CCM 1 p1473 PDF

Chromatographie planaire.
Partie 1
par Antoine Michel SIOUFFI

Docteur ès Sciences
Professeur émérite à l’Université Paul Cézanne, Aix Marseille III
Chantal DAUPHIN
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Maître de conférences à l’université Paris XI
et Dominique PRADEAU
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Pharmacien responsable de l’Établissement pharmaceutique des Hôpitaux de Paris
1. Processus chromatographique............................................................. P 1 473 – 2

1.1 Comparaison de la chromatographie liquide sur colonne
et de la chromatographie planaire ............................................................. — 2
1.2 Domaine d’application de la chromatographie planaire .......................... — 3
2. Mise en œuvre d’une chromatographie planaire ............................ — 3
2.1 Géométrie de la couche de phase stationnaire......................................... — 3
2.2 Dépôt de l’échantillon.................................................................................. — 3
2.3 Développement des plaques ...................................................................... — 4
2.4 Méthodes de développement en chromatographie sur couche mince... — 6
2.5 Systèmes à flux forcé .................................................................................. — 8
3. Grandeurs fondamentales en chromatographie planaire ............. — 10
3.1 Caractéristiques de rétention...................................................................... — 10
3.2 Efficacité ....................................................................................................... — 11
4. Combinaisons phase stationnaire/phase mobile : mécanismes
de rétention ............................................................................................... — 15
4.1 Généralités ................................................................................................... — 15
4.2 Chromatographie d’adsorption sur gel de silice....................................... — 15
4.3 Chromatographie d’adsorption sur alumine............................................. — 17
4.4 Chromatographie sur cellulose et dérivés ................................................ — 17
4.5 Chromatographie sur polyamide ............................................................... — 17
4.6 Chromatographie sur silice greffée apolaire............................................. — 17
4.7 Chromatographie sur phases greffées polaires........................................ — 18
4.8 Chromatographie d’échange d’ions et d’appariement d’ions ................. — 18
4.9 Séparation d’énantiomères ........................................................................ — 19
4.10 Nature chimique des liants ......................................................................... — 19
4.11 Autochromatographie d’un mélange de solvants. Démixion .................. — 20
Chromatographie planaire : partie 2 ........................................................... P 1 474
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 474
es progrès réalisés dans le domaine des matériaux adsorbants, de l’instru-

L mentation, de la quantification et des possibilités de détection ont conduit à
une renaissance de la chromatographie planaire. La chromatographie en couche
mince (thin layer chromatography TLC) ne constitue pas uniquement une alter-
native économique, il s’agit d’une méthode pratique, rapide et fiable qui ne
nécessite pas des préparations d’échantillons très complexes.
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

est strictement interdite. − © Editions T.I. P 1 473 − 1
CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1 __________________________________________________________________________________________________
Elle est utilisée pour le « screening » en toxicologie clinique, en médecine

légale, en pharmacognosie.
Elle joue un rôle important dans le contrôle des produits pharmaceutiques
(identification, pureté, stabilité, dosage) et des produits alimentaires (recherche
d’impuretés toxiques).
Notations et Symboles Principales abréviations

Symbole Unité Définition CCM Chromatographie sur couche mince
As cm2 surface occupée sur l’adsorbant par une
molécule CLHP Chromatographie liquide sur colonne à haute
performance
B0 cm2 perméabilité de la couche
CP Chromatographie planaire
C mol · L−1 concentration du soluté
CG Chromatographie en phase gazeuse
dp µm diamètre des particules du milieu poreux
D m2 · s−1 coefficient de diffusion FID Flame ionization detection
e cm épaisseur de la couche HPTLC High performance thin layer chromatography
H (ou µm hauteur équivalente à un plateau OPLC Overpressured layer chromatography

HEPT) théorique
κ cm2 · s−1 constante de vitesse OPMLC Overpressured multi layer chromatography
k facteur de capacité TLC Thin layer chromatography

K coefficient de distribution du soluté
AMD Automated multiple development
L cm longueur de développement
N nombre de plateaux théoriques (ou

efficacité)
1. Processus
Rf rapport frontal
chromatographique
Rs résolution de la phase stationnaire
u cm · s−1 vitesse d’avancement du solvant

1.1 Comparaison de la chromatographie
VR cm3 volume de rétention liquide sur colonne
z cm distance de migration et de la chromatographie planaire
α sélectivité
La partie la plus importante d’un chromatographe est l’ensemble
γ N · m−1 tension superficielle du solvant phase stationnaire/phase mobile. Toute opération chromatographi-
que comporte :
θ ˚ angle de mouillage — la mise en mouvement de la phase mobile ;
— l’injection des solutés ;
εt porosité totale
— le processus chromatographique ;
η Pa · s viscosité du solvant — la détection des solutés.
En chromatographie liquide sur colonne à haute performance
σ2 variance (CLHP), la phase mobile est pompée dans la colonne et l’opérateur
est maître du débit ; l’injection est effectuée par une vanne à boucle
λ coefficient de tortuosité sans interruption du débit de la pompe et les solutés sont injectés
dans un système équilibré. Le processus chromatographique se
ω cm largeur des pics à la base déroule mais il n’est pas visible par l’opérateur. Les solutés séparés
sortent de la colonne, ils sont élués et détectés en continu. L’appa-
ν vitesse réduite du soluté reillage peut être totalement automatisé.
Une chromatographie planaire (CP) peut se dérouler de deux
façons selon que l’opérateur est maître ou non du débit de phase
Indices mobile.
f : front de solvant ; m : phase mobile ; s : phase stationnaire. ■ Dans le cas le plus classique, appelé chromatographie en couche
mince (CCM), le dépôt des solutés s’effectue à la surface de la

P 1 473 − 2 est strictement interdite. − © Editions T.I.
__________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1
phase stationnaire. On peut donc parler d’une injection latérale, à 2.1 Géométrie de la couche de phase
la différence de l’injection centrale réalisée sur colonne. Le dépôt
est préalable au mouvement de la phase mobile qui s’effectue par
stationnaire
capillarité, et une partie de la phase stationnaire, un côté de la
surface plane, est en contact avec l’atmosphère ; on est donc en La chromatographie sur papier spécial (matière fibreuse ou adsor-
présence d’un système à trois phases du fait de la présence de cette bante) qui peut être découpé avec des ciseaux à la dimension vou-
phase gazeuse. Le processus chromatographique est visible et peut lue n’est plus guère utilisée de nos jours que dans quelques cas
être interrompu à tout instant par l’opérateur s’il constate une particuliers comme la chromatographie des colorants.
anomalie. La différence la plus importante entre la CLHP et la CP est
que, dans ce dernier cas, les solutés ne sont pas élués ; c’est l’opé- En CCM, les plaques prêtes à l’emploi sont disponibles chez de
nombreux fabricants. Elles sont constituées d’un support inerte
rateur qui arrête le processus. Le chromatogramme est ainsi
rigide ou souple (plaque de verre, feuille d’aluminium, de polya-
préservé et la même phase stationnaire peut être utilisée pour une
mide, etc.) sur lequel la phase stationnaire est déposée sous forme
autre chromatographie avec un autre solvant après évaporation du
d’une couche mince (épaisseur de 200 à 250 µm).
premier. La détection ne se fait pas en continu et la plaque doit être
transférée vers un détecteur après avoir été débarrassée du Seules sont disponibles des couches de particules solides agglo-
solvant. La préservation du soluté permet de procéder à plusieurs mérées par un liant organique ou minéral qui sert également à assu-
détections et même à des réactions successives, opération délicate rer l’adhésion sur le support inerte. Il n’existe pas de plaques
à mettre en œuvre en CLHP. Il n’y a aucune possibilité d’automa- commerciales de phase stationnaire liquide déposée sur un support
tisation totale. solide. Il appartient à l’utilisateur de les préparer le cas échéant.
Avec des plaques prêtes à l’emploi, on ne peut réaliser que des chro-
matographies liquide/solide. Les dimensions habituelles de la sur-
■ Dans le cas de la CP à flux forcé, la phase gazeuse présente en face de la couche sont :
CCM est totalement éliminée et le système est tout à fait analogue à
une CLHP dont la colonne serait de forme parallélépipédique. On 10 × 5 cm 2 ( L × ) 10 × 20 cm 2 ( L × )
peut effectuer l’injection avant mouvement de la phase mobile, 10 × 10 cm2 20 × 20 cm2
comme en CCM, ou lorsque le système est équilibré, comme en
CLHP. Il en est de même de la détection qui peut être effectuée en On appelle nanoplaques ou plaques HPTLC (High Performance
continu ou en discontinu. Le chromatogramme peut être préservé Thin Layer Chromatography) des plaques de 10 × 10 cm2 ou de
ou non à la volonté de l’opérateur. Celui-ci est maître du débit car le 10 × 5 cm2 dont le diamètre des particules est beaucoup plus res-
liquide est pompé dans la colonne. La grande différence, outre la treint (5 à 7 µm) que celui des particules des plaques TLC (11 à
forme de la colonne, réside dans l’injection latérale. Les détecteurs 13 µm). Il existe aussi des plaques de silice monolithique où la silice
de CLHP peuvent être utilisés dans la CP à flux forcé. (préparée par un procédé sol/gel) est directement greffée sur le sup-
port. Cette technique est déjà expérimentée en chromatographie
liquide haute performance depuis 2001. Ces plaques appelées UTLC
(Ultra Thin Layer Chromatography), de silice monolithique greffée
sur un support en verre ont été mises sur le marché par Merck en
1.2 Domaine d’application 2002. L’épaisseur de la couche est de 10 µm. Le monolithe est carac-
de la chromatographie planaire térisé, comme en CLHP, par deux types de pores, les macropores (1
à 2 µm) et les mesopores (13 nm).
Les supports chromatographiques en vrac peuvent être utilisés
Tous les solutés qui peuvent être chromatographiés en CLHP peu- pour la fabrication artisanale de plaques par l’utilisateur. On trou-
vera dans des ouvrages spécialisés [1] [2] le protocole expérimental
vent l’être en CP. La CCM a souvent été utilisée comme technique
pour préparer les couches minces de phase stationnaire. La repro-
pilote dans la mise au point de systèmes chromatographiques CLHP.
ductibilité est très dépendante de l’habileté de l’expérimentateur et
En mode classique, la CP n’atteint pas les efficacités obtenues à
ne peut être comparée à celle des plaques prêtes à l’emploi. Cette
l’heure actuelle avec les colonnes remplies de très petites particules opération est réservée à des cas particuliers, lorsque la séparation
ou les colonnes capillaires utilisées en CLHP. La sélectivité peut être doit être réalisée sur une phase stationnaire peu commune (c’est le
très grande car la CP se prête mieux à la modification de l’ensemble cas des phases imprégnées de nitrate d’argent) qui n’est pas dispo-
phase mobile/phase stationnaire que la CLHP. La chromatographie nible sous forme de plaques prêtes à l’emploi. Ces dernières peu-
planaire seule permet la multichromatographie, c’est-à-dire la chro- vent être utilisées pour la CP à flux forcé moyennant une
matographie simultanée de plusieurs échantillons (jusqu’à 15 ou manipulation simple et rapide de préparation des bords de plaque.
20). Le temps d’analyse peut être très court (parfois en moins d’une
Dans le cas de CP à flux forcé avec des appareils non commer-
minute). La CP permet la détection postchromatographique par
ciaux, des procédures de remplissage d’une colonne de section
transformation chimique suivie ou non d’un chauffage, par réaction parallélépipédique ont été décrites [3] [4]. Pour les plaques prêtes à
microbiologique, par couplage avec la spectrométrie de masse l’emploi, on constate que le compactage des particules est bien
(couplage TLC-MALDI par exemple) (voir Chromatologie planaire, réussi. Des mesures de perméabilité comparées avec celles des
partie 2 [P 1 474]). colonnes CLHP ont montré que les valeurs sont tout à fait compara-
bles, c’est-à-dire 10−3 cm2 (selon la loi de Darcy).
Un cas particulier est constitué par les baguettes Chromarods®
(appareillage latroscan®). La couche n’est pas disposée sur une pla-
2. Mise en œuvre que mais sur la surface externe d’une baguette de 0,9 mm de diamè-
tre et 152 mm de long. L’épaisseur de la couche est de 75 µm.
d’une chromatographie
planaire 2.2 Dépôt de l’échantillon
Nous distinguerons le cas du mouvement de la phase mobile par Dans la CCM classique, la solution d’échantillon de substance à
capillarité et le mouvement à flux forcé. analyser est déposée à l’aide d’un capillaire calibré ou d’une

Figure 1 – Microchromatographie de spots déposés par

des micropipettes de 1 µL sur une plaque HPTLC : mélange
de colorants lipophiles dans différents solvants (doc. Merck)
seringue à une petite distance (1 cm en général) de l’extrémité de la

couche. Le volume déposé est très faible (1 à 5 µL) et il faut prendre
garde à ne pas détériorer la couche de phase stationnaire avec
l’extrémité de la seringue ou du capillaire.
La tache (ou spot) ainsi obtenue doit être aussi circulaire et petite
que possible. Le dépôt idéal est de l’ordre de 0,5 à 5 µL en CCM, de
50 à 500 nL en HPTLC (nanoplaques) et quelques nanolitres avec
des plaques UTLC. Les volumes transférables par de petits capillai-
res sont de 10 à 500 nL, ceux possibles avec les seringues vont de
10 nL à 100 µL. L’emploi d’aiguilles capillaires en silice fondue per-
met des dépôts d’un volume de 10 nL. Figure 2 – Appareil automatique de dépôt de l’échantillon
(doc Camag)
Lorsque la tache est grande, on constate une inhomogénéité

du dépôt et un début de chromatographie circulaire (figure 1).
Pratiquement, il faut effectuer le dépôt en solution dans un sol- 2.3 Développement des plaques
vant dont la force éluante est beaucoup moins forte que celle du
solvant de développement ; autrement dit lorsque la phase sta-
tionnaire est polaire, le dépôt doit être effectué dans le solvant le Dans une expérience de type CCM, la plaque est placée dans une
plus apolaire possible compatible avec la solubilité. cuve à développement avec le solvant (ou le mélange de solvants),
qui constitue la phase mobile.
Des appareils automatiques de dépôt de l’échantillon ou applica-

teurs sont commercialement disponibles (figure 2) : 2.3.1 Montée capillaire
— des déposeurs mécaniques utilisent des capillaires en verre à
usage unique à aiguille non biseautée, calibrés en volume allant de La couche poreuse peut être assimilée à une multitude de petits
0,5 µL, 1,0 µL, 2,0 µL, 5,0 µL à 10,0 µL fixés sur un stylet de manipu- capillaires interconnectés, et le liquide monte sur la couche en rem-
lation. Le dépôt doit être le plus fin possible pour les dépôts en plissant d’abord les capillaires les plus petits. On constate expéri-
bande et ne pas dépasser 6 mm de diamètre pour les dépôts mentalement que la relation entre la distance zf parcourue par le
circulaires ; front du solvant et le temps t est de la forme :
— des déposeurs automatiques utilisent une seringue calibrée
terminée par une aiguille ou un capillaire en acier inoxydable, asser- z f2 = κ t (1)
vie à une motorisation directe ou indirecte. Le dépôt est réalisé par
nébulisation sous gaz comprimé de l’échantillon au-dessus de la La vitesse du front du solvant est donc :
surface de la couche mince, sans contact. L’appareil permet d’effec-
tuer des dépôts ponctuels ou en bandes de longueur prédétermi-
née. Cette dernière technique est recommandée pour la dz κ
u f = --------f = -------- (2)
quantification. En effet, la précision du dépôt est de l’ordre de 0,5 % dt 2z f
pour des volumes de 5 µL.
Les dépôts en forme de traits peuvent être obtenus par l’emploi La constante κ est la constante de vitesse, elle a été explicitée et
de plaques à zone de concentration (figure 3). Une couche de kiesel- s’écrit :
guhr est juxtaposée à la couche de phase stationnaire sur le côté de
la plaque qui sera placé dans la phase mobile. Cette couche de kie- κ = − 2bB0dp(γ/η)cosθ (3)
selguhr n’ayant aucune propriété de rétention, le soluté est entraîné
avec b constante de proportionnalité entre la vitesse
par le solvant jusqu’à la couche où il se rassemble sous forme de
d’avancement du front du solvant dzf /dt et la
traits. Des volumes très divers (0,5 à 500 µL) peuvent être déposés à
vitesse locale de phase mobile, b est en général
la seringue ou avec le Linomat®.
de l’ordre de 0,8,
Dans le cas d’une CP à flux forcé, le dépôt de l’échantillon peut B0 perméabilité de la couche,
être réalisé de la même façon que précédemment ou au moyen
d’une seringue (ou d’une vanne) de façon analogue à la CLHP grâce dp diamètre des particules du milieu poreux,
à l’injecteur prévu à cet effet. Les principales caractéristiques
γ tension superficielle du solvant de viscosité η,
concernant le dépôt de l’échantillon sont regroupées dans le
tableau 1. θ angle de mouillage.

partie supérieure : dépôts des échantillons dans la zone de concentration et développement jusqu'au bord de la couche
partie inférieure : chromatogrammes obtenues dans les différents solvants
Distance parcourue par le front de solvant Zf = 70 mm
Figure 3 – Chromatographie dans différents solvants d’une solution de sept colorants lipophiles à 0,1 % déposés sur une plaque de gel de silice
(Silicagel 60) avec zone de concentration et développés dans une cuve sans saturation [42]
(0)
Tableau 1 – Dépôt des échantillons : caractéristiques
Nature du solvant de dépôt Utilisation

du solvant ayant la force éluante la plus faible vis-à-vis de l’éluant utilisé : évite l’amorce de chroma-
tographie lors du dépôt
Positionnement du dépôt 1 cm pour plaque CCM
par rapport au niveau 0,5 cm pour plaque HPTLC
du solvant Cela conditionne la reproductibilité des rapports frontaux
Dépôt en point : – 0,5 à 5 µL pour plaque CCM
Type de dépôt – 50 à 500 nL pour plaque HPTLC
Dépôt en trait étroit : pour toutes quantités et tous types de plaques
Analyse qualitative : un capillaire ou une microseringue
Analyse quantitative : amélioration de la reproductibilité, de la précision et de l’automatisation
Choix du mode de dépôt
3 simple dépôt (existe pour 8 plaques à la fois)
Échantillonneur
2 dépôts multiples automatiques avec une précision d’environ 1 % sur 5 nL
La constante κ dépend donc linéairement de dp (alors qu’elle La vitesse de montée du front du solvant est donnée par :
dépend de d p2 en CLHP) ; elle augmente ainsi avec la taille des
particules et est très dépendante de la répartition granulomé- 2bB 0 ρg
trique. Le choix des solvants est également déterminé par le u f = -------------- ⎛ γ cos θ – z f d p -------⎞ (4)
rapport γ/η. η zf ⎝ 12 ⎠

où ρ est la masse volumique du solvant et g l’accélération due à la

pesanteur.
Il est clair que, si la phase stationnaire n’est pas mouillée par le
solvant, cosθ = 0 et il n’y a aucune montée capillaire. Dans de nom-
breux cas, l’angle de mouillage est nul ; c’est vrai pour les solvants
organiques dans leur quasi-totalité, mais ce n’est plus vrai dans le
cas de solvants aqueux ou très associés qui doivent imprégner une
phase stationnaire hydrophobe. Le choix du solvant devient alors
plus restreint.
Exemple : dans le cas des plaques UTLC, la montée capillaire ne
peut guère dépasser 2 à 3 cm et les distances de migration sont plutôt
de l’ordre du centimètre.
Par ailleurs, la vitesse du front du solvant est la seule observable,
mais elle est différente de la vitesse de l’ensemble du solvant. Le
profil d’occupation de la couche n’est pas uniforme [5] du fait de la
montée plus rapide dans les petits capillaires. La région proche du
front du solvant n’est pas identique au reste de la plaque imprégnée
et il faut éviter que des solutés y migrent.
La détermination de la constante de vitesse s’effectue par Figure 4 – Développement dans une cuve normale : importance
linéarisation : de la phase vapeur
2lgzf =lgκ + lgt (5)

de mesurer la vitesse de montée du solvant et de porter sur un gra-
phe z 2/t en fonction de t (figure 6).
2.3.2 Influence de la phase gazeuse sur la vitesse
de montée capillaire Un bon solvant conduit évidemment à une droite parallèle à l’axe
des abscisses ; une pente positive ou négative indique si l’adsorp-
tion (qui augmente la vitesse) ou l’évaporation (qui la réduit) est le
■ On constate que la loi quadratique (1) n’est pas souvent respec- phénomène prépondérant et il faudra donc y remédier.
tée, en particulier lorsque la cuve de développement possède des
dimensions beaucoup plus importantes que celles de la plaque. Conséquence pratique : il faut toujours mesurer le temps de mon-
Cela est dû au fait qu’une partie de la phase est en contact avec tée du solvant pour savoir si celui-ci est bien reproductible.
l’atmosphère de la cuve.
■ Il existe de nombreuses techniques en CCM pour pallier cet
Lorsque le liquide monte par ascension capillaire, la surface de la inconvénient. L’une d’elles consiste à tapisser les parois de la cuve
plaque est mouillée, et un flux d’évaporation se produit perpendicu- de papier filtre. Le solvant monte par capillarité et, au bout d’un cer-
lairement à la direction de la migration du solvant. Inversement, la tain temps, l’atmosphère de la cuve est saturée en solvant. Il faut
présence de solvant dans la cuve de développement entraîne la pré- mentionner que l’introduction de la plaque déséquilibre le système,
sence inévitable de vapeurs qui peuvent s’adsorber sur la couche à moins qu’un montage identique à celui préconisé par Lamotte ne
poreuse sèche en remplissant l’espace intergranulaire ; le résultat soit utilisé [8]. Lorsque l’on travaille en système non équilibré, c’est-
est une imprégnation préalable de la couche et une accélération de à-dire que la cuve contient la quantité de solvant nécessaire et que
la vitesse de montée du front du solvant. Les deux effets antagonis- la plaque CCM est immédiatement mise en place, les données de
tes (évaporation et adsorption) sont souvent concomitants. La situa- rétention observées sont différentes de celles obtenues en cuve
tion classique est celle où le solvant se vaporise derrière le front et saturée avec des vapeurs de solvant [9]. L’influence de la vapeur de
s’adsorbe sur la couche encore sèche (figure 4). Selon [6], l’équation solvant peut être étudiée de façon systématique avec une cuve
générale s’écrit : Vario KS® (Camag).
V a – 2V e
z 2 = κ t 1 + ----------------------- t (6)
2e ε t ( 0 ) 2.4 Méthodes de développement en
chromatographie sur couche mince
avec Va vitesse d’adsorption des vapeurs de solvant par
unité de surface de la phase stationnaire,
Ve vitesse d’évaporation du solvant par unité de 2.4.1 Développement linéaire
surface de plaque humide,
e épaisseur de la couche, ■ La grande majorité des analystes continue d’utiliser la montée
capillaire, système dans lequel la plaque CCM est disposée vertica-
εt(0) porosité totale de la couche au temps t = 0, c’est- lement dans une cuve adaptée aux dimensions des plaques. Pour
à-dire à l’instant de l’introduction de la plaque éviter l’influence néfaste des vapeurs de solvant, des cuves sand-
dans la cuve. wich peuvent être utilisées : une plaque de support inerte (verre ou
■ Les allures de la courbe z = f(t) pour différentes situations sont tôle) est disposée à une petite distance de la couche de phase
données sur la figure 5. Elles expriment clairement qu’un phéno- stationnaire (quelques millimètres). Les montées de solvant sont
mène prépondérant (adsorption ou évaporation) peut affecter énor- très reproductibles mais il faut prendre garde à la chaleur d’adsorp-
mément la vitesse de montée du front du solvant. En particulier, tion de solvants volatils qui peut se traduire par la formation de
l’adsorption préférentielle du solvant le plus volatil dans le cas d’un gouttelettes.
mélange de solvants conduit au remplissage des pores avec un sol- Une chambre de développement automatisée a été proposée
vant différent de celui du développement, ce qui se traduit par une dans laquelle un capteur optique à double faisceau est activé lors-
modification de la composition de la phase mobile [7]. Un moyen que le front du solvant coupe le faisceau déclenchant automatique-
simple et pratique d’appréhender le phénomène prépondérant est ment la montée de la plaque et sa mise hors solvant [10].

p
κ
κ
κ
κ
Figure 6 – Mise en évidence des phénomènes prépondérants

d’adsorption et d’évaporation d’après [6]
La plaque est développée plusieurs fois, dans la même direction

(25 étapes maximum), en augmentant à chaque étape la distance de
migration. Le gradient débute avec le solvant le plus éluant, pour
lequel la distance de migration est la plus courte. On passe ensuite
à des solvants de polarité moyenne pour finir avec des solvants peu
éluants, et des distances de migration de plus en plus longues. Il se
produit une focalisation par reconcentration à chaque étape, les
courbe I Ve = 0 ; Va = 2 × 10 –5 . s –1 spots sont donc plus fins et cela permet un développement sur une
distance plus grande qu’en CCM classique (intérêt du séchage de la
Les grains de silice sont remplis au point A : εT = 0,40 plaque entre chaque migration). Cette technique a été employée,
La porosité totale vaut :
entre autres, dans l’industrie alimentaire pour la caractérisation des
εT = 0,30 au point C constituants des vanilles de différents pays. Le couplage de la CLHP
εT = 0,20 au point D avec l’AMD permet l’identification de 60 pesticides. Le principe de
εT = 0,10 au point E l’AMD est schématisé sur la figure 7.
courbe II jusqu'au point B Ve = 0 ; Va = 0

L'équation quadratique est vérifiée
courbe III Ve = 10 –5 cm . s –1 ; Va = 0
2.4.2 Développement circulaire
courbe IV Ve = 0 ; Va = 6 × 10 –6 cm . s –1
Les grains de silice sont remplis au point B : la porosité est de 0,30 Dans ce système, la phase stationnaire est disposée horizontale-
au point F. ment, la phase mobile arrive au centre de la plaque et se distribue
courbe V à partir du point B Ve = 0 ; Va = 0
uniformément par capillarité, ce qui produit une tache circulaire qui
s’agrandit si l’on continue l’alimentation en solvant.
courbe VI à partir du point B Ve = 10 –5 cm . s –1 ; Va = 0
Dans la chambre en U, la phase mobile est amenée sur la phase
Figure 5 – Effets combinés de l’adsorption et de l’évaporation stationnaire à l’aide d’une seringue actionnée par un moteur pas à
d’après [6] pas. Suivant le débit de sortie de solvant du capillaire, la taille de la
gouttelette formée peut varier.
■ Une autre façon de procéder à un développement linéaire con- La valeur limite du débit peut être atteinte lorsque la gouttelette
siste à disposer la plaque horizontalement ; le solvant arrive de n’est plus maintenue par sa tension superficielle. Un système adé-
deux côtés opposés de la plaque par une fente capillaire. Le proces- quat fait circuler, ou non, les vapeurs de solvant, permettant de tra-
sus de développement s’arrête lorsque les deux fronts se rencon- vailler dans des conditions de saturation ou d’insaturation.
trent. L’avantage de ce système est de permettre une occupation
totale de la couche d’adsorbant et de doubler le nombre d’échan-
tillons que l’on peut analyser. 2.4.3 Développement anticirculaire
■ Une variante du développement linéaire est constituée par le
développement multiple, dont la version la plus élaborée est le Dans ce procédé, le liquide vecteur se dirige de la périphérie vers
développement multiple programmé (PMD). Dans ce mode, la pla- le centre de la plaque. Pratiquement, un canal très étroit entoure la
que disposée verticalement (ou inclinée à 45˚) est développée plu- plaque : il est rempli de liquide et le transfert sur la couche est réa-
sieurs fois et, entre chaque développement, le solvant est évaporé lisé par capillarité. Dans ce système, la surface que doit mouiller la
avant de recommencer l’opération. phase mobile diminue à mesure que celle-ci avance. Ce montage,
Dans le développement multiple automatisé (Automated Multiple contrairement au précédent, permet une augmentation du nombre
Developpement - AMD) [11], le système est complètement automa- de dépôts sur la plaque et un passage plus aisé à la chromatogra-
tisé et l’évaporation du solvant est effectuée sous azote. phie préparative.

2.5 Systèmes à flux forcé
Grâce aux systèmes à flux forcés, l’opérateur cherche à s’affran-

chir de la capillarité et à se rendre maître de la vitesse de la phase
mobile. Le but immédiat est le gain de temps et le but ultime d’arri-
ver à un système quasi colonne.
2.5.1 Utilisation de la force centrifuge
Cette idée n’est pas nouvelle, mais elle a fait sa réapparition sous
la forme d’un appareil élaboré et fiable : le Rotachrom®. Il en existe
plusieurs versions.
■ Dans le mode le plus simple utilisé en préparatif et dérivé d’un
appareil plus ancien (Chromatotron®), la plaque tourne autour d’un
pivot central dans une enceinte. L’arrivée de solvant n’est pas effec-
tuée au centre à cause du pivot mais à environ 1,5 cm du centre.
L’enceinte n’est pas fermée et l’évaporation du solvant est considé-
rable. Pour les besoins analytiques, on utilise une microchambre
(MRPC : Microchamber Rotation Planar Chromatography) dans
laquelle la plaque est solidarisée et l’ensemble est mis en rotation.
La chambre est fermée, la phase gazeuse au-dessus de la phase sta-
tionnaire est réduite et son volume peut être ajusté suivant les
besoins de l’utilisateur.
Il s’agit donc d’un système saturé. Tous les types de plaques peu-
vent être utilisés et une préparation adéquate de la plaque permet
de fonctionner en mode anticirculaire et même en mode linéaire.
■ Dans l’ultramicrochambre (URPC), il n’y a plus d’espace pour la
vapeur de solvant car une plaque de caoutchouc est placée sous la
couche de phase stationnaire. La vitesse de la phase mobile peut
être modifiée (figure 8).
La migration du solvant est fonction de la vitesse de rotation et de
l’alimentation de la phase stationnaire. La vitesse maximale autori-
sée est définie par la quantité de liquide qui peut alimenter la couche
sans inonder la surface. À grande vitesse de rotation, la migration
du solvant suit une loi du premier degré en développement linéaire,
mais reste à peu près quadratique en développement circulaire.
Pour plus de détails on se reportera à la référence [12].
Figure 7 – Principe du développement multiple automatisé

(doc. Camag) Figure 8 – Coupe d’une ultramicrochambre (URPMC) [16]

2.5.2 Chromatographie sur couche mince

pressurisée OPLC
■ Le terme général OPLC (Overpressured Layer Chromatography),

ou Optimum Performance Layer Chromatography, est dû à Tyihak
et al. qui ont, les premiers, placé une plaque de CCM dans une
enceinte fermée sous pression [13]. Dans les années 1980, l’appareil
Chrompress est apparu sur le marché. La pression était assurée par
le pompage d’un volume d’eau. La phase mobile était ensuite forcée
à travers la phase de la couche mince.
Le OPLC 2e génération, version réactualisée de l’OPLC des années
1980 (OPLC-NIT Ltd), (figures 9 et 10) permet une élution isocrati-
que ou par gradient d’élution ternaire. Les plaques, disponibles
commercialement, sont chargées par la face avant. Une fois les pla-
ques introduites, l’utilisateur détermine les paramètres d’analyses :
pression, débit, élution isocratique ou à gradient. La plaque, isolée
de l’extérieur, se comporte exactement comme une colonne HPLC
qui serait extra plate. L’éluant est ensuite forcé à travers la phase sta-
tionnaire entraînant une meilleure résolution dans un temps d’ana-
lyse réduit.
Lorsqu’un liquide est forcé de passer dans une couche poreuse

initialement sèche, l’air déplacé par le liquide forme un second
front (front β). Ce front peut présenter un aspect chaotique, car il se
produit des microbulles provenant de la dissolution de l’air dans le Figure 9 – Appareil OPLC 2e génération de type cassette (cliché
liquide. La présence de solutés dans la zone comprise entre le front Bionisis)
du solvant (front α) et le front β doit être évitée.
■ L’emploi de pressions plus élevées (25 bar) permet l’utilisation de Pression

plaques de microparticules. Le débit peut donc être régulé de façon 50 bar
Solvant Sortie colonne
à obtenir une vitesse linéaire uniforme du liquide vecteur. Le sys-
tème permet de travailler de multiples façons : les échantillons peu-
vent être déposés sur la plaque sèche, la plaque positionnée dans
l’appareil, développée et la chromatographie arrêtée quand on le
juge nécessaire. Il est aussi possible, après que le système soit à Téflon
l’équilibre, d’injecter les produits à analyser à l’aide d’une seringue
Colonne
par l’injecteur prévu à cet effet, et d’éluer les produits ; une rigole
placée à l’autre extrémité de la plaque permet de rassembler le sol-
vant et de l’acheminer vers un détecteur analogue à un détecteur de Support métallique
CLHP et/ou un collecteur de fractions (ce qui évite tout grattage de
plaque et permet, entre autres, un couplage à la spectrométrie de
masse). L’appareil est donc propice à une détection en continu ou en a OPLC normal
discontinu au gré de l’utilisateur [14].
Par ailleurs, un développement continu peut être mis en œuvre Pression
50 bar
pour obtenir une meilleure résolution lorsque l’éluant utilisé donne Solvant
de faibles valeurs du rapport frontal Rf (§ 3.1) avec un bon pouvoir
de résolution pour les constituants de l’échantillon (Rf < 0,5). Ainsi,
les conditions opératoires utilisées en chromatographie liquide peu-
vent être transposées directement [15]. Seuls les paramètres opéra-
toires doivent être optimisés [16] tels que le débit de l’éluant, la
distance virtuelle de séparation parcourue, qui peut dépasser 20 cm,
la température de développement.
■ Enfin, une nouvelle version de l’OPLC utilisant deux, trois (ou
plus) plaques chromatographiques au cours d’un seul développe-
Support métallique
ment a été proposée par Tyihak et al. [17]. Cette technique
dénommée Overpressured Multi Layer Chromatography (OPMLC)
est très attractive en raison du nombre très important d’échantillons b OPLC bidimensionnel
(50 à 100 au moins) qui peuvent être séparés en une seule migra-
tion, la reproductibilité des performances de résolution étant tout à Figure 10 – Principe de la CCM à flux forcé (OPLC)
fait identique pour l’ensemble des plaques chromatographiques.
lieu de l’eau et a été prévu pour des arrivées orthogonales de liquide

2.5.3 Autres systèmes pressurisés vecteur [3]. De très hautes pressions peuvent être envisagées, mais
l’appareil construit ne fonctionne qu’en mode circulaire [18]. Un sys-
D’autres systèmes ont été décrits dans la littérature. Aucun n’est tème linéaire dont la géométrie de colonne ressemble à celle d’une
commercialisé à l’heure actuelle. Un appareil de dimensions beau- colonne de fractionnement par champ de force a été décrit ; la
coup plus restreintes que le précédent utilise l’air sous pression au grande originalité réside dans la détection électrochimique [4].

2.5.4 Autres méthodes d’entraînement de la phase ■ En CLHP, la vitesse de la phase mobile s’écrit :
mobile
L
u = ---- (9)
■ Shear Driven Chromatography (Chromatographie mue par t0
cisaillement) [19] : une plaque mobile tire une couche mince de
fluide qui passe devant une plaque supportant la phase stationnaire. et la vitesse d’une substance i à séparer :
En faisant glisser la partie mobile devant la partie fixe, la viscosité
du liquide permet d’établir un flux laminaire sans recours à une L
u i = ---- (10)
pompe ou à une différence de potentiel. Des vitesses linéaires éle- t ri
vées peuvent être atteintes dans des canaux très étroits.
■ Utilisation du flux électroosmotique : l’électrophorèse capillaire et t0 est le temps de rétention du composé inerte, c’est-à-dire le
l’électrochromatographie sont des techniques bien établies qui repo- soluté qui n’a pas d’affinité pour la phase stationnaire et t ri le temps
sent sur l’utilisation du flux électroosmotique, c’est-à-dire le mouve- de rétention du composé i.
ment d’un fluide sous l’influence d’une différence de potentiel très t0 doit être défini pour un soluté donné dans le cas d’un milieu
élevée. Le profil de vitesse engendré par un flux électroosmotique est poreux, car la phase mobile peut se trouver à la fois dans l’espace
plat, à la différence du profil parabolique engendré par une différence intragranulaire et dans l’espace intergranulaire au sein desquelles
de pression. L’application de ce principe à une couche mince date de les vitesses sont différentes. D’une façon pratique, on définit le fac-
1974 [20] : il s’agit d’une électrochromatographie. Celle-ci peut être teur de rétention :
pratiquée sur des couches minces sèches ou humides. La plaque est
disposée à plat. Deux électrodes sont placées dans deux réservoirs de t ri – t 0
phase mobile. Ces derniers sont disposés à deux extrémités k = --------------
- (11)
opposées, comme dans la chambre DS [21] qui peut ainsi être modi- t0
fiée à moindres frais. Les voltages appliqués sont de l’ordre de 2 kV/
cm. Avec des plaques commerciales de silicagel, on peut atteindre de ■ En chromatographie planaire à flux forcé avec élution des compo-
0,039 à 0,21 cm/s [22]. La phase mobile est un solvant polaire ou un sés, les substances sont caractérisées par la valeur du facteur de
mélange solvant/tampon. On peut obtenir jusqu’à 5 500 plateaux rétention. On prendra garde au fait que le facteur de rétention d’un
théoriques avec une distance de migration de 7 cm [23]. Une consé- système CP identique à un système CLHP n’est pas le même,
quence de l’application de voltages élevés est l’effet Joule, qui provo- puisque :
que l’évaporation de la phase mobile.
Vs
k = K -------- (12)
Vm
3. Grandeurs fondamentales avec K coefficient de distribution du soluté,

en chromatographie Vs/Vm rapport des volumes de phase stationnaire et de
phase mobile ; ce rapport n’est pas forcément le
planaire même dans l’un et l’autre cas puisque la
géométrie du système n’est pas identique..
■ En CCM classique, il n’y a pas élution, l’opérateur arrête le mou-
3.1 Caractéristiques de rétention vement du solvant. Après un temps t0, le front du solvant a parcouru
la distance zf et la zone de soluté i la distance zi. On appelle rapport
frontal Rf la quantité zi /zf.
Dans tout processus chromatographique, la phase mobile est ani- Rf est donc un nombre sans dimension comme k, mais il ne peut
mée d’une vitesse u ; les substances à séparer sont retenues par la être caractéristique de la substance que si les paramètres expéri-
phase stationnaire et cheminent à une vitesse inférieure à u. mentaux sont bien maîtrisés. Rf est compris entre 0 et 1 et l’on uti-
lise quelquefois hRf = 100Rf, de même que :
■ En chromatographie en phase liquide sur colonne, le solvant per-
cole à travers la colonne et : 1 – Rf
R M = lg ⎛ ---------------⎞
⎝ R ⎠
4Q f
u = --------------- (7)
πd c2 ε t
Un calcul simple montre que :
avec Q débit affiché à la pompe, 1–R
dc diamètre interne de la colonne, k = ---------------f (13)
Rf
εt porosité totale, lorsque la colonne est remplie.
On peut aussi écrire : si le rapport des volumes des phases en CP et en CCM est identique.
Un facteur ξ (de l’ordre de 1,1 à 1,2) peut être ajouté pour tenir
d p2 ∆P compte du non-respect de la loi quadratique de montée du solvant :
u = B 0 --------------- (8)
ηL
⎛ ( 1 – R f )⎞
R M = lg ⎜ ξ -------------------⎟ (14)
avec ∆P/L gradient de pression sur la colonne de longueur ⎝ Rf ⎠
L,
dp diamètre des particules du milieu poreux, ■ En chromatographie circulaire, on écrit :
η viscosité du solvant,
R f circ = R f lin
B0 la perméabilité de la couche.

Cette relation n’est toutefois correcte que si le dépôt de l’échan-

tillon est identique au point d’arrivée du solvant. Si r est la distance
entre les deux, on écrit :
R f circ = R f lin ( 1 + 2r ) + r 2 – r
Dans le cas du développement anticirculaire, on écrit :
R f lin = 1 – ( 1 – R f anticir ) 2
■ Dans tous les cas, la substance est détectée et l’on considère que la
rétention de la substance est prise à la moyenne de la distribution.
Dans une chromatographie bien conduite, la distribution du soluté suit
une loi de Poisson à très faible dissymétrie assimilable à une loi gaus-
sienne. L’enregistrement de la distribution est effectué par le détecteur
(cf. le dossier Chromatographie planaire : partie 2 [P 1 474]).
Pour l'OPLC la vitesse de migration du solvant est constante (absence
de phase vapeur) et le temps d'analyse est réduit à 15 min.
3.2 Efficacité
3.2.1 Hauteur équivalente à un plateau théorique
■ En chromatographie à flux forcé, l’équation de Van Deemter (ou

l’équation de Knox), qui donne une expression de la hauteur équiva-
lente à un plateau théorique, est applicable :
B
H = A + ---- + Cu (15)
u
avec H hauteur équivalente à un plateau théorique (ou

HEPT), H = L/N,
L longueur de la colonne en cas d’élution ou
longueur du développement,
N nombre de plateaux théoriques ou efficacité.
Les termes A, B et C sont liés respectivement à la diffusion tour-
billonnaire, à la diffusion moléculaire et au transfert de masse. En
pratique, on peut utiliser, comme en CLHP, l’équation de Knox écrite
en nombres sans dimension sous la forme :
B
h = A ν 1 / 3 + ---- + C ν (16)
ν
avec h hauteur réduite h = H/dp,

ν vitesse réduite ν = udp/Dm,
Dm coefficient de diffusion du soluté dans la phase
mobile.
En CP à flux forcé, la HEPT est indépendante de la distance de
migration, et l’efficacité la plus grande est obtenue avec des particu-
les de granulométrie faible et de répartition très serrée.
Étant donné la forme des équations (15) ou (16), il existe une
vitesse de phase mobile optimale qui correspond au minimum de la
courbe de HEPT. Il a été observé expérimentalement que la valeur
optimale décroît en fonction de la distance de migration et ne
devient constante que pour des distances de migration supérieures
Figure 11 – Caractéristiques comparées de l’OPLC
à 25 cm, ce qui est rarement le cas en pratique. Des hauteurs de pla-
teau de 8 µm ont été observées, ce qui correspond à environ
30 000 plateaux sur une distance de migration de 25 cm. Cela est à la loi de Gauss, on peut définir une hauteur locale H de plateau
tout à fait comparable à ce qui est observé en CLHP. Le problème de théorique :
l’injection du soluté devient crucial, mais il peut être maîtrisé en uti-
lisant la technique de compression de pic au moyen d’un solvant d σ2
plus éluant. Les principales caractéristiques de l’OPLC sont rassem- H = ---------- (17)
dz
blées dans la figure 11.
■ En CCM classique, la vitesse du solvant n’est pas constante et la avec dσ2 accroissement de la variance,
longueur de la colonne est variable. Si la distribution du soluté obéit dz accroissement de la distance de migration.

La hauteur de plateau moyenne est définie par :

H
∫
z
H dz
z0 σ2
H = ------------------------
- = ------------------------- (18)
∫
z
( z – z 0 )R f
R f dz
z0
où z0 est la distance entre le spot et le niveau du liquide.

En considérant que la plaque chromatographique possède les
mêmes propriétés qu’une colonne de CLHP, que les coefficients de
l’équation de Knox peuvent donc être utilisés, et que le profil de con-
centration de la phase mobile est constant (ce qui exclut la zone près
du front), on peut écrire :
∫
z=L
H dz
H = -------------
- (19)
z0 L – z0
avec L la longueur du développement, analogue à la longueur de la

colonne en CLHP [24].
La hauteur de plateau en fonction de la distance de développe-
ment est donnée par l’équation de Guiochon [25] :
5 / 3 1 / 3 L2 / 3 – z 2 / 3 Cyd p3
B 3 Ad p y 0
H = ---------- [ L + z 0 ] + --- --------------------------- ⋅ --------------------------- + -------------------------------- ln L ⁄ z 0 (20)
yd p 2 ( 2D ) 1 / 3 L – z0 2D ( L – z )
m m 0
que l’on peut écrire sous la forme :
a c
H = b ( L + z 0 ) + -------------- ( L 2 / 3 – z 02 / 3 ) + ------------------- ln L ⁄ z 0 (21)
L – z0 ( L – z0 )
B Figure 12 – Hauteur équivalente à un plateau théorique en fonction
avec b = ---------- , de la distance de développement [25]
yd p
3 d p5 / 3 y 1 / 3
a = --- A ------------------------- ,
2 ( 2D m ) 1 / 3
3.2.2 Hauteur équivalente à un plateau théorique
en fonction de la longueur de développement
Cyd 3
c = --------------p- .
2D m
À partir de l’équation (20), on peut tracer les courbes H = f(L) en se
y est un coefficient lié à la constante de vitesse κ du solvant et à fixant un diamètre de particules, une valeur des coefficients de diffu-
ses propriétés physiques, sion, etc., comme il est présenté sur la figure 12.
A, B et C sont analogues aux coefficients des équations (15) et Exemple : la courbe H = f(L) tracée pour des particules de 30 µm
(16). est particulièrement instructive, car elle montre que la meilleure effica-
cité est atteinte pour une distance de développement de 10 cm. Cela
A est un coefficient de compacité tout à fait analogue à celui de la
avait été constaté expérimentalement et, dans tous les manuels fai-
CLHP, et sa valeur est de l’ordre de 1 pour les plaques prêtes à
sant allusion aux plaques en usage à la fin des années 1980, il était indi-
l’emploi disponibles commercialement.
qué que 10 cm était la distance de migration à utiliser.
Le terme de diffusion B s’écrit :
On constate que plus la granulométrie des particules est faible,
( 1 – Rf ) plus la distance de migration fournissant la meilleure efficacité est
B = 2 λ m D m + ------------------- λ s D s
Rf petite. Autrement dit : les plaques constituées de petites particules
doivent être développées sur de très courtes distances, les plaques
de grosses particules doivent être développées sur des distances
avec λm et λs coefficients de tortuosité dans la phase mobile et
plus longues. Avec les plaques UTLC, on ne dépasse pas 2 cm. On
la phase stationnaire,
voit clairement que, toutes choses étant égales par ailleurs, les pla-
Ds coefficient de diffusion du soluté dans la phase ques de particules plus grosses peuvent (dans certains cas) être plus
stationnaire. Les études effectuées ont montré efficaces que les plaques HPTLC (plaques de petites particules). Il
que le terme B était prépondérant lorsque des faut toutefois être prudent car les courbes H = f(L) font abstraction
plaques de petites particules sont utilisées, de la nature du détecteur qui peut être capable tout aussi bien de
C est un terme de transfert de masse dont la valeur restituer la séparation que de la déformer. De même, on considère
est analogue à celle observée en CLHP de 0,01 à que la variance due à l’injection ne dépasse pas 10 % de la variance
0,1. totale.

Rfi correspondant à la tache de plus grande mobilité.

Le nombre de plateaux étant proportionnel à Rf, il est pratique de
définir une efficacité N′ de la couche :
N = N′R f
où N′ est un coefficient de proportionnalité correspondant au nom-

bre de plateaux hypothétiques observés avec un soluté non retenu.
C’est la différence des coefficients de distribution K = Cs/Cm du
soluté entre la phase mobile et la phase stationnaire qui assure la
séparation, donc :
Kj – Ki ∆K α–1
---------------- = -------- = ------------- (25)
Ki Ki α
avec α facteur de sélectivité.

Si les deux taches ne sont pas très éloignées (Rfi ≈ Rfj ≈ Rf), on a :
∆K ∆R f ∆R f
-------- = ----------------------------
- = -------------------------
- (26)
Ki R fj ( 1 – R fi ) ( 1 – R f )R f
La combinaison des équations (24) et (26) permet d’écrire :
N ∆K
R s = -------- -------- ( 1 – R f ) (27)
4 K
ou
N′ ∆K
Figure 13 – Résolution et capacités en pics [42] R s = ---------- -------- ( 1 – R f ) R f (28)
4 K
Le coefficient de diffusion étant le terme prépondérant, on voit La variation de Rs en fonction de Rf montre que la courbe passe
clairement à partir de ces courbes que les solutés de coefficient de par un maximum pour Rf = 0,33 (figure 14).
diffusion élevé sont mal séparés sur des couches de petites particu-
les si l’on prolonge le développement. Par contre la situation est
beaucoup plus favorable lorsqu’on utilise des particules de Le nombre de plateaux nécessaires pour réaliser une sépara-
dp = 20 µm, par exemple (figure 13). Il importe donc de choisir le tion est donné par la relation de Purnell :
solvant, le diamètre de particules et la longueur du développement
à partir de la nature des solutés à séparer. α2 1
N min = 16R s -------------------- ---------------------- (29)
( α – 1 )2 ( 1 – Rf ) 2
3.2.3 Résolution et capacités en pics
3.2.4 Sélection des conditions opératoires

Par définition, la résolution entre deux zones chromatographi-
ques i et j de distribution gaussienne est donnée par [26] : Quel est le type de plaques (petites particules HPTLC ou particules
plus grosses TLC) et la longueur du développement à utiliser pour
( zj – zi )
R s = 2 ------------------- (22) obtenir la séparation désirée ?
ωi + ωj
avec zi et zj distances de migration,

ωi et ωj largeurs de pics à la base.
Par définition zi = RfiL.
Le nombre de plateaux pour une tache donnée s’exprime par :
R fi L 16 ( z i ) 2
N = ----------
- = ------------------ (23)
H ( ωi )2
en effet, pour une chromatographie quelconque, on a H = σ 2/L, et la

résolution s’écrit :
N ∆R f Figure 14 – Variation de la résolution entre deux composés

R s = -------- --------- (24) en fonction de la rétention du composé le plus retenu dans le cas
4 R fi
Rf1 ≈ Rf2

■ En CLHP (et donc en CP à flux forcé), le nombre de plateaux

(0)
nécessaires à la séparation peut être calculé par l’équation de Pur- Tableau 2 – Calcul de la capacité en pics
nell (29) et Nmin = L/H.
L − z0
■ En CP ou CCM classique : dp (cm)
(µm)
Rf L 2 5 10
N min = --------
- (30)
H 5 16 20 21
■ Si le terme C de l’équation de Knox (16) est négligeable, on peut 10 13 19 24
écrire en CP à flux forcé : 20 9 14 19
h = Aν1/3 + B/ν avec y = 120
Dm = 5 × 10−5 cm2/s
H = bL + aL2/3 (31)
si z0 est négligeable devant L ; (cela n’est pas exact lors de déve- Le tableau 2 donne le résultat de ce calcul pour quelques lon-
loppements très courts mais est toujours exact avec des plaques à gueurs de développement.
zone de concentration.) Une autre façon d’évaluer la capacité en pics est d’utiliser le nom-
bre de séparation Ns dont l’expression est donnée par :
■ La longueur du développement et le diamètre des particules sont
déterminés par l’intersection de la courbe H = f(L) et de la droite pas- Ns = lg(b0/b1)[lg[(L − b1 + b0)/(L + b1 − b0)]] (36)
sant par l’origine, de pente Rf /Nmin. Si cette dernière n’a aucune
intersection avec les courbes H = f(L), la séparation n’est pas possi- b0 et b1 sont les largeurs des spots (pris à mi-hauteur sur le chroma-
ble en CCM. togramme) de Rf = 0 et Rf = 1 obtenus par extrapolation à partir de
valeurs intermédiaires. Le nombre de séparation obtenu par ce cal-
Exemple : la séparation des chrysène, benzo (e) pyrène, benzo (a) cul est supérieur à la capacité réelle en pics.
pyrène exige 180 plateaux pour que l’on obtienne une résolution de 1
(Rf respectifs : 0,30 ; 0,23 et 0,20).
Les plaques de dp = 7 µm développées sur 2 cm seulement convien- 3.2.5 Développement bidimensionnel suivant deux
dront à la séparation avec un solvant acétonitrile (y = 70 sur une plaque directions perpendiculaires
hydrophobe, coefficient de diffusion : Dm = 5 × 10−5 cm2/s).
La résolution en CP à flux forcé est définie comme précédem-
Le développement bidimensionnel est une caractéristique tout
ment. Étant donné que l’on peut considérer N comme constant,
à fait unique de la chromatographie planaire. Lorsqu’une migra-
l’équation de Purnell est applicable :
tion a été réalisée et que l’échantillon de départ a été déposé à l’un
des coins, le solvant peut être évaporé et la plaque placée dans
N ( α – 1 ) k j′ une autre cuve contenant un solvant différent. Les solutés sépa-
R s = -------- ----------------- -------------- (32)
4 α 1 + kj rés dans le premier développement constituent autant de spots
d’injection et les constituants non résolus par le premier solvant
de développement peuvent être séparés par le second.
k j′ étant alors le facteur de capacité du soluté le plus retenu.
Il est clair que les deux systèmes chromatographiques doivent être

La capacité en pics est le nombre maximal de composants aussi différents que possible, sinon les solutés se distribuent suivant
d’un mélange pouvant être séparés avec une résolution de 1, en une diagonale. Si n1 est la capacité en pics obtenue lors du premier
comptant les pics à partir du composé non retenu. La capacité développement, n2 la capacité en pics obtenue lors du deuxième
en pics excède les besoins de l’analyste dans les colonnes à très développement, la capacité en pics observée doit en principe être :
haute résolution, mais il n’en est pas de même en CP du fait des
2n = n 1 n2
dimensions limitées de la plaque.
ce qui surpasse de loin toutes les possibilités de colonnes de chro-
Si dn est le nombre de pics sur la distance dz et 4σ = ω la largeur matographie gazeuse ou de colonnes de chromatographie liquide
du pic gaussien, on a : mises en série. En pratique, 2n est inférieur au produit n1n2 pour
deux raisons.
dz
dn = ------- (33) ■ Lors du deuxième développement, le spot (qui a été chromato-
4σ graphié avec le premier solvant) possède une largeur caractérisée
par σ qui est supérieure à l’écart-type d’injection de départ σinj.
Guiochon [25] a tenu compte de la variation du nombre de pla-
teaux avec la longueur du développement. Sachant que la variance Il s’ensuit que la capacité en spot dans le deuxième développe-
observée σ 2 peut s’écrire : ment est inférieure à 2n. Avec des plaques de petites particules, le
processus diffusionnel est majoritaire, alors :
σ 2 = σ inj
2 + zH (34)
2 λ 1 D m1 L 12
σ 12 = σ inj
2 + 2λ D
1 m1 t 1 = σ inj + ----------------------------
2 (37)
somme de la variance due à l’injection σ inj
2
et de celle due au pro- κ1
cessus chromatographique, la distance entre deux spots successifs
p et p + 1 séparés avec une résolution de 1 est égale à 4σp, diamètre avec Dm1 coefficient de diffusion dans la phase mobile,
du spot p : L1 longueur du premier développement réalisé dans le
temps t1 avec une constante de vitesse κ1,
n n+1 λ1 coefficient de tortuosité.
∑ 4 σp L – z0 ∑ 4 σp (35)
■ Par ailleurs, durant le deuxième développement, les taches aug-
p=0 p=0
mentent aussi en largeur. Elles doivent donc être séparées avec une

1–ε
résolution supérieure à l’unité au début du second développement, ε = --------------T où εT est la porosité totale. ε est le
pour que la résolution unité soit observée à la fin. Une partie de la εT
résolution observée durant le premier développement est perdue coefficient de dispersion qui est souvent assimilé au
dans le second. En tenant compte de tous ces facteurs, on écrit : coefficient de diffusion D ; c’est le cas en particulier
dans la phase stationnaire où l’on écrit :
2 λ 2 D m2 L 22
σ 22 = σ inj
2 + R L H + ----------------------------
f1 1 (38) δC δ 2 Cs
κ2 ---------s = D s ------------ (41)
δt δz 2
et Il est donc capital de connaître le coefficient de distribution du
2 soluté entre les deux phases :
C
2 L dp K = -------s-
n = --------------------------------------------------------- = ---------------------------------------------
- (39) Cm
D m1 D m2 D m1 D m2
4 2 λ ---------- - + ----------- L 2 32 λ ----------- + ----------- En chromatographie liquide/solide, la courbe Cs en fonction de Cm
κ1 κ2 y1 y2
s’appelle une isotherme. Celle-ci peut avoir trois allures possibles :
linéaire, convexe ou concave. Dans ces deux derniers cas, il existe
Le tableau 3 donne quelques valeurs de 2n en fonction de la lon- toujours une partie linéaire aux faibles concentrations.
gueur de développement et du diamètre des particules.
(0)
La figure 15 donne l’allure de la distribution du soluté dans les
phases suivant l’allure de l’isotherme. On en déduit deux consé-
quences pratiques : suivant l’allure des isothermes, une diminution
Tableau 3 – Valeurs de 2n en fonction de la longueur (ou une augmentation) de la rétention en fonction de la quantité de
de développement L et du diamètre des particules dp substance injectée est observée, ainsi que l’évolution de la forme de
la tache au cours du développement : à une isotherme concave cor-
dp respond une tache à tête floue, à une isotherme convexe une tache
L (µm) suivie de traînées.
(cm)
5 7 10
2 144 144 110
4.2 Chromatographie d’adsorption sur gel
3 196 196 169 de silice
5 225 256 240
7 256 289 289
■ Un gel de silice est un agrégat de microparticules dont la surface
En CP à flux forcé, le problème majeur est l’élimination du solvant est recouverte de groupements silanols (figure 16).
du premier développement. Un rétrobalayage par de l’hélium peut Le gel de silice, comme tout adsorbant, est caractérisé par :
être utilisé, mais cette solution n’est pas satisfaisante.
— la granulométrie, c’est-à-dire le diamètre moyen des
particules : il existe des particules de toutes les tailles à partir de
3 µm ; les diamètres de particules les plus utilisés en CP sont à
l’heure actuelle 5 µm (plaques HPTLC) et 11 µm (plaques TLC) ; plus
4. Combinaisons phase la répartition granulométrique est étroite (monodisperse), meilleure
est la compacité de la couche et meilleures sont les propriétés
stationnaire/phase mobile : chromatographiques ;
— la surface massique ou surface spécifique exprimée en m2/g :
mécanismes de rétention plus celle-ci est élevée, plus la rétention est grande ;
— le diamètre des pores exprimé en angströms : en général, les
gels de silice de CP sont des Si 60 ou Si 100 (c’est-à-dire 60 Å ou
100 Å) ; il existe toutefois d’autres diamètres de pores dans les cata-
4.1 Généralités logues des manufacturiers (jusqu’à 50 000 Å) ;
— la morphologie, c’est-à-dire la forme des particules : sphéri-
ques ou irrégulières ; ces dernières sont les plus utilisées ;
Les molécules de soluté sont considérées comme immobiles — la nature hydroxylée de la surface qui rend le gel de silice hygros-
lorsqu’elles sont dans la phase stationnaire, et en mouvement à la copique et permet à l’eau de se fixer (figure 17). La première couche
vitesse de la phase mobile lorsqu’elles sont dissoutes dans celle-ci. d’eau se fixe par chimisorption et est souvent difficile à enlever. La
Toutefois, la fixation sur la phase stationnaire (adsorption ou deuxième couche d’eau est complètement éliminée par chauffage à
absorption) se réalise sans que la molécule de soluté perde son l’étuve pendant une nuit à 110 ˚C, et la dernière couche d’eau provient
identité. Il y a formation d’une liaison faible. L’expression générale de l’humidité ambiante. Suivant la teneur en eau de l’adsorbant, celui-
de l’équation différentielle de la chromatographie est : ci est plus ou moins « actif ». Il n’existe pas, comme en CLHP, de
méthode de contrôle de l’activité. La méthode la plus utilisée consiste
à travailler en atmosphère à humidité contrôlée et à vérifier le temps de
δC m uδC m δC s δ 2 Cm
----------- + ---------------- + ε --------- – ε -------------- = 0 (40) montée de la phase mobile. Un chauffage prolongé à des températures
δt δz δt δz 2 supérieures à 150 ˚C altère la nature de l’adsorbant, car deux silanols
opposés dans un pore étroit peuvent réagir suivant :
avec z abscisse de la zone de produit,
> 150 °C
C concentration du soluté à l’instant t dans la phase Si OH + HO Si
mobile Cm et dans la phase stationnaire Cs,
Si O Si
u vitesse de la phase mobile, siloxane

I II III
I
II
III
Figure 17 – Nature hydroxylée de la surface : température

d’élimination des différentes couches d’eau
■ En CP à flux forcé, les procédures connues de contrôle de l’humi-

dité du support par percolation d’un mélange de solvant sec et de
solvant humide en proportions déterminées peuvent être mises en
œuvre.
L’adsorption sur gel de silice est réalisée par interaction de type
accepteur-donneur. Suivant la force et le nombre de liaisons hydro-
gène possibles entre le soluté et le solide, la rétention est plus ou
moins forte. Le nombre de liaisons hydrogène est évidemment fonc-
tion de la surface de l’adsorbant et des possibilités du soluté.
L’ordre d’adsorption des groupements fonctionnels est le
suivant :
méthyl<fluoro<chloro<nitro<aldéhyde<acétyle<hydroxy<cétone<amino<carboxyle
Pour que la molécule de soluté ait un rapport frontal non nul, il

faut qu’elle soit entraînée par la phase mobile. Snyder a développé
la théorie du déplacement :
( X )m + n ( M )s ! ( X )s + n ( M )m
Une molécule X de soluté dans le solvant doit déplacer n molé-

cules M de solvant préalablement adsorbées. L’équation générale de
la mobilité décrite par Snyder est :
Va W
R M = lg k = lg ⎛ -------------⎞ + β ( S 0 – ε 0 A s ) + Σ int. sec. (42)
⎝ V ⎠
m
avec As surface occupée sur l’adsorbant par une

molécule de solvant,
S0 grandeur sans dimension directement liée à
l’enthalpie d’adsorption du soluté,
Va volume de la couche monomoléculaire de
solvant adsorbé,
Vm volume total de la phase mobile,
W masse de l’adsorbant,
β activité de l’adsorbant définie de façon
Figure 15 – Allure de la distribution du soluté dans les phases empirique,
suivant l’allure de l’isotherme [43] ε0 énergie d’adsorption des molécules de solvant
par unité de surface d’adsorbant,
Σ int. sec. interactions secondaires, en particulier au sein
de la phase mobile.
Il est donc évident qu’un solvant convenable doit pouvoir
déplacer les solutés en ayant une affinité marquée pour la phase
adsorbante. La mesure de cette affinité est donnée par ε0 qui est
appelé la force éluante du solvant. On a classé les solvants suivant
ε0 croissant en prenant pour base l’hexane dont la force éluante est
Figure 16 – Structure d’un gel de silice arbitrairement fixée à 0 (pour la silice et pour l’alumine).

■ Le classement par ε0 croissants est appelé série éluotrope. Ainsi, La règle d’additivité de Martin indique que, dans un système
la stratégie de sélection d’un solvant est fondée sur cette série donné de deux phases, l’introduction d’un groupement i dans une
éluotrope dans laquelle Snyder a classé plus de quatre-vingts sol- molécule change la valeur de RM d’une valeur constante dépendant
vants dans huit groupes selon leurs propriétés d’accepteur de pro- de la nature et de la configuration stérique du groupement introduit
tons, de donneur de protons et leurs interactions dipolaires [27]. À mais pas du reste de la molécule.
partir de ces huit groupes, vingt-sept solvants (tableau 4) habituelle-
ment utilisés en chromatographie planaire ont été retenus par Nyi- Exemple : l’incrément d’adsorption de : est de
redy et al. [28] pour définir le système d’optimisation de phase
mobile PRISMA. Le système PRISMA est un modèle structuré un noyau aromatique (ou 6 électrons π) par rapport à l’anthracène ; si
d’expérimentations successives permettant de prévoir la rétention. l’on connaît les RM du naphtalène et de l’anthracène, on peut calculer
La combinaison de PRISMA et des fonctions de désirabilité en fait ∆RM, et par suite l’adsorption du tétracène, molécule qui a la même
un système interactif dans lequel la modélisation par ordinateur conformation.
permet d’évaluer la meilleure combinaison phase stationnaire/
Nota : lorsque le pourcentage d’eau adsorbée sur le gel de silice devient très important
phase mobile [29]. ou lorsqu’une phase mobile aqueuse est utilisée, la théorie de l’adsorption n’est plus vala-
(0)
ble car le soluté ne peut plus accéder aux silanols. Il faut considérer que le soluté se partage
entre deux liquides : une phase circulante et une phase stagnante.
Tableau 4 – Solvants utilisés pour l’optimisation
en chromatographie planaire classés
selon leur force éluante
4.3 Chromatographie d’adsorption
Groupe Force éluotrope ε0 Solvant sur alumine
Base ≈0 n-hexane
L’alumine Al2O3 est également un adsorbant inorganique polaire
2,1 n-butyléther
hygroscopique. Il existe des alumines neutres, acides ou basiques
2,4 éther de diisopropyle suivant le pH de la suspension dans l’eau. La sélectivité de l’alumine
I vis-à-vis des grandes fonctions chimiques est assez semblable à
2,7 méthyl-tert-butyléther
celle de la silice, mais l’interaction avec le soluté s’effectue suivant
2,8 diéthyléther un mécanisme acide-base de Lewis, ce qui amène des sélectivités
3,9 n-butanol tout à fait particulières.
3,9 2-propanol Exemple : l’anthracène et le phénanthrène sont séparés avec un

facteur de sélectivité de 7,4 alors qu’il n’est que de 1,6 sur gel de silice.
II 4,0 1-propanol
Toutefois l’emploi de l’alumine a beaucoup décliné.
4,3 éthanol
5,1 méthanol
4,0 tétrahydrofuranne 4.4 Chromatographie sur cellulose
5,3 pyridine et dérivés
III
5,5 méthoxyéthanol
6,4 diméthylformamide La cellulose pour chromatographie planaire n’est utilisée qu’en
CCM. La cellulose amorphe peut retenir l’eau tandis que la cellulose
6,0 acide acétique
IV cristalline ne le peut pas. On suppose que l’eau retenue forme un gel,
9,6 formamide et la rétention des solutés est déterminée par la possibilité de pénétrer
dans le gel. Les plaques de cellulose sont utilisées dans l’analyse de
3,1 dichlorométhane
V substances très polaires (sucres, acides, phosphates). La cellulose
3,5 1,1-dichloroéthane microcristalline est capable de séparer des énantiomères (§ 4.9).
4,4 acétate d’éthyle
4,7 méthyléthylcétone
4.5 Chromatographie sur polyamide
VI 4,8 dioxanne
5,1 acétone
Ce support se comporte de façon différente suivant le solvant avec
5,8 acétonitrile lequel il est en contact. Avec des solvants apolaires, il y a rétention par
2,4 toluène adsorption. Avec les solvants aqueux ou hydroorganiques, le
VII mécanisme de rétention est celui d’un partage entre deux solvants.
2,7 benzène
Le tableau 5 regroupe les principes de rétention et domaines
4,1 chloroforme d’application des phases polaires. (0)
VIII
10,2 eau
■ L’adsorption d’un soluté peut être considérée en première 4.6 Chromatographie sur silice greffée
approximation comme la somme des contributions de chaque grou- apolaire
pement constituant la molécule :
S 0 = ΣQ i0 Sur ces supports, on retrouve les mêmes particules que celles

employées sur les plaques à polarité de phase inversée prêtes à
où Q i0 est l’adsorption d’un groupement donné (nitro, hydroxy, l’emploi, dites RP (reversed-phase) ; on trouve donc des plaques
chloro, etc.). RP2, RP8, RP18. Sur ces supports hydrophobes, les molécules très

Tableau 5 – Phases polaires non greffées

Type de phase Principe de rétention (1) Domaine d’application
Gel de silice 60 Å Adsorption Séparation de solutés peu polaires
Partage
Gel d’alumine Adsorption Séparation de composés peu polaires ou basiques
Partage
Terre siliceuse de diatomées (kieselghur) Adsorption Séparation de substances polaires
Partage
Cellulose Partage Séparation de molécules polaires (sucres, acides aminés)
Diéthylaminoéthylcellulose Échange d’ions Séparation de métabolites, catécholamines
Cellulose imprégnée de polyéthylèneimine Échange d’ions Séparation d’anions inorganiques [35]
Polyamide 6 ou 11 Partage Séparation de phénols, flavonoïdes
(1) Le principe de rétention majoritaire apparaît en gras.
polaires et très hydrophiles sont peu ou pas retenues. Le développe- sont pas sensibles à l’humidité comme les supports inorganiques
ment (ou l’élution dans le cas de la CP à flux forcé) est assuré par un polaires. Les phases de ce type peuvent être employées soit avec
mélange eau-solvant organique. Les mélanges binaires eau-métha- des phases mobiles analogues à celles utilisées avec la silice mais
nol ou eau-acétonitrile sont les plus employés en CCM. Par contre, de force éluante plus faible, soit avec des solvants aqueux car elles
les solvants ternaires ou quaternaires (du type eau-méthanol-acéto- sont parfaitement mouillables. La phase amino possède des pro-
nitrile-tétrahydrofuranne) ne sont employés qu’en CP à flux forcé. priétés échangeuses d’ions.
(0)
Les grandes lignes de la rétention constatées en CLHP (linéarité

de lgk en fonction du nombre d’atomes de carbone dans une série
homologue, linéarité de lgk en fonction du pourcentage volumique Tableau 6 – Phases greffées polaires
d’eau sur une gamme d’environ 50 %) sont observées en CCM et en
CP à flux forcé [30] [31]. Toutefois, la phase stationnaire n’est plus Principe
Silices greffées Domaine d’application
mouillable, et cosθ tend vers 0 lorsque le pourcentage d’eau dans la de rétention
phase mobile augmente. Adsorption Anions (phénols, nucléoti-
Pour pallier cet inconvénient, il existe des plaques résistant à l’eau Aminopropyle des, acides sulfoniques,
Échange d’ions acides carboxyliques)
dites WF dans lesquelles la modification de la surface du gel de silice
a été contrôlée de façon à assurer une mouillabilité complète quel Partage Amides
que soit le solvant utilisé. Sur les plaques RP WF, la rétention est dif- solvant aqueux
férente de celle observée avec les plaques RP. Dans le cas de la CP à Cyanopropyle
flux forcé avec élution, les données de rétention ne sont stables Adsorption Composés polaires
qu’une fois le système parfaitement équilibré ; cela peut demander solvant organique
plusieurs dizaines de minutes. Glycéropropyle Adsorption Composés peu polaires
Les avantages de la chromatographie planaire à polarité de phase (silice diol)
inversée sont :
— l’élargissement du domaine de la CP aux substances polaires Ces phases ont été mises en œuvre pour la séparation d’acides
et apolaires ; carboxyliques, de phénols, de bases puriques et pyrimidiques, de
— l’existence d’une relation linéaire entre la force éluante et le nucléotides et d’acides sulfoniques.
rapport frontal dans de très larges proportions, ce qui n’est pas le
cas avec la silice. Exemple : la séparation sur 5 cm de l’adénosine triphosphate,
l’adénosine diphosphate, le nicotinamide adénine dinucléotide phos-
Les inconvénients sont l’absence de compatibilité avec des sol- phate, l’adénosine monophosphate et le nicotinamide adénine dinu-
vants trop aqueux en raison : cléotide cyclique a été réalisée en utilisant une solution 0,2 M de NaCl
— de la présence de liants sensibles à une proportion d’eau dans un mélange éthanol-eau (30-70, v/v) comme éluant [32] ou encore
importante ; la séparation de traces de glucose et de fructose sur 8 cm avec un
— du caractère très hydrophobe des phases C2, C8, C18, qui est à mélange acétonitrile-eau (70-30, v/v) comme éluant [33]. Les phases
l’origine d’une augmentation considérable de la durée de dévelop- cyano se sont révélées particulièrement efficaces pour séparer les ami-
pement, ce qui en limite son emploi. des et les stéroïdes [34].
4.7 Chromatographie sur phases greffées 4.8 Chromatographie d’échange d’ions

polaires et d’appariement d’ions
Trois types de phases greffées sont utilisés de façon courante : les ■ Bien que le gel de silice soit un échangeur de cations faible, on ne
phases amino, cyano et diol (tableau 6). Là aussi, les supports sont l’utilise pas en tant qu’échangeur d’ions. La silice greffée amino est
absolument identiques à ceux de la CLHP. Il s’agit d’adsorbants un échangeur d’anions faible mais suffisant ;
polaires qui se rapprochent du gel de silice, mais qui sont beaucoup Si ⎯ O ⎯ Si ⎯ ( CH 2 ) 3 ⎯ NH 2 en milieu faiblement acide (pH4) est
moins rétentifs du fait de la partie alkyle et de la délocalisation de protoné et donne Si ⎯ R ⎯ NH 3+ . Cette propriété a été utilisée pour
l’adsorption. La migration des solvants est rapide et ces plaques ne séparer des phosphates. L’affinité d’un soluté pour un échangeur

d’ions est proportionnelle à sa charge. Pour qu’une chromatogra- Les polymères à empreinte moléculaire doivent être préparés à la
phie d’échange d’ions ait lieu, il faut que le soluté soit ionisé ; cela demande, ils ont une grande sélectivité vis-à-vis des molécules
implique, dans la quasi-totalité des cas, l’emploi d’une solution modèles. Les applications concernent essentiellement les éphédri-
aqueuse. Suivant le support employé, le mécanisme devient com- nes et les β-bloquants [41]. Les sélecteurs chiraux de Pirkle [42] peu-
plexe, car il faut tenir compte des interactions hydrophobes possi- vent agir par interaction π − π. Ils ne sont pas encore très employés
bles. La polyéthylèneimine (PEI) et la diéthylaminocellulose (DEAC) en CP.
sont des échangeurs d’anions [35].
■ Utilisation de sélecteurs chiraux dans la phase mobile :
Les agents d’appariement d’ions les plus courants sont les sulfa-
tes ou sulfonates d’une part, les ammoniums quaternaires de l’autre Les deux modes chromatographiques (phase normale ou polarité
[36]. de phases inversée) peuvent être utilisés, mais la grande majorité
des publications fait état de séparations réalisées au moyen de
■ En CCM, le principal problème réside dans l’imprégnation de la cyclodextrines avec des supports stationnaires hydrophobes. Les
phase stationnaire. En effet, ces agents d’appariement d’ions sont cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques ayant la forme
solubles dans l’eau et sont dissous dans une phase mobile d’un tronc de cône. La cavité est hydrophobe et la couronne est
hydroorganique ; cela implique automatiquement l’emploi d’une hydrophile. Le diamètre diffère suivant qu’il s’agit d’α, β, ou γ cyclo-
phase stationnaire greffée apolaire de type RP. Du fait de leur partie dextrine. Les énantiomères forment un complexe d’inclusion 1:1, et
apolaire, les agents d’appariement sont retenus, et l’imprégnation l’énantiomère formant le complexe le moins stable sera retenu pré-
homogène de la plaque est quelquefois très longue. De nombreuses férentiellement. Les complexes sont solubles dans l’eau, et leur
applications sont amenées à voir le jour, notamment en analyse solubilité peut être augmentée par ajout d’urée. Les racémates des
médicale pour la séparation d’anions organiques. Un exemple dérivés dansylés des acides aminés sont bien résolus par cette
récent des performances de la méthode a ainsi été présenté par méthode. Lepri et al. [41] ont publié un tableau des énantiosépara-
Kovacs-Halady et al. pour la séparation de dérivés aminés de l’acide tions utilisant les cyclodextrines ou les dérivés de celles-ci, comme
salicylique [37]. l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine.
■ En CP à flux forcé, le problème est identique à celui de la CLHP et Des phases mobiles contenant de l’albumine de sérum bovin ont
l’équilibre est long à atteindre. Des séparations fort intéressantes été utilisées en conjonction avec des plaques silanisées pour résou-
sont possibles, Szepesy et al. en ont défini les principales caractéris- dre plusieurs types de racémates (une trentaine). Les paramètres à
tiques d’utilisation [38]. ajuster sont le pH de la phase mobile, la force ionique et la propor-
tion de solvant organique.
4.9 Séparation d’énantiomères

4.10 Nature chimique des liants
Elles sont réalisées de la même manière qu’en CLHP, soit au
moyen de phases stationnaires chirales (PSC) ou de sélecteurs chi- Des liants de différentes natures sont utilisés pour fixer la couche
raux dissous dans la phase mobile. d’adsorbant sur la plaque chromatographique en CCM classique et
haute performance (HPTLC). Les qualités requises pour qu’un liant
■ Phases stationnaires chirales (PSC) : puisse être au mieux compatible avec le procédé chromatographi-
Alors qu’il existe un nombre considérable de PSC commerciale- que sont :
ment disponibles en HPLC, il n’en existe qu’un nombre infime en CP. — la résistance aux réactifs usuels de la chromatographie
La silice imprégnée du complexe cuivre(II)-N-(2-hydroxydodecyl)-4 planaire ;
hydroxyproline est disponible chez deux fabricants : Macherey- — une relative inertie.
Nagel (Chiralplate) et Merck (HPTLC-Chir) (Allemagne). Ces PSC
Une partie des liants autrefois utilisés (tels que agar-agar, amidon,
sont bien adaptées à la résolution des aminoacides, des amines et
alcool polyvinylique, acétate polyvinylique) pouvaient être attaqués
des acides α hydroxylés. Les sélectivités obtenues peuvent être très
par des réactifs agressifs et étaient partiellement dissous dans des
grandes. Des complexes de constante de stabilité différente se for-
systèmes chromatographiques contenant de l’eau en grande quan-
ment entre les ligands de configuration opposée et le chélatant. La
tité. Pour ces raisons, leur utilisation est aujourd’hui abandonnée. Ils
formation de cycles à cinq atomes donne les meilleures chances de
ont laissé la place à des liants polymériques inertes organiques ou
séparation. C’est un mécanisme d’échange de ligands [39], par con-
inorganiques qui présentent l’avantage d’être parfaitement stables
tre, l’ordre de rétention ne peut être prédit.
vis-à-vis des systèmes aqueux et des solvants organiques, et partiel-
La cellulose et l’amylose sont des polymères chiraux. La faculté lement résistants aux différents réactifs chimiques. Les plus utilisés
de reconnaissance chirale résulte de leur structure stéréorégulière sont :
qui donne lieu à une organisation supramoléculaire. La cellulose — des polymères, à haut degré de polymérisation, d’acide acryli-
microcristalline est disponible chez les deux fabricants précités et que ou d’acide méthacrylique ou de leurs sels ;
aussi chez Avicel (Japon), mais c’est le triacétate de cellulose micro-
cristalline (l’acronyme est MCTA) qui est le plus utilisé car il possède — des copolymères d’éthylène et d’acide maléique ou de leurs
de bonnes propriétés mécaniques et un meilleur pouvoir de résolu- sels ;
tion. Le mécanisme de séparation est complexe ; il implique majori- — des polyacrylamides et/ou polyméthacrylamides et leurs
tairement l’inclusion (d’où le terme de chromatographie d’inclusion) dérivés ;
et des interactions secondaires de type dipôle-dipôle et liaison — des silicates.
hydrogène. La MCTA permet de séparer les énantiomères d’un Bien que présentant des caractéristiques de résistance bien
grand nombre de solutés : benzoïne et dérivés, cétones de type phé- meilleures que les premiers, ils ne sont cependant pas sans présen-
nyle cyclohexanone, profènes, flavones, etc., avec une résolution ter quelques inconvénients :
souvent supérieure à celle de l’HPLC [40]. La phase mobile est un
mélange eau-alcool. L’énantioséparation de β-bloquants peut être — des réactifs très agressifs (tels que l’acide sulfurique) peuvent
obtenue avec le triphényle carbamate de cellulose avec une phase les attaquer (plus particulièrement à haute température) ;
mobile hexane-isopropanol. Les plaques peuvent être préparées par — ils réagissent avec des réactifs de dérivation d’usage courant
l’utilisateur par mélange de MCTA et de silicagel, ce dernier n’affecte (tels que la ninhydrine) entraînant des interférences non négligea-
pas l’énantiosélectivité. bles lors d’une évaluation quantitative.

4.11 Autochromatographie d’un mélange gnée de celle de la cuve. Il est à signaler que le solvant B possède
une force éluante plus grande.
de solvants. Démixion
Le rapport frontal du second front dépend évidemment de la dif-
férence des forces éluantes des solvants constituant le mélange ; il
L’utilisation d’un solvant unique ne permet pas toujours d’ajuster est plus élevé pour des solvants de grande surface moléculaire, et il
les rapports frontaux dans la zone désirée. La force éluante d’un est également plus élevé pour des adsorbants de faible surface spé-
mélange binaire A et B n’est pas facile à déterminer rapidement ; cifique. Dans un mélange de A et B, la théorie de Snyder prévoit
elle est donnée par : que :
lg ( k A ⁄ k B ) = β A s ( ε B0 – ε A0 )
lg ( N B 10 β nB ( εB – εA ) + N B )
0 0
ε AB
0 = ε A0 + -----------------------------------------------------------------
- (43)
β nB As étant la surface occupée par une molécule adsorbée,
k A′ et k B′ étant les facteurs de capacité observés dans les solvants
avec nB surface moléculaire effective de B adsorbé (c’est purs A et B et :
la valeur de As de B), RMx = Cte − lg[B]
NB fraction molaire de B dans le mélange binaire,
RMx étant le RM du soluté X.
β activité de l’adsorbant,
Autrement dit, la rétention d’un soluté X dans un mélange consti-
ε A0 , ε B0 forces éluantes de A et B. tué d’un diluant et d’une fraction volumique d’un solvant de force
Un mélange binaire permet de mieux ajuster la sélectivité, mais la éluante beaucoup plus grande varie linéairement avec le logarithme
différence entre les valeurs de ε0 entraîne la formation de deux de la concentration de ce dernier. Cela a été observé expérimentale-
fronts. Le solvant ayant la plus faible force éluante a le moins d’affi- ment dans un très grand nombre de cas.
nité pour la phase stationnaire, et il chemine plus vite que le second. Dans le cas des phases greffées alkyles, la rétention suit les
La composition réelle du solvant de migration peut être très éloi- mêmes règles qu’en CLHP.


CCM 1 p1473 PDF

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

CCM 1 p1473 PDF

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Chromatographie planaire.

par Antoine Michel SIOUFFI

1. Processus chromatographique............................................................. P 1 473 – 2

es progrès réalisés dans le domaine des matériaux adsorbants, de l’instru-

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Elle est utilisée pour le « screening » en toxicologie clinique, en médecine

Notations et Symboles Principales abréviations

D m2 · s−1 coefficient de diffusion FID Flame ionization detection

e cm épaisseur de la couche HPTLC High performance thin layer chromatography

H (ou µm hauteur équivalente à un plateau OPLC Overpressured layer chromatography

κ cm2 · s−1 constante de vitesse OPMLC Overpressured multi layer chromatography

k facteur de capacité TLC Thin layer chromatography

N nombre de plateaux théoriques (ou

u cm · s−1 vitesse d’avancement du solvant

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Figure 1 – Microchromatographie de spots déposés par

seringue à une petite distance (1 cm en général) de l’extrémité de la

Lorsque la tache est grande, on constate une inhomogénéité

Des appareils automatiques de dépôt de l’échantillon ou applica-

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Distance parcourue par le front de solvant Zf = 70 mm

Tableau 1 – Dépôt des échantillons : caractéristiques

Nature du solvant de dépôt Utilisation

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

où ρ est la masse volumique du solvant et g l’accélération due à la

2lgzf =lgκ + lgt (5)

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Figure 6 – Mise en évidence des phénomènes prépondérants

La plaque est développée plusieurs fois, dans la même direction

courbe II jusqu'au point B Ve = 0 ; Va = 0

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

2.5 Systèmes à flux forcé

Grâce aux systèmes à flux forcés, l’opérateur cherche à s’affran-

2.5.1 Utilisation de la force centrifuge

Figure 7 – Principe du développement multiple automatisé

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

2.5.2 Chromatographie sur couche mince

■ Le terme général OPLC (Overpressured Layer Chromatography),

Lorsqu’un liquide est forcé de passer dans une couche poreuse

■ L’emploi de pressions plus élevées (25 bar) permet l’utilisation de Pression

lieu de l’eau et a été prévu pour des arrivées orthogonales de liquide

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

3. Grandeurs fondamentales avec K coefficient de distribution du soluté,

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Cette relation n’est toutefois correcte que si le dépôt de l’échan-

Dans le cas du développement anticirculaire, on écrit :

3.2.1 Hauteur équivalente à un plateau théorique

■ En chromatographie à flux forcé, l’équation de Van Deemter (ou

avec H hauteur équivalente à un plateau théorique (ou

avec h hauteur réduite h = H/dp,

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

La hauteur de plateau moyenne est définie par :

où z0 est la distance entre le spot et le niveau du liquide.

avec L la longueur du développement, analogue à la longueur de la

que l’on peut écrire sous la forme :

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

Rfi correspondant à la tache de plus grande mobilité.

où N′ est un coefficient de proportionnalité correspondant au nom-

avec α facteur de sélectivité.

La combinaison des équations (24) et (26) permet d’écrire :

3.2.3 Résolution et capacités en pics

3.2.4 Sélection des conditions opératoires