n3

Bulletin dinform
ation international pour les partenaires pharm
aceu
tiq
u
e
s d
e
b
io
M

rie
u
x
.
M
ai 20
0
6

Bienvenue pour ce troisime numro de
bioPharma, le bulletin d'information inter-
national pour les professionnels de
l'assurance qualit dans les industries
pharmaceutiques, biotechnologiques et
cosmtiques. Avec ce bulletin, nous
souhaitons vous offrir un forum qui vous
permettra dtudier les questions lies
l'assurance qualit dans un environnement
de plus en plus complexe.
Dans ce numro, nous traitons des sujets lis
la production pharmaceutique et au niveau
lev dexpertise et de qualit que nous devons
tous avoir pour protger la sant publique.
Comme vous, nous travaillons constamment
lamlioration de la qualit de nos produits et
l'innovation devient capitale dans le domaine
de la microbiologie. Dans ce numro, nous vous
prsenterons deux innovations majeures : l'une
rsulte d'un partenariat avec la socit Copan
spa, pour l'amlioration du contrle denviron-
nement de producti on avec un nouveau
dispositif d'couvillonnage rvolutionnaire; l'autre
concerne la biologie molculaire, nous prsen-
tons nos nouvelles solutions automatises pour
l'extraction d'ADN et ARN partir d'chantillons,
permettant deffectuer ensuite des tests de
biologie molculaire sur un micro-organisme.
Lorsque vous lirez ces pages, pensez aux sujets que
vous souhaiteriez voir dvelopps dans les futurs
numros de bioPharma et faites-nous en part.
chaque dition, du Japon aux tats-Unis en passant
par l'Europe, des lecteurs comme vous partagent
leurs expriences des technologies innovantes et
expliquent comment les solutions quils ont choisies
pour le laboratoire contribuent amliorer leur
approche PAT.
Vos ractions et commentaires permettront toujours
damliorer bioPharma et en feront une ressource
utile pour vous-mme et vos
partenaires industriels.
ditorial enjeux
bi Pharma bi Pharma
Alexandre Mrieux
Corporate Vice-Prsident
Microbiologie industrielle
INTERVIEW
NOM: GEERT VERDONK
FONCTION: RESPONSABLE DE SECTION -
LABORATOIRE DE CONTRLE
MICROBIOLOGIQUE
SOCIT: ORGANON
PAYS: PAYS-BAS
bioPharma: Pouvez-vous vous prsenter et
prsenter votre socit nos lecteurs ?
Geert Verdonk: Je travaille chez Organon, labora-
toire pharmaceutique nerlandais prsent dans le
monde entier. Je suis l'un des respon-
sables de section du laboratoire de
contrle microbiologique et je suis
responsable de la slection des nouvelles
mthodes microbiologiques et de leur
validation sur nos process.
bioPharma: pourquoi vous intressez-
vous aux mthodes rapides?
G. V.: Nous avons besoin de mthodes
rapides pour le contrle en cours de
fabrication. Le dpannage des process de production
biopharmaceutiques complexes est un point capital ;
si l'on souhaite avoir des informations et des actions
correctives pendant le process, des rsultats microbio-
logiques rapides sont indispensables, d'o notre
intrt pour des mthodes rapides.
bioPharma: Comment votre socit s'est-elle
intresse aux mthodes rapides?
G. V. : Ces dernires annes, les rglementations ont
assoupli leur position vis--vis des mthodes rapides
et elles sont de plus en plus prsentes dans les
discussions, dans le monde entier (par exemple
congrs, articles). Je pense que la runion de l'EDQM
Copenhague, en 2003, a t rellement le facteur
dclenchant pour notre direction. Nous avons ralis
qu'il y avait une opportunit pour nous et nous avons
commenc rflchir la manire dont ces nouvel-
les mthodes pouvaient nous tre bnfiques.
bioPharma: Donc, une fois que vous avez identifi
un intrt en faveur des mthodes rapides,
comment avez-vous commenc? Avez-vous des
recommandations pour nos lecteurs?
G. V. : Selon moi, le plus important est de crer une
quipe au sein de la socit. Vous devez impliquer
le personnel de la production, de l'AQ, des achats,
de l'enregistrement et, bien sr, le laboratoire de
microbiologie. Une fois l'quipe constitue, il est
possible d'effectuer une analyse dtaille de tous les
processus pour identifier la(les) partie(s) critique(s)
du processus o des rsultats microbiologiques
rapides pourraient prsenter un intrt maximal. Cette
analyse doit tre ralise dans l'atelier de production,
avec les experts de la production, car ce
sont eux qui connaissent le mieux les
contraintes du process.
bioPharma: Quel est l'lment de
motivation cl, pour un laboratoire
pharmaceutique, dans la mise en
uvre d'une mthode rapide?
G. V. : pour nous, la matrise du
processus est rellement le facteur
dclenchant. Organon fabrique quatre
types de produits diffrents: des comprims, des
produits spciaux comme des implants contra-
ceptifs, des produits injectables et des produits
biotechnologiques (qui, dans la majorit des cas, sont
des produits injectables). La matrise des produits
biotechnologiques tait notre objectif principal. Le
process en lui-mme est trs complexe: lorsque
vous savez que, dans l'industrie mondiale des
biotechnologies, les taux de contamination peuvent
atteindre 30 % des lots, vous vous rendez compte
que l'amlioration du processus est un aspect trs
important. Bien entendu, la motivation suivante est
la baisse des cots mais c'est une consquence
vidente de ce que j'ai mentionn prcdemment.
Imaginez les conomies ralisables si vous tes
capable d'empcher la contamination d'un bio-
racteur de 10000 litres rempli de milieux de culture
d'une valeur de l'ordre de 50 par litre!
bioPharma: il existe sur le march plusieurs
solutions pour la microbiologie rapide.
Comment en choisissez-vous une en particulier?
G. V. : le paramtre numro un est l'chantillon. Vous
devez dfinir prcisment la nature de votre chan-
tillon: ses proprits, son mode de prlvement et
la contamination prvue. Une fois l'chantillon dfini,
vous pouvez rechercher la meilleure technologie.
Par exemple, si vous avez un produit cellulaire ou un
produit visqueux, les technologies faisant appel la
filtration ne sont pas particulirement bien adaptes,
l'inverse, si vous avez un chantillon trs riche en
ATP, l'ATPmtrie n'est pas pertinente. Une fois la
technologie identifie, vous pouvez slectionner les
diffrents instruments et enfin, le dernier point consiste
choisir le bon fournisseur.
bioPharma: En votre qualit d'expert des
mthodes rapides, vous avez essay et travaill
avec plusieurs mthodes diffrentes. Comment
voyez-vous l'avenir de la microbiologie rapide
dans l'industrie pharmaceutique?
G. V. : Au cours des cinq prochaines annes, je
pense qu'il y aura une solution de remplacement
rapide pour chaque mthode classique: soit comme
solution de secours soit comme solution de rempla-
cement. L'norme difficult laquelle nous sommes
confronts consiste convaincre les microbiologistes
de rflchir des solutions en dehors du cadre
habituel. Lorsque vous utilisez une nouvelle techno-
logie, vous devez avoir de nouveaux critres. Tout est
relatif et dpend de la mthode choisie. Cela est
galement vrai pour certaines mthodes actuelles,
par exemple, dans un test de strilit, aprs 2 semaines
d'incubation de TSB, sil n'y a aucune croissance, le
produit est ensuite considr comme strile mais,
si la mthode consistait incuber TSB pendant
4 semaines au lieu de 2, une croissance aurait peut-
tre t observe et le lot aurait t rejet. Avec les
mthodes rapides, il faut commencer penser en
termes de seuil ou d'units relatives et ne pas essayer
de tout ramener aux classiques UFC. Je suis persuad
que nous allons atteindre cet objectif, nous devons
simplement collecter davantage de donnes!
Une nouvelle vision pour la microbiologie pharmaceutique*
Geert Verdonk
* Traduit de langlais sous la responsabilit de bioMrieux.
innovation
Copan et bioMrieux signent un accord exclusif
de distribution mondiale
avis de lexpert
INTERVIEW*
PERSONNE INTERVIEWE: MICHELA FERRARI
FONCTION: BUSINESS DEVELOPMENT MANAGER
SOCIT: COPAN S.P.A.
PAYS: ITALIE
bioPharma: Madame Ferrari, pouvez-vous nous
prsenter l'historique de votre socit, COPAN?
Michela Ferrari : Copan a t cr en 1979,
comme fabricant de produits de laboratoire
jetables en plastique, puis s'est lanc peu aprs
dans la R&D et la fabrication de dispositifs de
recueil et de transport d'chantillons microbiolo-
giques. Notre socit ralise toutes les tapes,
de la R&D aux applications techniques et la
production, notre objectif consiste amliorer la
qualit de la phase pr-laboratoire en utilisant
une approche quantitative de la collecte d'chan-
tillons. Copan est le leader mondial de la
production d'couvillons de collecte et de
conservation: nous possdons une usine ultra-
moderne de 9000 mtres carrs Brescia qui
produit chaque anne environ
150 millions d'couvillons
de transport, 400 millions
de pipettes de transfert et
250 millions de lances
d'inoculation en plastique.
bioPharma : Vous avez
rcemment dvelopp une
technologie rvolutionnaire
pour la production d'couvillons.
Pouvez-vous nous expliquer leur
mode de fonctionnement ?
M. F.: Les couvillons classiques,
fabriqus en coton, en Rayon ou en Dacron,
sont fabriqus avec la mme technologie que
les cotons-tiges classiques pour les oreilles:
plusieurs kilomtres de microfibres sont enrouls
autour de l'extrmit de la tige en plastique pour
crer la tte de l'couvillon. Notre innovation a
consist appliquer une technologie appele
flocage pour produire des couvillons de Nylon
floqu (brevet international
Copan). Ce procd rvolution-
naire implique la projection de
microfibres de Nylon sur une
extrmit en plastique colle,
ce qui cre un revtement
mince comme du velours sur
la tte de l'couvillon. C'est ce
revtement qui confre des
performances trs suprieures
celles d'couvillons classiques.
bioPharma: Comment en tes-
vous venu dvelopper un
produit innovant de ce type?
M. F. : Tous les investissements de dveloppe-
ment et de production ont t raliss par
Copan aprs des annes de recherche destines
amliorer les performances des couvillons
de collecte, en particulier en termes de capacit
de production. Nous avons galement form un
partenariat avec lindustrie pharmaceutique pour
dfinir ses exigences particulires, afin d'tre
srs que nous allions dans la bonne direction et
que le produit final appel QUANTISWAB
apportait un avantage maximal au client.
bioPharma: Quel est lintrt de ce produit pour
l'industrie pharmaceutique?
M. F. : La technologie de flocage avec du
Nylon permet, pour la premire fois, d'avoir un
contrle quantitatif de l'environnement, comme
avec des botes de contact. Les indications
qualitatives de contamination sont insuffisantes
dans les environnements pharmaceutiques o
il existe des niveaux d'alerte et d'action. Il s'agit
d'une vritable perce et diffrentes validations
et protocoles montrent que nos couvillons de
Nylon floqu sont plus performants et
restituent 90 % de l'chantillon collect, alors
que les couvillons classiques en Dacron
ou en Rayon torsad n'en restituent qu'entre
15 et 20 %.
D
r
Gilberto Dalmaso, GlaxoSmithKline S.p.A.,
Parme, Italie.
> RSUM
Les couvillons sont utiliss grande chelle dans
les programmes de contrle microbiologique de
l'environnement. L'objectif de cette tude
tait la validation des performances d'un nouveau
type de QUANTISWAB en Nylon floqu par
rapport des couvillons classiques en Rayon.
L'tude montre que les couvillons classiques
ont un faible taux de rcupration de 20 % des
contaminants des surfaces. En raison de sa
capillarit hydraulique exceptionnelle, le
QUANTISWAB en Nylon floqu prsente une
amlioration du pourcentage de rcupration
des micro-organismes, comprise entre 20 % et
60 %, par rapport aux couvillons classiques
en Rayon, et possde une capacit restituer
plus de 90 % des micro-organismes recueillis.
Ces observations ont t confirmes par une
valuation de l'chantillonnage des surfaces de
l'environnement des zones de production de
produits pharmaceutiques.
> MATRIEL ET MTHODES
Inoculum: 100 l de chaque suspension ont t
directement transfrs sur une bote de glose
trypcase soja, incubs 32 2 C pendant
5 jours et dnombrs comme rfrence.
100 l de suspension bactrienne frache
contenant entre 50 et 150 UFC (inoculum)
ont t pulvriss sur une surface en acier
inoxydable. Un panel de micro-organismes a
t test, dont des souches de la pharmacope:
S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, B. subtilis
(spore), C. albicans, S. abony, A. niger
(spore), M. luteus (isol de l'environnement),
B. parabrevis (isol de l'environnement).
Temps d'analyse: une limite de temps de
3 minutes a t observe entre la pulvrisa-
tion, l'couvillonnage et l'talement sur botes,
afin de minimiser la mort des micro-organismes.
Croissance des micro-organismes: une fois
l'inoculum pulvris et chantillonn avec le
QUANTISWAB ou l'couvillon en Rayon, les
couvillons ont t tals sur une glose trypcase
soja de 90 mm et incubs 32 2 C pendant
5 jours. Tous les tests ont t raliss en double
et sur trois lots diffrents d'couvillons.
Trois types d'expriences ont t raliss pour
valider la capacit de rcupration et de restitu-
tion des couvillons. Par la rcupration, nous
dfinissons la capacit de l'couvillon collecter
et rcuprer des micro-organismes viables dune
surface. La capacit de restitution est la capacit
de l'couvillon restituer un chantillon collect
dans une solution ou un milieu.
> RSULTATS ET DISCUSSION
1- Capacit de rcupration:
Cette exprience montre que la rcupration des
micro-organismes obtenus avec les couvillons
floqus est de l'ordre de 60 %, alors que la
rcupration avec les couvillons en Rayon est
de l'ordre de 20 % (cf. figure 1).
2- Capacit maximale de rcupration:
La rtention de l'chantillon par l'couvillon a ga-
lement t tudie. Aprs talement de l'cou-
villon sur une bote, l'extrmit de l'couvillon
a t insre dans un tube contenant 10 ml de
srum physiologique strile et agite au vortex
pendant 30 secondes, afin de rcuprer tous les
micro-organismes qui auraient pu tre retenus
dans l'couvillon aprs talement sur la bote. La
solution extraite a t filtre sur un filtre de
0,2 m, la membrane a t place sur une
glose trypcase soja et incube pendant 5 jours
30-35 C. la fin de la priode d'incubation,
les colonies ont t dnombres afin d'valuer la
rcupration supplmentaire.
La rcupration supplmentaire observe avec
QUANTISWAB aprs talement sur une bote tait,
en moyenne, infrieure 4 %, ce qui montre que
la plupart des bactries avaient dj t libres par
l'couvillon sur la boite. En revanche, la rcupration
supplmentaire avec les couvillons standards en
Rayon aprs talement sur une bote n'tait que
de l'ordre de 0,3 %, ce qui indique que les micro-
organismes restants emprisonns dans la matrice
de fibres de Rayon pouvaient ne pas tre restitus
aprs agitation des couvillons au vortex.
3- Capacit de restitution:
Une hypothse serait que les couvillons en
Rayon ne soient pas efficaces pour capturer des
organismes sur une surface ou que les couvil-
lons en Rayon ne soient pas en mesure de
restituer les organismes qui ont t capturs par
l'couvillon. Une troisime exprience a donc t
ralise afin de vrifier chacune de ces hypothses.
100 l de chaque inoculum de dpart ont t
inoculs directement sur l'couvillon puis tals
directement sur des botes. La capacit de resti-
tution est en moyenne suprieure 90 % pour
le QUANTISWAB, contre 20 % pour les couvil-
lons en Rayon, ce qui laisse penser que
les couvillons classiques peuvent absorber des
micro-organismes mais ont des difficults
restituer les micro-organismes viables (cf. figure 2).
> CONCLUSION
Cette tude dmontre que:
- le nouvel couvillon QUANTI SWAB en
Nylon floqu est capable de rcuprer 60 %
des micro-organismes de surface, contre 20 %
pour les couvillons classiques en Rayon;
- les rsultats des tests de restitution mettent en
vidence une trs faible rtention des chantil-
lons pour lcouvillon QUANTISWAB, et donc
une capacit de rcupration des couvillons trs
reproductible,
- QUANTISWAB fait apparatre une restitution
des chantillons de plus de 90 % d'un
inoculumconnu par le test d'inoculation directe,
contre 20 % pour les couvillons en Rayon.
Le contrle microbiologique denvironnement
de surfaces avec le nouvel couvillon floqu,
est une mthode valide et qui est fortement
recommande. Elle amliore la rcupration
des micro-organismes, en particulier dans
les zones faible niveau de contamination
(zones de production classes).
Validation du nouveau QUANTISWAB en Nylon floqu irradi pour la rcupration
quantitative des micro-organismes dans les environnements critiques de salles propres*
couvillon de Nylon floqu
*
C
e
t
t
e

v
a
lu
a
t
io
n

a

p
r

s
e
n
t

e

a
u

P
D
A

2
0
0
7
-
M
ila
n

(
I
t
a
lie
)
.
56,49%
20,33%
53,94%
24,98%
55,80%
19,70%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
Srie 3 Srie 2 Srie 1
QUANTISWAB COUVILLONS TRADITIONNELS
Figure 1: Test de capacit de rcupration avec
chantillonnage classique.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
S. aureus C. albican A. niger E. coli P. aeruginosa B. subtili S. abony M. luteus B. parabrevis
QUANTISWAB COUVILLONS TRADITIONNELS
89,83% 89,52% 92,41% 93,98% 92,39% 93,02% 90,82% 88,98% 94,44%
20,72% 23,33% 22,39% 19,80% 18,84% 21,43% 20,34% 21,01% 22,58%
Figure 2: Test de capacit de restitution des couvillons.
*

T
r
a
d
u
it

d
e

la
n
g
la
is

s
o
u
s

la

r
e
s
p
o
n
s
a
b
ilit

d
e

b
io
M

r
ie
u
x
.
Cet accord permet bioMrieux de commercia-
liser un dispositif d'chantillonnage innovant
avec la technologie dveloppe par Copan. Le
dispositif d'chantillonnage permet deffectuer un
dnombrement quantitatif prcis l'aide d'un cou-
villon dans le contrle denvironnement. L'cou-
villon peut tre utilis avec les milieux prts
l'emploi de bioMrieux et est destin une utili-
sation par l'industrie pharmaceutique, dans les
salles propres et environnements contrls de la
fabrication aseptique. Par cet accord, bioMrieux
possde dsormais une gamme importante de
produits pour le contrle de l'environnement,
dont l'chantillonneur d'air airIDEAL

3P
TM
et une
gamme complte de milieux prts l'emploi.
actualits
Symposium bioMrieux Florence (Italie)
Le 23 novembre 2006, un symposium consacr l'innovation technologique dans les
contrles microbiologiques de la production pharmaceutique s'est tenu Florence.
Une centaine de personnes reprsentant plus de soixante-dix laboratoires pharmaceutiques
ont particip ce symposium. Les sujets, la qualit et les connaissances des prsentateurs
ainsi que la qualit des questions, associs l'ambiance du site, ont contribu la russite
exceptionnelle de cette manifestation. Un des participants du symposium a fait le commen-
taire suivant : ce symposium constitue une tape importante dans l'histoire des confrences
et des manifestations pharmaceutiques.
L'volution de la pharmacope a fait l'objet de discussions d'un point de vue global. Des
reprsentants nationaux et internationaux se sont concentrs sur le dtail de la situation
actuelle ainsi quaux perspectives venir.
Le sujet dintgration du process analytique a t au cur de la deuxime partie du
symposium. VITEK

2 Compact
TM
, airIDEAL

3P
TM
et les solutions Count-Tact
TM
3P
TM
et Unidatrix
ont apport une preuve concrte de la force dune solution globale bioMrieux destine au
laboratoire de microbiologie pharmaceutique moderne.
Dans la partie finale du symposium, les technologies PAT et les solutions de biologie mol-
culaire de bioMrieux ont captiv le public et ont donn un aperu des technologies futures.
Symposium EDQM Strasbourg (France)
L'European Directorate for the Quality of Medicine (EDQM) a tenu un symposium internatio-
nal en octobre 2006 Strasbourg. Ce symposium a port sur les nouveaux chapitres de
microbiologie publis par la pharmacope europenne. Deux thmes essentiels ont t abords
par les intervenants: les textes harmoniss relatifs au contrle des produits pharmaceutiques
non striles ont t dbattus la premire journe, alors que l'importance des mthodes
microbiologiques alternatives dans le contrle microbien des produits pharmaceutiques tait
prsente lors de la deuxime journe. Parmi les diffrentes prsentations internationales,
deux ont port sur BacT/ALERT

, mthode alternative de contrle rapide de la strilit

des produits biopharmaceutiques. Pendant ce temps, le docteur Jonquires (bioMrieux) a
effectu une prsentation sur l'approche validation pour les fabricants de milieux de culture
pour atteindre les critres de performances fixs par les nouveaux chapitres harmoniss
(2.6.12 et 2.6.13 de la pharmacope europenne). Plus de 200 personnes venues du
monde entier ont assist ce symposium, pour des discussions extrmement fructueuses.
Toutes les prsentations sont disponibles sur le site: http://www.edqm.eu/site/page_601.php
Confrence PharMIG 2006
En novembre 2006, des microbiologistes pharma-
ceutiques du Royaume Uni et d'Irlande ont particip
la confrence annuelle de PharMIG qui s'est tenue
l'htel Nottingham Belfry. Cette confrence a runi
prs de 100 dlgus et 24 exposants.
Pour la troisime anne conscutive, bioMrieux a
organis une runion de groupes d'utilisateurs de VITEK

2 Compact
TM
la veille du dbut de
la confrence. Un total de quarante utilisateurs actuels et potentiels a t invit une soire
de dgustation Colwick Hall, autrefois demeure familiale de Lord Byron.
Bien entendu, la runion des groupes d'utilisateurs s'est galement concentre sur des sujets
trs importants pour un laboratoire de microbiologie qui effectue des tests d'identification.
Jeffrey Anthony de LGC Promochem a prsent les techniques utilises par lATCC

pour la
conservation et la caractrisation des cultures microbiennes. Jeffrey a, par ailleurs, donn des
conseils utiles sur le maintien des cultures dans les laboratoires de microbiologie de routine.
Cindy Somogye (Corporate Product Manager de bioMrieux pour l'identification) a prsent
les donnes de performances de la prochaine carte d'identification pour les anarobies qui
comprend un ensemble de corynformes dans la liste des espces dtectes.
Chris Wells (directeur des ventes et du marketing de bioMrieux pour le Royaume-Uni) a
cltur la srie de prsentations en donnant une vue globale des nouvelles fonctions qui
seront mises en uvre dans les futures mises jour du logiciel en2007.
Les participants pendant un expos
Des progrs technologiques rcents, en parti-
culier dans le domaine de la biologie molcu-
laire, ont permis des avances significatives
dans la dtection des microbes. La dtection
molculaire ncessite l'extraction d'acides
nucliques de nombreux types diffrents
d'chantillons. La qualit des acides nucliques
extraits peut avoir des rpercussions impor-
tantes sur la qualit des rsultats de test
obtenus. Les inhibiteurs de la raction
d'amplification prsents dans l'chantillon
doivent tre totalement limins avant l'ampli-
fication. Par consquent, les performances de
l'tape d'extraction sont essentielles au succs
de la dtection molculaire. Dans le mme
temps, l'extraction nuclique est une tche qui
comporte des tapes rptitives et possde
une faible valeur ajoute. Par consquent,
l'extraction est la premire tape qui doit tre
aborde pour contribuer amliorer la produc-
tivit du laboratoire de biologie molculaire.
bioMrieux a dvelopp deux solutions
destines augmenter les performances et
la productivit de l'extraction des acides
nucliques et rpondre aux diffrents
besoins de solutions automatises. Nucli-
SENS easyMAG

est un systme entirement

automatis pour l'extraction/la purification des
acides nucliques, alors que NucliSENS
miniMAG

est une solution semi-automatique.

Atteindre les performances
Les solutions bioMrieux reposent sur notre
technologie brevete BOOM

. Dveloppe
dans les annes 1980, la technologie BOOM
s'appuie sur la capacit de la silice fixer l'ADN
et l'ARN de fortes concentrations de sel.
Aprs plusieurs tapes de lavage destines
liminer tout dbris, les acides nucliques sont
rcuprs par lution dans un tampon dont
la concentration en sel est infrieure. Il y a
plusieurs annes, bioMrieux a introduit la si-
lice magntique. Un aimant permet de
sparer le complexe d'acides nucliques des
matrices chaque tape, ce qui facilite l'auto-
matisation et rend le procd plus convivial.
La technologie BOOM est reconnue comme
la mthode la plus efficace pour l'extraction
des acides nucliques et fait l'objet de conces-
sion de licences par bioMrieux pour une
utilisation dans de nombreuses solutions du
commerce. Rcemment, bioMrieux a dve-
lopp un nouveau type de silice qui fixe
20 fois plus d'acides nucliques que les
versions prcdentes. De plus, les tampons de
lyse, de lavage et d'lution ont t amliors.
Les rsultats obtenus par diffrentes valua-
tions dmontrent les excellentes performances
du systme. Par exemple, la puret de
l'ADN/ARN extrait est trs bonne: le rapport
OD
260
/OD
280
est infrieur 1,8 pour l'ADN.
La quantit d'ADN rcupre est galement
trs satisfaisante: le rendement total est
suprieur 90 % pour de nombreux
paramtres. Enfin, l'intgrit des grosses
molcules d'ADN est garantie et l'analyse
gnomique est ainsi facilite avec easyMAG.
Ces performances ont t values en
comparaison avec d'autres solutions du
commerce et reconnues dans de nombreux
articles. Par exemple, Rutjes et al. ont montr
que, avec miniMAG les concentrations d'ARN
ont augment d'au moins 100 500 fois
(Rutjes et al, AEM,(71), 7, 2005, pp 3734-3740). Tang et
al. ont montr que miniMAG produit la plus
grande quantit d'acides nucliques et la
meilleure prcision, sur les trois systmes
[tests]. (Tang and al, JCM, (43), 9, 2005, pp4830-4833).
Utilisation facile
easyMAG peut traiter jusqu' 24 chantillons
par srie et, du fait qu'il est entirement
automatique, il ne ncessite que 15 minutes
d'intervention de la part de l'oprateur. Toutes
les 45 minutes, l'oprateur peut lancer une
nouvelle srie, ce qui signifie qu'il est
possible d'extraire jusqu' 240 chantillons
au cours d'une journe de travail moyenne.
easyMAG peut effectuer une analyse sur un
volume d'chantillon qui peut aller jusqu'
1 ml, ce qui permet une dtection sensible.
Cet chantillon peut tre ensuite concentr
pour obtenir un luat correspondant approxi-
mativement une concentration de 80 fois.
INTERVIEW
PERSONNE INTERVIEWEE: DR A. CARLOTTI
FONCTION: PDG
SOCIT: IDMYK
PAYS: FRANCE
bioPharma: Dans quel cadre utilisez-vous
NucliSENS miniMAG

?
Dr A. Carlotti : Nous utilisons depuis plus de
deux ans le miniMAG dans le cadre de nos
activits de Recherche et Dveloppement. En
effet, nous souhaitons proposer nos clients
industriels, des services de dtection de micro-
organismes (bactries, champignons, virus)
dans les matires premires et les produits
finis par PCR en temps rel. Une tape
cruciale de ces tests est lobtention des acides
nucliques de bonne qualit, dbarrasss des
ventuels agents inhibiteurs prsents dans les
matrices analyser, avec une excellente
sensibilit et dont la stabilit est assure, en
particulier dans le cas des cibles ARN.
bioPharma: Quelles sont les utilisations sp-
cifiques du miniMAG dans votre entreprise?
A. C. : Nous utilisons le miniMAG pour
lextraction des ADN et des ARN partir de
cultures cellulaires et de matrices plus ou
moins complexes (produits finis trs purs
trs chargs).
bioPharma: Est-il adapt aux problmatiques
de microbiologie pharmaceutique?
A. C. : Aprs des tests prliminaires de
diffrentes solutions dextraction bases sur
des principes trs diffrents, le miniMAG est
le seul systme qui sest avr performant
pour lever les inhibitions rencontres dans les
matrices les plus complexes (mme partielle-
ment). En outre les performances obtenues
en ce qui concerne la qualit (intgrit) des
acides nucliques, le rendement dextraction
et leur stabilit taient trs satisfaisants. En
ce sens, il nous est apparu particulirement
adapt aux problmatiques de microbiologie
pharmaceutique.
bioPharma: Quels travaux de validation avez-
vous d raliser pour tablir les performances?
A. C. : Les tests que nous voulons proposer
sont des tests qualitatifs (prsence-absence).
Nous avons donc entrepris les tudes de vali-
dation prconises par les diffrents rfrentiels
(Pharmacope, PDA Technical report, ICH,
etc) telles que spcificit, reproductibilit,
limite de dtection, robustesse et bio-quiva-
lence. Les performances du miniMAG,
obtenues dans les tests de dtermination des
limites de dtection (LOD: limit of detection)
sont particulirement satisfaisantes puisque
des LOD de lordre de 20 quivalents
gnome pour les cibles ADN et de 200
quivalents gnome pour les cibles ARN,
dans le milieu ractionnel, sont couramment
obtenues. La trs bonne reproductibilit a
galement t note dans ce cadre.
bioPharma: Finalement tes-vous satisfait de
l'outil ?
A. C. : Nous sommes trs satisfaits de loutil
car il nous permet datteindre des performances
que les autres solutions ne permettent pas.
Nous avons galement not lexcellente stabi-
lit des ARN, lie aux agents chaotropiques
utiliss. Enfin, la robustesse de la technique et
sa simplicit de mise en uvre, nous donnent
toute satisfaction. Cette solution nous permet-
tra de proposer des services performants et
fiables nos clients dans un proche futur.
Systme
NucliSENS easyMAG

Extraction des acides

nucliques dans le laboratoire
de biologie molculaire
avis de lexpert
innovation
produits et services
bioPharma est une publication internationale de
bioMrieux Industrie
Directeur de la publication: Alexandre Mrieux
Rdacteur en chef : Pascal Cruveiller
Ont contribu ce numro:
Anne Barnes, Karen Mullen,
Michele Storrs-Mabilat, Koren Wolman-Tardy,
Antonio Caturani, Joseph Jammal, Renaud
Jonquires, Olivier Martinez, Arnaud Paris,
Olivier Pasquier, Chris Wells.
Remerciements particuliers : Michela Ferrari (Copan
spa), Arnaud Carlotti (IDMYK), Geert Verdonk
(Organon), Dr Gilberto Dalmaso (Glaxo Smithkline
spa), Dr Hirotsugu Yasuda (Oxygenix). Catherine
Ferguson and Scott Jenkins (ATCC)
Mise en page et conception:
ISSN: 1951-2848
bioMrieux S.A
69280 Marcy lEtoile - France
Tl. 33 (0) 4 78 87 20 00
Fax. 33 (0) 4 78 87 20 90
www.biomerieux.com
Nhsitez pas nous crire pour nous faire
part de vos commentaires et suggestions
ou nous proposer des articles publier:
biopharma@eu.biomerieux.com
applications bioMrieux
Leader mondial dans le contrle microbiologique, bioMrieux propose une gamme unique de tests dassurance qualit en microbiologie couvrant le contrle
denvironnement, les tests de strilit des produits ou lidentification microbienne. Nous nous sommes engags aider nos partenaires des industries phar-
maceutique et cosmtique ainsi que les banques de sang, les banques de tissus et les socits de biotechnologies fournir des produits srs en toute confiance.
0
5
/
0
7
/
0
0
6
F
R
9
9
0
9
0
C
/
C
e

d
o
c
u
m
e
n
t

n
e
n
g
a
g
e

p
a
s

n
o
t
r
e

r
e
s
p
o
n
s
a
b
ilit

l
g
a
le
.
b
io
M

r
ie
u
x

s
e

r

s
e
r
v
e

le

d
r
o
it

d
e

m
o
d
if
ie
r

le
s

s
p

c
if
ic
a
t
io
n
s

s
a
n
s

n
o
t
if
ic
a
t
io
n

p
r

a
la
b
le
.
B
io
m

r
ie
u
x

e
t

le

lo
g
o

b
le
u
,
C
o
u
n
t
-T
a
c
t
,
V
IT
E
K
,
V
IT
E
K

2

C
o
m
p
a
c
t
,
A
P
I,
a
ir

I
D
E
A
L
,
3
P
,
e
a
s
y
M
A
G
,
m
in
iM
A
G
,
U
n
id
a
t
r
ix
,
B
O
O
M
,
Q
U
A
N
T
I
S
W
A
B

e
t

B
a
c
T
/
A
L
E
R
T

s
o
n
t

d
e
s

m
a
r
q
u
e
s

d

p
o
s

e
s

e
t

p
r
o
t

e
s

a
p
p
a
r
t
e
n
a
n
t

b
io
M

r
ie
u
x

S
A

o
u

lu
n
e

d
e

s
e
s

f
ilia
le
s
.
Im
p
r
im

e
n

F
r
a
n
c
e
.
R
C
S

3
9
4

8
0
5

1
1
3

b
io
M

r
ie
u
x

-

R
C
S

L
Y
O
N

6
7
3

6
2
0

3
9
9
.
INTERVIEW*
PERSONNE INTERVIEWE:
HIROTSUGU YASUDA
FONCTION: MANAGER, ANALYTICAL
CHEMISTRY LAB. KYOTO RESEARCH CENTER
SOCIT: OXYGENIX
PAYS: JAPON
OXIGENIX est un laboratoire pharmaceutique
"joint venture" qui dveloppe un produit exclu-
sif driv de technologies dveloppes par les
universits de Keio et de Waseda. Ce produit
est un systme innovant de dlivrance de
mdicaments constitu de liposomes fortement
biocompatibles qui peuvent encapsuler des
protines thrapeutiques et d'autres
mdicaments macromolculaires.
Notre prochain produit commercial est un trans-
porteur d'oxygne de type cellulaire galement
connu sous le nom de sang artificiel qui sera un
mdicament biotechnologique rvolutionnaire pour
la transfusion. Il est vident qu'OXYGENIX doit
exiger le niveau maximal de contrle qualit car il
s'agit d'un mdicament injectable.
Lorsque nous avons dvelopp notre produit, notre
tablissement n'tait pas quip de salles
blanches conformes aux BPF. Ces installations sont
en effet coteuses et n'taient pas la porte
d'une socit biotechnologique comme la ntre,
au stade de la R&D. Nous recherchions alors une
technologie conviviale pour des tests rapides de
strilit qui seraient utilisables dans un local de
microbiologie. Nous connaissions dj bioMrieux
pour son savoir-faire dans le domaine de l'identi-
fication automatique car nous travaillons avec un
appareil VITEK

2 Compact
TM
. Nous avons choisi
BacT/ALERT

3D pour diffrentes raisons:

1- Rsultats automatiss fiables,
2- Si le rsultat devient positif, l'chantillon peut
tre mis en culture partir du flacon et
identifi par VITEK

2 Compact
TM
,
3- Cette solution tait parfaitement acceptable pour
les manipulations ralises dans un local de
scurit.
BacT/ALERT

nous permet de raliser facilement

des tests de strilit dans un local de scurit bio-
logique. Nous sommes en outre parvenus rduire
le dlai de ralisation des tests, de 14 jours avec
la mthode de la pharmacope japonaise 7 jours.
Ce gain de temps important nous permet de dve-
lopper le contrle en cours de fabrication, ce qui
tait impossible auparavant en raison du dlai.
Nous pensons que BacT/ALERT

3D correspond
rellement au principe PAT de la FDA; c'est le
systme le mieux adapt nos tests en cours de
fabrication.
Le docteur Hirotsugu Yasuda et les membres de son quipe
de laboratoire
Catherine Ferguson, biologiste charge
du contrle qualit chez ATCC, avec Scott
Jenkins, rdacteur scientifique d'ATCC.
ATCC

est le plus important centre mondial de

ressources biologiques but non lucratif, avec
plus de 80 ans d'exprience dans le domaine
de la croissance et de la conservation des
cultures. Les cultures des collections de l'ATCC

reprsentent une large plage de lignes cellu-

laires, de micro-organismes et de virus. La
collection biologique de cellules de l'ATCC

est
la collection la plus complte dans son
domaine, elle se compose de plus de 3600
lignes cellulaires issues de plus de 80 espces
diffrentes. Elle comprend plus de 950 lignes
cellulaires cancreuses, plus de 1000 hybri-
domes, ainsi que diverses collections spciales.
Le systme de conservation ATCC du stock de
souches et du stock de distribution (avec des
oprations de contrle qualit (CQ) tout au
long du processus) garantit
que les matires sont authen-
tiques et les plus proches
possible de la culture d'origine,
avec des transferts minimaux.
Les contrles de strilit
bactrienne et fongique font
partie des tests de CQ rali-
ss chez ATCC

sur les lignes

cellulaires, les cellules sou-
ches, les milieux de culture,
les virus et les protistes, afin de garantir que
les clients reoivent des produits de grande
qualit. ATCC

a valu le systme
BacT/ALERT

de bioMrieux comme outil

pour les tests de strilit en ralisant une
comparaison avec la mthode de test de
strilit qu'ATCC

utilise en routine. Cette

mthode implique l'inoculation de plusieurs
bouillons et botes de sang et l'incubation des
milieux en conditions arobies et anarobies
diffrentes tempratures.
La mthode de strilit classique prsente plu-
sieurs limites. La plus importante est la
subjectivit dans l'interprtation des rsultats
de test: chaque biologiste qui lit les tubes dter-
mine s'il y a eu ou non prolifration bactrienne.
Cela ncessite souvent un examen microsco-
pique suivi d'une mise en culture pour identifier
le contenu des tubes observ comme des
cellules eucaryotes, des rsidus de milieu de
culture, une prolifration bactrienne ou autre
chose.
Une autre limite de la mthode de test de
strilit est la dure ncessaire pour la prpa-
ration et pour l'obtention du rsultat final. La
prparation implique la collecte et l'tiquetage
de milieux (8 tubes de bouillon et 2 botes
par chantillon fourni). Par exemple, pour
tester 20 chantillons, des centaines de tubes
et de botes de culture sont consommes pour
les tests. De plus, il faut faire bouillir du thiogly-
colate pendant 10 minutes et le refroidir avant
inoculation et il faut sceller toutes les botes de
culture arobie avec du parafilm pour emp-
cher leur dessiccation. Le dlai d'excution de
cette mthode est long, avec des contrles
quotidiens de la turbidit et
de la croissance, les rsul-
tats finaux n'tant obtenus
qu'aprs 21 jours suivant
l'inoculation.
Le systme BacT/ALERT

3D offre une mthode de

test de strilit plus rapide et
plus efficace qui demande
moins de temps et prsente
un risque moindre d'inter-
prtations subjectives des rsultats de test. Pour
l'valuation initiale de l'appareil par l'ATCC,
diffrents organismes ont t choisis, reprsen-
tant diffrentes tempratures de croissance
(24 C 37 C), diffrentes dures de crois-
sance (24-72heures) et diffrentes conditions
de croissance (arobie, anarobie et atmos-
phre contenant 5% de CO
2
). Six espces de
bactries (reprsentant des organismes faculta-
tifs, non entriques, anarobies et exigeants) ont
t utilises avec une espce de moisissure et
une espce de levure. Organismes utiliss:
ATCC

25922 (Escherichia coli)

ATCC

53416 (Neisseria meningitidis)

ATCC

12743 (Bordetella pertussis)

ATCC

23745 (Bacteroides fragilis)

ATCC

11325(Rhizobium rhizogenes)
ATCC

17909(Acinetobacter johnsonii)
ATCC

MYA-905 (Candida albicans)

ATCC

201971 (Aspergillus flavipus).

Afin de comparer l'efficacit de la dtection de
BacT/ALERT

par rapport la mthode classi-

que des botes, les organismes ont fait l'objet
d'une premire dilution en srie dans un
tampon de phosphate (10-15 fois) ( l'excep-
tion d'ATCC

23745, qui a t dilu dans un

milieu clostridial renforc). Un ml de chaque
dilution a t ajout un flacon arobie (iAST)
et un flacon anarobie (iNST) et incub
32C pendant 14 jours. Un volume de 0,1ml
de chaque dilution a t galement tal
sur le milieu de culture adapt et incub la
temprature recommande pour l'organisme.
La moisissure et la levure n'ont pas t
comprises dans cette srie de tests.
Trois des six souches bactriennes ont t
dtectes une dilution numrique plus
leve (c'est--dire 10
-5
contre 10
-3
, par cons-
quent une concentration infrieure de cellules
bactriennes) par BacT/ALERT

que par l'ob-

servation macroscopique des botes ; une
souche tait dans la fourchette d'une
dilution et deux souches ont t dtectes sur
BacT/ALERT

des dilutions considrablement

infrieures (dtection 10
-1
sur BacT/ALERT

contre 10
-4
et 10
-7
sur les botes) (concentra-
tion suprieure) par rapport la mthode
classique d'talement sur les botes. Il est
noter que les deux souches associes une
dtection considrablement infrieure sur
BacT/ALERT

par rapport aux botes sont des

organismes exigeants, Neisseria meningitidis
et Bordetella pertussis.
Dans une deuxime phase de tests, le proto-
cole dcrit ci-dessus a t modifi par le
remplacement du tampon phosphate par un
chantillon dilu de DMEM contenant ATCC

CCL-2, cellules HeLa. tant donn que le

DMEM est un milieu couramment utilis pour
les chantillons de biologie cellulaire, il tait
important de dterminer si le milieu favorise-
rait ou freinerait la croissance et/ou la dtection
bactrienne. L'chantillon d'E. coli n'a pas t
retest mais la moisissure et la levure ont
t ajoutes au test. Sur les cinq souches
bactriennes testes, deux ont t dtectes
des dilutions suprieures, dont Neisseria
meningitidis. Bordetella pertussis a t dtect
une dilution plus leve que lorsqu'il est dilu
dans un tampon phosphate (10
-3
dans le
DMEM contre 10
-1
dans le tampon phosphate)
mais encore plusieurs dilutions en dessous de
la mthode des botes. La moisissure a t
dtecte une dilution de 10
-6
dans le flacon
arobie et la levure a t dtecte une
dilution de 10
-10
dans les flacons arobies et
anarobies. Il est noter que tous les
rsultats positifs pour tous les organismes ont
t dtects en moins de 7 jours.
Une fois les tests de dilution termins, nous
avons ralis une comparaison plus tendue
de BacT/ALERT

par rapport la mthode de

test classique avec 49 organismes. 47 ont
donn des rsultats identiques la fois avec
BacT/ALERT

et avec la mthode classique,

indiquant une bonne sensibilit du systme.
Les deux autres ont produit des faux positifs.
Nous avons recommenc les tests sur ces
organismes, les nouveaux rsultats ont t
ngatifs.
Sur la base des donnes obtenues, lATCC

a
conclu que BacT/ALERT

offre aux utilisateurs

une dure de prparation rduite, des
rsultats plus rapides et, ce qui est plus impor-
tant, supprime le facteur humain de subjectivit.
LATCC

inclut maintenant BacT/ALERT

dans
la production et le contrle qualit des cultu-
res cellulaires, des chantillons de cellules
souches et des chantillons de milieu et nous
estimons que cet appareil nous aide mieux
servir nos clients.
BacT/ALERT

3D, des utilisateurs partagent leur exprience

Principe de lecture
valuation, par l'ATCC

, du systme BacT/ALERT

3D pour les tests de strilit*

*

T
r
a
d
u
it

d
e

la
n
g
la
is

s
o
u
s

la

r
e
s
p
o
n
s
a
b
ilit

d
e

b
io
M

r
ie
u
x
.