FACULTE DE MEDECINE DEPARTEMENT DE PHARMACIE LABORATOIRE DE CHIMIE

ANALYTIQUE D’ALGER

Support de Cours de Chimie

Analytique 3em Année Pharmacie
Appareillage et les applications de la
Spectrophotométrie UV- Visible
Dr DJEBROUNI
03/02/2021

Elle est inscrite dans toutes les Pharmacopées.et c’est la technique spectrale la plus utilisée du fait
de sa simplicité, mais aussi sa flexibilité (avec un large choix d’instruments).

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Les différents types de spectromètres UV-visible
Il existe sur le marché des spectromètres UV simple faisceau ou double
nd
faisceau. Les 2 étant plus précis et plus chers.

Ils comportent
1. la source : composé de 2 lampes, une au tungstène pour le domaine
visible, l’autre au deutérium pour le domaine UV
2. le monochromateur
3. le compartiment à échantillon
4. le détecteur à photodiode ou photomultiplicateur

1-Lampes = sources polychromatiques du spectrophotomètre UV – Visible

 lampe à décharge au deutérium : domaine 190 à 400 nm (UV)

 lampe à filament de tungstène : domaine 350 à 800 nm (Visible)

 lampe à décharge au xénon : domaine UV et visible = lampe flash

Figure 01 Schéma du spectrophotomètre à simple faisceau.

Il est nécessaire de faire un blanc lorsqu’on utilise un appareil monofaisceau.

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Principe d’un spectrophotomètre à double faisceau

La lumière est séparée en deux faisceaux avant d'atteindre l'échantillon. L'un

des faisceaux est utilisé comme référence et traverse un « blanc »
d'absorbance nulle ou connue, l'autre passe par l'échantillon. Le détecteur
alterne entre la mesure du faisceau échantillon et celui du blanc.

Figure 02 : Schéma du spectrophotomètre à double faisceau.

LES APPLICATIONS DE L’UV VISIBLE

A /Analyse qualitative

A-1-Identification et détermination de structure :

• Les informations qualitatives (max , min ,  ) fournies par cette méthode

peuvent parfois compléter les données obtenues par des techniques plus
puissantes telles que la spectroscopie dans l’infra-rouge, la
spectrométrie de masse, la RMN etc...
• Dans des conditions particulières, les spectres dans ultra-violet sont
utilisés pour une confirmation de structure ou pour une identification.

L’identification permet de confirmer l’identité de la matière première.

• On retrouve la spectrophotométrie d’absorption dans l’ultraviolet plus

particulièrement en 2ème identification, préconisée par la Pharmacopée
Européenne.

• Afin de se prononcer sur l’identité de la matière première, il faut que le

spectre ultraviolet de la substance réponde aux exigences de
l’identification :

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 • Longueur d’onde à laquelle on obtient le maximum d’absorption

• Absorbance spécifique au maximum d’absorption.

• La région spectrale dans laquelle a lieu l’analyse est indiquée dans la

monographie de la matière première.

A-2- Contrôle de pureté :

Pour un composé le coefficient d’absorption molaire est constant dans un

solvant donné. La valeur de  est liée à la pureté du produit.

 Si le composé pur est transparent et que l’impureté qu’il renferme

absorbe, l’absorbance va décroître quand la pureté augmente.

 Si le composé n’est pas transparent (), la valeur de  augmente avec

le degré de pureté du composé.

B/ Analyse quantitative

Elle est basée sur l’application de la loi de BEER-LAMBERT

A= ελ l c
- A : Absorbance (mesurée au moyen d’un spectromètre)
- l(cm) : Epaisseur de la solution traversée.
- C : Concentration molaire de la solution examinée
-  : Coefficient d’absorption molaire à la longueur d’onde  à laquelle on
fait la mesure.
-  est exprimée en mol-1.l-1.cm-1 . Il est propre au composé analysé

Autres expressions de la loi de BEER LAMBERT

A =logI0 /I  A= log1/T  A=2-logT%

I0 = intensité lumineuse de la radiation incidente

I = intensité lumineuse transmise
L = épaisseur de la cuve
T = transmittance = I /I0 (T est souvent exprimé en pourcentage)

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 Additivité des absorbances :

La loi de BEER LAMBERT est additive : A une longueur d’onde donnée

l’absorbance d’un mélange est égale à la somme des absorbances de
chaque composant du mélange pour cette longueur d’onde.

A= A1+A2 = L ( 1 C1 + 2 C2 )

A : absorbance d’un mélange de deux composés

A1 : absorbance du composé 1
A1 : absorbance du composé 2

 Si la concentration C est exprimée en gramme pour 100 ml de solution

(g/100ml), on remplace dans la loi de Beer-Lambert le coefficient
d’absorption molaire du soluté par le cœfficient d’absorption spécifique:

A = A 1%1cm l C

Selon La Ph E 8em Edition: Absorbance Spécifique

L’expression A1pour cent1cm représentant l’absorbance spécifique d’une

substance dissoute, se rapporte à l’absorbance d’une solution à 10 g/l
sous une épaisseur de 1 cm à une longueur d’onde déterminée d’où

Méthodes utilisées en analyse quantitative

a) Méthode directe

La substance à doser est la seule qui absorbe à λmax, le dosage est simple

A=  . l . c  c = A /  . l   = A/c .l

On effectue deux mesures :

 Sur la solution contenant le produit à doser : concentration

inconnue « Cx »

 = Ax/cx .l .....................(1)

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  Sur une solution du produit à doser à une concentration connue « C ».

 = A/c .l ......................(2)

(1) = (2) =  = Ax/cx .l = A/c .l  Cx = C.Ax /A Ax et A sont mesurées

directement.

b.) Méthode indirecte :

Deux cas se présentent :

- Premier cas Le composé à doser est présent dans une matrice dont certains
constituants absorbent dans le même domaine spectral.

Le composé est transformé par une réaction totale et spécifique en un dérivé

ont l’absorption est située dans une région du spectre libre de toute
interférence.

- Deuxième cas :Le composé à doser n’a pas de chromophore exploitable. On

fait apparaître un chromophore de remplacement par une dérivation de
l’espèce initiale selon le même principe que dans le cas précédent.

c) Dosage simultané de deux composés :

Un des avantages de la spectrométrie UV/Visible est celui de permettre le

dosage simultané de deux ou plusieurs composés colorés à condition que
chacun d’entre eux n’ait pas d’absorption importante pour la longueur d’onde
du maximum d’absorption de l’autre.

Mélange des deux substances

Substance pure C1 Substance pure C2

Figure 03 : Analyse
spectrophotométrique simultanée d’u mélange à deux composés..

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 1= maximum d’absorption du composé 1 dont la concentration est C1

2 = maximum d’absorption du composé 2 dont la concentration est C2

(A1)1 + ( A2)1 = A 1

(A1)2 +(A2)2 = A 2

Si 1et 2 sont les coefficients d ‘extinction molaire des composés 1 et 2 on peut

écrire :

A1 = l 11 .C1 + l21 . C2

2 équations à 2 inconnues C1 et C2

A2 = l 12 .C1 + l22 . C2

Remarque : 1 et 2 peuvent être déterminés en mesurant l’absorbance de

solutions pures de chaque composé.

d) Intérêt de spectrophotométrie UV en analyse quantitative :

Méthode rapide ayant :

 Vaste champ d’application : Composés organique, inorganique et

biochimique
- Analyse directe = pour le grand nombre de composés qui absorbent dans
l’UV et le visible.

- Analyse après transformation pour de nombreux composés non absorbants

 Grande sensibilité : limites de détention entre 10-4 et 10-5 M

 Bonne sélectivité : possibilité de trouver une  ou seul l’analyte absorbe

 Bonne précision : erreur de l’ordre de 1 à 5 

 Facilité de mise en œuvre et possibilité d’automatisation

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C/ Détermination des points de fin de titrage :

Les mesures spectrophotométriques dans L’UV /VIS peuvent être utilisées pour
déterminer les points de fin de titrage

-Condition nécessaire :

Au moins un des réactifs ou des produits de réaction soit absorbant -

-Appareillage :

Spectrophotomètre modifié de manière à placer le récipient où se fait le

titrage dans le trajet du faisceau lumineux

- Aspects des courbes de titrage : Différents cas peuvent se présenter.

Figure 04 : Aspects des courbes de titrage

Avec s = coefficient d’absorption molaire de la substance à doser

t = coefficient d’absorption molaire du réactif titrant

p= coefficient d’absorption molaire du produit de la réaction

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- Exemple : Application au dosage complexométrique des ions Ca2+ :

Ca2+ + In4- CaIn2-

CaIn2- + Y4- CaY2- + In4-

Choix de  du dosage : 630 nm seul l’indicateur In4- absorbe

- Absorption des espèces à 630 nm

Ca2+ = 0 [Cay] 2- = 0

 EDTA = 0 In4- = maximale

Figure 06 : Aspect de la courbe de dosage A = f(volume d’EDTA) à 630 nm

- Au début du dosage : l’absorption est due à l’excès d’indicateur In4-

- Au fur et à mesure de l’addition d’EDTA, l’indicateur In4- est déplacé du

complexe [CaIn]2- au profit de la formation du complexe [CaY]2-. L’absorbance
du complexe augmente jusqu’au point d’équivalence.

- après le point d’équivalence l’absorbance reste constante.

- Avantage de la méthode : Plus précise car ne fait pas appel à l’appréciation

visuelle d’un changement de couleur

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D) Détermination des pka :

- Principe : Méthode basée sur la modification des absorbances en fonction du

pH de deux espèces en équilibre.

« Méthode utilisée lorsque l’analyte est un acide faible ou une base faible »

- Exemple : Cas d’un acide faible AH

AH A- + H+

1-x x x

L’acide existe sous deux formes AH et A- dont les propriétés d’absorption sont
différentes :

- à pH=2 : L’acide est sous forme moléculaire AH m

- à pH =8 : L’acide est sous forme ionisée A- i

- à pH =5,5 : il y a équilibre et coexistence de AH et A. Le pH est donné par la

relation

pH = pka + log base  / acide d’où

pKa = pH – log base  / acide 

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Figure 07: Aspect des courbes d’absorption

 Tracés des courbes d’absorption aux trois valeurs de pH :

pH = 2 , pH = 5,5 , pH = 8

On constate que les différences d’absorbance sont maximales pour  = 358

nm qui est choisie comme  optimale.

 Détermination de i et m à  optimale

 A optimale = 358 nm en application de la loi d’additivité de BEER-Lambert :

Atotale = l i x + l (c-x) m à pH = 5,5

C = Concentration totale de l’acide

l = 1 cm

Atotale = i x + C m - m x

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X=AT-C m /i- m

(C-x)’ = Ci -AT/i - m

Am = C m = absorbance de la substance sous forme moléculaire à  = 358 nm

Ai = C m = absorbance de la forme ionisée à  = 358nm d’où

E/. Autres applications de la spectrométrie UV :

E.1. Spectrophotométrie dérivée : Technique spectrophotométrique

moderne

-Elle permet d’amplifier et de préciser les particularités des courbes spectrales.

-L’analyse du tracé de la dérivée comparativement au spectre initial permet de

mettre en évidence des différences que l’on ne pouvait observer sur les simples
spectres.

b) Qu’est –ce qu’un spectre dérivé :

Le spectre dérivé et la représentation graphique du quotient différentiel

A = f (λ)

En analyse courante on utilise les dérivées d’ordre 1,2 et parfois 4 , la dérivée

d’ordre 3 est peu ou pas utilisée.

c) Obtention des spectres dérivés

- La courbe dérivée est obtenue à partir d’un spectrophotomètre associé à un

système de calcul électronique, les softwares des spectrophotomètres
conduisent à des courbes dérivées à partir d’un algorithme.

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Le résultat est une amélioration de la structure du spectre qui permet
l’amélioration de la précision des dosages.

d) Aspects des spectres dérivés

 Courbes simples : courbe de GAUSS

Figure 08: Dérivée d’ordre 0

Trois points caractéristiques :

- A et B points d’inflexion de la courbe  annulation de la dérivée d’ordre 2 et

changement de pente.

- M (maximum de la courbe) à une annulation de la dérivée d’ordre 1.

Dérivées successives d’une courbe de Gauss

dérivée d’ordre 0 (A) puis ‘ordre 1 à 4 (Δ1 à Δ4)

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  Spectres réels :-

-Les spectres réels sont des courbes expérimentales résultant de la

superposition ,Il n’est pas possible d’en connaître l’équation et d’en calculer la
dérivée .

- Les spectres dérivés sont obtenus directement à partir d’un

spectrophotomètre associé à un système de calcul électronique.

-Le signal donné par le spectrophotomètre est automatiquement transformé

par l’électronique

Figure 09 : Spectre UV de la phényle alanine et courbe de la dérivée seconde

E-2 Analyse multicomposant (MCA) :

- Lorsque l’échantillon à étudier est un mélange, il est possible de le soumettre

à une analyse multicomposante sans séparation préalable des différents
constituants.

- La technique MCA est basée sur la connaissance des spectres d’absorption

individuels des différents composants et sur la loi d’additivité de BEER
LAMBERT

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E-3-Utilisation comme détecteur en chromatographie en phase liquide

La détection spectrophotométrique basée sur la loi de BEER LAMBERT est un

système largement utilisé dans la chromatographie liquide à haute
performance (CLHP)*.

Deux types d’appareils équipent les chromatographes

a) Les systèmes classiques : La source de lumière est monochromatique

b) Les systèmes perfectionnés : La source de lumière est

polychromatique :

Ces systèmes permettent la mesure simultanée des absorbances à plusieurs

longueurs d’ondes, ils sont dits à détection multicanal.

L’intérêt de ces systèmes est de permettre le dosage simultané de plusieurs

substances.

Principe : Emission par la source d’une lumière polychromatique dans le

proche UV/Vis.

Figure 10 : Principe du détecteur à barrette de diode

- Dispersion de la lumière transmise par l’échantillon à analyser par un réseau

sur un détecteur constitué par une « barrette » de diode (rangée de diodes
pouvant atteindre plusieurs centaines).Chaque diode indique l’absorbance
moyenne sur un intervalle très étroit de longueur d’onde (= 1 nm).

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