germes par cm2. Dans les aliments le risque dentrotoxicose devient grand quand leur nombre atteint ou dpasse les 10 000 / g .
E - 1 . Enrichissement
La recherche des staphylocoques coagulase + ncessite parfois un enrichissement pralable sur des milieux liquides tels que le milieu de ZEBOVITZ. Cest partir de ce milieu que peut tre ralise la recherche du germe par hybridation ADN-ADN ( cf Salmonella ). milieu de ZEBOVITZ peptone de casine soytone extrait de levure mannitol glycine K2HPO4 10 g 3,5 g 6,5 g 5g 10 g 5g
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LiCl pyruvate de sodium eau D
5g 10 g 1000 ml
Ajouter au milieu rgnr 20 ml de tellurite de potassium 1 % strilis par filtration. Le milieu ensemenc est incub 24 h 37C. Les staphylocoques coagulase+ rduisent le tellurite en tellure mtallique ce qui leur permet dliminer la toxicit du tellurite. La concentration leve en glycine inhibe fortement la flore secndaire Gram+, le chlorure de lithium, la flore Gram-. Pyruvate, mannitol et glycine favorisent le dveloppement des staphylocoques coagulase+ en apportant ainsi une ventuelle attnuation aux inhibiteurs. La formation de tellure noir rvle la croissance de Staphylococcus et lintensit du noircissement dpend de la quantit de germes. Le milieu de CHAPMAN liquide peut aussi tre utilis pour lenrichissement des staphylocoques. milieu de CHAPMAN liquide peptone extrait de viande protose peptone NaCl lactose glose eau D 10 g 6g 10 g 150 g 15 g 1g 1000 ml
A 10 ml de milieu ajouter 10 ml de suspension enrichir (concentration finale en NaCl 7,5 %). Incuber 24 h 37C. Ce milieu permet lenrichissement en staphylocoques du fait de sa teneur trs leve en sel. Lutilisation de ces milieux denrichissement permet de mettre en vidence des staphylocoques prsents dans un aliment donn en trs petit nombre. La rponse est alors du type prsence ou absence dans x ml de produit analys.
E - 2 . Numration sur milieux solides
Cette numration sur milieu nest possible que si le nombre de staphylocoques dans le produit est suprieur 10 /g ou ml.
E - 2 - a . Numration sur milieu de CHAPMAN
Ce milieu nest slectif que des germes arobies halophiles. Ainsi de nombreuses espces de Bacillus peuvent y cultiver. peptone 10 g exctrait de viande 1g NaCl 75 g mannitol 10 g rouge de phnol 25 mg glose 15 g eau D 1000 ml pH = 6,8. Striliser 121C pendant 15 minutes. Le milieu , rparti raison de 17 ml par bote de Ptri , est ensemenc en surface par 0,1 ml du produit ou des dilutions. La bote est incube 24 h 37C. Les colonies de Staphylococcus
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aureus sont rondes, rgulires, bombes, opaques et pigmentes en jaune-dor; elles sont entoures dun halo jaune correspondant une acidification partir du mannitol (mannitol +) . S.epidermidis donne des colonies blanches mannitol - .
E - 2 - b . Numration sur milieu de Baird Parker peptone pancratique de casine 10 g extrait de levure 1g extrait de viande 5g pyruvate de sodium 10 g Li Cl 5g glycine 12 g glose 20 g eau D 1000 ml pH = 6,8. Striliser 121C pendant 15 minutes .
Ajouter au milieu rgnr et ramen 50C, 50 ml dune mulsion de jaune duf 50 % en eau physiologique, 3 ml dune solution de tellurite de potassium 3,5 % strilises par filtration et pour viter la croissance des Proteus , 50 mg de sulfamthazine. Le tellurite inhibe la croissance des germes qui ne peuvent le rduire en tellure noir, la sulfamthazine inhibe les Proteus et la glycine et le pyruvate sont des nutriments favorisant la croissance. Le chlorure de lithium inhibe les germes Gram -. Ensemencer en surface partir de 0,1 ml de suspension mre ou de ses dilutions et incuber 24 h 37C. S. aureus donne des colonies noires, brillantes, convexes, de 1,5 mm de diamtre, entoures dun halo clair (protolyse) de 2 5 mm de diamtre. Des zones opaques peuvent apparatre plus tardivement dans le halo clair ; elles sont dues lactivit lipolytique et lcithinolytique du germe. S. epidermis : colonies noires, brillantes, de forme irrgulire Micrococcus : trs petites colonies marron sans halo Bacillus : colonies irrgulires marron fonc, ternes Levures : colonies blanches.
E -3 . Numration en milieu liquide
Cette mthode est utiliser si le nombre suppos de germes est infrieur 10 par g ou ml daliment. milieu trypticase - soja tryptose soytone NaCl K2HPO4 glucose eau D 17 g 3g 100 g 2,5 g 2,5 g 1000 ml pH = 7,3. Striliser 15 minutes 121C.
Ensemencer avec 1 ml ( ou 10 ml) de suspension mre ou de ses dilutions (essais en double ou en triple, mthode de Mac Grady). Incuber 48 h 37C. Transfrer une se de chaque tube positif sur milieu de Baird Parker. Incuber les botes 30 h 37C. Identifier la prsence de colonies de staphylocoques. Raliser la numration par la mthode du NPP.
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E - 4 . Identification
Le germe est un coque Gram + , group en amas (mosaque partir de milieux solides), catalase positive, glucose + (F), halophile . Son identification repose surtout sur la recherche de lactivit coagulase et ADNase (thermonuclase) et sur la recherche de protines activits particulires.
E - 4 - a . Recherche de lactivit coagulase
Parmi les coques Gram+, catalase+, seuls les Staphylococcus aureus possdent une plasma coagulase (coagulation de plasma oxalat de lapin en moins de 24 h). La production de coagulase permet de diffrencier S. aureus de S. epidermidis et des Micrococcus. On ensemence dabord un bouillon dans lequel le staphylocoque excrtera la coagulase. bouillon pour recherche de la staphylocoagulase protolysat papanique de viande hydrolysat de glatine citrate trisodique eau D 500 ml 20 ml 3g 480 ml
Rpartir raison de 5 ml par tube et striliser. Aprs ensemencement et 24 h dincubation 37C, 0,5 ml de milieu est mlang 0,5 ml de plasma de lapin oxalat. Le mlange est incub 37C et observ toutes les 30 minutes. La prise en masse du plasma est gnralement totale au point que le tube peut tre renvers.
E - 4 - b . Recherche de lactivit ADNase
milieu Hydrolysat trypsique de casine 20 g ADN 2g NaCl 5g glose 12 g eau D 1000 ml pH = 7,3. Striliser 15 minutes 121C et couler en bote de Ptri raison de 15 ml par bote. Ensemencer par strie unique. Incuber 24 heures 37C. Inonder la surface de la glose avec une solution dacide chlorhydrique N, ou avec une solution 0,1 % de bleu de toluidine. Aprs 5 minutes on observe dans les cas dune raction positive : - avec lacide chlorhydrique une zone claire autour de la strie (placer la bote sur fond noir) - avec le bleu de toluidine une zone rose autour de la strie, le reste de la bote tant bleu. La thermonuclase est recherche par cette mthode aprs traitement de linoculum 100C pendant 15 minutes et dpt de 5 10 l dinoculum dans des puits creuss lemporte pice. Aprs 4 h dincubation 37C, la glose ADN pralablement additionne de 3 ml de bleu de toluidine 0,1 M par litre devient rose autour des puits contenant la thermonuclase ( cf aussi E4-e). Les souches de Staphylococcus pathognes coagulent en gnral le plasma de lapin et les staphylocoques coagulase ngative ne produisent quexceptionnellement des entrotoxines. La prsence dune ADNase thermostable semble tre en bonne corrlation avec le pouvoir entrotoxinogne des germes.
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E - 4 - c. Staphyslide-test
principe : S. aureus possde un rcepteur protique pour un fragment du fibrinogne. Ce rcepteur est prsent sur 96% des souches humaines et sur la plupart des autres biotypes. Dans ce test, des hmaties de moutons sensibilises par du fibrinogne sont agglutines en prsence dune souche de S. aureus porteuse du rcepteur. ralisation : sur une lame dposer une goutte dhmaties tmoins (-) et une goutte dhmaties sensibilises (+) sur une lame. Dans ces gouttes ,disperser 1 2 colonies laide de lanse ou dune pipette Pasteur boutonne; donner la lame un lger mouvement de rotation. Lire la rponse aprs15 secondes. Une rponse positive correspond une agglutination massive avec les hmaties sensibilises. Cette rponse est obtenue avec 99% des S. aureus. Une rponse ngative est observe avec Micrococcus et les autres Staphylococcus.
Staphylococcus aureus hmaties tmoins Autre bactrie
agglutination
hmaties sensibilises au fibrinogne
E - 4 - d . Recherche de la protine A
principe : La protine A est un antigne spcifique de quelques biotypes de S. aureus, port par 90% des souches dorigine humaine. Cette protine A peut fixer un fragment Fc des immunoglobulines de lapin ou de lhomme. Des hmaties de mouton sensibilises par du srum de lapin anti-hmaties de mouton sont agglutins en prsence de Staphylococcus porteurs de protine A. La mthode permet de dtecter 90% de S. aureus porteurs de protine A ce qui permet un screening rapide. ralisation : Le test est ralis partir du milieu GNO ou ADNase (pas Chapman ni glose au sang). Sur une lame dposer une goutte de suspension dhmaties tmoins et une goutte dhmaties sensibilises; ajouter une colonie en agitant pour obtenir une suspension. Agiter la lame par rotation. Observer en lumire rasante : la rponse + correspond une agglutination en moins de 2 minutes .
E - 4 - e . Dtection immunologique de la DNase thermostable : test dinhibition en glose.
Principe : S. aureus possde une nuclase thermostable dune grande spcificit antignique. Le test consiste comparer lactivit ADNasique dune culture bactrienne sur une plaque glose contenant ou non un anticorps antinuclase, lantisrum tant en quantit suffisante pour inhiber cete activit. En prsence de bleu de toluidine et dADN dans la glose, une activit nuclasique provoque la formation dun halo rose. Ralisation : Sur une plaque glose contenant de lADN et du bleu de toluidine et de lantisrum sur sa moiti, introduire 7 l de la culture tester dans les puits. Incuber 37C pendant 2h.
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partie sans antisrum (fond bleu violet) halo rose de diamtre > 4 mm
partie avec antisrum ( fond bleu clair)
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus ou autre espce ne produisant pas de nuclase halos roses Staphylococcus non aureus ou autre espce produisant une nuclase de spcificit antignique diffrente
Lentrotoxine A , B ou D peut tre recherche par immunoenzymologie (ELISA permettant un seuil de dtection de 70 pg ): Clonatec, 60, rue de Wattignies, 75580 Paris cdex12.
F. RECHERCHE DE Salmonella (et de Shigella) (cf norme AFNOR V 08 013)
Il sagit l dun problme trs important en microbiologie alimentaire, la contamination des aliments par des Salmonella en France tant de plus en plus frquente. La transmission seffectue par des voies multiples et parfois complexes. Les viandes sont les vecteurs les plus communs mais toutes les varits daliment peuvent tre contamines par ces germes. Le nombre de germes pouvant provoquer une maladie infectieuse est parfois trs faible (de lordre de 1 50 par 100 g produit) et dpend de lespce et du consommateur. La recherche de ces germes seffectue par des tests prsence ou absence et la norme est de 0 germe par g (ou 25 ou 50 ou plus). La recherche par hybridation ADN-ADN est une technique au point pour leur recherche, de mme que des mthodes immunoenzymatiques ou par immunofluorescence ou par fixation de phage spcifique. La mise en vidence des Salmonella par la mthode traditionnelle ncessite plusieurs phases: - un pr-enrichissement (revivification) qui est facultatif pour les produits non soumis certains types de traitements technologiques susceptibles de stresser les bactries - un enrichissement slectif ( obligatoire ) - un isolement slectif - une identification biochimique - un srotypage Ces phases et les diffrentes mthodologies de recherche disponibles sont schmatises la page suivante.
F - 1 . Pr-enrichissement (AFNOR 1973)
milieu eau peptone tamponne extrait de viande
10 g
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peptone 20 g NaCl 6g KH2PO4 1,5 g Na2HPO4 9g eau D 1000 ml Striliser 20 minutes 121C.
pH = 6,9.
25 g daliment sont broys dans 225 ml de milieu pendant 2 minutes. Lincubation est ralise pendant 16 h au moins et 24 h au plus 37C.
ALIMENT 25 g
enrichissement 4 6 heures
HYBRIDATION ADN-ADN
1 4 heures ou IMMUNO ENZYMOLOGIE 1 4 heures
pr-enrichissement 24 heures
dure totale : 30 34 heures
enrichissement 4 6 heures enrichissement slectif (slnite MullerKauffmann etc.) 24 heures
HYBRIDATION ADN-ADN
ou IMMUNO ENZYMOLOGIE
1 4 heures 1 4 heures
dure totale : 54 58 heures
GALERIE CLASSIQUE et SEROTYPAGE

24 heures
isolement 24 heures (milieu S.S.par ex.)
subculture 24 heures
dure totale > 96 heures
F - 2 . Enrichissement
Plusieurs milieux denrichissement sont utilisables : milieu de MULLER KAUFFMANN au ttrathionate extrait de viande peptone extrait de levure 0,9 g 4,5 g 1,8 g
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NaCl 4,5 g CaCO3 25 g Na2S2O3 40,7 g bile de buf sche 4,75 g eau D 1000 ml, pH = 7,6. Mlanger au bain marie 100C. Au moment de lemploi ajouter 19 ml de solution iodo iodure (5 g de KI, 5 g dI2, eau D 20 ml) et 9,5 ml de vert brillant 0,1 %. Laddition de 40 mg de novobiocine inhibe les Proteus . 1 2 ml de milieu de pr-enrichissement sont ajouts 10 ml de ce milieu. Raliser deux tubes par essai. Lincubation est ralise sur chaque tube respectivement 42C et 37C pendant 24 h ( ou 48 h). Dans ce milieu le thiosulfate se transforme en ttrathionate en prsence diode. Le ttrathionate inhibe la croissance des coliformes et des autres bactries intestinales. Les Salmonella (mais aussi les Proteus) rduisent le ttrathionate et ne sont pas inhibs. Le carbonate de calcium a pour rle de neutraliser lacide sulfurique libr au cours de cette rduction par formation de sulfate de calcium et dacide carbonique qui se dcompose en anhydride carbonique, ce qui vite lacidification du milieu. Laddition de bile de buf stimule la croissance de Salmonella et inhibe les germes dorigine non intestinale. Le vert brillant inhibe les bactries Gram+. bouillon au slnite et la cystine (milieu mieux adapt au contrle des aliments) peptone de casine 5 g cystine 10 mg lactose 4g Na2HPO4 10 g slnite de sodium 4 g eau D 1000 ml
pH = 7. Striliser par filtration.
10 ml de milieu de pr-enrichissement sont ajouts 100 ml de bouillon au slnite. Deux tubes sont raliss, lun tant incub 37C lautre 43C pendant 24 48 h.
F - 3 . Isolement
A partir dune se ou dune goutte dun des milieux denrichissement on ralise un isolement sur milieu SS ou milieu glos sulfite bismuth ou sur glose au vert brillant et au rouge de phnol ou sur DCL selon HYNES. milieu SS (Salmonella Shigella ) peptone 5g extrait de viande 5g sels biliaires 8,5 g citrate de sodium 10 g Na2S203 8,5 g citrate de fer 1g lactose 10 g rouge neutre 25 mg vert brillant 0,33 mg glose 15 g Eau D 1000 ml pH = 7 . NE PAS AUTOCLAVER. Aprs 48 h dincubation 37C, les colonies se prsentent sous les aspects suivants:
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colonies rouges lactose + (Enterobacter, Klebsiella ) colonies incolores lactose- (Salmonella, Shigella, Serratia, Proteus morganii, E. hafniae ) colonies centre orang (Proteus rettgeri, Providencia ) colonies centre noir (Salmonella, Citrobacter, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis ). milieu au vert brillant et au rouge de phnol peptone 10 g extrait de levure 3g NaCl 5g lactose 10 g saccharose 10 g Na2HPO4 2g rouge de phnol 80 mg eau D 1000 ml pH = 6,9. Autoclaver 12 minutes 121C. Aprs inoculation incuber 24 h 37C. Les dgradations du lactose et du saccharose sont mises en vidence par le rouge de phnol. Le vert brillant inhibe la flore Gram +. Du fait que les Salmonella sont lactose- et saccharose-, ce milieu vite les rsultats faussement positifs. Les colonies lactose ou/et saccharose+ sont jaune-verdtres et entoures dune coloration identique. Les Salmonella donnent des colonies rouges (ou roses) entoures dune zone rouge franc. Les Proteus produisent parfois des colonies similaires. milieu sulfite -bismuth peptone 5g extrait de viande 5g Na2HPO47H2O 4g sulfite de bismuth 8g sulfate de fer 0,3 g glucose 5g vert brillant 16 mg glose 13 g eau D 1000 ml pH 7,6 . NE PAS AUTOCLAVER. Les botes sont incubes 37C au moins 48 h. Les composs soufrs prsents dans le milieu sont transforms en H2S, qui en association avec les sels de fer, permet la coloration en brun ou noir des colonies. colonies vertes transparentes centre noir et reflet mtallique : S. typhi colonies noires ouvertes ou claires parfois reflet mtallique en 48 h: autres Salmonella colonies vertes : coliformes colonies marron : Shigella colonies noires : Proteus. milieu DCL (dsoxycholate, citrate, lactose) selon HYNES peptone 5g extrait de viande 5g citrate de sodium 8,5 g Na2S203 5,4 g citrate ferrique 1g dsoxycholate de sodium 5 g lactose 10 g
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rouge neutre 20 mg glose 16 g eau D 1000 ml pH = 7,3. NE PAS AUTOCLAVER Ce milieu diffre de celui utilis pour la colimtrie surtout par sa teneur leve en dsoxycholate. Il inhibe la croissance des germes Gram+ et partiellement celle de nombreuses entrobactries (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter ).Lincubation est ralise 37C pendant 24 h. Sur ce milieu les germes lactose+ donnent des colonies rouges ou roses. Salmonella donne des colonies incolores blanchtres (Salmonella H2S-) avec un centre noir (Salmonella H2S+).
F - 4 . Identification biochimique
La reconnaissance des colonies ne permet pas didentifier Salmonella mais donne une bonne prsomption (leur aspect peut varier en fonction des souches isoles, mais aussi en fonction du mode de prparation des milieux). La recherche du biotype se fait par la mthode classique (Kligler, ure-indole, LDC, galactosidase, Clark et Lubs, citrate) ou par un minisystme de type API. Le pourcentage de Salmonella donnant un caractre + ou - est indiqu ci-dessous: caractres biochimiques glucose + avec acidification glucose+ (gaz) lactosesaccharoseH2S+ uraseLDC+ -galactosidaseindoleVP% des Salmonella 100 92 99 99,5 91,5 100 94,5 98,5 99 100
Gnralement, la prsomption de prsence de Salmonella suffit pour satisfaire aux buts de lanalyse, et cette prsomption est acquise ds la fin de lisolement sur SS ou autre milieu quivalent (la pression de slection est telle tout au long de lanalyse que la prsence de colonies lac - H2S + sur ces milieux suffit lanalyste pour conclure la prsence du germe).
F - 5 . Srotypage
Sa ralisation au laboratoire nest gnralement pas ncessaire. En effet, cette dtermination requiert des anti-srums dont la dure de vie est limite et de cot leve. Par ailleurs le fait de connatre ce srotype ne changera en rien les dmarches raliser par rapport au produit ou au milieu dans lequel cette bactrie a t dtecte. En cas de dtection dun srotype de Salmonella il est possible dobtenir un srotypage auprs de lInstitut Pasteur Paris ou au Laboratoire Central dHygine Alimentaire, 43 rue de Dantzig, 75015 Paris. Dans ce cas envoyer la souche repiqu sur GNO en tube.
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Le genre Salmonella comprend plus de 2000 srotypes. Ils se diffrencient par leurs antignes somatiques 0, de surface Vi et flagellaires H. Les srotypes sont classs en groupe (A, B, C,...Y, Z) et sous groupes daprs leurs antignes O communs et constants. Lantigne Vi sert diffrencier des srotypes dans les groupes C et D. Cet antigne de surface rend O-inagglutinables S. typhi et S. paratyphi C. Les antignes H dfinissent les srotypes dans les groupes et peuvent se trouver sous 2 aspects (ou phases) dnommes 1 et 2. La recherche du srotype selon KAUFFMANN WHITE exige la prsence : - de srums O polyvalents OMA (agglutinines des groupes A, B, D, E, L) OMB (agglutinines des groupes C, F, G, H) OMC (agglutinines des groupes I, J, K, M, N, O, P) OMD (agglutinines des groupes X, Y, Z) OMF (agglutinines des groupes 54 59) OMG (agglutinines des groupes 60 67). - de srums O monovalents - de srums H polyvalents - de srums H monovalents - du srum Vi Mthodologie La souche srotyper est cultive sur glose nutritive (24 h - 37C). 1 - On sassure que la souche est smooth (S) : on place une goutte deau physiologique sur une lame et on y mulsionne un peu de culture microbienne en agitant doucement. Lapparition dagglutinats indique que la souche est en phase R (rough) et quelle ne peut tre soumise au srotypage (souche auto-agglutinante). 2 - on dpose sur une lame 1 goutte des diffrents srums polyvalents (OMA et OMB surtout car 98 % des Salmonelles rencontres chez lhomme et les animaux sang chaud possdent un antigne O correspondant aux agglutinines contenues dans les srums OMA et OMB) et on y mulsionne un peu de culture. Aprs agitation douce on examine la goutte au-dessus dun miroir concave ou dfaut sur fond noir pendant 5 minutes. Les agglutinations O sont lentes et fines. 3 - si lessai est ngatif il peut sagir : - dune Salmonella appartenant un autre groupe non test - dune couche rendue O inagglutinable par masquage de ses antignes O par des antignes Vi que lon recherche alors - dune bactrie nappartenant pas au genre Salmonella - dune souche S possdant des antignes T 4 - si lessai 2 est positif on ralise des essais avec des srums monovalents 5 - si lessai est positif on recherche les antignes H phase 1 ou 2.
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Nature de quelques srotypes selon KAUFFMANN WHITE antigne H phase 1 phase 2 _____________________________________________________________________ S. paratyphi A 1,2,12 a A S. paratyphi B 1,4,5,12 b 1,2 S. typhi murium 1,4,5,12 i 1,2 S. essen 4,12 gm B S. coeln 4,5,12 y 1,2 _____________________________________________________________________ S. paratyphi C 6,7 + c 1,5 C1 S. cholerae suis 6,7 c 1,5 y 1,5 C ____S. bareilly______ 6,7____________ C2 S. newport 6,8 eh 1,2 S. bovis morbificans 6,8 r 1,5 _____________________________________________________________________ S. typhi 9,12 + d S. enteritidis 1,9,12 gm D S. dublin 1,9,12 gp S. sendai 1,9,12 a 1,5 S. pollurum 1,9,12 groupes srotype antigne O Vi
F - 6 . Autres mthodes de recherche des Salmonella
Les principales mthodes de recherche des Salmonella sont schmatises p.58. La plupart des mthodes qualifies de rapides requirent encores les phases de prenrichissement et denrichissement. Seule la mthode par PCR sera peut-tre, dans les annes venir, capable dtre applique sans lensemble de ces deux phases.
F - 6 - 1 . Limmunofluorescence
Un frottis est ralis sur une lame partir de 1 l de milieu denrichissement. La technique directe utilise des anticorps anti-Salmonella conjugus la fluorescine (antigne somatiques O des groupes A S), la technique indirecte dabord des anticorps de lapin anti Salmonella H puis des anticorps de moutons fluorescents anti-anticorps de lapin. Les lames sont observes au moyen dun microscope quip dun systme dclairage en fluorescence. Le seuil de dtection est de 1 bactrie pour 100 champs soit environ 104 cellules / ml de milieu denrichissement. Il ny a pas de faux ngatifs mais environ 20 % de faux positifs.
F - 6 - 2 . Limmuno-enzymologie
Cette mthodologie permet la recherche des Salmonella dans les milieux denrichissement . Il existe actuellement deux principales modalits de cette technique qui font toutes deux appel une phase solide lors de la raction, phase qui permet la fixation du complexe Ag-Ac (il sagit souvent de polystyrne sous forme de billes, tubes, puits etc. ou de fibres de verre) :
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- dans la technique sandwich lanticorps est fix aux parois dun support solide (figure ci-dessous). Le produit contenant les antigne ou susceptible de les contenir est incub dans ce rcipient ce qui conduit la formation dun complexe Ag-Ac .
+ E
E E
S E E S S S
Pcolor Pcolor Pcolor Pcolor
Schma dun dosage ELISA par la technique Sandwich Le conjugu Ac-enzyme est alors ajout au systme et forme un complexe avec lanticorps ayant fix lantigne. Laddition du substrat de lenzyme permet de visualiser la fixation. La rponse est proportionnelle la quantit dantigne. Ce test est ralis en routine pour rechercher les Salmonella dans leur milieu denrichissement (test Tcra de 3M Sant: dure de la recherche 2 heures). Le test Spectate (Rhne Poulenc) est compos de deux mlanges de suspensions de latex rouge, bleu et vert. Chaque bille de latex a t sensibilise avec un anticorps spcifique dun groupe donn de Salmonella . Pour procder la recherche de cette bactrie, il suffit de mlanger 1 goutte de ractif et 1 goutte de suspension analyser. Aprs 4 minutes dagitation, sil y a raction entre le latex sensibilis avec lanticorps correspondant au groupe de la Salmonella et la bactrie du milieu, il se produit une agglutination avec apparition dun croissant color et dun changement de coloration du fond. - dans la technique par comptition cest un antigne qui est fix aux parois du rcipient hydrophobe. Lchantillon susceptible de contenir un antigne de mme nature est ajout dans le rcipient. Dans lexemple ci-dessous 3 chantillons diffrents sont soumis ce type danalyse et lchantillon 1 a une concentration leve en antigne, le 2me une concentration plus faible et le 3me nen contient pas .Aprs addition du conjugu Ac-Enzyme, la raction Ag-Ac se produit et conduit, en fonction des concentrations en Ag libre ( doser), une fixation dAcEnzyme sur le support dautant plus importante que la quantit dantigne doser dans la solution est faible. Aprs lavage, laddition du substrat et sa transformation en un produit color permet alors dvaluer lintensit de cette fixation (coloration ++++ en absence dAg, coloration ++ faible concentration en Ag, pas de coloration en prsence de forte concentration en Ag). La rponse est inversement proportionnelle la quantit dantigne initialement prsente dans le produit.
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E E E conjugu Ac-Enzyme E E E support chantillon 2 conjugu Ac-Enzyme E E E support chantillon 3 E conjugu Ac-Enzyme E E E E E
E E E
support
chantillon 1
E E E
E E E
phase 1
phase 2
phase 3
phase 4
phase 5
Schma dune dosage ELISA par comptition Il existe des systmes automatiques de ralisation de ces deux types de tests ELISA qui permettent jusqu 4000 analyses / j. De nombreux kits sont proposs par des Socits comme Transia, Chemunex etc.. La recherche proprement dite aprs pr-enrichissement et enrichissement (48 heures dincubation) dure 1 heure et 30 minutes. Des systmes dvaluation par microtitration coupls lutilisation danticorps monoclonaux permettent actuellement de dtecter moins de 10 cellules de Salmonella dans 25 g de produit en moins de 20 heures (LEE et Coll., 1990 ; VAN POUCKE, 1990). Le Salmonella Bio-EnzaBead Test Kit (Organon Teknika Corp.) est sensible jusqu 1 Salmonella par 25 g. Dans ce test des billes plastiques mtallises porteuse dun anticorps monoclonal anti-flagellaire sont mises au contact du produit puis spares par attraction magntique. Les bactries sont ainsi rcupres et mise en vidence par un anticorps antiSalmonella conjugu la peroxydase.
F - 6 - 3 . Lhybridation ADN - ADN ou ARN-ARN
cf aussi Mthodes Modernes dAnalyse Rapide en Microbiologie Alimentaire.Cette approche analytique dans la recherche des Salmonella , mais aussi des autres bactries importantes en hygine alimentaire (Listeria, E.coli, Staphylococcus aureus, Campylobacter, Yersinia) est aujourdhui particulirement bien adapte au contrle qualit. Ces mthodes directement issues de la biologie molculaire sont rapides , trs spcifiques et simples mettre en uvre. Il sagit l de mthodes de dtection trs prometteuses qui seront la base de la plupart des mthodes danalyse futures et dans un premier temps appliques la recherche en tout ou rien de germes pathognes ou mme de virus .Pour la recherche des Salmonella (et dautres germes) la Socit Gene-Trak Systems reprsent en France par Diagnostics Nouveaux Alimentaires, Cap Alpha, 34831 Clapiers propose un kit qui permet de raliser la recherche partir du milieu denrichissement. Les squences de cette recherche sont les suivantes :
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1 - lyse des bactries avec libration de leur matriel gntique 2 - neutralisation puis hybridation avec une sonde spcifique des ARN possdant un triplet AAA et marque la fluorescine. 3 - capture de lhybride par chromatographie daffinit avec une phase stationnaire TTT se prsentant sous forme dune bandelette. 4 - la phase stationnaire est retire, lave et place dans un tube contenant un anticorps anti-fluorescine coupl la peroxydase. Incuber. 5 - retirer la bandelette, la laver et l introduire dans un tube contenant le substrat chromogne. Incuber 20 minutes. 6 - retirer la bandelette et ajouter la solution darrt. Lire labsorbance 450 nm.
F - 6 - 4 . Autres mthodes
Il existe dautres tests de recherche des Salmonella comme le test 1-2 de Biocontrol qui est un test qualitatif de dtection des Salmonella mobiles. Ce test associe le pouvoir slectif du ttrathionate vis vis des Salmonella et permet de dtecter les flagelles de ces germes aprs quils aient migr dans un milieu contenant des anticorps correspondants.
milieu semi-solide pepton avec anticorps anti-flagellaires
milieu liquide au ttrathionate
test ngatif
test positif
Il sagit dun dispositif en matire plastique transparente constitu de deux chambres. La plus petite, chambre dinoculation, contient un bouillon au ttrathionate. La plus grande, chambre de migration, contient un milieu semi- solide pepton renfermant des anticorps H polyvalents (anti-flagellaires). Les bactries qui cultivent dans le bouillon au ttrathionate et mobiles se dplacent dans la chambre de migration o elles ragissent avec les anticorps anti-flagellaires. Il se produit une agglutination des bactries: dveloppement dune immunobande visible loeil nu. La lecture se fait 24 heures aprs lensemencement. Le Lumi-phage Testing system ( MCLAS Technologies Inc) est un test de dtection des Salmonella dans lequel un bactriophage spcifique des Salmonella marqu avec du luminol permet la dtection de 1 bactrie pour 25 g de produit alimentaire en 1 heure partir du milieu de pr-enrichissement .
F - 7 . Recherche des Shigella
Les Shigella sont des germes pathognes dorigine humaine. Agents de maladies infectieuses telles que la dysenterie bacillaire (Shigella dysenteriae), ils sont transmis par leau et par les aliments crus (salades, lgumes etc...). Lingestion de quelques milliers de bactries peut provoquer la maladie. Les aliments suspecter sont ceux qui sont manipuls sans chauffage et dont le pH est compris entre 6,5 et 7,5. La recherche de ces germes est ralisable avec la mme mthodologie que celle utilise avec Salmonella. Le srotypage est effectu partir dune culture sur glose ordinaire. Les Shigelles possdent des antignes O (parfois R) et quelques fois des antignes K ; elles nont pas dantignes H. Au laboratoire on recherche le srotype partir de srums A, A1, B, C, C1, C2, D et Alkalescens.
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G - RECHERCHE INDIRECTE DE Brucella
Cette recherche est effectue dans le lait (surtout de chvre) par srologie. Un antigne de Brucella (souche Londres 99) color lhmatoxyline ou au rose bengale donne une raction dagglutination avec les anticorps de type IgG prsents dans le lait des animaux malades. Ring test ou test de lanneau 1 ml de lait est mlang avec 1 goutte dantigne color. Si lchantillon de lait est positif, les germes colors qui constituent lantigne sont agglutins et adhrent aux globules gras qui, en slevant dans le lait, forment un anneau teint. La rapidit de la raction est fonction de lge du lait test et de sa teneur en matires grasses. Elle est plus rapide sur un lait frais et est acclre par incubation 37C (lecture en 30 minutes). Test positif : anneau de crme bleu violet, lait sous jacent blanc Test ngatif : anneau de crme blanc, lait sous jacent bleu violet clair Lintensit de la raction est fonction du taux dagglutinines prsentes dans le lait; la technique nest pas applicable aux laits contenant du colostrum. La bactrie peut tre isole sur glose Columbia (cf Campylobacter) Des travaux sont entrepris actuellement pour obtenir des sondes utilisables dans la dtection de cette bactries par hybridation. Principaux caractres des Brucella : coccobacilles Gram- (1 m x 0,5 m) asporuls, immobiles, arobies stricts. Pas dacidification des milieux additionns de glucides, urase +, indole -, catalase +, nitrate rductase +, exigent des atmosphres enrichies en CO2.
H - RECHERCHE ET/OU NUMERATION DES Vibrio H - 1 . Vibrio choler
La recherche de cette bactrie ne seffectue que dans des cas bien prcis (pidmies etc...). Leau est le vhicule de choix de ce vibrion dont lisolement est bas sur la capacit que prsente le germe de pousser dans des milieux dont le pH est suprieur ou gal 8,5. Ces germes sont arobies prfrentiels et forment des voiles la surface des milieux de culture liquides. Sur les milieux gloss les colonies lisses (S) sont brillantes, translucides, rondes. Le vibrion du cholra est trs mobile (cil polaire) ; il se multiplie entre 10 et 40C et cultive bien entre pH 7,6 et 9, ou dans des milieux sals (3 %). Il est inhib par le sulfate de magnsium. Les vibrions du cholra sont oxydase+, glatine+, H2S-, citrate+ (lentement), glucose+, amidon+, maltose+, mannose+, lactose-, dextrine+, indole+. Ils donnent la raction du cholra roth : aprs 24 h dincubation dans une eau peptone additionne de 0,1 % de nitrate de potassium, laddition dune goutte dacide sulfurique produit une coloration rouge (formation de 2-nitrosoindole).
H - 1 - a . milieu denrichissement (eau peptone alcaline)
peptone NaCl eau D
10 g 10 g 1000 ml
pH = 9.
Striliser 15 minutes 121C.
1 ml deau est additionne ce milieu. Aprs 6 h dincubation 37C, on prlve une se en surface et on ensemence un second tube qui est sont tour incub 6 h 37C ; lisolement est ralis partir dune se prleve en surface.
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H - 1 - b . milieux disolement
1 - glatine nutritive pH = 9 2 - milieu TCBS peptone 10 g extrait de levure 5g citrate de sodium 10 g Na2S2O3 10 g NaCl 10 g bile sche 8g citrate ferrique 1g saccharose 20 g bleu de bromothymol 40 mg bleu de thymol 40 mg glose 14 g eau D 1000 ml
pH = 8,6.
NE PAS AUTOCLAVER
La plupart des microorganismes sont inhibes en raison du pH lev (au moins pendant 24 h) ; certains Proteus et Streptocoques D peuvent y cultiver. Ce milieu permet la croissance rapide de V. cholerae en 15 h 37C. V. cholerae donne sur ce milieu des colonies jaune brun (saccharose+) de 2 3 mm de diamtre. V.parahaermolyticus donne sur ce milieu des colonies blanches arrondies sur fond vert.
H - 2 . Vibrio parahmolyticus
Il sagit dun germe dorigine marine identifi en 1963 par SAKAZAKI au Japon. Entropathogne, halophile, vibrion Gram-, anarobie facultatif, il a dabord t lorigine de gastroentrites au Japon, pays o le poisson est parfois consomm cru. Tous les produits de la mer sont susceptibles dtre contamins par cette bactrie. La prparation de la suspension mre destine lanalyse (et de ses dilutions), partir de poisson ou de crustac, est toujours ralise en milieu sal (NaCl 3 %).
H - 2 - a . Numration en milieu liquide
(milieu glucos au teepol-mthyl-violet) extrait de viande 3 g peptone 10 g NaCl 30 g glucose 5g mthyl violet 2 mg teepol 4 ml eau D 1000 ml pH = 7,4. Rpartir raison de 10 ml / tube. Autoclaver 15 minutes 121C. Ensemencer avec 1 ml des dilutions (10-1 10-4) et incuber 18 h 37C. Aprs incubation 1 se des tubes positifs est ensemence sur milieu TCBS (p.72). Les colonies sont observes aprs 18 h dincubation 37C.
H - 2 - b . Identification Le germe est glucose+, lactose-, H2S-, gaz- (Kligler), mobilit+, glucose+ par voie fermentaire, oxydase+, LDC+, ADC-, glatine+, croissance 42C+, VP-, indole+.
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H - 2 - c . Mise en vidence de lhalophilie Le germe cultive dans les milieux sals (entre 3 et 8 % de sel) mais pas 0 et 10 % en sel.
1 - milieux liquides sals Il suffit de prparer une gamme de concentration entre 0 et 100 g/ l de chlorure de sodium dans des tubes de milieux du type eau peptone pH 9 et de suivre, aprs ensemencement, la croissance 37C aprs 24 heures dincubation. 2 - milieu gradient de concentration en sel (mthode de SZYBALSKI) milieu A milieu B extrait de viande 3g 3g peptone 5g 5g tergitol 0,1 ml 0,1 ml glose 15 g 15 g NaCl 150 g eau D 1000 ml 1000 ml pH = 7. Autoclaver 15 minutes 121C. Rgnrer les 2 milieux et rajouter ( 55C) 0,1 ml de solution strile de chlorure de triphnylttrazolium 1% A et B. Poser une bote de Ptri avec une inclinaison donne et verser 8 ml de milieu B de telle sorte que la glose atteigne le niveau a (cf schma).
milieu B
milieu A
Na Cl
15%
Aprs solidification, poser la bote plat et couler 8 ml de milieu A. Aprs nouvelle solidification, ensemencer en strie linaire selon laxe du gradient de concentration en sel. Incuber 24 h 37C.
H - 2 - d . Phnomne de KUNAGAWA
V. parahaemolyticus isol des aliments nest pas hmolytique tandis quisol partir dhumains il est hmolytique.
milieu de WATSAGUNA extrait de levure 3 g bactopeptone 10 g NaCl 70 g
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K2HPO4 5g mannitol 10 g cristal violet 0,1 mg glose 15 g eau D 1000 ml . pH = 8. NE PAS AUTOCLAVER. Aprs 30 minutes dbullition ajouter 100 ml dune suspension frache dhmaties humaines pralablement laves 3 fois dans de leau physiologique. Ensemencer en stries ou par points ( partir dune culture en bouillon trypticase soja 3 % de NaCl pralablement incube 20 h 37C). Aprs 48 h dincubation 37C observer lhmolyse (zone claire) autour des zones de dveloppement du Vibrio.
H - 2 - e . bouillon glucos sal au teepol
Ce milieu permet lisolement et la numration de Vibrio parahaemolyticus dans leau et les aliments . extrait de viande 3g tryptone 10 g Na Cl 30 g glucose 5g mthyl violet 2 mg teepol 610 4 ml eau D 1000 ml dissoudre chaud , ajuster le pH 8,4.
I - RECHERCHE ET NUMERATION DE Bacillus cereus ET DE Bacillus sp
Bacillus cereus est un bacille Gram+ sporul rencontr dans de nombreux aliments crus ou traits et sur les vgtaux. Cette bactrie peut par ailleurs se dvelopper dans de nombreux aliments cuits et mal rfrigrs, les conserves de pommes de terre et de lgumes, la viande hache, les saucisses, les poudres de cacao, les potages etc... et y excrter une phospholipase C. La choline phosphoryle rsultant de laction de la phospholipase est lorigine, aprs consommation de laliment dans lequel elle a t forme, des signes cliniques de la toxiinfection. On peut alors supposer quil existe un grand nombre de bacilles dans laliment (plus de 106 / g ).
I - 1 . Numration sur milieu de Mossel
extrait de viande 1 g peptone 10 g mannitol 10 g NaCl 10 g rouge de phnol 25 mg glose 15 g eau D 900 ml pH = 7,2. Autoclaver 15 minutes 121C. Au milieu ramen 45C ajouter 100 ml dmulsion de jaune duf 20 % et 10 ml dune solution de sulfate de polymyxine 1 mg/ml striliss par filtration. Inoculer 0,1 ml de la suspension mre et de ses dilutions sur la surface sche du milieu. Incuber 48 h 32C.
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B. cereus donne des colonies rouges plates, rugeuses, sches, avec un fond color en violet, entoures dun halo de prcipit blanchtre due lactivit lcithinolytique Il est possible de compter sparment les formes vgtatives et les spores. Pour cela traiter la suspension mre 80C pendant 10 minutes (contrler la temprature dans un tube tmoin). B. cereus est mannitol- ; la teneur en mannitol du milieu permet de sparer la flore secondaire mannitol + (jaune). Laddition de polymyxine permet dinhiber une partie de la flore secondaire. B. cereus synthtise une lcithinase : les produits dhydrolyse insolubles forms partir de lcithine saccumulent en formant un prcipit blanc.
I - 2. Identification
B. cereus est un bacille court (4 m x 1 m) bouts carrs, en chanes courtes. Les spores sont ovodes paroi mince, non dformantes et centrales. B. cereus est glucose+, saccharose+, glycrol+, salicine+, xylose-, arabinose-, VP+, amidon +, casine+, glatine+, indole-, citrate-, urase-, cultive en anarobiose, nitrate rductase+.
I - 3 . Dnombrement des bactries arobies ou des spores de Bacillus msophiles ou thermophiles ( aromates , pices , autres denres alimentaires)
Cette numration est ralise sur glose glucose au pourpre de bromocrsol . Milieu BCP-Glucose peptone 10 g glucose 5g amidon soluble 2g pourpre de bromocrsol 40 mg glose 15 g eau D 1000ml pH 7,0 . Autoclaver 121C pendant 20 minutes.
I - 3 - 1. Numration des bactries msophiles arobies dans les sucres
Inoculer 10 ml dune solution de sucre 20% dans 100 ml de milieu en surfusion 47C. Mlanger et rpartir dans 5 botes de Ptri. Incuber 30C pendant 5 jours et dnombrer chaque jour sparment les colonies jaunes (acidifiantes) et les colonies bleues (non acidifiantes).
I - 3 - 2 . Numration des spores de Bacillus msophiles et thermophiles
Dans les sucres : procder comme en I-3-1 mais aprs avoir chauff la solution sucre 5 minutes 100C. Pour les pices procder de la mme faon mais avec une suspension au 1/10 de lchantillon . Pour les spores de Bacillus msophiles incuber 30C pendant 5 jours en notant chaque jour le nombre de colonies acidifiantes ou non. Pour les spores de Bacillus thermophiles incuber 55C pendant 3 jours aprs avoir obtur avec de lhuile de vaseline la bote ou avec une bande adhsive plastifie.
Dnombrer chaque jour, sparment, les colonies acidifiantes et non acidifiantes.
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J . RECHERCHE DE Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis est recherch directement dans les produits alimentaires (lait) et mis en vidence par la coloration de ZIEHL. La spcificit de la coloration repose sur la proprit dalcoolo-acido-rsistance du germe (AAR). Aprs centrifugation 3 000 g pendant 10 minutes du produit liquide (lait par exemple) on ralise des frottis partir du culot et dans le cas du lait de la crme. Aprs schage et fixation lalcool absolu, on effectue la coloration de Ziehl. - colorer le frottis fix par la fuchsine chaud pendant 10 minutes sur une platine de Malassez (le frottis ne doit pas aller sec et il doit y avoir mission de vapeurs blanches; il faut rajouter du colorant au fur et mesure de son vaporation). La composition de la solution de fuchsine phnique est la suivante: Fuchsine basique 1 g, phnol aqueux 5,5 ml, thanol 95 10 ml et eau qsp 100 ml. - dcolorer par HNO3 au 1/2 (ou H2SO4 au 1/4 soit 9 N ) pendant 2 minutes - rincer leau - dcolorer par lalcool absolu pendant 5 minutes - rincer leau - le bleu de mthylne phniqu (30) (bleu de mthylne 2 g, thanol 95 10 ml phnol aqueux 2,2 ml, eau qsp 100 ml) est utilis comme colorant de contraste. - rincer leau. Scher. Observer lobjectif immersion.
Les bacilles de KOCH (M. tuberculosis ) se prsentent sous forme de bacilles fins et longs colors en rose sur fond bleu. Lobservation de plusieurs dizaines de champs microscopiques est ncessaire avant de conclure. La culture du germe est possible ( milieux de Coletsos, de Dubos au Tween 80, de Lwenstein-Jensen ) mais en raison des temps de latence et de doublement trs levs, lobservation visuelle des colonies caractristiques de la bactrie nest ralisable quaprs plusieurs jours dincubation 37C (parfois 8 semaines). Les colonies sont lisses sur Coletsos et sches et rugueuses sur Loewenstein-Jensen .
K - RECHERCHE DE Yersinia enterocolytica
Il sagit dune entrobactrie prsente dans lenvironnement (eaux, vgtaux) et chez de nombreuses espces animales (porc) qui peut se dvelopper des tempratures relativement basses (produits rfrigrs) et excrter une entrotoxine provoquant une entrite.Ses principaux caractres sont les suivants : lactose +, glucose +, gaz -, H2S -, urase +, APP -,
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ADH -, lDC -, ODC +, galactose +, oxydase -, citrate -, nitrate rductase +, indole + ou -, saccharose +, VP + ou -, saccharose +, VP + ou -, lcithinase -, rhammose -, sorbitol -. Il existe 5 biotypes se diffrenciant par les caractres salicine, esculine, indole et xylose et 34 srotypes 0 et 19 srotypes H. Le germe est mobile 20C et immobile 37C. La recherche du germe se fait en 4 phases comme pour Salmonella. et cette recherche est possible par hybridation ADN-ADN partir du milieu denrichissement. 1) Pr enrichissement : 50 g de produit sont ajouts 200 ml de tampon phosphate 1/15 M pH = 7,6. Aprs homognisation le mlange est incub pendant 7 ou 14 jours 4C. 2) Enrichissement dans un bouillon au slnite 5 % contenant 0,05 % dextrait de viande (1 ml de milieu de pr-enrichissement dans 10 ml de bouillon au slnite). Lincubation est ralise 23C pendant 3 jours.La recherche par hybridation ADN-ADN peut se faire aprs cette phase. 3) Isolement : sur un milieu SS ou bismuth - sulfite glos ( 23C pendant 3 jours) ou sur milieu CIN. Glose CIN (cefsulodine, irgasan, novobiocine). bio-glytone 17 g bio-polytone 3g extrait de levure 2g mannitol 20 g sels biliaires 1g chlorure de sodium 1g pyruvate de sodium 2 g 10 mg MgSO4 rouge neutre 30 mg cristal violet 1 mg cefsulodine 15 mg irgasan 4 mg novobiocine 2,5 mg glose 13,5 g eau D 1000 ml, pH 7,4 Les sels bilaires, le cristal violet , lirgasan et les antibiotiques inhibent le dveloppement des bactries Gram + et celle de la plupart des bactries Gram -. Le mannitol et le rouge neutre permettent une identification prsomptive de Y. enterocolytica . Lensemencement peut se faire directement partir dune suspension de laliment ou mieux partir du milieu denrichissement . Incuber entre 23 et 32C. Y. enterocolytica donne de petites colonies (1 mm) centre rouge entour dune zone translucide contour irrgulier. Aprs 48 heures dincubation les colonies peuvent sentourer dune zone de prcipit de sels biliaires. Enterobacter, Citrobacter et Serratia donnent des colonies roses sur CIN. 4) Identification (galerie traditionnelle des entrobactries - API 20 , incubation 30C) La prsence dentrotoxine (thermostable 120 pendant 30 minutes) peut tre visualise par invasion dune culture cellulaire HeLa.
L - RECHERCHE DE Campylobacter jejuni
C. jejuni est un germe commensal de lintestin de nombreux mammifres et oiseaux. Eau et sol peuvent tre contamins par le germe. Le lait et les volailles semblent tre les vhicules les plus importants du germe.Limportance de cette bactrie dans les maladies transmises par les aliments va en grandissant .
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C. jejuni est microarophile (10 % doxygne pour une croissance optimale). Il cultive trs bien 42C. Il sagit dun germe de trs petite dimension qui peut tre isol par filtration (filtres de 0,65 m). La recherche de ce germe est possible par hybridation. Le germe peut tre isol sur le milieu de SKIRROW aprs 48 heures dincubation 42C dans une jarre sous CO2.
Milieu de SKIRROW milieu de base : (glose Columbia) peptones 23 g amidon 1g NaCl 5g glose 13,5 g eau D 1000 ml. Striliser 121C pendant 10 minutes.
milieu complet : Ajouter 1000 ml de milieu de base ramen 47C 150 ml de sang de mouton dfibrin (ou 70 ml de sang de cheval lys) et 10 ml dune solution dantibiotiques (vancomycine 10 mg, polymyxine B 5000 UI soit 50 mg, trimthoprime 5 mg et amphotricine B 2 mg). Latmosphre optimale requise est compose de 85 % dazote, 10 % de gaz carbonique et de 5 % doxygne. Loxygne atmosphrique prsent au taux de 21 % est toxique pour le germe. Une jarre anarobie, avec gnrateur dhydrogne et de gaz carbonique est utilisable condition denlever le catalyseur situ gnralement dans le couvercle. Aprs incubation 42C, les colonies apparaissent, lisses , fines, avec une tendance confluer. Campylobacter jejuni est oxydase + ,catalase +, mobilit + (mobilit en flche comme un Vibrio ), croissance 42C +, croissance 25C -, sensibilit lacide nalidixique 30 g + (disque), hydrolyse lhyppurate, rsistant au TTC 400 g/ml. La sous espce C. fetus subsp. intestinalis cultive 25 mais pas 42C, est rsistante lacide nalidixique, sensible la cfalotine et au TTC 400 g/ml et nhydrolyse pas lhippurate. Le milieu Campylosel est un milieu quivalent dans lequel les antibiotiques utiliss sont diffrents (par litre de milieu : cfoprazone 15 mg, vancomycine 10 mg, colistine 10 000 UI et amphotricine B 2 mg). Aprs incubation 42C sous atmosphre adapte, les colonies de Campylobacter jejuni ont un diamtre de 1 2 mm et stalent le long des stries densemencement. Elles sont gristres, plates, lisses et brillantes parfois granuleuses.
M - RECHERCHE DE Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes est un petit bacille Gram + bouts arrondis de 0,5 2 m de longueur sur 0,4 0,5 m de diamtre pouvant sassocier en palissade. Asporul, parfois coccobacillaire, oxydase -, catalase + , cette bactrie est aro-anarobie msophile (cultive entre +3 et +45C avec un optimum 37C. La bactrie reste viable aprs plusieurs annes dentreposage 4C. Le genre Listeria fait partie des Lactobacillaceae . Sept espces sont dcrites dans le genre (L. ivanovii , L. innocua , L. seeligeri , L. welshimeri , L. gravi et L.murrayi et L.monocytogenes ) . Chez lhomme, ce germe opportuniste qui nest virulent que si les dfenses naturelles de lorganisme devienent dficientes peut provoquer une mningo-encphalite, une septicmie, lavortement de la femme enceinte avec mortinatalit ou la naissance denfants infects. Les malades sont le plus souvent des personnes ges, des enfants de moins de 15 ans, des adultes immunodprims (malades hpatiques, diabtiques, cancreux, sidaques). En pathologie humaine le srotype le plus souvent rencontr est le 4b. Lhmolysine est la toxine majeure. La contamination directe par contact avec des animaux ou des hommes malades est rare. Ce nest quen 1985 que la relation entre la listriose et la consommation de fromage a t indiscutablement tablie.
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La relation plante-sol, comme pour la plupart des autres germes de la famille des Lactobacillaceae permet la constitution dun rservoir (source primaire). Le germe se rencontre dans les produits laitiers non pasteuriss ou recontamins. Le changement des habitudes alimentaires avec augmentation de la consommation de produits vgtaux crus, rfrigrs est aussi lorigine de laugmentation du nombre de cas de listrioses. La recherche des Listeria seffectue suivant la dmarche schmatise dans le tableau A. Dans les milieux de culture, le rle des divers composs est le suivant : lacide nalidixique inhibe certains des germes Gram +, le LiCl les germes Gram -, la cycloheximide les champignons. Les autres antibiotiquesont une action inhibitrice slective. Sur le milieu OXFORD (base COLUMBIA et inhibiteurs) et sur glose PALCAM, L. monocytogenes forme des colonies noires par hydrolyse de lesculine (cf strepto D). Sur les gloses MMA et LPM, la bactrie forme des colonies qui apparaissent bleutes par transillumination en lumire blanche incidente avec un angle de 45C.
ENRICHISSEMENT
Bouillon tryptone -soja 25 g dans 225 ml 24 heures 30 C
Bouillon coeur -cervelle 0,1 ml dans 10 ml incuber 1 3 mois 4 C
Colonies rondes translucides colores en bleu-vert en lumire oblique
SUBCULTURE Bouillon trytone-soja 0,1 ml dans 10 ml 24 heures 30 C
ISOLEMENT
milieu coeur-cervelle glos 1 mois 4 ou 48 h C 30 C
milieu LPM
tryptose 10 g extrait de viande 3 g NaCl 5g phnylthanol 2,5 g glycine 10 g LiCl 5g moxalactam 1 % 2 ml glose 15 g eau 1000 ml , pH 7,3
milieu OXFORD
biopolytone 10 g hydrolysat de protines anima et vgtales 10 g biomyotone 3g amidon de mas 1g Na Cl 5g glose 13,5 g esculine 1g citrate de fer ammon. 0,5 g LiCl 15 g cycloheximide 0,4 g colistine 20 mg acriflavine 5 mg cefotetan 2 mg fosfomycine 10 mg eau 1000 ml , pH = 7,0
milieu PALCAM
biopolytone 10 g hydrolysat de protines anima et vgtales 10 g biomyotone 3g amidon de mas 1g Na Cl 5g glose 13,5 g mannitol 10 g LiCl 15 g esculine 0,5 g citrate de fer III 0,5 g rouge de phnol 80 mg acriflavine 5 mg polymyxine 10 mg ceftazidine 20 mg eau 1000 ml pH 7,2
milieu MMA
tryptose 10 g extrait de viande 3 g NaCl 5g phnylthanol 2,5 g glycine 10 g LiCl 0,5 g cycloheximide 0,2 g glose 15 g eau 1000 ml , pH 7,3
Tableau A . Les milieux d isolements sont incubs 35C pendant 24 72 heures.
Un repiquage est alors ralis sur milieu glos trypticase-soja (trypticase -soja - glose BioMrieux) additionn de 0,6 % dextrait de levure (24 48 heures 30C). Lidentification est effectue par la recherche de certains caractres morphologiques et biochimiques tels que : - ltat frais ( mobilit en pirouettes) - catalase + - coloration de Gram
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- glose au sang (glose trypticase - soja - extrait de levure 0,6 % - sang de mouton dfribin 7%). L. monocytogenes : hmolyses avec petites zones claires; L.ivanovii zones claires nettes. Ltude des fermentations est ralise partir dune base milieu liquide. protose peptone n3 Difco 10 g extrait de viande 1g NaCl 5g pourpre de bromocrsol 15 mg eau 1000 ml. pH 6,8 , striliser 15 minutes 121C. Lose est ajout au milieu partir de solutions 5 % strilises par filtration pour obtenir une concentration finale de 0,5 %. Placer des cloches de Durham dans les tubes de 16 x 160. Inoculer avec 0,3 ml dune culture de 24 heures sur bouillon trypticase soja - extrait de levure et incuber pendant 7 jours 35C. L. monocytogenes est glucose +(gaz -), esculine + (gaz -), maltose + (gaz -), mannitol -, rhamnose + (gaz -), xylose - . Il existe une mthode de recherche par hybridation ADN-ADN ralisable aprs enrichissement .
N - NUMERATION DES LEVURES ET MOISISSURES
La contamination des aliments par les moisissures est actuellement considre avec beaucoup dattention en raison des mycotoxines que ces microorganismes sont capables de synthtiser. Plus de 100 mycotoxines diffrentes ont t identifes ce jour et il est vraisemblable, quavec des mthodes danalyse plus labores,dautres le seront bientt. Les moisissures sont trs largement rpandues dans la nature (air, sol...) et elles peuvent trs facilement contaminer les aliments en cours de fabrication. Elles peuvent sporuler au cours doprations technologiques comme la dshydratation, lacidification, la rfrigration, labaissement de lactivit de leau. Leurs enzymes peuvent tre lorigine daltrations diverses dans les aliments. Les levures acidophiles, psychrotrophes ou osmophiles peuvent induire des altrations profondes dans les aliments (structure, proprits organoleptiques etc.). La plupart dentre elles ne sont pas pathognes. Ces germes peuvent tre dnombrs sur des milieux rendus slectifs par acidification ou addition de substances antibactriennes (antibiotiques). milieu glos la pomme de terre (PDA) infusion de pommes de terre 200 g glucose 20 g glose 15 g eau D 1000 ml Autoclaver 121C pendant 15 minutes. Ajuster le pH 3,5 par addition dacide tartrique 10%. Ensemencer en surface par talement partir de 100 l de produit ou de ses dilutions. Incuber 3 5 jours 20-25C. milieu glos glucos loxyttracycine (OGA) extrait de levure 5 g glucose 20 g glose 16 g eau D 1000 ml pH = 6,8. Autoclaver 10 minutes 121C.
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Aprs rgnration ajouter au milieu, ramen 50C, 100 ml dune solution strile doxyttracycline 1 mg / ml ou 100 ml dune solution strile frachemment prpare de gentamycine 0,5. Avec le milieu PDA lensemencement est ralisable dans la masse avec une prise dessai de 1 ml. En gnral la numration est effectue aprs talement de 0,1 ml de suspension mre ou de ses dilutions la surface du milieu. Le nombre de levures et moisissures est valu aprs 3 5 jours dincubation 20-25C.
O - RECHERCHE DES BACTERIOPHAGES FECAUX
Les bactriophages peuvent tre prsents dans lenvironnement mais les phages capables dinfecter une espce particulire de bactrie se retrouvent surtout dans des milieux o la bactrie est prsente. Par exemple, les coliphages se retrouvent dans les matires fcales ou leau pollue par ces dernires. Le nombre de phages dans les aliments (eau surtout) est souvent trs faible et il est ncessaire de procder souvent un enrichissement par centrifugation ou autre.
Recherche des bactriophages dEscherichia coli
- enrichissement 5 ml deau analyser sont additionns de 1 ml de chloroforme. Aprs centrifugation 1500 g pendant 5 minutes, 1 ml de surnageant est transfr dans 9 ml dune culture en bouillon ordinaire dE. coli en phase exponentielle (2 h, 37C). Lincubation est ralise 37 pendant 3 h. Lenrichissement peut porter sur un grand volume deau. A 50 ml deau analyser on ajoute 50 ml deau peptone double concentration et 10 gouttes dune culture de 10 h dE. coli sur eau peptone. Aprs 10 h dincubation 37C (production de phages), 6 ml sont prlevs et chauffs en tube 56C pendant 30 minutes; les cellules bactriennes sont dtruites tandis que les coliphages rsistent au traitement. - mise en vidence Sur une glose ordinaire raliser un talement uniforme en surface partir de 2 gouttes de culture dE. coli en eau peptone. Dposer la surface 1 se du tube contenant les coliphages. Incuber 8 h 37C . La prsence de coliphages se traduit par une plage claire au point dinoculation. Les rsultats sont exprims en prsence ou absence de phages dans le volume deau analyse.
P - RECHERCHE DE LA TOXINE BOTULINIQUE
Cette recherche dangereuse nest quexceptionnellement ralise par des laboratoires spcialiss. Elle est effectue par ELISA ou par la mthode des souris protges. Il existe 6 toxines (A ,B ,C ,D ,E , F et quelques sous-groupes) qui ont une action toxique identique mais qui sont antigniquement diffrentes, chaque type de toxine ntant neutralis que par le srum spcifique contenant les anticorps correspondants. Les types les plus frquents sont les types A, B, E (A et B dans les conserves de lgumes, jambons, conserves de viande, B et E dans les poissons et produits drivs). Mthodologie - 1 volume daliment est additionn d1 volume deau physiologique strile. Aprs mlange (broyage ou mortier 10 minutes) on centrifuge 5000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est soumis une filtration strilisante (Millipore 0,45 m). - 2 ml de filtrat sont prlevs et dilus (1 10-6) dans de leau physiologique. On injecte 0,5 ml de chaque dilution par voie intrapritonale la souris (2 souris par dilution). On dtermine ainsi la dose minima mortelle (DMM) de lextrait. La mort survient dans les 72 h en prsence de toxine.
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- 2 ml de filtrat sont prlevs et chauffs 10 minutes 100C. 0,5 ml est inject la souris (2 souris par essai). La toxine perd son pouvoir toxique dans ces conditions (100C, 10 minutes). - 2 ml de filtrat sont traits par la trypsine (0,2 ml de trypsine DIFCO 10 %) pendant 45 minutes 37C. Aprs dilutions injecter 1 ml la souris. Le pouvoir toxique est maintenu dans ces conditions de traitement. Rpartir le filtrat raison de 2 ml / tube Ajouter au premier 0,1 ml de srum antibotulinique A Ajouter au second 0,1 ml de srum antibotulinique B ...................................................................................... Ajouter au sixime 0,1 ml de srum antibotulinique F Laisser en contact 30 minutes 37C. Aprs injection la souris de 0,5 ml, seule survivra celle qui a t inocule avec le surnageant trait par le srum correspondant la toxine quil contenait. Il est possible dinjecter le srum la souris et dinjecter ensuite le filtrat.
Q - LES MALADIES PARASITAIRES
Le nombre dhumains affects par ces maladies et en particulier atteints d HELMINTHIASES est trs lev (plusieurs dizaines de millions pour la trichinose et le tniasis et plusieurs centaines de milliers pour lchinococcose). Dans les aliments la recherche des parasites se fait par observation directe. Cette recherche est surtout ralise dans la viande et les produits carns ; elle permet de dtecter les cestodes (Taenia, Echinoccus), les nmatodes (Trichinella, Ascaris, Dracunculus), les trmatodes (Echinostoma) et les protozoaires (Toxoplasma, Entomobea). Lexamen histologique des viandes est ralis sur des coupes fixes (formol 5 %) dshydrates par lthanol avant inclusion dans la paraffine. Les coupes histologiques ralises au microtome sont colores losine orange G aprs dparaffinage au xylol. La trichinose est due un nmatode (Trichinella spiralis ) dont les larves senkystent dans le muscle stri danimaux. Les kystes donnent, chez lhomme qui les a ingrs, des larves qui senkystent leur tour. La viande de porc mal cuite ou mal sale est souvent porteuse de ces microorganismes. Le taeniasis est trs rpandu en Afrique et en Asis. Taenia saginata ou T. solium se dveloppent dans lintestin de lhomme contamin. Ces parasites proviennent souvent du porc (T. solium) ou du buf (T. saginata). Lhomme sinfecte en consommant de la viande contenant des cysticerques vivants, forme intermdiaire du cycle 2 htes, soit Cysticercus bovis (buf), soit C. cellulosae (porc). Les animaux ne peuvent sinfester que sils consomment des aliments contenant des ufs produits par la forme adulte or ces ufs ne sont limins que par les hommes porteurs de tnia. Lchinococcose est une maladie grave souvent mortelle chez lhomme. Lhomme sinfeste en absorbant des ufs limins par le chien porteur de la forme adulte du cestode: Taenia echinococcus. La toxoplasmose et la Sarcosporidiose dues des parasites prsents dans des viandes (porc en particulier) sont trs tudies lheure actuelle.
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IV. ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES

Les mthodes utilises et indiques dans chacune des analyses dcrites dans ce chapitre sont dtailles dans le chapitre III. Pour une analyse donne les numrations dune flore particulire sont raliser pour des dilutions du produit qui sont indiques entre parenthses. Par exemple pour les coliformes fcaux (0 - 10-3) signifie que les dilutions analyser sont les suivantes : produit , 10-1 , 10-2 et 10-3. La bonne connaissance du produit fabriqu permet ensuire de limiter le nombre danalyse.
IV - A - PRESENTATION DES RESULTATS
Lapprciation de la qualit microbiologique dun produit donn rsulte souvent de linterprtation de cinq analyses dchantillons ralises dans une mme fabrication. La qualit du lot et par l mme la qualit de lensemble de la fabrication devront alors tre apprciables.
0
bonne qualit
3m
qualit acceptable avec c / n 2,5
non satisfaisants
dangereux avec c / n > 2,5
c = nombre d' chantillons entre m et M n = nombre d' units de l' chantillon M = 10 m M = 30 m en milieu solide en milieu liquide seuil de toxicit
S = m . 1000
m fix par dcret (21 dcembre 1979) 3m est un seuil limite de qualit satisfaisante tenant compte de la tolrance analytique (limite suprieure de IC 95%)
Cette valeur de S est utilisable pour la flore arobie msophile, les coliformes, les coliformes fcaux et les anarobies sulfito-rducteurs. En ce qui concerne Staphylococcus, le critre S est gal m.1000 sans toutefois pouvoir dpasser 5.104 / g ou ml . La prsence de 1 seule Salmonella pour la prise dessai (en gnral de lordre de 25 g 25 ml) suffit pour qualifier le produit de toxique.
EXEMPLE : Essai destimation de la qualit dans le cas o 5 analyses* (FAMT , coliformes, coliformes fcaux, Staphylococcus aureus, ASR 46C, Salmonella) sont effectues sur chacun des 5 chantillons prlevs. *Il sagit des analyses les plus frquemment ralises au cours du contrle systmatique de la qualit
Dans ce cas (5 chantillons, 5 analyses), chaque rsultat danalyse est affect de la valeur (attribut) suivante : -entre 0 et m : attribut gal 0 pour chaque analyse -entre m et 3 m : attribut gal 0,01 pour chaque analyse
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-entre 3 m et M : -entre M et S : -valeurs suprieures S :
attribut gal 0,4 pour chaque analyse attribut gal 1,5 pour chaque analyse attribut gal 46 pour chaque analyse
Si la somme des attributs pour ces 5 chantillons (30 analyses) est : -gale 0 : excellente qualit du lot et donc de la fabrication -comprise entre 0,01 et 0,3 : qualit satisfaisante -comprise entre 0,4 et 1,08 : qualit acceptable -comprise entre 1,5 et 45 : qualit non satisfaisante -suprieure 45 : produit dangereux Dans lexemple ci-aprs, cest lvaluation de la qualit microbiologique dune fabrication de plat cuisin lavance qui est dcrite.
ANALYSE D'UN PLAT CUISINE A L'AVANCE date de prlvement FAMT 30 C coliformes 30 (DCL) C coliformes fcaux (BLBVB) Staphylococcus aureus ASR 46 C Salmonella (25 g)
Rsultats analytiques
chantillon n
( UFC ou UFT / g ) 4 17 /3 /91 7.10 5 2.10 2 6 0 10 0 5 17 /3 /91 6.10 4 10 8 50 0 0

2
NORME (19 jan 80) 3.10 5 10 2 10 10 2 30 0
1 17 /3 /91 2.10 150 5 0 10 0

6
2 17 /3 /91 10 5 2.10 2 50 10 2 50 0
3 17 /3 /91 4.10 25 10 0 5 0
4
Les normes (valeurs de m concernant ce produit sont indiques dans le JO) sont indiques dans la colonne de droite et ne sont jamais dpasses pour Salmonella dans les chantillons de plats cuisins, sinon le lot serait qualifi de toxique. Les valeurs de 3m, M et S ainsi que les attributs de lanalyse sont les suivants:
chantillon n
valeurs des paramtres 5 0 0,01 0 0 0 0 0,01 3m 9.10 5 3.10 2 3.10 3.10 90 0

2
1 FAMT 30C coliformes 30C (DCL) coliformes fcaux (BLBVB) Staphylococcus aureus ASR 46C Salmonella (25 g) total / analyse TOTAL 0,4 0,01 0 0 0 0 0,41
2 0 0,01 0,4 0 0,01 0 0,42
3 0 0 0,01 0 0 0 0,01
4 0,01 0,01 0 0 0 0 0,02
M 3.10 6 10 3 3.10 2 10 3.10 0

3 2
S 3.10 8 10 5 10 10
4 4 4
m 3.10
5
10 2 10 10 30 0
2
3.10 0
en UFC ou UFT / g
0,87
Cette valeur de 0,87 correspond, pour le plat cuisin, une qualit acceptable du lot.
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IV - B - ANALYSE DES EAUX DE CONSOMMATION
Il est aujourdhui vident que leau est essentielle bien des gards. Disposer dune eau potable et vacuer des eaux uses les moins pollues possibles constituent deux problmes majeurs de lhygine urbaine mais aussi de la plupart des industries alimentaires. Les eaux destines lalimentation humaine (boissons, prparation daliments etc.) ont des origines diverses (eaux souterraines ou de surface). La flore microbienne prsente dans leau est trs varie et dpend de lorigine de leau (eau de captage ou de distribution, eau rsiduaire etc.).
Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans leau on rencontre essentiellement des germes normalement aquatiques, des germes telluriques et des germes dorigine intestinale :
Les bactries vivant normalement dans leau sont surtout reprsentes par des bacilles ou des vibrions Gram - (Vibrio, Flavobacterium, Achromobacter, Pseudomonas, Cytophaga, Acinetobacter, bactries sulfato-rductrices ou ferrugineuses, Sphaerotilus, Spirillum etc...) des bactries Gram + (Streptomyces, Micrococcus, Corybacterium). Bon nombre des bactries typiquement aquatiques sont difficiles cultiver au laboratoire et requirent des milieux trs dilus ne cultivent pas ou peu sur les milieux ordinaires) et ont des tempratures optimales de croissance de 20C ou moins. Certaines de ces bactries (Sphaerotilus, Leptothrix, Gallionella et un degr moindre Pseudomonas et Acinetobacter) sont qualifies de mucognes car elles induisent des troubles et la formation de filaments qui peuvent engendrer des corrosions ou bloquer les canalisations. Les germes typiques de leau sont souvent rencontrs sur les parois des canalisations ; Les germes telluriques sont surtout reprsents par des germes sporuls comme par exemple Clostridium, Bacillus ou des germes des genres Enterobacter ou Streptomyces. Les germes de contamination intestinale humaine ou animale sont souvent pathognes (Streptocoques D, entrobactries dont Salmonella, Clostridium, Vibrio etc...). Ces bactries ne se multiplient pas dans leau peu charge en matires organiques. Ces germes sont blesss dans leau et leur culture ncessite souvent la revivifivation. En dehors de ces microorganismes on peut signaler la prsence ventuelle dans leau : dalgues microscopiques (Chlorella) photosynthtiques qui cultivent dans leau avec formation dun mucus chlorophyllien. de protozoaires et dautres parasites animaux ou humains, en particulier sous des climats chauds et humides (kystes de la cysticercose, de lamibe Entomobea histolytica , douve du foie Fasciola hepatica , cercaire de la schistomiase etc.). de virus (virus de la poliomylite, hpatite virale, entrovirus, etc.). La prsence de microorganismes pathognes dans leau est gnralement la rsultante dune contamination de la nappe ou de la rivire ou encore du lac. Une contamination secondaire de leau de distribution peut intervenir avec des installations dtriores. Ces germes pathognes sont gnralement peu rsistants en milieu aqueux et leur survie nest pas bonne : les problmes sanitaires quils posent rsultent alors de leur prsence en nombre limit.
IV - B - 1. Dfinition dune eau potable
Toute eau, pour tre considre comme potable, doit satisfaire aux conditions bactriologiques dfinies par le dcret du 8 mars 1991 n91-257. Les limites de qualit microbiologique des eaux destines la consommation humaine sont les suivantes : 1) leau ne doit pas contenir de germes pathognes ou de parasites 2) Les limites dacceptabilit sont de : 0 Salmonella dans 5 litres
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0Staphylococcus pathogne dans 100 ml 0 bactriophage fcal dans 50 ml 0 entrovirus dans 10 litres 0 coliforme thermotolrant dans 100 ml 0 streptocoque fcal dans 100 ml 95 % au moins des chantillons prlevs ne doivent pas contenir de coliformes /100 ml pas plus dune spore de bactries anarobies sulfito-rductrices / 20 ml Lorsque les eaux sont livres sous forme conditionne, le nombre de germes arobies msophiles revivifiables ne doit pas dpasser 20 et 100 UFC / ml respectivement aprs incubation 37C pendant 24 heures et 22 C pendant 72 heures. Leau destine la boisson, conserve et livre en bouteilles ou autres rcipients, doit prsenter les mmes autres critres que les eaux non traites. Lanalyse doit tre ralise dans les 12 heures suivant le conditionnement. Les exigences de qualit des eaux douces superficielles destines produire de leau potable sont fonction des types de traitements quelle subira.
en UFC ou UFT / 100 ml
A1
Coliformes totaux (37C 24h) Coliformes thermotolrants Streptocoques fcaux Salmonelles dans 5000 ml 50 20 20 0
A2
5000 2000 1000 0
A3
50000 20000 10000 0
A1 : traitement physique simple et dsinfection A2 : traitement normal physique, chimique et dsinfection A3 : traitement physique, chimique pouss, affinage et dsinfection IV - B - 2. Divers types danalyses deau distribues par un rseau public ou priv
a) analyse complte (de type B3) Ce type danalyse est ralis sur une eau inconnue destine la distribution par exemple. Elle comprend : les dnombrements des germes arobies revivifiables (22C - 72 h et 37C - 24 h), des coliformes totaux et thermotolrants (avec ventuellement recherche dE. coli), des streptocoques fcaux, des spores de Clostridium sulfitorducteurs. A partir deaux suspectes la recherche des phages fcaux, de Salmonella, de Shigella, de Vibrio etc... peut tre entreprise. b) analyse sommaire ou de surveillance (de type B2) Elle comprend la numration des germes arobies revivifiables (22C - 72 h et 37C - 24 h), des coliformes thermotolrants (E. coli ), des streptocoques fcaux. c) Analyse de surveillance rduite (de type B1) Elle comprend la numration des coliformes thermotolrants (E. coli) et des streptocoques fcaux.
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IV - B - 3 - Prlvement et frquence des analyses
Les prlvements deau analyser sont rgis par de Dcret n 91-257 du 7 mars 1991. Les analyses raliser pour des eaux souterraines ou superficielles sont du type : B1 au point de puisage avant traitement B3 avant traitement ou au point de puisage en labsence de traitement B2 en rseau
250 eau non dsinfecte eau dsinfecte 200
150
100
50
nombre d'analyses par an
20000
40000
60000 nombre d'habitants
80000
100000
120000
La frquence des analyses de leau distribue est fonction du nombre dhabitants et sa valeur minimale est de 2 4 pour les communes de 500 habitants (eau non traite - eau traite), 6 pour les villages de 2000 habitants, 12 pour 5000 habitants etc. Lextrapolation linaire est raliser pour des villes de plus de 100000 habitants. Cette analyse est du type B2. En ressource et en usine de production deau, la frquence annuelle varie en fonction du dbit journalier , en fonction de lorigine et du traitement. Ainsi au point de puisage avant traitement la frquence annuelle danalyse doit tre la suivante avec une analyse de type B1:
15
eau souterraine eau superficielle
12
12
12
10
0,5 frquence annuelle d'chantillonnage 2
0,5
0,5
10
classe de dbit journalier
Avec comme symbole les correspondances indiques dans le tableau ci-dessous les analyses sont du type B3.
4 11
12
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Classe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
dbit journalier (m3.j-1) inf 100 100 399 400 999 1000 1999 2000 5999 6000 9999 10000 19999 20000 29999 30000 59999 60000 99999 > 100000
P1 1 2,5 2,5 3,5 7 8 14 22 42 70 140
frquence annuelle P2 P3 1 0,2 1 0,2 1 0,2 1 0,5 1 0,5 2 1 3 1 6 1 10 1 20 1
Les principaux types deau sont les suivants : a) Quantit deau prlever Elle varie avec le type danalyse de 5 fois 1 litre (analyse de type B3) environ 300 ml (analyses de types B1 et B2). Se rfrer aux rgles dchantillonnage. b) Eaux de source Un griffon (tube en acier inoxydable coud) est enfonc dans lorifice dmergence dau moins 50 cm. On laisse couler plusieurs heures. On flambe lorifice et le volume deau ncessaire lanalyse est recueilli aprs refroidissement (10 minutes). c) Eaux de surface On utilise des flacons striles lests. Leau est prleve 30 cm au moins de la surface et moins de 30 cm du fond, 1 m au moins des rives.
eau souterraine traite
analyse
RP
P1 , P2 P , P3
eau de surface traite
analyse
Rs
P1 , P2 P , P3
eau souterraine non traite
analyse
P1 , P2 P , P3
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d) Eaux de puits Le prlvement seffectue comme pour les eaux de surface. Il faut viter de toucher les bords qui sont en gnral couverts denduits muqueux trs riches en microorganismes. Sil y a une pompe, laisser couler 2 ou 3 heures avant de procder au prlvement .
ouverture
lest
e) Eaux de distribution Cest lanalyse la plus souvent ralise. Cette eau peut provenir de forages, de sources, de rivires ou de lacs. Elle est en gnral collecte puis leve dans des rservoirs avant dtre distribue aux consommateurs ou dans lusine par un rseau de canalisations. Trs souvent cette eau est soumise des traitements physicochimiques de clarification (sdimentation), de strilisation (soit par le chlore soit par ozonisation). Le chlore prsent dans les eaux chlores ou javellises doit tre limin avant de procder lanalyse microbiologique. Pour cela on ajoute quelques cristaux de thiosulfate de sodium dans le flacon destin au prlvement ou mieux 0,2 ml dune solution de thiosulfate de sodium 2 % (P/V) pour 100 ml deau analyser. La mise en vidence du chlore libre peut seffectuer par la mthode lorthotoluidine : 10 ml deau + 1 ml de ractif lorthotoluidine (1g dorthotoluidine pour 1000 ml dacide chlorhydrique 0,46 N). Si leau contient du chlore une coloration jaune apparat (sensibilit voisine de 0,01 mg de chlore par litre deau). Les eaux conditionnes et la glace alimentaire ,subissent une analyse de type B3 avec 3 6 analyses au moins par an, lanalyse tant ralise la ressource, avant soutirage ou avant conglation, aprs conditionnement . Si leau utilise dans les entreprises agroalimentaires nest pas dorigine publique, les analyses raliser sont du type B3 et leur frquence correspond celle donne en fonction du dbit (tableau p.80) Le contrle microbiologique est donc effectu la source (ou la station de pompage), au niveau de la station de traitement, la sortie du rservoir ou au niveau du robinet chez lusager. Dans lusine le contrle de la qualit de leau doit se faire tout au long de son rseau (entre, traitement de dminralisation, etc.)
IV - B - 4 - Analyse microbiologique
a) Dnombrement de la flore totale (eau - 10-4) Mthodes utilisables : classique, filtration, Ptrifilm. Milieu PCA surtout. Certaines tablesanciennes donnent la valeur hyginique dune eau en fonction du nombre de germes totaux par ml. Ainsi la table de MIQUEL donne : eau trs pure eau pure eau mdiocre eau impure 102-103 103-104 104-105 0-102 germes/ml germes/ml germes/ml germes/ml
Ces valeurs nont quune plus quune signification trs limite et dpendent de la nature de la flore compte qui est fonction de la composition du milieu et des conditions dincubations.
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b) Tests microbiens de contamination fcale 1) coliformes totaux et/ou des thermotolrants (BLBVB : eau - 10-3, VRBL ou DCL : eau - 10-2). Principales mthodes utilisables : classique, filtration, Ptrifilm. En milieu liquide, ensemencer en fonction de la charge de leau : 50 ml deau avec 50 ml de BLBVB double concentration 5 fois 10 ml avec 10 ml de BLBVB double concentration 5 fois 1 ml avec 10 ml de BLBVB normal puis ensemencements avec 1 ml des dilutions 2) numration des streptocoques fcaux (eau-10-2) Mthodes utilisables : classiques en milieux liquides ou solides, filtration 3) recherche des coliphages c) Numration des anarobies sulfito-rducteurs (eau - 10-3) Mthodes utilisables : classiques en milieux liquides ou solides, filtration. Numration des spores aprs traitement 80C pendant 5 minutes. d) Numration des germes putrides (eau - 10-3) Il sagit de bactries productrices dH2S partir de thiosulfate ou des acides amins soufrs prsents dans les protines. La prsence de ces germes diminue la qualit technologique ou marchande de leau . Aucune conclusion ne peut tre tire quant la pathognicit de cette catgorie de microorganismes . milieu bouillon nutritif 1000 ml peptone trypsique 20 g NaCl 10 g Na2S2O3 1g pH = 7,2. Striliser par autoclavage 15 minutes 121C. Aprs ensemencement placer une bandelette de papier filtre inhib dactate de plomb entre le bouchon et le tube et incuber 48 h 37C. lecture
papier l'actate de plomb
ngatif
ngatif
positif
Tout tube avec trouble et noircissement du papier lactate est considr comme positif. e) Recherche des germes pathognes Cette recherche est difficile car les bactries pathognes sont souvent peu nombreuses, ne sont pas dans leur milieu naturel, sont dtruites soit par choc osmotique soit par des phages; de plus, ces bactries sont souvent plus ou moins inhibes par la flore de leau. Il faut en gnral procder une concentration pralable de ces germes en utilisant des milieux de pr-enrichissement (revivification) et denrichissements adquats, ou concentrer au pralable les germes pathognes par des mthodes physiques (centrifugation aprs addition leau de lait dalumine, filtration surtout). Pour Salmonella : pr-enrichissement, enrichissement (slnite 37 ou 43C) puis SS Pour Vibrio cholerae : enrichissement en milieu pH alcalin Pour Clostridium perfringens : mthode par filtration puis milieu TSC ou TSN
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Pour Legionella : glose Columbia au sang avec cystine, pyrophosphate ferrique slnite et comme inhibiteurs cefamandole, polymyxine, anisomycine. Incubation 37C pendant 10 jours avec 10% de CO2. Pour Pseudomonas aeruginosa : filtration et milieu de King A. f) rsultats Donner tous les renseignements concernant cette eau (commune, mode de distribution, le lieu du prlvement, lorigine de leau, la date du prlvement, la temprature de leau, le mode de transport, la date de lanalyse et le nom de lanalyste etc...). Exprimer les rsultats de lanalyse microbiologique par le nombre ou la prsence de germes retrouvs dans 1 ou 10 ou X ml deau et les mthodes utilises. g) La qualit microbiologique de leau dans une usine agroalimentaire Le cahier des charges concernant la qualit de leau dans lusine doit tre trs rigoureux. Par exemple la prsence de germes saprophytes psychrotrophes a une incidence sur la stabilit des aliments rfrigrs. Des germes comme Sphaerotilus ou Leptothrix peuvent bloquer des transferts deau dans des canalisations etc. h) Analyses par filtration Les mthodes danalyse par filtration se prtent trs bien lanalyse de leau, en particulier quand sa charge microbienne est trs faible. Ses avantages sont les suivants : rapidit, peu coteuse, lchantillon peut tre trait sur place, les microorganismes peuvent tre revivifis facilement, de grandes quantits deau sont analysables, les antimicrobiens ventuellement prsents sont limins. Ses inconvnients sont lis la non mise en vidence de la production de gaz pour les coliformes , la non utilisabilit avec les eaux troubles qui colmatent la membrane, et la prsence dinterfrences de cultures sur le filtre.
4 - C - ANALYSE DU LAIT ET DES PRODUITS LAITIERS
Le lait est le produit de la traite totale, effectue plus de 7 jours aprs la mise bas de vaches saines, en bon tat et soumises des traites rgulires. La lgislation requiert un taux de matires grasses suprieur ou gal 35 g/L pour le lait commercialis entier . Le lait de vache est de trs loin le plus rpandu et, de par sa composition, il constitue un bon milieu de culture pour la plupart des microorganismes. Prlev dans des conditions dhygine rigoureuses partir dun animal sain, le lait contient quelques milliers de germes par ml. Il sagit de germes prsents sur le pis et dans les canaux galactophores : Micrococcus, Lactobacillus, Streptococcus (S. lactis surtout) qui en se dveloppant vont conduire son altration par acidification essentiellement. La prsence de globulines dans le lait (lactnines) empche la prolifration des bactries dans la premire heure qui suit la traite. Les laits de catgorie A ont des charges microbiennes voisines de 10 30 000 germes / ml. Les laits paucimicrobiens ont des charges microbiennes voisines de 3000 germes par ml ; ceci rsulte de lensemble des mesures prises pour matriser la qualit de ce produit alimentaire hautement prissable (hygine de la traite, dsinfection des rcipients et matriels de collecte, rfrigration immdiate 4C etc.). Entre 15 et 30C cest surtout Streptococcus lactis et des Corynformes qui se dveloppent tandis quentre 30 et 40C ce sont surtout les Lactobacillus, Streptococcus thermophilus et les ventuels coliformes. Ces organismes fermentent le lactose avec production dacide lactique. Avec un lait naturellement contamin, la coagulation acide fait tourner le produit, le coagulum pouvant tre homogne ou au contraire grumeleux, gazeux ou odeurs variables. Cette acidification empche la prolifration des organismes putrfiants.
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Les laits pasteuriss ou striliss peuvent devenir filants ou acqurir des odeurs maltes ou fruites, voire ammoniacales ou encore putrides avec les laits striliss. Les laits conservs crus en tank ont parfois des odeurs ou des saveurs rances. Dans le lait pasteuris Microbacterium lactis, thermorsistant, peut tre prsent. Cette bactrie provient de la peau ou de lintestin des animaux. Des laits concentrs sucrs peuvent contenir des colonies mycliennes en bouton ou permettre le dveloppement en surface de moisissures diverses. Les accidents dorigine microbienne sur les laits ferments et les fromages ne sont pas rares. Ainsi si le lait contient des antibiotiques, la flore normale ou lactique est inhibe et des germes acidifiants gazognes comme les coliformes se dveloppent alors; le yaourt coagule difficilement, les camemberts sont trous, gonfls et leur got est dsagrable. La prsence de germes comme Clostridium butyricum perturbe la fabrication des fromages pte cuite comme le Comt, le Beaufort, lEmmenthal ou le Gruyre. En-dessous de 10C ce sont surtout des Pseudomonas , des coliformes psychrophiles (Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes ) qui se dveloppent. A des tempratures suprieures 45C les lactobacilles thermophiles (L. thermophilus ) se multiplient rapidement et acidifient le lait. Des bacilles Gram - sont rarement prsents et proviennent de la peau des animaux et des manipulations. Alcaligenes est trs commun dans les laits et Pseudomonas fluorescens provoque la glification des laits UHT. Le lait peut contenir de nombreuses espces de germes potentiellement pathognes (Pathogenic bacteria in milk, P.C. VASAVADA, J.Dairy Sci., 1988, 71, 2809-2816) provenant danimaux malades atteints de maladies comme la tuberculose, la brucellose, le charbon, la fivre Q (respectivement Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Bacillus anthracis, Coxiella burnettii ) ou atteints dinfections de la mamelle qualifies de mammites Streptococcus, Corynebacterium, Staphylococcus . Le lait peut aussi contenir des germes qui sont introduits au cours des diverses transformations quil subit et dont lorigine est varie (coliformes avec Escherichia coli entrophatogne, Salmonella, Shigella, Clostridium butyricum, Leuconostoc, Aeromonas hydrophila, Levures, Staphylococcus, Yersinia enterocolytic , Corynebacterium diphteri, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Rickettsia burnettii, Streptomyces etc...). Le lait peut, du fait du dveloppement de microorganismes : - sacidifier (S. lactis, S. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus...). Quand le pH atteint 4,6 par accumulation dacide lactique form partir du lactose il se produit une coagulation des casines. - se gazfier ( coliformes) - salcaliniser au cours de lentreposage basse temprature par dsamination des acides amins librs par protolyse (Pseudomonas fluorescens , Alcaligenes faecalis, Micrococcus...) - rancir par oxydation de la matire grasse (Bacillus...) - se colorer par suite de la prsence dun pigment bactrien (Pseudomonas syncyanea, P.aeruginosa : bleu, Flavobacterium : jaune, Serratia marcescens ou Brevibacterium erythrogenes : rouge ....) - filer par formation de substances mucopolysaccharidiques (capsules glycoprotiques de Leuconostoc mesenterodes, S. cremoris, Alcaligenes viscosus, Aerobacter par exemple). Ce phnomne peut rsulter dune glification par chauffage des protines du lactosrum ou encore de la prsence de composants du sang comme le fibrinogne et des leucocytes la suite dune mammite. - shydrolyser (protines) au cours dun stockage basse temprature. Cette protolyse provoque par des germes tels que Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus, Clostridium ).
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- prendre des gots particuliers (par exemple got de caramel avec Streptococcus lactis varit maligences ).
Signalons que les dsinfectants de type anionique chlors ou iods ou de type ammonium quaternaires sont efficaces sur des bactries comme Listeria ou Salmonella.
IV - C - 1 - Divers types de laits
Schmatiquement, il est possible de dcrire les divers types suivants : a) lait cru (instable, doit toujours tre rfrigr) b) laits modifis par des mthodes industrielles - lait crm (plus ou moins partiellement) - lait chauff (lait pasteuris, lait strilis) - lait homognis - lait conserv (lait en poudre, lait concentr sucr ou non) - lait ferment Parmi les produits laitiers on peut citer le beurre, les fromages, les produits lacts divers.
IV - C - 2 - Prlvement des chantillons (cf chapitre E.1)
Il est rglement par arrt ministriel et peut tre effectu tous les stades depuis la traite jusqu la vente. Le volume prlev est en gnral de 50 100 ml pour les laits liquides. Le nombre de prlvements pour le contrle du lait dans un atelier de traitement est au minimum gal : 2 pour une quantit de lait traite de 5 m3 par jour 3 pour une quantit de lait traite comprise entre 5 et 10 m3 par jour 5 pour une quantit de lait traite suprieure 10 m3 par jour Lintervalle entre 2 prlvements doit tre suprieur 15 minutes.
IV - C - 3 - Analyse microbiologique
a) examens microscopiques Ces examens ne sont pas raliss dans les analyses de routine mais dans le cas de laits anormaux ou de laits ferments. 1) Estimation de la charge microbienne 10 l de lait sont tals sous forme dun carr de 1 cm de ct (1 cm2 ) sur une lame de verre. Aprs schage lair chaud et fixation par lalcool absolu pendant 5 minutes, le frottis est color par le bleu de mthylne phniqu pendant 30 secondes. Aprs lavage leau et schage, on compte le nombre de bactries par champ microscopique (x100), champ dont la surface est dtermine par lvaluation de son diamtre au moyen du vernier de la platine. On peut aussi utiliser un micromtre objectif. On obtient ainsi une approximation de la charge microbienne du lait. 2) Etude cytologique Cette tude est effectue partir de lait cru individuel. Le lait est maintenu 5 minutes 37C, puis centrifug strilement 3000 g pendant 10 minutes. Le culot de centrifugation est mis en suspension dans le liquide restant aprs dcantation et tal comme un frottis sanguin (en tirant la goutte).
goutte de culot de centrifugation
contact avec la lame suprieure
frottis traiter
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Aprs chage lair, le frottis est fix par immersion dans lalcool absolu pendant 5 minutes. Colorer au bleu de mthylne phniqu pendant 5 minutes. Diffrencier rapidement par lalcool 60. Laver leau et examiner aprs schage limmersion. Compter alors une centaine dlments cellulaires qui seront classs en lments normaux et lments anormaux
Elments normaux monocytes Elments anormaux mononuclaires lipophages
lymphocytes polynuclaires
cellules granuleuses corps en croissant hmaties
Calculer le rapport
m nombre de mononuclaires = p nombre de polynuclaires
Si m / p est compris entre 0,5 et 1 le lait est normal. m/p est infrieur 0,5 en cas de mammite aige et suprieur 1 en cas dinfection tuberculeuse. Dans les laits de rtention ou le colostrum on rencontre des lments anormaux.
3) Etude de la flore bactrienne : orientation morphologique Cette tude se fait aprs coloration de Gram partir dun frottis ralis dans ltude cytologique. Pour les laits ferments, taler directement sur la lame 1 se du produit. Il est souvent ncessaire de dgraisser au xylol pendant 5 minutes aprs fixation. Si la coloration est ralise sur un frottis obtenu partir dune se de lait, la densit cellulaire sera trs faible.
Flore normale du lait cru : surtout des bactries Gram+ (diplocoques, streptocoques, bacilles, streptobacilles). Flore anormale : bactries Gram-, longs streptocoques Gram + (20 100 cellules) traduisant une mammite streptococcique (Streptococcus agalactiae).
4) Recherche du bacille de KOCH Cette recherche se fait aprs centrifugation du lait pendant 5 minutes 3000 g. Faire 2 frottis avec la crme. Dcanter. Mlanger le culot avec le peu de liquide restant et faire 2 autres frottis. Scher et fixer lalcool absolu pendant 5 minutes. Raliser une coloration de ZIEHL (cf chapitre III-J). b) dnombrement de la flore arobie (lait - 10-4)
Ce dnombrement est ralise sur glose au lait papan (milieu de CHEVALIER-GUITONNEAU). Les protines du lait sont pr-hydrolyses dans ce milieu dune part pour le transpariser et le rendre utilisable pour la numration et dautre part pour gnrer des peptides qui sont des facteurs de croissance pour les bactries lactiques. Le comptage est effectu aprs 72 h dincubation 30C (le lait cru des pays nordiques contient environ 3.104 germes/ml, le lait dans les plupart des pays europens environ 105 germes/ml). c) numration des indolognes (lait - 10-4) Cette numration se fait en eau peptone aprs 48 h dincubation 37C (ajouter 2 3 gouttes de ractif de Kovacs par tube ; la prsence dindole se traduit par la formation dun anneau rouge vif en surface). La flore normale du lait est indole - ; ces germes indolognes ont une bonne probabilit de correspondre des entrobactries indole + (Escherichia, Providencia, Proteus, Edwardsiella et
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Shigella ). Lincubation 44,5C donnant aprs 24 heures dincubation une rponse positive a une forte probabilit de correspondre Escherichia coli .
d) colimtrie (lait - 10-3) Coliformes totaux et fcaux. e) germes putrides (lait - 10-3) (voir analyse de leau) f) flore thermorsistante (1 ml de lait) Il sagit de germes rsistants un chauffage de 30 minutes 63C (pasteurisation basse). Limportance de cette flore permet dvaluer la pollution lie la traite et denvisager les techniques de pasteurisation adquates. 10 ml de lait sont chauffs, dans un tube essai, 63C pendant 30 minutes. Aprs refroidissement procder comme pour le dnombrement de la flore totale. g) recherche des staphylocoques pathognes aprs enrichissement (1 ml) h) numration des streptocoques fcaux (1 ml) i) recherche des Brucella (Ring test ) j) recherche des Salmonella et Shigella (20 ml) j) recherche des anarobies sulfito-rducteurs (1 ml) Pour linterprtation des divers rsultats cf chapitres IV-A et E-1-a et normes pour le lait.
IV - C - 4 - Analyses chimiques et biochimiques associes lanalyse microbiologique
La couleur, la saveur, lodeur et la consistance du lait sont notes. a) contrle de la propret : lactofiltration 500 ml de lait sont filtrs sur ouate. La rondelle douate est soumise un examen comparatif (prsence de poils etc.). b) dtermination de lacidit Lacidit du lait, exprime en degr Dornic, est le nombre de ml dhydroxyde de sodium N/9 ncessaire neutraliser 10 ml de lait en prsence de phnolphtaline. acidit normale : 15 17 D pour un lait cru 14 16D pour un lait pasteuris acidit augmente (fermentation lactique, addition de K2Cr2O7) 26D : lait coagulant par chauffage 70D : lait coagulant temprature ordinaire acidit diminue addition de NaHCO3 ou Na2CO3 c) contrle de la pollution par mesure dactivits enzymatiques dorigine microbienne
1) rductase (voir chapitre E-6-b)
Dans ce test rapide dvaluation de la charge microbienne, 10 ml de lait sont additionns de 1 ml de bleu de mthylne 5 mg % et incubs 37C dans un bain-marie. Raliser un tmoin avec 10 ml
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de lait et 1 ml deau. Noter le temps de dcoloration. La rponse fournie par ce test nest pas corrle lventuelle contamination fcale. Dcoloration : . en moins dune heure : lait fortement contamin (106/ml) . entre 1 h et 3 h : lait peu contamin (entre 105 et 106/ml) . en plus de 3 h : qualit satisfaisante (105 germes/ml) . en plus de 5 h : bonne qualit (infrieur 105/ml) On peut procder un conditionnement pralable du lait en procdant comme suit : quand le lait arrive au laboratoire placer 50 ml dans un erlenmeyer pendant 24 heures 18C. Aprs mlange de 10 ml avec 1 ml de colorant et incubation 37C. Si le lait se dcolore en moins de 1/2 heure, le lait ne respecte pas le test. remarques : dans le cas de lait rfrigr le test na de signification que si le lait est pr-incub une temprature de 12C pendant 20 h (ou 15C pendant 15 h). Ceci lve le nombre de germes indicateurs dune mauvaise hygine de traite plus que le nombre de germes de mamelles. Le test nest pas applicable au lait contenant du colostrum et au lait de mammite. Quand le temps de dcoloration augmente, le test perd de sa valeur. Le lait cru possde un pouvoir rducteur qui est dtruit aprs pasteurisation. Le lait cru additionn de substances rductrices (formol par ex.) vire plus rapidement. Les cellules non bactriennes (leucocytes) peuvent rduire le bleu de mthylne mais beaucoup moins vite que la rsazurine. Cette mesure est fonction du nombre de cellules, mme si elles sont groupes en amas (dans ce cas un amas ne donne quune colonie sur une glose : phnomne de clumping).
2) rduction de la rsazurine
Cette rduction se fait par tapes successives. Aprs 1, 2 et 3 h dincubation la couleur du lait additionn de rsazurine est estime au comparateur de Lovibond. Les leucocytes rduisent rapidement ce colorant ce qui permet un dpistage rapide des mammites. d) test au teepol Il sagit dune mesure indirecte du nombre de cellules prsentes dans le lait. La valeur de 5.105 /ml constitue la limite entre le lait de mammite et le lait normal. Placer 2 ml de lait dans un cristallisoir de 6 cm de diamtre. Ajouter 2 ml de ractif au teepol (50 ml de teepol 30 %, 15 mg de pourpre de bromocrsol, 10 ml deau). Agiter quelques secondes. LADN cellulaire libr par clatement des cellules sous leffet du teepol flocule, et le pourpre de bromocrsol permet destimer le pH ( la difficult actuelle est de trouver du vrai teepol). nombre de cellules/ml caractristiques raction +++ . . . . . . . . . . . . . . ..106. . . . . . . . . . . . . . . . . . . formation dun gel pais ++ . . . . . . . . . . . . .8.105 5.106 . . . . . . . . . . . . floculat pais adhrant au fond + . . . . . . . . . . . . . . . .5.105 . . . . . . . . . . . . . . . . . floculat lger persistant - . . . . . . . . . . . . . . .inf. 105 . . . . . . . . . . . . . . . . . aucun floculat l existe un cas o le floculat lger disparat aprs quelques secondes (+ -). pH couleur caractristiques 6,6 - 6,7. . . . . . . . . .gris violet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .normal 6,8 et + . . . . . .violet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mammite ou fin de lactation 6,4 - 6,5 . . . . . . . .jaune olive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . colostrum 6,3. . . . . . . . . . . . . jaune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . lait acide
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e) contrle indirect du degr de chauffage On peut estimer les conditions de chauffage auxquelles le lait a t soumis (dure - temprature) en constatant la prsence ou labsence de certaines activits enzymatiques normalement prsentes dans le lait cru ou en mettant en vidence la dnaturation de certaines protines. En connaissant la thermorsistance des enzymes ou de protines constitutives on peut savoir quel traitement thermique le lait a subi.
1) recherche de la peroxydase
Les bactries arobies possdent une peroxydase qui catalyse la raction : AH2 + H2O2
currentpoint currentpoint 2O A+2H
On choisit dans ce test le gaacol comme substance oxydable (AH2) ; il se forme alors un driv doxydation quinonique rose (A). La peroxydase est dtruite 80C en quelques secondes. Dans un tube essai on introduit 2 ml de lait, 0,2 ml de solution aqueuse de gaacol 2 % et 1 goutte deau oxygne 10 volumes ; le tube est tenu la main (temprature voisine de 35C). Un tube tmoin est ralis dans les mmes conditions partir de 2 ml de lait bouilli. Une raction positive se traduit par lapparition dune coloration rose marron en moins dune minute. Certains composs (cuivre) catalysent la raction et conduisent une rponse faussement positive.
2) recherche de la phosphatase : test dASHAFFENBURG et MUELLEN
La phosphatase doit tre absente dun lait pasteuris. Labsence de cette enzyme thermolabile permet de prsumer que le lait a subi une pasteurisation une temprature suffisamment leve pendant un temps donn pour assurer la destruction des formes vgtatives des bactries pathognes. Le substrat choisi dans ce test est de p-nitrophnyl phosphate disodique (PNPP). Ce compos shydrolyse en p-nitrophnol jaune sous laction de la phosphatase pH = 8. La quantit de pnitrophnol libre est value au comparateur de Lovibond. On effectue un tmoin dont la phosphatase a t inactive par bullition.
currentpoint
NO2 O PNPP
O P ONa ONa
H2 O
NO2 p-nitrophnol
OH
+ Na2HPO4 currentpoint
Dans un tube essai on introduit 1 ml de lait et 5 ml de ractif PNPP (PNPP 1,5 g, NaHCO3 1,5 g, Na2CO3 3,5 g, eau qsp 1000 ml). Le tube est incub pendant 2 minutes au bain marie 37C, puis plac ltuve 37C. Aprs 30 minutes et 2 h dincubation, la quantit de p-nitrophnol libre est value au comparateur de Lovibond (disque ATPW 7 donnant les teintes de jaune correspondant des quantits de p-nitrophnol comprises entre 0 et 42 mg / ml). Aprs 30 minutes dincubation la raction est positive avec une concentration en p-nitrophnol de 10 g / ml au moins et aprs 2 h dincubation avec une concentration de 18 g / ml et plus.
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3) recherche de la xanthine oxydase (aldhydo rductase ou enzyme de SHARDINGER) Lenzyme libre partir daldhydes de lhydrogne actif capable de rduire, par exemple, le bleu de mthylne selon la raction : currentpoint
H O O C H O
+ bleu de mthylne oxyd
C H
C H
+ leucodriv currentpoint
10 ml de lait sont additionns de 0,5 ml de ractif (5 ml de solution alcoolique sature de bleu de mthylne, 5 ml de formol neutralis, 190 ml deau distille) et incubs 37C. Lobservation se fait de 10 minutes en 10 minutes. Si le lait reste bleu, il a subi une pasteurisation de quelques secondes 75C ou plus. Si la dcoloration se produit en 25 minutes il sagit dun lait cru ou ayant subi une pasteurisation basse (30 minutes - 63C).
4) contrle de strilisation (test de turbidit dASHAFFENBURG)
Ce test permet de savoir si un lait a t chauff au-dessus de 100C, temprature laquelle sont dnatures (prcipitation) les protines du lactosrum et en particulier les lactoglobulines. On limine dabord du lait les casines par prcipitation fractionne au sulfate dammonium et on recherche dans le liquide surnageant la prsence de globulines thermocoagulables. Si le lait a t chauff plus de 100C les lactoglobulines sont dnatures et coprcipitent avec les casines. A 20 ml de lait ajouter 4 g de (NH4)2SO4 et dissoudre froid. Aprs 10 minutes filtrer sur papier. Prlever 5 ml de filtrat et les porter 5 minutes bullition. Si le liquide reste limpide le lait test a t chauff plus de 100C. Lapparition dune turbidit dans ces conditions rvle la prsence de lactoglobulines (lait cru ou pasteuris). f) recherche dantibiotiques Dans une bote de Ptri introduire 2 ml dune culture de Bacillus stearothermophilus varit colidolactis et 5 6 ml de glose - tryptose 55C. Mlanger et laisser solidifier. Dposer la surface 1 disque de Pnicilline 10 U et 1 disque de papier filtre imprgn de 100 l de lait tester. Incuber 5 h 24 h 55C la bote pralablement enveloppe dans du papier daluminium pour viter sa dshydratation. Mesurer le diamtre des zones dinhibition autour des disques. Dautres bactries tests sont utilisables : Micrococcus luteus, Bacillus subtilis. Il existe un test de rduction du TTC par Streptococcus thermophilus. Quand le lait ne contient pas dantibiotiques, le germe rduit rapidement le TTC en formozan rouge .
IV - C - 5 - Analyse du lait cru
a) flore arobie totale (1 ml - 10-4) b) colimtrie (totaux et fcaux) , E. coli (1 ml - 10-3) c) recherche des staphylocoques (1 ml) d) numration des indolognes (1 ml - 10-4) e) flore thermorsistante (1 ml - 10-2 lait chauff 63C pendant 30 minutes) f) anarobies sulfito rducteurs (1 ml - 10-3) g) rductase > 3 h h) acidit normes : acidit titrable < 21D rductase > 3h indolognes m = 100 / ml coliformes m = 100 / ml anarobies SR m = 50 / ml
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IV - C - 6 - Analyse du lait pasteuris
a) b) c) d) e) f) g) h)
flore arobie totale (1 ml - 10-2) colimtrie (coliformes totaux et fcaux ) et E. coli (1 ml - 10-2) recherche des staphylocoques (1 ml) numration des indolognes (1 ml - 10-1) recherche de Salmonella (250 ml) recherche de la phosphatase anarobies sulfito rducteurs (1 ml) recherche dantibiotiques.
Les normes (valeurs de m) concernant les laits pasteuriss sont indiques dans le tableau ci-aprs ( extraits du JO du 21 juin 1982).
Salmonella / 250 ml germes arobies msophiles 30C / ml Staphylococcus aureus / ml
coliformes 30C/ ml
Phosphatase
coliformes fcaux / ml
acidit (D)
Stabilit l' bullition
jusqu' J+4 la date de premption
3.10 4 3.10 4
10 100
1 1
1 10
0 0
sans 14 18 stable dfaut
IV - C - 7 - Analyse du lait strilis
Le lait strilis ne doit pas contenir de germes revivifiables (cf chapitre I - E - 1 - a - 2) a) tuvage 55C 10 jours, 30C 20 jours b) contrle du chauffage c) mesure de lacidit d) recherche des Bacillus ( partir des chantillons tuvs coaguls ou non) sur milieu glos glucose - amidon (1 ml - 10-1) e) recherche des anarobies sporuls (milieu VF) partir des chantillons tuvs. norme : m = 5 sporuls /ml.
IV - C - 8 - Analyse dun lait en poudre
10 g de lait sont additionns de 90 ml de diluant tryptone - sel. Agiter 10 minutes 45C. a) flore arobie totale (1 ml - 10-4) b) coliformes et E. coli (1 ml - 10-4) c) streptocoques fcaux (1 ml - 10-4) d) anarobies SR (1 ml - 10-1) e) recherche de Salmonella (5 50 ml) f) recherche de Staphylococcus (10 ml) g) levures et moisissures (1 ml ; sur OGA) pas de germes pathognes normes : germes totaux m = 5.104/g coliformes m = 5/ g
analyse sensorielle
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IV - C - 9 - Analyse dun lait concentr sucr
A 10 ml de lait on ajoute 18 20 ml deau distille strile. a) flore arobie totale (1 ml - 10-3) b) colimtrie et E. coli (1 ml - 10-1) c) indolognes (1 ml - 10 - 1) d) Staphylococcus (1 ml) e) streptocoques du groupe D (1 ml) f) Salmonella (250 ml) g) levures et moisissures (1 ml) h) anarobies SR (100 ml) normes : flore totale m = 3.104/ml coliformes m = 1/ml indolognes m = 1/ml anarobies SR m = 10/1000 ml, levures m = 0/ml, pas de germe pathogne.
IV - C - 10 - Analyse de laits ferments (yaourts, kfir etc)
La flore normale du yaourt est compose de Streptococcus thermophilus (ferment darme) et de Lactobacillus bulgaricus (ferment dacidification). Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bifidus reprsentent la flore de lait ferments Bio. Le kfir subit une fermentation lactique par Streptococcus lactis puis une fermentation alcoolique (Candida kefir ) et enfin une fermentation par Lactobacillus acidophilus . a) b) c) e) f) g) flore arobie totale (1 ml - 10-8) coliformes (totaux et fcaux) et E. coli (1 ml - 10-3) indolognes (1 ml - 10-3) acidit Salmonella (25 ml) levures et moisissures (1 ml - 10-2)
normes : m = 10 indolognes / ml , m =10 coliformes / ml, m = 1 coliforme fcal / 1 ml, Salmonella m = 0 / 25 ml.
IV - C - 11 - Analyse des laits glifis et des laits emprsurs aromatiss
a) b) c) d) e) f) g)
flore arobie totale (1 ml - 10-3) m = 103 / ml (totaux m = 10/ml et fcaux m = 1/ml ) colimtrie (1 ml - 10-1) indolognes (1 ml - 10 - 1) Staphylococcus (1 ml) m = 10 /ml Salmonella (25 ml) m = 0 levures et moisissures (1 ml) anarobies SR (100 ml)
IV - C - 12 - Analyse des fromages (frais pasteuriss)
10 g de fromage sont broys dans 50 ml de citrate de sodium 2 %, ou 50 ml de bouillon tryptonesel. a) flore totale (1 ml - 10-6) b) indolognes (1 ml - 10-3) + papier actate de Plomb (putrides) c) coliformes (1 ml - 10-1) (totaux m = 10 /g et fcaux m = 1 /g ) et E. coli
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d) e) f) g) h)
levures et moisissures (1 ml - 10-4) anarobies SR (1 ml - 10-3) flore thermorsistante (1 ml - 10-3) sur VF aprs 10 minutes 85C Staphylococcus (1 ml - 10-1) m = 10/g Salmonella (25 g) m = 0/25 g.
IV - C - 13 - Analyse du beurre
125 g de beurre sont additionns de 10 ml de tampon phosphate 0,05 M pH = 8. Aprs 1 h dincubation 41C, centrifuger 15 minutes 2000 g. Lanalyse est effectue sur la phase aqueuse. a) flore arobie totale (1 ml - 10-4) avec m =104/g b) coliformes (totaux m = 25/g et fcaux m = 1 /g) c) indolognes (1 ml - 10-3) d) recherche de Salmonella (10 ml) e) levures et moisissures (1 ml - 10-4) m = 10/g f) Pseudomonas (1 ml - 10-4) sur une eau peptone. Incuber 3 j 30C et apprcier la pigmentation. normes : pas de pathogne absence de phosphatase
IV - C - 14 - Glaces et crmes glaces
a) b) c) d e) f) g)
flore arobie totale (1 ml - 10-4) m = 3.105/g coliformes (1 ml - 10-2) : totaux m = 100/g et fcaux m = 1/g recherche des staphylocoques (1 ml) m = 10/g recherche des Salmonella (25 g de produit) m = 0 / 25g streptocoques fcaux (1 ml) phosphatase Staphylococcus normes : pas de germes pathognes phosphatase ngative
IV - C - 15 - Crmes de consommation pasteurises
a) b) c) d e) f) g)
flore arobie totale (1 ml - 10-4) m = 3.104/g coliformes (1 ml - 10-2) : totaux m = 100/g en vrac et 10/g conditionne et fcaux m = 1/g recherche des staphylocoques (1 ml) m = 10/g recherche des Salmonella (25 g de produit) m = 0 / 25g streptocoques fcaux (1 ml) phosphatase Staphylococcus normes: pas de germes pathogne phosphatase ngative et acidit 2,5 (acide lactique)
IV - C - 16 - Casines et casinates
a) flore arobie totale (1 ml - 10-4) m = 3.104/g b) coliformes totaux m = 0/0,1g c) flore thermophile (45C) m = 3.102/g
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IV - D - ANALYSE DES VIANDES ET PRODUITS CARNES IV - D - 1 - Flores microbiennes normales et pathognes des viandes
La peau des animaux est naturellement contamine par des bactries Gram - qui y adhrent fortement, par des bactries gram + et par des spores de moisissures .Les muscles profonds mais aussi sous-jacents sont normalement striles. La flore de contamination normale rsultant de labattage provient donc dabord de la peau et un degr moindre des muqueuses (Pseudomonas putrefasciens, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter, Enterobacter, Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Streptomyces, moisissures des genres Penicillium, Sporotrichum, Cladosporium, Mucor, Thamnidium etc.) mais peut aussi provenir du tube digestif (entrobactries, streptocoques fcaux, Clostridium etc.). Dans la prparation des viandes , des contaminations extrieures interviennent aussi (air, sol, manipulateurs, outils de dcoupe etc) . Les germes le plus souvent rencontrs appartiennent alors aux genres Pseudomonas , Bacillus (B.cereus), Clostridium (C. perfringens et C. botulinum), Staphylococcus ou dautres familles de bactries Gram - (entrobactries avec Salmonella, E.coli, Shigella , etc.) . Des levures et des spores de moisissures peuvent aussi contaminer la surface des viandes partir de lair ou de surfaces de travail contamines (Penicillium , Sporotrichum , Cladosporium , Mucor , Thamnidium Alternaria , Monilia etc.) . Ces microorganismes se retrouvent la surface des viandes dcoupes avec des teneurs de lordre de 1000 UFC/cm2 si les conditions de bonne fabrication et dhygine sont respectes. La viande fournie par les animaux malades est souvent porteuse des germes lorigine de la maladie, la transmission vers le muscle se produisant surtout par la voie lymphatique. Les maladies transmises lhomme par de telles viandes sont pour la plupart soit dorigine parasitaire soit dorigine bactrienne. Certains helminthes tels que les cestodes et nmatodes peuvent tre transmis par les viandes. Parmi les cestodes on peut signalerTaenia solium (porc) et Taenia saginata (boeuf), la transmission de la maladie lhomme (ver solitaire) rsultant de la consommation de cysticerques. Echinococcus granulosus et Echinococcus multiocularis provoquent chez lhomme un kyste hpatique. Parmi les nmatodes, Trichinella spirali , qui est lagent de la trichinose (troubles moteurs graves), est le plus souvent impliqu, sa transmission lhomme se faisant par consommation de viande de porc dans laquelle se trouvent des larves enkystes du parasite. Parmi les protozooaires susceptibles dinfester les viandes, il faut signaler Toxoplasma gondii (viande de porc ou viande contamine par des ovocystes de djection de chat) responsable de la toxoplasmose et Sarcocystis agent de la sarcosporiose, maladie transmise par la viande dherbivores (mouton par exemple). Parmi les bactries pathognes ventuellement prsentes dans les viandes et susceptibles de provoquer une maladie chez les consommateurs, il faut signaler Salmonella, Brucella, Erysipelothrix rhusiopathiae (provoquant le rouget), Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis (agent du charbon) et Pasteurella tularensis (agent de la tularmie : viande de gibiers). Les bactries anarobies ne sont considrer que si la temprature est suprieure 25C; dans ce groupe les Clostridium sp prdominent. Ainsi 65 70 % des carcasses de porc contiennent C.perfringens et environ 10 % Clostridium botulinum. Heureusement que cette dernire bactrie est une trs mauvaise comptitrice en prsence des autres bactries contaminantes .
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IV - D - 2 - Evolution des flores microbiennes des viandes et qualit
Au cours des phnomnes de rsolution de la rigor mortis, la viande est soumise laction de protases endognes (cathepsines) qui en produisant un attendrissement favorisent la prolifration des germes contaminants. Cette prolifration dpend aussi de ltat physiologique de lanimal au moment de son abattage, de la charge microbienne, du pH, des mthodes dquarrissage et dentreposage (temprature, humidit). Dans des conditions dentreposage ou de transformation des tempratures de rfrigration et en milieu humide, les microorganismes cryophiles contaminants les plus frquents appartiennent la famille des Pseudomonadaceae (Pseudomonas putrefasciens, Pseudomonas fluorescens ) et aux genres Acinetobacter, Enterobacter, Microbacterium. Certains Leuconostoc , Streptococcus et Lactobacillus ainsi que des moisissures sont aussi rencontrs. Les principales modifications qui affectent les proprits organoleptiques des viandes et dcelables sont les suivantes : formation du limon : elle correspond au dveloppement en surface de microorganismes producteurs de substances mucilagineuses : Pseudomonas, Leuconostoc, Bacillus, Micrococcus, Achromabacter , Streptococcus , certaines levures et moisissures. formation de tches par dveloppement de microorganismes pigments ou excrtion de pigments. Dans des conditions dentreposage en milieu sec, la prolifration des moisissures est possible jusqu -1C (boeuf) et jusqu -10C (viande congele de mouton). Les taches vertes sont le reflet de la prsence de Penicillium spp., les taches blanches de Sporotrichum spp., les noires de Rhizopus ou Cladosporium spp., les rouges de Rhodotorula et les feutrages de Mucor et Thamnidium . De nombreuses bactries peuvent aussi contribuer la formation de taches colores (Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Flavobacterium , etc.). dcoloration par modification de la myoglubine par des bactries comme Leuconostoc, Lactobacillus etc. rancissement et modifications dfavorables du got par Pseudomonas, des bactries lactiques, des levures et moisissures. Moisissement par Thamnidium, Rhizopus ou encore Mucor etc. surissement par formation dacides organiques tels quacides lactique, actique, formique, propionique, butyrique etc. (entrobactries, Staphylococcus, Bacillus cereus, Clostridium butyriques). putrfaction par formation de drivs soufrs (H2S , CH3 -S- CH3), dindole, de scatole et damines diverses (Clostridium, Proteus, Staphylococcus, Bacillus cereus, etc.). Ces dgradations sont souvent le fait de bactries anarobies strictes ou aro-anrobies et la toxicit des substances libres associe au pouvoir pathogne des germes rendent ces viandes dangereuses consommer. Ce sont les viandes dsosses, dcoupes en profondeur, haches lavance, conditionnes sous film relativement impermable pour lesquelles lanarobiose est prsente qui peuvent le mieux servir de substrat ces modifications et donc qui sont les plus dangereuses.
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IV - D -3 - Analyse des plats cuisins lavance , escargots prpars , pices de viandes cuites tranches ou non (JO du 19 janvier 1980)
25 g de produit sont broys dans 225 ml de bouillon tryptone peptone normes -8) 1) flore arobie totale (1 ml - 10 m = 3.105/g 2) coliformes (1 ml - 10-6) m = 103/g 3) coliformes fcaux (1 ml - 10-4) m = 10/g 4) anarobies SR (1 ml - 10-2) m = 30/g -3) m = 100/g 5) Staphylococcus aureus (1 ml - 10 6) Salmonella (25 g) m = 0/25 g 7) levures et moisissures (1 ml - 10-6) m = 104/g
IV - D - 4 - Analyse de la viande frache ou hache
5 g de viande sont broys dans 45 ml de diluant. 1) flore arobie totale (1 ml - 10-5) m = 5.105/g 2) coliformes (1 ml - 10-3) fcaux ( m = 102/g) 3) indolognes (1 l - 10-5) m = 30/g 4) anarobies SR (1 ml-10-2) aprs 10 mn 85C -1) m = 102/g 5) Staphylococcus aureus (1 ml - 10 6) Salmonella (25 g) m = 0/25g 7) Bacillus cereus (1 ml)
IV - D - 5 - Analyse de la charcuterie crue
Les germes les plus souvent rencontrs sont : Lactobacillus, Leuconostoc et Streptococcus (jusqu 108/g) et des germes de dgradation : Corynbactries, Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus etc 5 g de produit sont broys dans 45 ml de diluant. 1) flore arobie totale (1 ml - 10-6) 2) indolognes (1 ml - 10-5) 3) streptocoques fcaux (1 ml) 4) anarobies SR (5 ml, 1 ml) 5) Staphylococcus aureus (1 ml - 10-1) 6) Salmonella (25 g) 7) coliformes fcaux (1 ml - 10-2)
IV - D - 6 - Analyse de la charcuterie cuite
normes m =105/g (usine) m = 50/g m = 5.102/g m = 0/25 g m = 103/g
Boudins et rillettes sont soumis une cuisson peu prolonge tandis que pts jambons cuits ou saucissons cuits sont soumis un traitement thermique prolong qui limine pratiquement la flore microbienne prsente sous sa forme vgtative et slectionne les spores de Clostridium et Bacillus . Des recontaminations de ces produits par des Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc Micrococcus , Bacillus peuvent engendrer des altrations du got (srissement) ou lapparition de limon ou de taches colores (Alternaria, Monilia, Rhizopus, Mucor etc) 5 g de produit sont broys dans 45 ml de diluant.
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normes 1) flore arobie totale (1 ml - 10-5) 2) anarobies SR (5 ml - 1 ml) 3) streptocoques fcaux (1 ml - 10-1) 4) coliformes (1 ml - 10-1) 5) Salmonella (25 g) 6) Staphylocoques (1 ml - 10-2)
IV - D - 7 - Analyse des semi-conserves
m = 3.105/g) m = 30 g coliformes m = 103/g, coliformes fcaux m = 10g m = 0/25 g m = 102/g
5 g de produit sont broys dans 45 ml de diluant 1) flore arobie totale (1 ml - 10-8) 2) coliformes (1 ml - 10-6) 3) anarobies SR (2ml - 1 ml) 4) Salmonella (5 g) 5) Staphylococcus (1 ml - 10-1) 6) germes putrides (1 ml - 10-6) normes : absence de bactries pathognes, flore totale infrieure 104/g.
IV - E - ANALYSE DES COQUILLAGES
La flore microbienne de leau de mer est comparable celle de leau douce mais avec une adaptation aux conditions de salinit (voisine de 30 g/l). La survie de la plupart des germes pathognes dans leau de mer nest pas bonne ce qui rend la mer moins pollue que les eaux de rivire. Cependant, les eaux littorales sont souvent charges de matires organiques qui protgent les microorganismes de laction ltale du sel et leur charge microbienne est souvent trs leve en raison du rejet deaux uses hautement contamines. La flore de leau de mer varie en fonction de trs nombreux paramtres tels que teneur en matires organiques, profondeur, temprature, courants etc.. Elle est reprsente par de nombreuses bactries halophiles ou halotolrantes comme Vibrio, Achromobacter, Halobacterium, Photobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Flavobacterium etc.). Les eaux des zones littorales sont souvent charges en entrobactries (Salmonella, Proteus ) et Clostridium botulinum (type E) est un hte normal de certaines eaux . Leau de mer peut vhiculer des virus (hpatite, entrovirus, bactriophages) et des parasites. Les coquillages filtrent de grands volumes deau (plusieurs litres par jour pour une huitre par exemple) et concentrent sur leur filtre et leau internes les microorganismes. La flore la plus courante est constitue dAchromobacter et Flavobacterium mais la prsence de germes dorigine fcale dans les zones pollues par des rejets dgouts nest pas rare. Laver, brosser les coquilles avec de leau savonneuse, immerger dans de leau javellise dilue. Laver lalcool (flamber), ouvrir. Rcuprer le contenu du coquillage (avec le liquide) et broyer. A 5 ml de broyat on ajoute 45 ml de diluant strile (dilution 10-1). normes 1) coliformes fcaux (5 ml - 1 ml) 2) Salmonella (25 ml) m = 10/g m = 0/ 25 g
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3) anarobies SR (5 ml) 4) Vibrio parahaemolyticus (1 ml) 5) streptocoques fcaux 6) flore arobie totale (1 ml - 10-6) 7) Staphylococcus
IV - F - ANALYSE DUNE VOLAILLE
m = 10/g m = 25/100 ml m = 104/g m = 102/g
La volaille peut tre introduite entire dans un sac strile en polythylne et tre soumise un massage an prsence dune quantit donne de bouillon tryptone-sel. Lanalyse sera alors ralise sur une partie aliquote de la suspension obtenue. Il est possible de procder des prlvements dcoups. La flore arobie msophile totale, les coliformes, Salmonella, Staphylococcus, Clostridium perfringens, Streptococcus D et Campylobacter sont soit compts soit recherchs. Il nest pas rare que la FAMT soit suprieure 2,5.105/cm2, les coliformes en nombre suprieur 103/cm2, et Staphylococcus suprieur 10/cm2 Un FAMT peu nombreuse indique que les contaminants sont peu nombreux et un nombre peu lev de coliformes fcaux indique une bonne hygine de prparation alors quun nombre peu lev de Streptocoques D reflte une viscration correcte et une bonne hygine .
IV - G - ANALYSE DUN SUCRE
Il sagit, si aucune autre prcision nest donne, de saccharose extrait de vgtaux comme la betterave ou la canne sucre. La flore normale contaminante du produit est dorigine tellurique et vgtale. Il sagit essentiellement de Pseudomonadaceae, Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Bacillus, Enterobacter, levures et moisissures. Les oprations de raffinage conduisent la destruction des formes vgtatives et seules les spores de Clostridium (C.saccharolyticum, C.nigricans ) et de Bacillus (B.stearothermophilus, B.subtilis ) survivent. Des contaminants exognes peuvent tre apports par leau ou par lair. Le sucre en grain est peu contamin, stable (activit de leau trs faible) et sa charge en spore est trs faible. Une trs lgre humidification de la surface peut permettre la croissance de moisissures ou de levures (Saccharomyces, Candida, Rhodotorula). Les sirops de sucre peuvent permettre la croissance, en plus de ces spores, des germes osmophiles et en particulier des levures (Saccharomyces rouxxi, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bisporus). Analyse 30 g de sucre sont additionns de 150 ml deau D strile. 1) flore arobie totale : 10 ml de solution sont introduits dans 100 ml de glose lactose au pourpre de bromocrsol (BCP) 50C. Couler 5 botes de Ptri. Aprs 5 jours dincubation 30C, compter les germes lac + et lac - ou saccharose + ou - (on peut utiliser une glose sans lactose). 2) levures et moisissures (1 ml - 10-1) 3) recherche de Leuconostoc mesenterodes 15 g de sucre sont ajouts 100 ml de bouillon ordinaire. Aprs 4 jours dincubation 30C, procder un isolement sur glose saccharose (protose peptone 15 g, saccharose 150 g, glose 15 g, eau D 1000 ml, pH = 7, bouillir seulement). Sur ce milieu L. mesenterodes donne de grosses colonies muqueuses transparentes.
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IV - H - ANALYSE DES CONSERVES
(cf E-1-a-1)
Les conserves sont des denres alimentaires prissables dorigine animale ou vgtale dont la conservation est assure par lemploi combin - dun conditionnement dans un rcipient tanche aux liquides, aux gaz et aux microorganismes, toute temprature infrieure 55C - dun traitement par la chaleur ou par tout autre mode autoris ayant pour but de dtruire ou dinhiber totalement dune part les enzymes et dautre part les microorganismes et leurs toxines dont la prolifration pourrait altrer la denre considre ou la rendre impropre lalimentation humaine (dcret du 10 fvrier 1955). Ces denres doivent rester stables au cours dun tuvage prolong (au moins 8 jours 37C et 55C pour les pays chauds). Une conserve ne doit pas subir daltrations dorigine microbienne et si une telle altration intervient il faudra en dterminer lagent causal et son origine. Une bote anormale indique gnralement un produit anormal. Au cours des phnomnes daltrations, la bote peut prsenter des anomalies daspect facilement apprciables : demi bombe, bombe dformable, bombe indformable . Le bombage est soit dorigine microbienne (fermentation des glucides avec production de gaz - surtout du CO2 - ou fermentation des protines avec production dazote ou de NO2) soit dorigine chimique avec production dhydrogne par attaque du mtal par des acides soit li une surchauffe de strilisation. Le contenu de la bote peut aussi, par suite de la prsence de bactries, subir des modifications daspect, texture ou pH (flat sour). La nature du gaz dune conserve bombe peut tre valu aprs rcupration du gaz dans un tube pralablement rempli deau baryte (la surface de la bote est pralablement dsinfecte avec une solution 2% diode dans lalcool 70%). Si le volume diminue rapidement cest quil sagit de CO2. Si une flamme prsente lorifice du tube dclanche une petite explosion il sagit vraisemblablement dhydrogne.
dispositif smple de rcupration des gaz d'une bote de conserve bombe vide
agent de tempage non moussant
formation de bulles en cas de fuite
La dtection de microfuites est ralise en plaant sur la bote un adaptateur transparent avec une prise de vide. Le contrle de strilit est ralis sur 2 botes qui sont incubes 37C et 55C et sur 1 bote qui est soumise lanalyse immdiate. Aprs ouverture de la bote dans des conditions daseptie rigoureuses (nettoyage du couvercle, flambage lalcool pour les botes non bombes) 30 g de produit sont broys dans 120 ml de diluant.
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Les examens et analyses raliser sont les suivants : 1) examen microscopique dun frottis aprs coloration de Gram (20 champs) 2) examen macroscopique : aspect, couleur, odeur, mesure du pH 3) examen de ltat des sertis, apprciation du bombage 4) flore arobie totale (1 ml - 10-6) 5) germes putrides (1 ml - 10-6) 6) staphylocoques (1 ml - 10-2) 7) coliformes (1 ml - 10-2) 8) Salmonella (10 ml) 9) indolognes (1 ml - 10-2) 10) Lactobacillus (1 ml sur milieu MRS) 11) anarobies SR (1 ml - 10-3) 12) thermophiles du flat sour (1 ml - 10-3) Glose BCP ; Bacillus thermoacidurans et B. stearothermophilus 13) levures et moisissures (1 ml). Les principales causes daltrations des conserves sont schmatises dans le tableau ci-aprs:
aspect externe plate ALTERATIONS DES PRODUITS ACIDES Produits peu acides ( pH compris entre 4,5 et 6)
plate
modifications du produit
perte de vide l' entreposage , apparence peu modifie , pH abaiss , liqufaction , odeur anormale FLAT SOUR
microorganisme
Bacillus stearothermophilus Clostridium nigrificans Clostridium thermosaccharolyticum Clostridium sporogenes C. botulinum Bacillus polymyxa Bacillus macerans Bacillus subtilis Clostridium butyricum Clostridium perfringens Clostridium pasteurianum Bacillus thermoacidurans B. coagulans bactries lactiques Streptococcus thermophilus
L' produit induit une odeur d' pourri H2S oeuf et un noircissement du produit bombage risque d' explosion par production de CO2 et H2 Produit ferment aigre , odeur butyrique bombage risque d' explosion (H2 et CO2). Contenu partiellement digr , pH augment , odeur putride ( H2S , indole , scatole , mercaptan etc) un bombage peut intervenir avec les viandes plate cuites avec des nitrates et des sucres , dans du lait coagul , des betteraves bombage risque d' explosion H2 , CO2). Produit ferment . Odeur butyrique peu de modifications du vide (Flat sour du jus de tomate . pH peu affect . Odeurs et flaveurs marques Eclatement ou bombage stabilis pH diminu , odeurs d' aigre
Produits entre pH 4,5 et 3,7
plate bombage
en dessous de pH 3,7 , ce sont des altrations chimiques qui dominent
Les analyses raliser peuvent tre prsentes sous forme dun organigramme qui a lavantage de permettre une bonne vision des oprations raliser.
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3 botes tuvage 37 C tuvage 55 C 30 g / 120 ml de diluant 4 h puis 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml dilutions frottis 10 ml 37 C 10 ml 44 C
24 heures
48 heures
72 heures
96 heures 8 15 jours
glose SS glose SS
API API
biotype biotype
10 ml + 10 ml bouillon slnite eau peptone glose VF-sulfite bouillon Chapman milieu MRS milieu BCP milieu DCL -6 milieu PCA (0-10 ) putrides (-0-10 -6 ) 37 C 37 C 37 C 55 C 30 C 44 C 30 C 30 C 30 C 55 C 30 C thermophiles du flat sour levures,moisissures lactobacilles papier actate de plomb 37 C 37 C 55 C glose Chapman ou Baird Parker Lactobacillus R.Kovacs (indolognes) anarobies msophiles sulfito-rducteurs anarobies thermophiles (Staphylococcus)
Entrobactries API Thermophiles du flat sour coliformes Escherichia coli FAMT
conserves pH< 4,5
1 ml
bouillon acide pH 5 bouillon malt extract
IV - I - ANALYSE DE PRODUITS CONGELES (LEGUMES SURGELES) cf aussi chapitre E-2-a
10 g de produit congel sont additionns 90 ml de diluant. Aprs dconglation, broyer. normes (fonction du produit) 1) flore arobie totale (1 ml m = 5.105/g 2) germes psychrophiles (0,1 ml en surface dune glose nutritive ordinaire; incuber 25 jours 8C) 3) staphylocoques (1 ml) m = 10/g -4) 4) coliformes (1 ml - 10 coliformes m =3.103/g, coliformes fcaux m = 15/g 5) streptocoques fcaux (1 ml - 10-1) m = 10/g 6) C. perfringens (5 ml) 7) Salmonella (25 g) m = 0/25 g 8) levures et moisissures (1 ml.10-3) levures < 103/g moisissures < 5.102/g 9)anarobies sulfitorducteurs ( 1 ml) m = 0/0,1 g pour C. perfringens 10-4)
IV - J - ANALYSE DALIMENT SOUPCONNE DETRE A LORIGINE DUNE MALADIE
10 g du reste du produit alimentaire souponn sont broys dans 40 ml de diluant strile.Les analyses devront tenir compte des symptmes prsents par les consommateurs malades. 1) Salmonella (25 ml) 2) coliformes et E. coli (1 ml - 10-2) 3) C. perfringens (1 ml - 10-2) 4) Staphylococcus (1 ml - 10-2) 5) recherches de la toxine botulinique et de la toxine staphylococcique 6) FAMT et anarobies sulfito-rducteurs
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IV - K - ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE LENVIRONNEMENT DANS UN ATELIER
Ce type danalyse est ncessaire pour valuer lefficacit des procdures de nettoyage/sanitation, pour rechercher dventuels points critiques et pour contribuer lducation des personnels. Les prlvements sur les surfaces (sols, tables, murs etc) sont ralisables au moyen de lames ou de botes contact avec des milieux adapts ou par couvillonnage ou par rinage. Par les gloses contact (bote ou lame), il est possible destimer la flore totale arobie msophile, les entrobactries, les staphylocoques ou encore les levures et moisissures contaminants de surfaces diverses. Trs faciles employer, les lames constituent par ailleurs un bon outil pdagogique et ont ainsi lavantage dencourager les bonnes pratiques dhygine du personnel. Avant dtre montres aux personnels, ces lames ou botes doivent tre fixes avec une laque cheveux (actate de vinyle dans une essence mthyle) pour viter les contaminations ariennes. Ces lames ou botes doivent ensuite tre obligatoirement autoclaves avant dtre limines. Pour contrler les bouteilles en verre aprs leur lavage (ou avant leur remplissage par le liquide alimentaire quelles sont supposes recevoir), utiliser les milieux solides classiques des flores rechercher en augmentant leur teneur en glose de 0,5 %: PCA (flore totale), Baird Parker (Staphylococcus ), DCL (coliformes), MRS* (Lactobacillus ), RCM * ( Clostridium ), BCP ( Bacillus). Rgnrer les milieux et les ramener 50C. Pour des bouteilles de volumes compris entre 250 et 1000 ml ajouter 100 ml de milieu en surfusion (et moins pour des volumes infrieurs). Boucher les bouteilles avec un bouchon strile et refroidir la bouteille place horizontalement sous un courant deau froide jusqu solidification de la glose sur la surface interne du rcipient.
incuber eau froide milieu de culture glos
Incuber verticalement et compter les colonies ; pour Lactobacillus et Clostridium incuber en anarobiose * milieu MRS ( Man, Rogosa, Sharpe) peptone 10 g extrait de viande 8g extrait de levure 4g CH3COONa 5g K2HPO4 2g 2g citrate NH4 MgSO4,7H2O 0,2 g MnSO4,4H2O 0,05g glucose 20 g tween 1 ml glose 10 g eau D 1000 ml , pH 6,2. Striliser 121C pendant 15 minutes.
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Lensemencement peut tre ralis dans la masse ou en surface mais avec une double couche de 3 mm dpaisseur pour protger les Lactobacillus de leffet toxique de loxygne. Les botes peuvent aussi tre incubes en anarobiose ou dans des atmosphres enrichies en CO2 (10%). Les colonies opaques et circulaires de 0,5 1 mm de diamtre apparaissent aprs 24 36 heures dincubation 30C. Par rapport aux Bacillus (catalase + et oxydase +) les Lactobacillus sont catalase - et oxydase *milieu RCM ( Reinforced Clostridiium Medium) peptone 10 g extrait de viande 10 g extrait de levure 3g CH3COONa 5g glucose 5g amidon soluble 1g cystine 0,5 g glose 15 g eau D 1000 ml pH = 7,1. Striliser 15 minutes 120C.
Lanalyse de lair est importante raliser car les germes ariens sont souvent des germes de contamination de produits . Ce sont surtout des bactries et des spores de moisissures qui sont en suspension dans lair, sous forme dunits individuelles ou de petits amas.
Il est possible de laisser des botes de Ptri (contenant les milieux adapts) ouvertes dans les zones contrler pendant des temps variables qui dpendent de la densit de contamination. Les chantillonneurs dair permettent lanalyse de volumes dair connus (SAS : surface air systems). Lair est soumis une acclration centrifuge et les particules dcantes sont dposes sur la surface dune glose. Millipore propose le Strifilm System dans lequel lair est dabord envoy en barbotage dans un milieu liquide, lequel est soumis une filtration (0,45 m); les microorganismes retenus sur le filtre sont mis en vidence aprs incubation sur des milieux adapts.
IV - L - STERILISATION, DESINFECTION ET TRAITEMENT DES MATERIELS CONTAMINES
Rappelons que les principales mthodes de strilisation utilises par le microbiologiste / technologue sont : le flambage , la chaleur sche (four Pasteur), la chaleur humide (autoclaves), les composs chimiques (dsinfectants, antiseptiques, additifs) le plus souvent utiliss sous forme liquide et parfois gazeuse, la filtration et les radiations lectromagntiques ou soniques (UV, ). La plupart de ces mthodes sont tudies en dtail dans dautres enseignements. Nous dcrirons ici simplement les dsinfectants utilisables dans lindustrie et au laboratoire.
IV - L - 1 - Types et usages au laboratoire de quelques dsinfectants
Chaque produit dsinfectant est caractris par son spectre dactivit. Gnralement, ce sont les formes vgtatives des bactries qui sont les plus sensibles, levures et moisissures ainsi que virus contenant des lipides tant lgrement moins sensibles. Les mycobactries et les virus sans lipides sont plus rsistants. Les spores bactriennes sont par contre souvent trs rsistantes ces agents. Le tableau ci-aprs rsume lactivit de quelques agents dsinfectants.
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Les plus utiliss au laboratoire sont les hypochlorites, lthanol et les solutions de phnols. Loxyde dthylne et la -propionolactone sont parfois utiliss pour striliser des composants fragiles (ou les pices pour le premier) mais trs peu employes au laboratoire. Les solutions de phnols clairs sont utiliss la concentration de 1 5 %, leur stabilit est denviron 1 semaine. Lhypochlorite est une solution de chlore dans une base (hydroxyde de sodium ou de potassium) . La sanitation de surfaces peu contamines est ralisable avec des solutions 1000 ppm. Les solutions 2500 5000 ppm sont utilises pour le pot collecteur de pipettes et lames et celles 10 000 ppm pour les zones trs contamines. La stabilit des solutions est mauvaise et la concentration diminue trs rapidement (24 heures pour les solutions dilues). Les aldhydes comme le formaldhyde (gaz) ou le glutaraldhyde (liquide) sont des antimicrobiens trs actifs.
spores bactriennes
ACTIVITE CONTRE
bactries gram + bactries gram levures et moisissures mycobactries
INACTIVE PAR
TOXICITE
matriaux
dtergents
protines
phnols hypochlorites alcools formaldhyde glutaraldhyde iodophores ammoniums 4aires
+++ + +++ +++ +++ +
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
++ ++ +++ +++ ++ ++ -
++ +++ +++ +++ + -
+ +++ +++ + + +++ +++
++ + + + + +
+ + + + + +
C C _ A A,C +
+ + + + + + +
yeux
+ + + + +
poumons
eau dure
peau
+ + ++ + -
+++ +++
A = dtergent anionique , C = dtergent cationique Le formaldhyde est peu actif des tempratures infrieures 20C et requiert une humidit relative de 70%. Il est gnr partir de sa forme polymrise (paraformaldhyde) ou de sa solution (formol 40%). Les alcools (thanol et un degr moindre propanol) sont efficaces des concentrations voisines de 70 %. Ils ne sont pas efficaces contre les spores fongiques et sont rapidement inactivs par les protines. Leur efficacit est augmente par association avec du formol (10% final) ou avec de lhypochlorite de sodium (2000 ppm). Les ammoniums quaternaires sont des dtergents cationiques actifs des concentrations de lordre de 1%. Leur double action (microbicide et dtergente) associe pour la plupart des produits une odeur agrable les fait utiliser largement. Les iodophores (dtergents et iode) sont actifs avec 150 ppm diode. La solution alcoolique (50%) diode 1500 ppm a une activit sporicide trs nette.
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IV - L - 2 - Traitement et limination des matriels contamins
Il est fondamental que des matriels contamins ne saccumulent pas dans le laboratoire.
matriels contamins (ustensiles et milieux de culture incubs)
usage unique
r-utilisables
dsinfection
autoclave
dsinfection
autoclave
incinration
poubelle
lavage
Les pipettes ainsi que les fioles volumtriques en verre ne peuvent tre strilises sans risque de subir des dilatations irrversibles et doivent donc tre dsinfects ( flche en pointill)
QUELQUES ADRESSES UTILES POUR LA FOURNITURE DU MATERIEL ET DES MILIEUX UTILISES EN MICROBIOLOGIE ( ractualiser frquemment)
Institut Pasteur
36, rue du Docteur Roux 75724 Paris cedex 15 catalogue des souches : 25, rue du docteur Roux 75015 Paris Institut Mrieux - BioMrieux Marcy lEtoile 69752 Charbonnires les Bains 3, Bd R. Poincar, 92430 Marles la Coquette tl 01 47 41 79 33 OSI 141, rue de Javel 75739 Paris cedex 15 tl 01 45 54 26 28 5 - 9, rue Anquetil BP 8 94130 Nogent sur Marne tl 01 43 94 54 00 LWD/APD BP 307 78054 St Quentin en Yvelines cedex tl 01 30 12 70 00 Parc Euromdecine 20 Rue R. Koch 34193 Montpellier cedex tl 04 67 10 59 00 BP 36,10 rue de la Durance, 67023 Strasbourg tl 03 88 65 80 20 3 rue Danton, 92245 Malakoff cedex tl 01 49 65 51 51 BP 54 Route de Dol, 35270 Combourg tl 02 99 73 11 35 54 rue R. Salengro, 94126 Fontenay sous Bois tl 01 45 14 87 55 11 avenue du 1er mai 91127 Palaiseau cedex tl 01 69 19 21 00 La Balme les Grottes 38390 Montalieu-Vercieu.
Diagnostic Pasteur Produits DIFCO Socit MERCK Millipore Labover SA Poly Labo Laboratoires 3M Sant AES Laboratoire Prolabo Sartorius ASTEC API System
Les dcrets rglementant les conditions danalyse et fixant les normes microbiologiques par aliment sont disponibles au service des textes officiels, 26, rue Desaix, 75732 PARIS 15. Les normes de lAssociation Franaise de normalisation (AFNOR) sont disponibles auprs de lAFNOR, Tour Europe, 92049 PARIS LA DEFENSE cedex (01 42 91 55 55).
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Flore arobie msophile 30 C
Streptocoques fcaux
Coliformes fcaux (44 C)
Indolognes ou E. coli
PRODUITS
Eau de consommation Lait cru Lait pasteuris conditionn Lait en poudre LAIT & PRODUITS LAITIERS Lait concentr Lait concentr sucr Laits ferments Yaourt-kfir Laits glifis et laits emprsurs Fromages frais pasteuriss crmes pasteurises glaces et crmes glaces Beurre Lait strilis casines et casinates
viande rfrigre ou congele Carcasses coupes 1/2 gros pices condition. sous vide ou non portions unitaires conditionnes
10 ( 37c ) 100 (22) 100 3.10 5.10 5 3.10

4 4 4
Coliformes totaux
0 pour 0 pour 100 ml 100 ml 100 (In) 1
0 pour 50 ml
0 pour 20 ml 50 10 0 pour 250 ml
Salmonella
Levures et moisissures 10 10 0
0 0 0 0 0
100 5
1 10 1 1 1 1 1
1 (ind) 1
1 pour 100 ml 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g
10 3
10 10
10 10 10
3.10 3.10 10
4 5
10 100 vrac 100 25 0 0 dans 0,1 g
0 3.10
4 2 4
5.10 5.10
2 100 300 100 10

3
VIANDES & PRODUITS CARNES
2 100 100 100 5.10 5.10

2 2
10 30 30 50 50
hache d'avance 5 5.10 ou demande
viandes transformes
plats cuisins l'avance charcuterie crue sche salaisons crues sales / sches Charcuterie cuite jambon cuit entier
5.10
10 100 10
3
0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g
3.10 10
4
10 10
10 0 pour 1g
entrobac
OEUFS & DERIVES
ovoproduits pasteuriss blanc d'oeuf non pasteuris
10
10
0 pour 25 g 0 pour 100 30 25 g 0 pour 0 pour 0 pour 1g 1g 25 g 0 pour 100 25 g 0 pour 25 g
pathognes 0
GERMES
Anarobies sulfito-rducteurs
Staphylococcus
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Flore arobie msophile 30 C
Coliformes fcaux (44 C)
Streptocoques fcaux
GERMES
Indolognes ou E. coli
Anarobies sulfito-rducteurs
Staphylococcus
Salmonella
PRODUITS
volaille entire , rfri-gre ou congele rtis ,escalopes crus pans ou non rtis cuits viande crue (VSM) viande cuite (VSM)
5.10 3.10 10
3 5
10 10
5.10 10
2 3
30 10 10 30 10 2 10
2
6 5
5.10 10 10 1
5
10 10 10 10
3.10 10 10
2 2 2 2
0 pour 25 g 0 pour 1g 0 pour 25 g 0 pour 1g 0 pour 25 g 0 pour 25 g 0 pour 25 g
VIANDE DE VOLAILLE
poisson tranch , filet pan (frais ou rfrigr) poisson tranch , filet pan (congel)
PRODUITS DE LA MER
prparation base de chair de poisson crustacs cuits , rfrigrs crustacs cuits ou non (congels) crevette dcortique cuite rfrigre coquillages bivalves prsents vivants semi-conser -ve non pasteurise lgumes surgels lgumes surgels non blanchis potages deshydrats anchois saumon fum
5.10 10
5
10 1 1 10 3
10 10
3 5
25 pour 100 ml
10 10
3 4 5 6 5 5 3
0 pour 1g 0 pour 1g 3.10

3 3
0 pour 1g 0 pour 1g 15 15 10 1 0 pour 1g
0 pour 25 g 0 pour 2 25 g 0 pour 2 25 g 2 0 pour 10 10 25 g 0 pour 25 ml 0 pour 0 pour 1g 25 g 10 0 pour 0 pour 1g 25 g 0 pour 10 25 g 0 pour 10 25 g 0 pour 30 25 g 10 0 pour 25 g
moisissures 5.10
2 3 3
Coliformes totaux
FRUITS & LEGUMES
5.10 1,5.10 3.10 3.10 10
10 100 100 100
10
5.10 10 10
2.10
Levures
3
1,5.10
3 3
PATISSERIES ET CREMES PATISSIERES SEMI-CONSERVES PASTEURISEES
0 pour 1g
0 pour 0 pour 0 pour 1g 1g 25 g
Page 117
TABLES DES MATIERES

Page 2 3 4 5 5 8 8 9 10 11 11 12 15 16 16 16 16 17 17 17 18 18 18 18 19 19 21 21 22 22 23 24 24 25 25 25 25 28 28 28 29 31 31 32 32 33 34
A B C D
GENERALITES
- Intrt de la microbiologie alimentaire - Les risques au laboratoire de microbiologie - Le laboratoire - Matriel dquipement du laboratoire danalyse microbiologique D - 1 - Systmes de strilisation / dsinfection et zones striles D - 2 - Matriels dincubation et de prparation des milieux D - 3 - Prparation des chantillons et culture microbienne D - 4 - Microscopie E - Techniques gnrales E - 1 - Prlvements a) Echantillonnage 1) Mthode dchantillonnage prconise par lICMSF 2) Cas particulier des conserves 3) Mthode dchantillonnage pour rechercher un nombre peu lev de microorganismes 3) Choix des chantillons b) Frquence des prlvements c) Conditions du prlvement 1) Prlvement en surface 2) Prlvement de produits liquides 3) Prlvement de produits solides E - 2 - Traitement de lchantillon a) Transfert au laboratoire b) Prparation de lchantillon E - 3 - Les diluants E - 4 - La revivification a) revivification en milieu liquide b) revivification sur milieu solide E - 5 - Techniques de dilution E - 6 - Principales techniques de numration a) Mthodes gnrales directes b) Mthodes gnrales indirectes E - 7 - Numration en milieu solide UFC a) Technique de numration dans la masse de la glose b) Technique de numration en surface E - 8 - Numration en milieu liquide UFT a) Fractionnement de grands volumes liquides b) Mthode de Mac Grady E - 9 - Numration par filtration E - 10 - Interprtation des numrations a) Calcul de la charge microbienne du produit b) Numration en milieu solide c) Numration en milieu liquide 1) Numration avec une seule dilution dans n tubes 2) Numration avec plusieurs dilutions dcimales de n tubes d) Exemple dexploitation statistique de rsultats exprimentaux e) Conclusions E - 11 - Le contrle de conformit par rapport une norme II A B C D E F G GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE Clostridium botulinum Salmonella sp Shigella sp Escherichia coli entropathogne Les entrobactries Staphylococcus aureus et lentroxine staphylococcique Vibrio
36 36 36 37 37 37 38
Page 118
H I J K L MN O -
1 - Vibrio cholerae 2 - Vibrio parahaemolyticus 3 - Vibrio sp Brucella Clostridium perfringens Bacillus cereus Streptococcus sp Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni Yersinia enterocolytica Levures et moisissures
38 38 38 39 39 39 39
III - PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION DES MICROORGANISMES DANS LES ALIMENTS A B La numration des germes totaux Recherche dune contamination fcale 1 - La colimtrie a) dnombrement en milieu liquide b) Dnombrement en milieu solide c) Identification dEscherichia coli d) colimtrie par filtration f) colimtrie par le systme Ptrifilm g) Rsultats 2 - Numration des streptocoques du groupe D de Lancefield a) Numration en milieu liquide b) Numration en milieu solide c) Isolement Recherche et numration des anarobies sulfito rducteurs 1 - Dnombrement des spores et des formes vgtatives 2 - Numration des spores Recherche et dnombrement de Clostridium perfringens 1 - Milieux de numration 2 - Tests de confirmation 3 - Milieu de sporulation 4 - Numration de C. perfringens par titrage de l-toxine Recherche et numration de Staphylococcus aureus 1 - Enrichissiment 2 - Numration sur milieux solides 3 - Numration en milieu liquide 4 - Identification Recherche de Salmonella (et de Shigella) 1 - Prenrichissement 2 - Enrichissement 3 - Isolement 4 - Identification biochimique 5 - Srotypage 6 - Autres mthodes de recherche des Salmonella 1 - Limmunofluorescence 2 - Limmunoenzymologie 3 - Lhybridation ADN-ADN 4 - Autres mthodes 6 - Recherche de Shigella Recherche indirecte de Brucella Recherche et/ou numration des Vibrio 1 - Vibrio cholerae 2 - Vibrio parahaemolyticus Recherche et numration de Bacillus cereus et de Bacillus sp. Recherche de Mycobacterium tuberculosis Recherche de Yersinia enterocolytica Recherche de Campylobacter jejuni Recherche de Listeria monocytogenes Numration des levures et moisissures Recherche des bactriophages fcaux 40 43 43 44 46 47 47 48 48 48 49 49 50 52 52 53 53 55 55 56 56 57 57 58 59 60 62 62 63 64 66 66 68 68 68 70 71 71 72 72 72 72 75 77 77 78 78 81 82
C D -
E -
F -
G H I J K L M N O -
Page 119
P Q -
Recherche de la toxine botulinique Les maladies parasitaires
82 83
IV - ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES A B Prsentation des rsultats 84 Analyse des eaux de consommation 86 1 - Dfinition dune eau potable 86 2 - Divers types danalyses deau 87 3 - Prlvements 88 4 - Analyse microbiologique 90 - Analyse du lait et des produits laitiers 92 1 - Divers types de lait 94 2 - Prlvement des chantillons 94 3 - Analyse microbiologique 94 4 - Analyses chimiques et biochimiques associes lanalyse microbiologique 96 a) Contrle de la propret b) Recherche dactivits enzymatiques c) Dtermination de lacidit d) Test au teepol e) Contrle indirect du degr de chauffage f) Recherche dantibiotiques 5 - Analyse du lait cru 99 6 - Analyse du lait pasteuris 100 7 - Analyse du lait strilis 100 8 - Analyse du lait en poudre 100 9 - Analyse du lait concentr sucr 101 10 - Analyse de laits ferments 101 11 - Analyse des laits glifis et des laits emprsurs aromatiss 101 12 - Analyse des fromages (frais , pasteuriss) 101 13 - Analyse du beurre 102 14 - Analyse des glaces et crmes glaces 102 15 - Analyse des crmes de consommation courante 102 16 - analyse des casines et casinates 102 - Analyse des viandes et des produits carns 103 1 - Flores microbiennes normales et pathognes des viandes 103 2 - Evolution des flores microbiennes des viandes et qualit 104 3 - Analyse de plats cuisins lavance et de viandes cuites 105 4 - Analyse de la viande frache ou hache 105 5 - Analyse de la charcuterie crue 105 6 - Analyse de la charcuterie cuite 105 7 - Analyse des semi conserves 106 - Analyse des coquillages 106 - Analyse dune volaille 107 - Analyse dun sucre 107 - Analyse des conserves 108 - Analyse de produits congels 110 - Analyse daliment souponn dtre lorigine dune maladie 110 - Analyse microbiologique de lenvironnement dans un atelier 111 - Strilisation , dsinfection et traitement des matriels contamins 102 1 - types et usages de quelques dsinfectants 112 2 - Traitement et limination des matriels contamins 114 114 115 117
E F G H I J K L
ADRESSES UTILES CRITERES DE QUALITE DE QUELQUES PRODUITS ALIMENTAIRES TABLE DES MATIERES

Analyses Biologiques

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Contrle microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech Dpartement STIA.

ACADEMIE DE MONTPELLIER UNIVERSITE MONTPELLIER II - SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC -----

Sciences et Technologies des Industries Alimentaires

Professeur Jean-Louis CUQ

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LABORATOIRE Salle de manipulations

matriels contamins Stockage des milieux et matriels striles

Verrerie sale non contamine

Autoclavage (121 , 20 mn) C

strilisation - autoclave - filtration

prparation des milieux

Cotonnage Dchet poubelle

Strilisation four Pasteur (180 10 60 mn) c,

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autoclave prparation de milieux tuves 25 -30 (37)-44 C hottes flux laminaires

figure 1 . Schma type dun laboratoire danalyse microbiologique

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HOTTES A FLUX LAMINAIRE horizontal de classe I Protrection du manipulateur pas du produit

figure 3 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du manipulateur

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HOTTE DE CLASSE II flux vertical Protection du produit et du manipulateur

HOTTE DE CLASSE III

igure 5. Hotte flux laminaire de classe III

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broyeur type VIRTIS

homognisateur type Stomacher

figure 6 . Schma des divers systmes de broyage / homognisation

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rpartition des chantillons

figure 7. Distribution des chantillons daprs lICMSF

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pas d' influence sur le risque

risque pour la sant

cas n4 3 classes n = 5 c = 3 cas n7 3 classes n = 5 c = 2 cas n 10 2 classes n = 5 c = 0 cas n13 2 classes n = 15 c = 0

cas n 14 cas n 15 2 classes n = 30 c = 0 2 classes n = 60 c = 0

tableau II . Plan dchantillonnage pour Salmonella dans du lait en poudre

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RESUME DUTILISATION DUN PLAN A TROIS CLASSES

Exemples de plan dchantillonnage 3 classes

2) Cas particulier des conserves

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E - 1 - b. frquence des prlvements

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2) Prlvement de produits liquides

3) Prlvement de produits solides

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E . 2. Traitement de lchantillon E - 2 - a. Transfert de lchantillon au laboratoire

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E - 4 - a. Revivification en milieu liquide

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temps d' incubation temps de latence + temps de doublement

homognat en milieu de revivification

temps d' incubation >> temps de latence + temps de doublement

recherche sur milieu slectif

homognat en milieu de revivification

milieu slectif (incubation)

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E - 4 - b. Revivification sur milieu solide