CHAPITRE II: CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HP...

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CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

I) Principe de la chromatographie

La chromatographie est une mthode de sparation des constituants d'un mlange

mme trs complexe.

Il existe trois principaux types de chromatographie:

la chromatographie en phase gazeuse

(CPG)

la chromatographie en phase liquide

haute performance (HPLC)

la chromatographie en couche mince

(CCM).

Les deux premires mthodes peuvent tre assez largement dcrites par des thories
communes. Dans les deux cas, un fluide appel phase mobile parcourt un tube appel
colonne. Cette colonne peut contenir des "granuls" poreux (colonne remplie) ou tre
recouverte l'intrieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la
colonne est appele phase stationnaire. A l'instant initial, le mlange sparer est
inject l'entre de la colonne o il se dilue dans la phase mobile qui l'entrane
travers la colonne.

Si la phase stationnaire a t bien choisie, les constituants du mlange, appels

gnralement les soluts, sont ingalement retenus lors de la traverse de la colonne.

De ce phnomne appel rtention il rsulte que les constituants du mlange inject se

dplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de dplacement
sont diffrentes. Ils sont ainsi lus de la colonne les uns aprs les autres et donc
spars.

Un dtecteur plac la sortie de la colonne coupl un enregistreur permet d'obtenir

un trac appel chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal
constant appel ligne de base en prsence du fluide porteur seul ; au passage de
chaque solut spar il conduit dans le temps l'enregistrement d'un pic.

Dans des conditions chromatographiques donnes, le "temps de rtention" (temps au

bout duquel un compos est lu de la colonne et dtect), caractrise qualitativement
une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limite par ces pics et la
prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque solut
dans le mlange inject.
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II) La chromatographie liquide haute performance

Les organes

a) Un rservoir de solvant (luant) qui contient la phase mobile en quantit

suffisante. Plusieurs flacons d'luants (solvants de polarits diffrentes)
sont disponibles pour pouvoir raliser des gradients d'lution (mlange de
plusieurs solvants des concentrations variables) l'aide de la pompe
doseuse.

b) La pompe : elle est muni d'un systme de gradient permettant

d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de
travailler:

- en mode isocratique, c'est--dire avec 100% d'un mme luant tout au long de
l'analyse.

- en mode gradient, c'est--dire avec une variation de la concentration des

constituants du mlange d'luants.

Les pompes actuelles ont un dbit variable de quelques l

plusieurs ml/min.

c) Vanne d'injection : c'est un injecteur boucles d'chantillonnage. Il

existe des boucles de diffrents volumes, nous utiliserons une boucle de
20l. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la
colonne et de la concentration suppose des produits analyser. Le systme
de la boucle d'injection permet d'avoir un volume inject constant, ce qui
est important pour l'analyse quantitative.
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d) La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matriau le plus possible inerte aux produits
chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamtre compris
entre 4 et 20 mm pour des longueurs gnralement de 15 30 crn. Au del, les
importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop
leves.

e) La phase stationnaire

- La phase normale:

La phase normale est constitue de gel de silice. Ce matriau est trs polaire. Il faut
donc utiliser un luant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits
polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent
en tte.

L'inconvnient d'une telle phase, c'est une dtrioration rapide au cours du temps du
gel de silice, ce qui entrane un manque de reproductibilit des sparations.

- La phase inverse :

La phase inverse est majoritairement compose de silice greffes par des chanes
linaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et
ncessite donc un luant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les composs
polaires qui seront lus en premier.

Contrairement une phase normale, il n'y a pas d'volution de la phase stationnaire au

cours du temps, et la qualit de la sparation est donc maintenue constante.

- La phase mobile :
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L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire

normale ou polarit inverse se rpercute sur les temps de rtention des soluts. La
polarit de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :

- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;

- si la phase stationnaire est trs peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le
plus souvent des mlanges de mthanol ou d'actonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarit de la phase mobile, on agit
sur les facteurs de rtention k des composs.

Les silices greffes conduisent en gnral une perte importante de polarit. Avec
une phase greffe, l'ordre d'lution est oppos celui auquel on est habitu avec les
phase normales. Ainsi avec un luant polaire, un compos polaire migre plus vite qu'un
compos apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On
ralise des gradients d'lution en diminuant au cours de la sparation la polarit de
l'luant (ex : mlange eau /actonitrile dont la concentration en actonitrile va en
croissant au cours de l'lution).

On peut, en mlangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'lution de la phase

mobile.
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f) Dtecteurs

Deux types de dtecteurs sont classiquement utiliss

* dtecteur UV-visible (celui que nous utilisons) : il mesure l'absorption de la lumire

par le produit la sortie de la colonne. E opre longueur d'onde constante, celle-ci
ayant t fixe par l'oprateur. La lampe Deuterium est utilis pour des longueurs
d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe vapeur de mercure est utilis la longueur
d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de dtecteur soit utilisable, il faut
que :

- le produit dtecter absorbe la lumire une longueur d'onde accessible

l'appareil, et que son coefficient d'absorption soit suffisamment grand ;

- la phase mobile n'absorbe pas la lumire la longueur d'onde choisie par l'oprateur.

Figure 5: Principe du dtecteur UV

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* rfractomtre : il mesure la variation de l'indice de rfraction du liquide la sortie

de la colonne. Cette mesure, extrmement prcise, dpend nanmoins de la
temprature du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il y a
donc une rfrence d'o le terme de variation de l'indice. Ce dtecteur exclut les
variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler
qu'en mode isocratique avec ce dtecteur.

Les donnes sont collectes par l'intermdiaire soit d'un intgrateur ou d'une -station
d'acquisition.

III) Application de la chromatographie l'analyse

1) Analyse des chromatogrammes

Une bonne sparation se traduira par une sparation distincte des pics correspondant
chacun des produits.

Un chromatogramme doit tre parfaitement reproductible.

La composition de la phase mobile est un paramtre particulier la HPLC. Il faut donc

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prciser pour chaque analyse :

- le type de colonne : marque, nature, diamtre, longueur, support

- la nature de l'luant : solvant, si c'est un mlange prciser sa composition, dbit,

mode de dtection en nm.

- la quantit injecte, le dbut de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilit du

dtecteur, etc

2) Analyse qualitative

Le temps de rtention (tR en min) est

une caractristique de chaque solut
dans les conditions opratoires
fixes.

On peut comparer le tR de deux

soluts en dfinissant :

- le facteur de slectivit entre les

deux soluts :

- lefficacit d'une
colonne qui est mesure en nombre de plateau thorique :

Nombre de molcule sortant

de la colonne en fonction du temps

: cart type : distance entre le point

d'inflexion (point o la drive
seconde s'annule) et la moiti de la
courbe.

: largeur du pic mi-hauteur

: largeur la base (unit de temps)

n = nombre de plateaux thoriques :

HEPT (hauteur quivalente de

plateaux thoriques)
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HEPT = L/n (L = hauteur de colonne, n nombre de plateaux thoriques)

Rsolution de la colonne pour la sparation de deux soluts bien dtermins.

R>1 bonne sparation

R<1 mauvaise sparation donc les paramtres appliqus la colonne ne sont pas les
bons.

3) Analyse quantitative

Cette analyse est base sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle la concentration ou la quantit de produit analys.

Mthode de l'talonnage externe :

Il est ncessaire de
disposer d'une quantit
suffisante du produit afin
de faire une courbe
d'talonnage Aire = f(masse
ou concentration du
produit), pour un volume
inject constant V.
L'injection ultrieure du
mme volume V de l'chantillon doser permet, l'aide de la mesure de l'aire du pic
reporte sur la courbe d'talonnage, de connatre la masse ou la concentration
recherche. Cette mthode est plus prcise que celle qui consiste ne faire qu'une
mesure avec l'talon et utiliser une rgle de trois :

Ae/Me = Aet/met

A: Aire des pics

e: chantillon

et: talon

m : masse du produit remplaable par la concentration

Mthode des ajouts :

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Comme la prcdente, cette mthode ncessite de possder le produit analyser pur;

aprs avoir analys l'chantillon, on ajoute celui-ci des quantit connues m du
produit avant de le chromatographier nouveau ( faire au minimum deux ajouts), ce qui
entrane une variation de l'aire du pic A.

Si m est la masse contenue dans l'chantillon analyser,

(A/m) = a/m soit m= A*(m/A)

Si le produit ajout est en solution, il faut tenir compte des effets de dilution.

Mthode de l'talon interne (utilise essentiellement en CPG) :

On compare la rponse du ou des produits analyser celle d'un talon interne, donc
introduit dans le mlange doser et convenablement choisi.

Une solution talon est prpare avec le ou les produits que l'on veut doser. Les
masses sont connues m1, m2, et me pur l'talon; ces masses correspondent les
aires A1, A2, , A'e, sur le chromatogramme.

Dans l'chantillon contenant les masses m1, m2, de soluts on ajoute me de l'talon,
ce qui donne les aires A1, A2, Ae.

On obtient :

m'1 = 1 A1

m'2 = 2 A2

me = e A'e

avec coefficient de proportionnalit

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et k1 = (1/e) = (m'1 Ae /me A1)

d'o la valeur k1 puisque toutes les donnes sont connues.

Dans l'chantillon inconnu on aura :

m1 = 1 A1

me = ae Ae

(m1/me) = (1 A1/e Ae) = k1(A1/Ae)

me, k1, A1, Ae sont connus.