PCR - Polymerase Chain Reaction

Coût • Quantification parfois

ES
possible

AG
PROTE
AGINE
U X
30 - 60 €* • Détection d’agent patho-

NT
LTURE
VITICU *par pathogène gène avant l’apparition des

AVA
Délai symptômes
GRAND S
ES
RE
1 à 2 jours*
CULTU
URE
*délai de réponse du laboratoire :
HORTIC
ULT
• Détection d’ADN/ARN libre

TS
8 à 15 jours ouvrés
Fiabilité (cellules lysées, organismes

IEN
mort)
MARAIC
HAGE
4,5*

ÉN
• Prix pouvant être plus élevé pour
*établie selon une échelle relative
certains micro-organismes

V
en fonction des autres techniques

ON
• Risque de contamination par
d’autres ADN/ARN

INC
PRINCIPE 3’
G T A C A C T G G T G T G T A C T G G T A C A
5’

C’est une technique permettant de détecter C A T G T G A C C A C A C A T G A C C A T G T

RIES un agent pathogène responsable de la mala- 5’ 3’
BACTÉ
die. La présence d’un organisme cible se traduit
3’ 5’
C

dans cette méthode par l’amplification spécifique G T A C A C T G G T G T G T A C T G G T A C A

H
A
M

d’un ou plusieurs marqueurs moléculaires (ADN/

P

Dénatura(on de l’ADN à 98°C

IG

ARN). La PCR permet la détection d’une séquence5’ C A T G T G A C C A C A C A T G A C C A T G T

N
O

3’
N

cible d’ADN ou ARN d’un virus, d’une bactérie ou

S

ODES
NEMAT d’un champignon phytopathogène recherché. La3’ 5’
PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de poly- G T A C A C T G G T G T G T A C T G G T A C A
P
H

T G T G A
YT

Hybrida(on des amorces

mérase en chaine) repose sur l’amplification spécifique 5’ 3’ 3’ 5’
O
P

d’une séquence d’acide nucléique in vitro.

LA

C T G G T
C A T G T G A C C A C A C A T G A C C A T G T
SM

Chaque cycle de PCR s’effectue en 3 étapes : dénatura-5’ 3’

E
S

VI RU S tion thermique de l’ADN à 95°C, hybridation des amorces Polymérisa(on à l’aide de la Taq
polymérase à 72°C
Taq Polymérase
à 50-65°C, élongation à 72°C. 3’ 5’
G T A C A C T G G T G T G T A C T G G T A C A
T G T G A
3’
5’ 5’
3’
C T G G T
C A T G T G A C C A C A C A T G A C C A T G T
5’ 3’

Protocole de prélèvement des échantillons

• Prélever les organes suspectés malades ou des échantillons de sol et les stocker dans des sachets
• Annoter soigneusement les sacs individuellement
• Conserver au frais (4°C) et envoyer le plus vite possible (dans les 24h suivant le prélèvement)
• Préférer un envoi en début de semaine, par transporteur rapide, pour éviter le stockage durant le weekend
Contacter un laboratoire proposant ce service pour déterminer le type d’échantillon (nombre, nature...), le meilleur moment de prélèvement et
les informations complémentaires à envoyer (état de la parcelle, itinéraires techniques…)
 PCR - Polymerase Chain Reaction
Différents types de PCR
• La PCR en temps réel est basée sur une PCR classique mais une mesure de l’amplification est réa-
lisée tout au long de la réaction d’où le terme « en temps réel ». Elle est pseudo-quantitative contraire-
ment à la PCR classique.
• La RT-PCR permet de travailler à partir d’ARN qui est rétrotranscrit par une transcriptase inverse en
ADN complémentaire (ADNc). Ce dernier est utilisé pour réaliser une PCR .

PCR PCR en temps réel RT-PCR

1. Cycle PCR 1. Cycle PCR 1. Transcription inverse :

• Dénaturation thermique • Dénaturation thermique ARN en ADNc
de l'ADN à 95°C. de l'ADN à 95°C.
• Hybridation des • Hybridation des amorces 2. Cycle PCR
amorces à 50°C-65°C à 50°C-65°C • Dénaturation thermique
• Elongation à 72°C • Elongation à 72°C de l'ADN à 95°C.
• Hybridation des
2. Electrophorèse 2. Révélation en temps réel par amorces à 50°C-65°C
une sonde fluorescente • Elongation à 72°C
3. Révélation UV
3. Résultats et quantification 3. Electrophorèse

4. Révélation UV

Révélation des produits d’amplification de la PCR

La révélation est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose ou d’acrylamide. Elle peut également se
faire par émission de fluorescence. L’ADN était révélé historiquement par une coloration au bromure d’éthy-
dium. Aujourd’hui, l’agent intercalant le plus utilisé est le SYBR Safe.
Cette étape de la PCR repose sur la migration des acides nucléiques chargés négativement sous l’effet
d’un champ électrique. La séparation est réalisée lors du passage de l’amplicon (produits de l’amplification)
dans un gel d’agarose ou d’acrylamide. Les acides nucléiques migrent à travers le gel avec des vitesses
différentes selon le poids de la molécule.

Révélation en temps réel

La révélation d’une PCR en temps réel est réalisé grâce à une courbe de fluorescence. La valeur de la
fluorescence est corrélée à la quantité de produit amplifié. La PCR en temps réel repose sur la détection et
la quantification par un signal fluorescent. Il en existe 2 groupes : les agents intercalants (bromure d’éthy-
dium et SYBR®Green) et les sondes (Taqman, FRET, Molecular Beacons, Scorpion).