2.2.23. Spectrométrie d’absorption atomique PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.

MODE OPÉRATOIRE LINÉARITÉ

L’emploi, dans la mesure du possible, de matériel de Préparez et analysez au moins 4 solutions de référence
laboratoire en plastique est recommandé. couvrant l’intervalle d’étalonnage, et une solution à blanc, avec
au minimum 5 réplications.
Utilisez un spectromètre d’émission atomique conformément Calculez la courbe d’étalonnage par la méthode des moindres
aux instructions du fabricant et en opérant à la longueur carrés à partir de l’ensemble des valeurs mesurées. Représentez
d’onde prescrite. Optimisez les conditions expérimentales graphiquement la courbe de régression, les moyennes, les
(température de flamme, hauteur de brûleur, utilisation d’un valeurs mesurées et l’intervalle de confiance de la courbe
tampon ionique, concentration des solutions) en fonction de d’étalonnage. Le mode opératoire est valable si :
l’élément à doser et de la matrice de l’échantillon. Introduisez
une solution à blanc dans le dispositif d’analyse et ajustez – le coefficient de corrélation est supérieur ou égal à 0,99,
l’instrument au zéro ou à la valeur à blanc. Introduisez ensuite – les résidus obtenus pour chaque concentration d’étalonnage
la solution de référence de concentration la plus élevée et présentent une distribution aléatoire autour de la courbe
réglez la sensibilité de façon à obtenir une lecture appropriée. d’étalonnage.
Il est préférable de travailler à des concentrations situées Calculez la moyenne et l’écart type relatif pour la concentration
dans la partie linéaire de la courbe d’étalonnage. En cas la plus faible et la plus élevée de la gamme d’étalonnage.
d’impossibilité, on peut également utiliser des courbes Si le rapport des écarts types estimés pour la plus faible et
d’étalonnage présentant une courbure, à condition de recourir la plus élevée des concentrations d’étalonnage est inférieur
à des logiciels de traitement appropriés. à 0,5 ou supérieur à 2,0, une estimation plus précise de la
Les mesures s’effectuent par comparaison avec des solutions courbe d’étalonnage peut être obtenue par régression linéaire
de référence de concentration connue en élément à doser, soit pondérée. Des fonctions de pondération du premier et du
par la méthode de la courbe d’étalonnage (Procédé I), soit par second degré sont appliquées aux données pour déterminer la
la méthode des ajouts dosés (Procédé II). fonction de pondération la plus appropriée. Si les moyennes
présentent un écart de linéarité par rapport à la courbe
PROCÉDÉ I - MÉTHODE DE LA COURBE D’ÉTALONNAGE d’étalonnage, une régression linéaire bidimensionnelle est
Pour les analyses de routine, il convient de préparer et utilisée.
d’examiner 3 solutions de référence et une solution à blanc. EXACTITUDE
Préparez la solution de la substance à examiner (solution à Vérifiez l’exactitude en utilisant de préférence un matériel de
examiner) comme prescrit dans la monographie. Préparez référence certifié (CRM). En cas d’impossibilité, effectuez un
au moins 3 solutions de référence dont les concentrations en essai de recouvrement.
élément à doser encadrent la concentration présumée de la Recouvrement. Pour les dosages, un recouvrement de
solution à examiner. Pour les dosages, la gamme d’étalonnage 90 pour cent à 110 pour cent doit être obtenu. Pour d’autres
optimale va de 0,7 fois à 1,3 fois la teneur présumée en élément déterminations, par exemple le dosage de traces d’éléments,
à doser ou la teneur limite prescrite dans la monographie. l’essai n’est valable que si le recouvrement se situe dans
Pour les essais de pureté, la gamme d’étalonnage s’étend de la l’intervalle allant de 80 pour cent à 120 pour cent de la
limite de détection à 1,2 fois la limite spécifiée pour l’élément valeur théorique. Le recouvrement peut être déterminé sur
à doser. Tous les réactifs utilisés dans la préparation de la une solution de référence appropriée (matrice) dopée avec
solution à examiner sont ajoutés, à la même concentration, une quantité connue de l’élément à analyser (concentration
aux solutions de référence et à la solution à blanc. médiane de l’intervalle d’étalonnage).
Introduisez chacune des solutions dans le dispositif d’analyse RÉPÉTABILITÉ
avec le même nombre de réplications pour chaque solution de La répétabilité est au maximum de 3 pour cent pour un dosage
façon à obtenir une lecture stable. et de 5 pour cent pour un essai de pureté.
Calcul. Tracez la courbe d’étalonnage à partir de la moyenne LIMITE DE QUANTIFICATION
des lectures obtenues avec les solutions de référence, en Vérifiez que la limite de quantification (déterminée par
représentant les moyennes en fonction de la concentration, exemple par l’approche dite 10 σ) est inférieure à la valeur à
et déterminez la concentration de l’élément à doser dans la mesurer.
solution à examiner à l’aide de la courbe obtenue.
PROCÉDÉ II - MÉTHODE DES AJOUTS DOSÉS
Dans au moins 3 fioles jaugées identiques, introduisez des
01/2008:20223
volumes égaux de la solution de la substance à examiner
(solution à examiner) préparée comme prescrit. Ajoutez
à toutes les fioles, sauf une, des volumes croissants d’une
solution de référence de concentration connue en élément à
doser, de façon à obtenir une série de solutions contenant des
quantités progressivement croissantes de l’élément, choisies de 2.2.23. SPECTROMÉTRIE
manière à obtenir des réponses situées dans la partie linéaire
de la courbe, si possible. Complétez au trait de jauge avec le
D’ABSORPTION ATOMIQUE
solvant. PRINCIPE GÉNÉRAL
Introduisez chacune des solutions dans le dispositif d’analyse L’absorption atomique est le phénomène observé lorsqu’un
avec le même nombre de réplications pour chaque solution de atome à l’état fondamental absorbe un rayonnement
façon à obtenir une lecture stable. électromagnétique à une longueur d’onde spécifique et
passe à un état excité. Les atomes à l’état fondamental
Calcul. Calculez l’équation de régression linéaire du graphique
absorbent l’énergie à leur fréquence de résonance, et cette
en utilisant la méthode des moindres carrés et résolvez-la de
absorption se traduit par une atténuation du rayonnement
façon à obtenir la concentration de l’élément à doser dans la
électromagnétique. L’absorption d’énergie est en théorie
solution à examiner.
proportionnelle au nombre d’atomes présents.
Le présent chapitre fournit des informations générales
VALIDATION DE LA MÉTHODE
et décrit les procédures à suivre pour les déterminations
Les performances des méthodes prescrites dans les élémentaires par spectrométrie d’absorption atomique
monographies sont vérifiées à intervalles de temps appropriés. utilisant différentes techniques d’atomisation (flamme,

40 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)

PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0 2.2.23. Spectrométrie d’absorption atomique

vaporisation électrothermique dans un four de graphite, par un courant de gaz inerte dans une cellule froide de
génération d’hydrures, technique de la vapeur froide pour le quartz placée sur le trajet optique de l’instrument. Les
mercure). hydrures générés sont entraînés par un gaz inerte dans une
La spectrométrie d’absorption atomique est une technique cellule chauffée, à l’intérieur de laquelle ils sont dissociés
de détermination de la concentration d’un élément dans un en atomes.
échantillon, par mesure de l’absorption d’un rayonnement INTERFÉRENCES
électromagnétique par la vapeur atomique de l’élément
générée à partir de l’échantillon. La mesure est effectuée Des interférences chimiques, physiques, d’ionisation ou
à la longueur d’onde de l’une des raies d’absorption (de spectrales peuvent affecter les mesures d’absorption atomique.
résonance) de l’élément concerné. La quantité de rayonnement Les interférences chimiques sont compensées par addition
absorbée est, selon la loi de Lambert-Beer, proportionnelle à de modificateurs de matrice, d’agents modifiant la volatilité
la concentration de l’élément. de l’élément, ou en utilisant, pour la flamme, un mélange
protoxyde d’azote-acétylène qui permet d’obtenir une
APPAREILLAGE température élevée. L’emploi de tampons d’ionisation
L’appareillage comprend essentiellement : spécifiques (lanthane ou césium par exemple) permet de
– une source de rayonnement, compenser les interférences d’ionisation. Les interférences
physiques liées à la salinité ou à la viscosité de l’échantillon
– un dispositif d’introduction des échantillons, sont éliminées en diluant l’échantillon, en utilisant la méthode
– un dispositif d’atomisation des échantillons, des ajouts dosés ou en ajustant la matrice. Quant aux
– un monochromateur ou un polychromateur, interférences spectrales, qui résultent de la superposition
– un détecteur, de raies de résonance, il est possible de s’en affranchir en
opérant à une raie de résonance différente. La correction du
– une unité d’acquisition des données.
fond par application de l’effet Zeeman permet également de
L’appareil est généralement équipé d’un système de correction compenser les interférences spectrales et les interférences
du bruit de fond. Les sources de rayonnement utilisées d’absorption moléculaire, notamment en atomisation
peuvent être des lampes à cathode creuse ou des lampes à électrothermique. L’utilisation de lampes à cathode creuse
décharge sans électrode (EDL), qui émettent un spectre à raies multi-éléments peut elle aussi être à l’origine d’interférences
très étroites (d’une largeur à mi-hauteur d’environ 0,002 nm) spectrales. L’absorption spécifique ou non spécifique est
correspondant à l’élément à doser. mesurée dans un domaine spectral défini par la largeur
Il existe 3 techniques d’atomisation des échantillons. de la bande passante sélectionnée par le monochromateur
– Atomisation dans la flamme (0,2-2 nm).
Ce dispositif d’atomisation se compose d’un système de CORRECTION DU BRUIT DE FOND
nébulisation, qui comporte un accessoire de production
pneumatique d’aérosol, d’un régulateur de débit gazeux Dans une flamme ou en atomisation électrothermique, la
et d’un brûleur. Divers mélanges combustible-comburant diffusion et l’absorption de fond entraînent une erreur de
sont couramment utilisés, pour produire des températures mesure par excès. L’absorption de fond couvre un large
allant d’environ 2000 K à 3000 K. Parmi les combustibles intervalle de longueurs d’onde, alors que l’absorption atomique
gazeux figurent le propane, l’hydrogène et l’acétylène ; le spécifique se produit sur un intervalle très étroit (environ
comburant peut être de l’air ou du protoxyde d’azote. La 0,005-0,02 nm). L’absorption de fond peut en principe être
configuration du brûleur est adaptée au gaz utilisé, et le corrigée en utilisant une solution à blanc de composition
débit gazeux est réglable. Les échantillons sont nébulisés, exactement identique à celle de l’échantillon, mais sans
et le solvant de choix pour la préparation des solutions l’élément spécifique à déterminer ; cette méthode est toutefois
à examiner et des solutions de référence est de l’eau souvent impraticable. En atomisation électrothermique,
acidifiée. Il est toutefois possible d’utiliser aussi des solvants il convient d’optimiser la température de pyrolyse pour
organiques en prenant les précautions nécessaires pour que éliminer les produits de décomposition de la matrice qui sont
le solvant n’affecte pas la stabilité de la flamme. responsables de l’absorption de fond. La correction de fond
peut également être effectuée en utilisant 2 sources lumineuses
– Atomisation électrothermique différentes, la lampe à cathode creuse qui mesure l’absorption
Ce dispositif d’atomisation se compose généralement totale (élément + fond) et une lampe au deutérium à spectre
d’un four à tube de graphite à alimentation électrique. d’émission continu, qui permet de mesurer l’absorption
L’ensemble de l’échantillon est atomisé dans un four à de fond. La correction consiste à soustraire le signal de
tube de graphite, et la vapeur atomique est retenue sur la lampe au deutérium du signal de la lampe à cathode
le parcours optique pendant un certain temps, ce qui creuse. Cette méthode n’est cependant applicable que sur un
permet d’améliorer la limite de détection. Les échantillons, domaine spectral limité, car les spectres émis par les lampes
liquides ou solides, sont introduits directement dans le au deutérium vont de 190 nm à 400 nm. Il est également
four à tube de graphite qui est chauffé en une série d’étapes possible de mesurer l’absorption de fond en effectuant des
programmées pour dessécher l’échantillon, éliminer par lectures sur une raie non absorbante voisine de la raie de
pyrolyse les principaux composants de la matrice, puis résonance, et en soustrayant cette mesure de celle obtenue sur
atomiser la totalité de l’élément à analyser. Le nettoyage du la raie de résonance. Enfin, une autre méthode de correction
four s’effectue par programmation d’une température finale de l’absorption de fond est l’application de l’effet Zeeman
supérieure à la température d’atomisation. La circulation (décomposition de la raie d’absorption sous l’influence d’un
d’un gaz inerte lors de l’étape de pyrolyse dans le four à champ magnétique). Elle est particulièrement utile lorsque
tube de graphite permet d’améliorer les performances à l’absorption de fond présente une structure fine, et permet
l’atomisation. une correction efficace sur l’intervalle 185-900 nm.
– Génération d’hydrures et vapeur froide
CHOIX DES CONDITIONS OPÉRATOIRES
La vapeur atomique peut aussi être générée à l’extérieur
du spectromètre. Tel est notamment le cas lorsqu’il est fait Après avoir sélectionné la longueur d’onde et la largeur de
appel à la méthode dite de vapeur froide pour le mercure fente appropriées à l’élément à doser, il convient de vérifier la
ou à la génération d’hydrures pour des éléments tels que nécessité des points suivants :
l’arsenic, l’antimoine, le bismuth, le sélénium et l’étain. – correction de l’absorption de fond non spécifique,
En ce qui concerne le mercure, les atomes sont générés – addition de modificateurs chimiques ou de tampons
par réduction chimique avec du chlorure stanneux ou du d’ionisation à l’échantillon ainsi qu’à la solution à blanc et
borohydrure de sodium et la vapeur atomique est entraînée aux solutions de référence,

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 41
2.2.23. Spectrométrie d’absorption atomique
– dilution de l’échantillon pour réduire, par exemple, les
interférences physiques,
– description détaillée de la programmation de
température : préchauffage, séchage, pyrolyse, atomisation,
post-atomisation, avec temps de rampe et temps d’arrêt,
– débit du gaz inerte,
– utilisation de modificateurs de matrice pour l’atomisation
électrothermique (four),
– emploi d’agents réducteurs pour les mesures portant sur le
mercure ou d’autres éléments générateurs d’hydrures, avec
une cellule de vapeur froide ou une cellule chauffée,
– spécification du modèle du four (nacelle, plate-forme de
L’vov, etc.).
MODE OPÉRATOIRE
L’emploi, dans la mesure du possible, de matériel de
laboratoire en plastique est recommandé. La préparation de
l’échantillon peut nécessiter une dissolution, une digestion
(souvent assistée par micro-ondes) ou une étape de calcination
ou une combinaison de ces étapes afin de purifier la matrice
et/ou d’éliminer des substances carbonées. Si on travaille dans
un système ouvert, la température de calcination ne doit pas
dépasser 600 °C en raison de la volatilité de certains métaux,
sauf spécification contraire dans la monographie.
Utilisez un spectromètre d’absorption atomique
conformément aux instructions du fabricant et en opérant à
la longueur d’onde prescrite. Introduisez une solution à blanc
dans le dispositif d’analyse et ajustez la lecture de l’instrument
de façon qu’il indique une transmission maximale. Il est
possible de déterminer la valeur à blanc en utilisant du
solvant pour régler le zéro de l’appareil. Introduisez ensuite la
solution de référence de concentration la plus élevée et réglez
la sensibilité de façon à obtenir une lecture d’absorbance
maximale. Rincez pour éviter la contamination et l’effet
mémoire. Une fois l’analyse terminée, effectuez un rinçage
à l’eau R ou à l’eau acidifiée.
Si une technique d’échantillonnage solide est requise, le
procédé à suivre est entièrement décrit dans la monographie.
Il est préférable de travailler à des concentrations situées
dans la partie linéaire de la courbe d’étalonnage. En cas
d’impossibilité, on peut également utiliser des courbes
d’étalonnage présentant une courbure, à condition de recourir
à des logiciels de traitement appropriés.
Les mesures s’effectuent par comparaison avec des solutions
de référence de concentration connue en élément à doser, soit
par la méthode de la courbe d’étalonnage (Procédé I), soit par
la méthode des ajouts dosés (Procédé II).
PROCÉDÉ I - ÉTALONNAGE DIRECT
Pour les analyses de routine, il convient de préparer et
d’examiner 3 solutions de référence et une solution à blanc.
Préparez la solution de la substance à examiner (solution à
examiner) comme prescrit dans la monographie. Préparez
au moins 3 solutions de référence dont les concentrations en
élément à doser encadrent la concentration présumée de la
solution à examiner. Pour les dosages, la gamme d’étalonnage
optimale va de 0,7 fois à 1,3 fois la teneur présumée en élément
à doser ou la teneur limite prescrite dans la monographie.
Pour les essais de pureté, la gamme d’étalonnage s’étend de la
limite de détection à 1,2 fois la limite spécifiée pour l’élément
à doser. Tous les réactifs utilisés dans la préparation de la
solution à examiner sont ajoutés, à la même concentration,
aux solutions de référence et à la solution à blanc.
Introduisez chacune des solutions dans le dispositif d’analyse
avec le même nombre de réplications pour chaque solution,
de façon à obtenir une lecture stable.
Calcul. Tracez la courbe d’étalonnage à partir de la moyenne
des lectures obtenues avec les solutions de référence, en
représentant les moyennes en fonction de la concentration, et
déterminez la concentration de l’élément dans la solution à
examiner à l’aide de la courbe obtenue.
42 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0
PROCÉDÉ II - MÉTHODE DES AJOUTS DOSÉS
Dans au moins 3 fioles jaugées identiques, introduisez des
volumes égaux de la solution de la substance à examiner
(solution à examiner) préparée comme prescrit. Ajoutez
à toutes les fioles, sauf une, des volumes croissants d’une
solution de référence de concentration connue en élément à
doser, de façon à obtenir une série de solutions contenant des
quantités progressivement croissantes de l’élément et choisies
de manière à obtenir des réponses situées dans la partie
linéaire de la courbe, si possible. Complétez au trait de jauge
avec le solvant.
Introduisez, à au moins 3 reprises, chacune des solutions dans
le dispositif d’analyse avec le même nombre de réplications
pour chaque solution, de façon à obtenir une lecture stable.
Calcul. Calculez l’équation de régression linéaire du graphique
en utilisant la méthode des moindres carrés et résolvez-la de
façon à obtenir la concentration de l’élément à doser dans la
solution à examiner.
VALIDATION DE LA MÉTHODE
Les performances des méthodes prescrites dans les
monographies sont vérifiées à intervalles de temps appropriés.
LINÉARITÉ
Préparez et analysez au moins 4 solutions de référence
couvrant l’intervalle d’étalonnage, et une solution à blanc, avec
au minimum 5 réplications.
Calculez la courbe d’étalonnage par la méthode des moindres
carrés à partir de l’ensemble des valeurs mesurées. Représentez
graphiquement la courbe de régression, les moyennes, les
valeurs mesurées et l’intervalle de confiance de la courbe
d’étalonnage. Le mode opératoire est valable si :
– le coefficient de corrélation est supérieur ou égal à 0,99,
– les résidus obtenus pour chaque concentration d’étalonnage
présentent une distribution aléatoire autour de la courbe
d’étalonnage.
Calculez la moyenne et l’écart type relatif pour la concentration
la plus faible et la plus élevée de la gamme d’étalonnage.
Si le rapport des écarts types estimés pour la plus faible et
la plus élevée des concentrations d’étalonnage est inférieur
à 0,5 ou supérieur à 2,0, une estimation plus précise de la
courbe d’étalonnage peut être obtenue par régression linéaire
pondérée. Des fonctions de pondération du premier et du
second degré sont appliquées aux données pour déterminer la
fonction de pondération la plus appropriée. Si les moyennes
présentent un écart de linéarité par rapport à la courbe
d’étalonnage, une régression linéaire bidimensionnelle est
utilisée.
EXACTITUDE
Vérifiez l’exactitude en utilisant de préférence un matériel de
référence certifié (CRM). En cas d’impossibilité, effectuez un
essai de recouvrement.
Recouvrement. Pour les dosages, un recouvrement de
90 pour cent à 110 pour cent doit être obtenu. Pour d’autres
déterminations, par exemple le dosage de traces d’éléments,
l’essai n’est valable que si le recouvrement se situe dans
l’intervalle allant de 80 pour cent à 120 pour cent de la
valeur théorique. Le recouvrement peut être déterminé sur
une solution de référence appropriée (matrice) dopée avec
une quantité connue de l’élément à analyser (concentration
médiane de l’intervalle d’étalonnage).
RÉPÉTABILITÉ
La répétabilité est au maximum de 3 pour cent pour un dosage
et de 5 pour cent pour un essai de pureté.
LIMITE DE QUANTIFICATION
Vérifiez que la limite de quantification (déterminée par
exemple par l’approche dite 10 σ) est inférieure à la valeur à
mesurer.