Electrophorèse

Capillaire

J. AUPIAIS
LICENCE PROFESSIONNELLE
MÉTROLOGIE CHIMIQUE & NUCLÉAIRE
CEA | 10 AVRIL 2012 | PAGE 1
 HISTORIQUE RAPIDE

Année Auteur Contribution

1791 Faraday Loi d’électrolyse
1856 Hittorf Définition du nombre de transport t+,
t–
1897 Kohlrausch Fonction de régulation, migration
Faraday
1930 Tiselius Electrophorèse – prix Nobel 1948
1967 Hjertén Electrophorèse capillaire de zone = ×
1981 Jorgenson Electrophorèse capillaire (75 µm)
1989 Appareils commerciaux

( )
=
Hittorf
Kohlrausch
=
+
Hjertén
27 SEPTEMBRE Tiselius L’électrophorèse capillaire | PAGE 2
2016
 THÉORIE

Sans champ Avec champ

Les ions sont des particules chargées entourées

d’une atmosphère ionique mais ils ont aussi un
mouvement brownien

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 3
2016 Onsager
 MIGRATION DES IONS SOUS

En appliquant une différence de potentiel V entre deux électrodes distantes de d,

on crée un champ électrique:
= ( . )
La force électrique qui s'exerce sur un ion de charge soumis au champ E, sera
donnée par :
= !∙#∙
Dans un liquide de viscosité η, la force de frottement est donnée par la loi de
Stokes, où r est le rayon de l'ion hydraté.
= $% ∙ & ∙ ' ∙ (
L’équilibre est rapidement atteint entre la force de frottement et l’accélération par le
champ électrique tel que l’ion atteint instantanément une vitesse uniforme ) :
∙ ∙ = 6+ ∙ , ∙ - ∙ )
./ ∙0∙1
D’où : ) = 23∙4∙5 .
/
67
Puisque la mobilité est définie comme : =
1
∙#!
8! = 9: ; <= <
27 SEPTEMBRE
$% ∙ & ∙ '!
L’électrophorèse capillaire | PAGE 4
2016
 THÉORIE – TRAITEMENT ONSAGER-FUOSS

Dépendances multiples :
- force ionique, viscosité, température, permittivité électrique

Modèle
Domaine de validité pour les théories de transport des ions : I < 0,1 M, pas de
formule explicite aux concentrations supérieures

Traitement de Onsager & Fuoss (pour un nombre quelconque d’ions):

 e3 ∞
e2 N AV 
µ (I ) = µ 0 − 
N AV I
⋅ z ⋅ µ 0 ∑ Cn R +
(n)
z
 12π
 (εkT )3
n =0 6πη εkT  1 + Ba I
2

Effet de Relaxation Effet Electrophorétique

(correction électrostatique) (correction hydrodynamique)
= freinage électrostatique dû à = freinage hydrodynamique dû
l’atmosphère ionique à la friction

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 5
2016L., Fuoss R.M., J. Phys. Chem. 36 (1932) 2689-2778
Onsager
 H ORDRE DE GRANDEUR 8> He
362.518
Li Be Electrophoretic mobility B C N
NH4+
O F Ne
N2H5+

40.102 46.2
(x 109 m2V-1s-1) 76.024
61.0847
M
Na Mg M
M+2+
M3+
25°C, I = 0 Al Si P S Cl Ar
M4+
MO2+
MO22+
Cation 63.719
51.942 55.314
K Ca Sc Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr
55.65
76.226 61.662 67.1 69.815 54.8343 70.9 55.710 55.0273 56.0462 55.1836
Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe
79.967 61.622 64.3 64.202 55.3226 64.4
Cs Ba Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn
Hg2+
Hg22+ 71.1

79.5410 65.952 66 77.445 72.5770 72.2 80.3 38.03

Fr Ra Rf Db Sg Bh Hs Mt Ds Rg Cn Nh Fl Mc Lv Ts Og
80 63.315

uncertainty La Ce Pr Nd Pm Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu
< 0.10%
0.10 - 1%
68.7229 68.515 68.8 68.9378 68.87 67.3864 67.416 66.115 65.614 65.27 64.85 65.05 65.614 64.227 64.65
1 – 2%
2 - 5% Ac Th Pa U
59
Np
54.4
Pu Am Cm Bk Cf Es Fm Md No Lr
74.5 68.3
doubtful 2 17 10
68.6 68.4 68.3
tentative 703 74.2
54.4 59.014 55.9
no uncertainty 70.8 72.617 59.2 55.4 52.4 67.827 67.831 65.13 65.83 603 623 65.3 65.3

L’électrophorèse capillaire | PAGE 6

 CALCUL DE 8

= × ( . ? ) µ en m².V–1.s–1
E en V.m–1

Exemple : Na+ 0 = 51,94 10-5 cm².V-1s-1

∆ = 25000 V
B = 60 cm

Vitesse de l’ion sodium ?

Temps de migration pour parcourir la totalité du capillaire ?

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 7
2016
 MOBILITÉ DES CATIONS
Relation de Nernst-Einstein : C) = × ) F : Faraday (96485,339924 C)

Conductivité équivalente ionique

Λ
H 0
300
200 D
Rb Cs
NH Tl
4
K
70 Pb
Ce
LaPr
Nd Hg
Sm
CrFe Eu
GdHo
ETm
r
2 Ra
Dy Yb
Λ (x10-4 m² s mol-1)

Sc Ba Hg
Al Y Ag
60 N H Ca Sr
2 5
Co
Fe Cd
Mg MnCu
Zn
50 Na Ni
0

Be

40
Li

UO
2
30
0 20 40 60 80 100
Z
Cations
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 8
Extrait2016
du Handbook of Chemistry & Physics, 75th edition, CRC Press
 MOBILITÉ DES ANIONS

Conductivité équivalente ionique

Λ
0
-30
H PO
HPO
2 44

-40 IO
HCO Br 3
H PO 3
3
2 2
-50 HSO
ClO 43
F
2
BrO IO ReO
3 4 4
-60 MnO
4
ClO
HS
SClO
O3
-70 N
CO PO2 44 WO
NO33 4 4
3 2 MoO
Cl SeO 4 I
SO Br 4
-80 3
4
S O
S O CrO
2
2 3
8 4
-90
S O
2 6

-100
-200 OH
-210
-220
0 20 40 60 80

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 9
Extrait2016
du Handbook of Chemistry & Physics, 75th edition, CRC Press
 MOBILITÉ VS CHARGE

360

80
µ (x10 m /Vs)

70
2
9

60

50

40

z=+1 30
z=+2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
z=+3 Z
27 SEPTEMBRE
z=+4 L’électrophorèse capillaire | PAGE 10
2016
 MOBILITÉ VS RAYON D’HYDRATATION

100 +1 +4
+3
90
+2
Exception ! 80

70
µ (x10 m /Vs)

60
2

50
9

40

30

20

10

0
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4
rayon hydraté (A)

Plus un ion est chargé, plus il est gros

Plus un ion est gros, pour une charge donnée, plus il est lent
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 11
2016
 MOBILITÉ VS ZEFF/R

!∙#
90

8! = Ions chaotropiques (déstructurant

+
Rb Cs
+

$% ∙ & ∙ '!
+
80 K
l’eau dans son voisinage)
70

µ (x10 m /VS)
2
60 +
Na
Ions cosmotropiques (structurant

9
l’eau dans son voisinage)
50
+
Li
40

30
0.300 0.305 0.310 0.315 0.320 0.325 0.330
90
zeff/r

80 68
2+
Ra
66

2+
70 64
Ba
µ (x10 m /V.s)

µ (x10 m /V.s)
2+
62 Ca
2+
Sr

2
2

60

9
60
9

58
50 2+
56
Mg

54
40 0.460 0.465 0.470 0.475 0.480 0.485 0.490 0.495 0.500
zeff/r

30
0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75
27 SEPTEMBRE
zeff/r L’électrophorèse capillaire | PAGE 12
2016
 MOBILITÉ VS EFFET DE MILIEU 1) Température

J U W
MNO T
MNO E
μ E, G = μ> H − ∙ ∙ μ> H RT S + ∙
12+ PQH J 6+& PQH XY
TV) 1+ E
2

∆µ ≈ 2 % par °C
-3
1.1x10
-3 25°C
1.1x10
45°C
-3
1.0x10
-4
9.5x10
-4
9.0x10

µ(Cl-) (cm Vs )
-1
µCl(16.5mM,T) -4
8.5x10

2
-4
8.0x10
120 -4
7.5x10
-4
110 7.0x10
-4
6.5x10
100
-4
6.0x10
-µCl x10 (m V s )
-1 -1

90 -4
5.5x10
2

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
10 10 10 10 10 10 10 10
µCl(25 to 45°C) = +32.6% C (M)
9

80
-

70
µCl(0, 25;45) = f(NaCl)
60

50
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
T (°C)
L’électrophorèse capillaire | PAGE 13
 MOBILITÉ VS EFFET DE MILIEU 2) Permittivité

La permittivité, plus précisément permittivité diélectrique, est une propriété

physique qui décrit la réponse d‘un milieu donné à un champ électrique
appliqué.
Permittivité relative (par rapport au vide)

Z = Z) × Z5 Z : permittivité du matériau, de la solution

Z) : permittivité du vide
Z5 : permittivité relative

Z) = 8,854187 × 10 W ∙

Permittivité relative du vide ?

Permittivité relative de l’eau =

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 14
2016
 MOBILITÉ VS EFFET DE MILIEU 2) Permittivité

J U W
MNO T
MNO E
μ E, G = μ) G − ∙ ∙ μ) G RT S + ∙
12+ PQG J 6+, PQG _Y
TV) 1+ E
2
NH4ClO4
P dépend de : 84
15°C
25°C
- La température 82 35 °C
80
- La nature du sel
78
- La concentration
76

Les données sont rares ! 74

72
ε

Quelques expressions : 70

Z = Z` − aR 68

66
c
Z = Z` − aR + b R 64

62

Z − 1 Z` − 1 60

= + YR 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
Z + 2 Z` + 2 C (M)

I < 0.2 M, la décroissance est faible (≈2.5% à 25 °C)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 15
2016
 ε - QUELQUES SELS & RELATIONS

Sel Equation Reference

H2O Z` = 78,54d1 − 4,579. 10 J − 25 Lileev A. et al., J. mol. Liq., 150
Jh
+ 1,19. 10 f − 25 W − 2,8. 10 g
− 25 (2009) 4-8
Z ,R Lileev A. et al., J. mol. Liq., 150
NH4ClO4 ij = Rd−0,1282363750 − 2,6298. 10 J
Z` (2009) 4-8
+ 1,04255. 10 l W h
c
NaOH Z 25, R = 78,33 − 19,928504R + 6,119554 R Buchner R. et al., J Phys Chem B,
103 (1999) 11186-11190
c
NaClO4 Z 25, R = 78,33 − 14,517662R + 2,985822 R Wachter W. et al., J Phys Chem A,
109 (2005) 8675-8683
c
Na2SO4 Z 25, R = 78,33 − 41,020752R + 15,573503 R Buchner R. et al., J Phys Chem B,
103 (1999) 11186-11190

KCl Z 26,6; 0,0037 = 79,24 ± 0,88 Drake F.H., et al., Phys. Rev., 35
Z 26,6; 0,014 = 79,01 ± 0,33 (1930) 613-622

Tout sel Z = 78,54 − aR Marcus Y., J. Solution Chem. 42

a =a +a
0 < R < 1 (2013) 2354-2363

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 16
2016
 SYSTEMATIQUE P = P„ − pw
Cation p Anion p

qr s 16 sq 8
t! 8 4
uv 7 wx 5
y 6 X' 6
z{ 6 | 7
w= 5 usr 5
}~ 1 wxs• 10
uq• 4 X • 10
€~: 24 qws: 4
wv: 17 •s:• (7)
•': 14
Xv: 10
w‚: 20
ƒr 22
tvr 25
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 17
2016
 MOBILITÉ VS EFFET DE MILIEU 3) Viscosité

J U
MNO T
eW Mˆ‰ E
μ E, G = μ) G − ∙ ∙ μ) G RT S + ∙
12+ ZQG J 6π‡ εkT _Y
TV) 1+ E
2

‡ dépend de: « Extended Jones-Dole equation »

- La température
, = ,) 1 + Y R + •R + R W
- La nature du sel
- La concentration

Autre modèle (T, C)

,(G)
ln = YR + •R W + R J
Les données sont nombreuses ! ,•‘’05 (G)
Y = Y) + Y G + YW G W
• = •) + ⋯
= )+⋯

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 18
2016
 η - QUELQUES SELS & RELATIONS

Sel Equation Reference

H2O 1301 Hardy R.C., Cottingto R.L., J.
0 < < 20 log ,` = Res. NBS 42 (1949) 573
998,333 + 8,1855 − 20 + 0,00585 − 20 W
− 1,30233
W
,` 1,3272 20 − − 0,001053 − 20
20 < < 100 i–— =
Swindells J.F., NBS,
,W) + 105 unpublished results

NaClO4 , 25, R = ,` 1 + 0,00702 R + 0,0151R + 0,029507R W Nightingale E.R., J. Phys.

Chem, 63(5) (1959) 742-743

NaCl , 25, R = ,` 1 + 0,007271 R + 0,076922R + 0,011167R W Hai-Lang Z., Shi-Jun H., J.

Chem. Eng. Data, 41 (1996)
516-520
, ,R
ij = d(−0,21319213 + 1,3651589. 10 J Mao S., et al., Int. J.
,` Thermophys., 30 (2009) 1510-
− 1,2191756. 10 2 W ) × R 1523
+ (0.069161945 − 2,7292263. 10 l
− 2,085244810 ˜ W ) × R W +(−2,5988855. 10 J

− 7,7989227. 10 2 ) × R J h

NaNO3 , 25, R = ,` 1 + 0,0005880 R − 0,039245R + 0,022416R W Janz G.J. et al., J. Phys. Chem.,
74(6) (1970) 1285-1289

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 19
2016
 EXEMPLE NPO2+ , 25 °C, NACL

5.5x10
-4 η = ηw, ε = εw

-5%
-4 2
5.0x10
η
0
µ (cm²/Vs)

Variation (%)

-4 -34%

ε
4.5x10
-2

-4
4.0x10 -4

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
10 10 10 10 10 10 10 10
C (M)

-4 I = 0.2 M
3.5x10
+0.1%

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
10 10 10 10 10 10 10 10
C (M)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 20
2016
 ELECTROPHORÈSE CAPILLAIRE - PRINCIPE

Injection : le capillaire est trempé

dans l'échantillon
Analyse : le capillaire est trempé dans l'électrolyte

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 21
2016
 CAPILLAIRE EN SILICE FONDUE

Caractéristiques générales

Diamètre externe = 360 µm

Diamètre interne = 20–100 µm
Polyimide = 15 µm
135 µm
Longueur = 30–100 cm

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200

r (µm)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 22
2016
 ELECTROOSMOSE

•!(sq)• ⇌ •!s(sq)r + q pK = 9,81±0,02

En pratique, plage de valeurs plutôt qu’une valeur unique ! (interactions (d-p)π chaîne Si-O)

Nature : c'est un phénomène de transport des molécules

de solvant dû à l'existence d'une double couche électrique
à une interface solide-liquide.
Z5 Z) ™
0 =− = 0
,
eo : mobilité électroosmotique
εr et η : constante diélectrique et viscosité du solvant
ε0 : permittivité du vide (8,85.10–12 C²N–1m–2)
27™SEPTEMBRE
: potentiel zêta
L’électrophorèse capillaire | PAGE 23
2016
 POTENTIEL ZÊTA
Définition ™
› œ
™=
Z5 Z)
δ : épaisseur de la double couche
σ : densité de charges par unité de surface

Double couche κ–1:

Z5 Z) SG
› =
2 1 W W

R : constante des gaz parfaits

T : température absolue
z et cE : charge et concentration de
l'électrolyte

ž <Ÿ
(#• = −
27 SEPTEMBRE
2016 & L’électrophorèse capillaire | PAGE 24
 QUELQUES VALEURS ›

Electrolyte symétrique Electrolyte asymétrique

CE Z+/Z– › (nm) Z+/Z– › (nm)

0.001 1:1 9,61 1:2, 2:1 5,56
2:2 4,81 1:3, 3:1 3,93
3:3 3,20 2:3, 3:2 2,49
0.01 1:1 3,04 1:2, 2:1 1,76
2:2 1,52 1:3, 3:1 1,24
3:3 1,01 2:3, 3:2 0,787
0.1 1:1 0,961 1:2, 2:1 0,556
2:2 0,481 1:3, 3:1 0,393
3:3 0,320 2:3, 3:2 0,249

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 25
2016
 VARIATION µEO

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 26
2016
 CALCUL DE 8#•

(#• = 0 =

Estimation de µeo dans NaClO4 0,01 M ?

σ = 0,01 C/m2

η?

› ?

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 27
2016
 CALCUL DE

› œ
™=
Z5 Z)
Permittivité dans NaClO4 0,01 M ?

Z = Z` − aR

› ?
σ = 0,01 C/m2
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 28
2016
 UNITÉS

› œ
™=
Z5 Z)
› ?
œ? ⟹

Z5 ?

Z) ? ⟹ ⟹

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 29
2016
 PROFIL DE VITESSE

Ecoulement Ecoulement
laminaire électroosmotique

Profil de vélocité du flux électroosmotique indépendant du diamètre

(jusqu’à 200-300 µM)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 30
2016
 AVANTAGES D’AVOIR UN FLUX EO

Le flux eo met en mouvement toutes les espèces (neutres comprises),

indépendamment de la charge dans une même direction.

Sans traitement de la surface interne du capillaire, le flux eo est toujours dirigé

vers la cathode.
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 31
2016
 VITESSE D’UN ION EN PRESENCE DE FEO

Cation Anion Eau

-- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- -- -- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- --
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Electroosmotic flow veof

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
-- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- -- -- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- --

Anionic electrophoretic
Cationic electrophoretic
‘¢¢, = 0 +
velocity vi velocity vi
‘¢¢, = 0 +

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 32
2016
 TEMPS DE MIGRATION

i i×B l : distance entre le point d’injection et le point

= =
de détection

0 + × L : longueur totale du capillaire

V : tension appliquée

l = 50 cm
L = 58,5 cm
V = 25 kV

µc, µa ?

1) Calculer µapp = µeo + µi

2) Calculer µi

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 33
2016
 EFFETS DISPERSIFS

Efficacité :
Hauteur de plateaux théoriques :
œ¤W
£=
i
œ¤W : variance spatiale après un parcours l

Nombre de plateaux théoriques :

¥=
¦

Particularité des capillaires : pas ou peu de diffusion radiale, ni de convection

(longitudinale)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 34
2016
 DISPERSION LONGITUDINALE (CAS IDÉAL)

2§iB 2§i
œ¤W = 2§ = = D : coefficient de diffusion
‘¢¢ ‘¢¢

‘¢¢ i ‘¢¢ i
¥= =
2§B 2§

Conséquences :
• Application de champ électrique élevé
• Les grosses molécules auront une
grande résolution
Expérimentalement:
W
¥ = 5,54
/W

Équation valable pour pic gaussien, sinon

utilisation par exemple de W = œ W
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 35
2016
 DISPERSION (CAS RÉEL)

W
œ¤W = œ©W ªª « T + œ W
T¬0-’ T + œ ®0¯¢é5‘’ 50
W W W
+ œN±« 5¢’ T + œ©é’0-’ T + œ1¤0-’5 ± «¢05« T +⋯

DIFFUSION W
©
SG )
§=

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 36
2016
 DISPERSION - INJECTION
W
œ¤W = œ©W ªª « T + œ W
T¬0-’ T + œ ®0¯¢é5‘’ 50
W W W
+ œN±« 5¢’ T + œ©é’0-’ T + œ1¤0-’5 ± «¢05« T +⋯
W
W
²T¬

Idéalement, la longueur de l’injection (plug)

devrait être inférieure à celle de la diffusion soit
2§ .
En pratique, l doit être inférieur à 1-
2 % de la longueur totale du
27 SEPTEMBRE
2016
capillaire L’électrophorèse capillaire | PAGE 37
 EXTRÊMITÉS DES CAPILLAIRES

à la coupe
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 38
2016
 DISPERSION - TEMPERATURE
W
œ¤W = œ©W ªª « T + œ W
T¬0-’ T + œ ®0¯¢é5‘’ 50
W W W
+ œN±« 5¢’ T + œ©é’0-’ T + œ1¤0-’5 ± «¢05« T +⋯

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 39
2016
 EFFET JOULE

SeR12  1 1  R2  1  R3  1 
T0 − Ta = + ln  + ln  +
2  2kb k g  R1  k p  R2  R3 h 

25.8 T0 Temperature inside the capillary

Ta Temperature of the coolant
Se = I2/ke; I the current density,
25.7 R3 ke the electrical conductivity of
the background electrolyte (BGE)
25.6 kb the thermal conductivity of water
kg the thermal conductivity of the glass
R kp the thermal conductivity of the
Temperature (°C)

25.5
R1 2 polymer coating
h the heat transfer coefficient
25.4
Matériau Conductivité thermique
QUARTZ 1,4 W m-1 K-1
25.3
R2 VERRE
BOROSILICATE
1,0 W m-1 K-1

25.2 POLYIMIDE 0,15 W m-1 K-1

EAU 0,6 W m-1 K-1
25.1
METHANOL 0,2 W m-1 K-1
AIR 0,025 W m-1 K-1

25.0 For water (T in °C):

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200
k b = 0.5605 + 1.998 ⋅ 10 −3 T − 7.765 ⋅ 10 −6 T 2
r (µm)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 40
2016
 EFFET JOULE – CALCUL DE ∆T

Méthode d’Evenhuis

GT − G0
∆T =
γG0
I
G=
With:
V
∆T the temperature difference between the inner capillary and the
temperature of the coolant,
γ is the thermal coefficient of electrical conductivity and can be determined
experimentally from the electrical conductivity κE of the electrolyte
extrapolated
27 SEPTEMBRE to zero power.
L’électrophorèse capillaire | PAGE 41
2016
 DEPENDENCE ³ # VS PUISSANCE DISSIPÉE

Li
0.355 κe =
0.350
SV
0.345
kE (Ω m )
-1

0.340
-1

0.335

0.330
BGE : chromate/borate buffer
pH 9
0.325 I = 16 mM

0.320
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
-1
P/L (Wm )
T = 60 °C

La conductivité électrique s’exprime en Siemens par mètre : S.m–1 = Ω–1.m–1.

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 42
2016
 DEPENDENCE ³ # VS T

0.34

0.32

0.30

0.28

0.26
kE (Ω m )
-1

γ = 0.0175 at 25°C
0.24
-1

0.22

0.20

0.18

0.16

10 20 30 40 50 60
T (°C)

γ n’est pas une constante

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 43
2016
 VARIATION DE ´

2.2

2.0

1.8

1.6
γ (%)

1.4

1.2

1.0

10 20 30 40 50 60
T (°C)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 44
2016
 COEFFICIENT DE TRANSFERT DE CHALEUR
Quelques exemples :
air (25°C) v = 2 m/s 263[1]
11-114, 240(ref in [2])
Agilent HP3D CE v = 10 m/s 312[2]
liquide jusqu’à 10000
Beckman PACE/MDQ (25°C) 940[3]
3000 Beckman PACE/MDQ (15-60°C) 1110 ± 88

2500

2000

1500
[1] Grossman, P. D.; Colburn, J. C. Capillary
h

Electrophoresis - Theory and Practice; Academic

1110±88 Press, Inc.: San Diego, 1992.
1000
[2] Evenhuis, C. J.; Guijt, R. M.; Macka, M.; Marriott,
P. J.; Haddad, P. R. Anal. Chem. 2006, 78, 2684-
500
2693.
[3] Peterson, N. J.; Nikolajsen, R. P. H.; Mogensen,
K. B.; Kutter, J. P. Electrophoresis 2004, 25, 253-
269
0
10 20 30 40 50 60

Evenhuis method [2]

27 SEPTEMBRE T (°C)
L’électrophorèse capillaire | PAGE 45
2016
 ∆T – REFROIDISSEMENT AIR

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 46
2016
 ∆T – REFROIDISSEMENT LIQUIDE

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 47
2016
 OPTIMISATION

Example: capillary 50 µm x 360 µm o.d., NaNO3 0.1 M, coolant: T = 55 °C

Ohm law Temperature excess

58.4
0.20°C
58.2
∆T = 3.5°C
250
58.0 58.5°C
57.8
200 57.6 14 kV

Temperature (°C)
57.4
150 57.2
i (µA)

0.06°C
100 56.0
∆T = 1.1°C
50 55.9 56.1°C

55.8 8 kV
0
0 5 10 15 20 25 30
-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200
V (kV)
r (µm)

V = 15 kV: optimised voltage in terms of time of separation, reproducibility,

and resolution.
But not in term of temperature increase!
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 48
2016
 EFFET SUR CONSTANTE DE COMPLEXATION
Complexation Ca2+ by SeO42-
− ∆rH ∆rS
I= 0.1 M , pH = 3.5, U = 8 kV, T= (15±0.2)°C, (35±0.3)°C, (45±0.3)°C, (55±0.3)°C ln K = +
RT R
Van’t Hoff law:
2.80

2.70 y = -401x + 3.94

R² = 0.9987
0,1M

55° 45°
2.60
ln K

35°

2.50 15° ∆rH = (3.3±0.3) kJ.mol-1

∆rS = (33±1) J.mol-1.K-1
2.40
0.003 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 0.0035
-1
1/T (K )
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 49
2016 J. Aupiais, et al., Electrophoresis, 30 (2009) 3582-3590
V. Philippini,
 DESIGN COMMERCIAL

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 50
2016
 DISPERSION - INTERACTION SOLUTÉ –
SURFACE
W
œ¤W = œ©W ªª « T + œ W
T¬0-’ T + œ ®0¯¢é5‘’ 50
W W W
+ œN±« 5¢’ T + œ©é’0-’ T + œ1¤0-’5 ± «¢05« T +⋯

W
W 0 ª
N±« W
±

µ 5 − )
Q =
)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 51
2016
 DISPERSION - ELECTRODISPERSION
W
œ¤W = œ©W ªª « T + œ W
T¬0-’ T + œ ®0¯¢é5‘’ 50
W W W
+ œN±« 5¢’ T + œ©é’0-’ T + œ1¤0-’5 ± «¢05« T +⋯
⇒ PERTURBATION LOCALE DU CHAMP ELECTRIQUE PAR LE PASSAGE D'UNE
ZONE SOLUTEE

⇒ DISPERSION DE LA VITESSE DE MIGRATION

⇒ PROFIL DISSYMETRIQUE DU PIC

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 52
2016
 EFFET TRÈS FREQUENT EN EC - CATIONS

ALCALINS ET ALCALINO-TERREUX
Unité d'absorbance (V) (1E-3)
Na
28,5 Cs, Rb : 3,0 mg/l
Capillaire 60cm, V=20kV, Ca NH4, K : 1,0 mg/l
[tropolone]=5mM, Ca, Na : 1,0 mg/l
[18-crown-6]=2mM, Sr : 1,5 mg/l
27,5 [UV-Cat2]=3mM Sr Mg : 0,4 mg/l
U.V. 185 nm Mg
Ba : 2,0 mg/l
Li Li : 0,2 mg/l
NH 4 Ba
26,5 K
Rb

Cs
25,5

24,5
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Temps (min)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 53
2016
 FONCTION DE REGULATION DE KOHLRAUSCH

L’électrodispersion (mais aussi le stacking et la détection photométrique) peut

être prédite théoriquement en solutionnant les équations de déplacement aux
limites. Friedrich Kohlrausch trouva une solution élégante en 1897. Elle est
désormais appelée « fonction de régulation de Kohlrausch » (KRF).

! ¸! ·
¶ · =
8!
!

¶(·) est localement invariant en un point x dans

le temps

A retenir : ¶(·) est dépendant de la distance mais indépendant du temps

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 54
2016
 ELECTRODISPERSION - KRF
Conductance
BGE : Cation A + Anion B
1
•¬ R¬.
Sample : ions j
› ¹ = › º»1 + •¬ = N ¬− º 1−
¬ ¬ : mobilité réduite
¬
Champ électrique
º»1 Q¬ 1 − ¬ º
¹
= Y¬ = 1− ¬
et Q¬ = ×
1 − ∑¬ Y¬ R¬. R¬¹ ¬ 1− º

• si 8½ > 1 alors ES < EBGE

traîne à l’arrière du pic
• si 8½ = 1 alors ES = EBGE pic
symétrique
• si 8½ < 1 alors ES > EBGE
traîne à l’avant du pic

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 55
2016
 EFFET TRÈS FREQUENT EN EC - ANIONS

Electrophérogramme
ANIONS
U.A. (x1000)
2-
28,3 Cl- SO4 - F-
NO2
-
27,8 NO3 -
H2PO4
Br-
-
27,3 ClO3

26,8

26,3
2 2,2 2,4 2,6 2,8 3
Temps (min)
Environ 4 ppm de chaque
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 56
2016
 KRF - EXEMPLE

1
Asymétrie (%)

-1

-2

-3
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Temps de migration (min)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 57
2016
 RESOLUTION

: ¾: − ¾< ¾: − ¾<
z= =
¶< + ¶: •Ÿ
Classique (chromatographie)

On peut également exprimer la résolution en fonction de l’efficacité.

< ∆8 ∆ = W −
z= u
• ¿
8 ̅=
+ W
2

< ; R avec ;
z= ∆8 (il faut quadrupler la tension
• : ¿ + 8#•Â
Á 8 pour doubler la résolution )

D : coefficient de diffusion
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 58
2016
 ¿ ≈ 8#•Â
EXEMPLE 8

0,0 1,0
79 Br 81 Br
0,5
-0,5 35 Cl

0,0

-1,0 -0,5
U.A. (mV)

-1,0
-1,5 37 Cl
-1,5

-2,0
-2,0

-2,5
-2,5

-3,0
52 54 56 58 60 52 54 56 58 60
Tem ps (m in)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 59
2016
 CARACTÉRISTIQUES EN EC

• Capillaire 20 – 100 µm diamètre interne

• Tension 0 -30 kV (jusqu’à 500 V/cm)
• Effet Joule limite la tension maximale
• Très grande efficacité (N > 105 – 106)
• Temps d’analyse court
• Détection in situ miniaturisée (DAD, LIF, Abs.)
ou ex situ (MS)
• Faible quantité injectée (1 – 50 nL)
• Opère en phase aqueuse ou organique
• Très automatisé

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 60
2016
 MODES D’INJECTION

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 61
2016
 MODES D’INJECTION – HYDRODYNAMIQUE
Injection par ∆P
∆Å‚• %¾!Ľ
;!Ľ =
<:Æ&t
∆P : différence de pression appliquée
d : diamètre interne du capillaire
tinj : temps d’injection
η : viscosité de l’électrolyte
L : longueur totale du capillaire

Même équation, remplacer ∆P par : ∆Å = Ç~ÈÉ

ρ : densité de l’électrolyte
27 SEPTEMBRE
g : 9,807 m/s2
2016
L’électrophorèse capillaire | PAGE 62
∆h : hauteur entre les réservoirs
 HYDRODYNAMIQUE – PERFORMANCES

• Répétabilité inférieure à
3%
• Volume injecté – qq nL
(< 1-2 % volume total)
• Diamètre minimum
(méthode ∆h) = 30 µm
• Méthode ∆P moins
bonne que ∆h
• Composition injectée
identique à la
composition initiale de
l’échantillon
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 63
2016
 MODES D’INJECTION – ÉLECTROCINÉTIQUE

8! + 8#•Â ;': %w¾!Ľ

Ê=
t
: mobilité de l’ion i
0 ª : mobilité électroosmotique
tinj : temps d’injection
V : tension
C : concentration de l’ion i
r : rayon interne du capillaire

Tension d’injection : 3-5 fois moindre

que la tension d’analyse
Temps d’injection : 10-30 s

la composition injectée est différente de la

composition initiale de l’échantillon

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 64
2016
 FIELD AMPLIFIED SAMPLE STACKING - FASS

La zone contenant l’analyte doit avoir

une concentration plus faible. Lors de
l’application du champ électrique, ce
dernier est plus localement important
dans la zone contenant l’analyte (donc
Ë ↗)

Un seul
27 SEPTEMBRE type d’ion est injecté (+ ou –)
L’électrophorèse capillaire | PAGE 65
2016
 DETECTION EN EC

• Absorptiométrie
• Longueur d’onde fixe, barrette de diodes, absorption directe
(chromophore), inverse
• Fluorimétrie
• Fluorescence inverse (luminophore), directe
• Conductométrie
• Ampérométrie, potentiométrie, conductivité
• Electrochimie

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 66
2016
 ABSORPTIOMÉTRIE
Principe : détecter l’analyte au moyen de photons de longueur d’onde calibrée
utilisant les phénomènes d’absorption (mode direct) ou de transfert d’un
chromophore par l’analyte (mode indirect).
Mode direct = sélectivité
Mode indirect = universalité C = 254 j
Unité d'absorbance (V) (x1E-4)
259

C = 214 j
258

257

256

255

254

253
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Temps (min)

C = 214 j
8

NO -
7
3

6
Unité d'absorbance (mV)

NO -
1
2

0
3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0
27 SEPTEMBRE T em ps (m in)
L’électrophorèse capillaire | PAGE 67
2016
 ABSORPTIOMÉTRIE – PRINCIPE
Absorbance
Faisceau U.V.

Absorbance du chromophore

Capillaire

Chromophore
détecteur
0
Temps
Fenêtre de détection

Absorbance Faisceau U.V.

Capillaire

Chromophore
détecteur
Cation

Temps
Fenêtre de détection

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 68
2016
 ABSORPTIOMÉTRIE – THÉORIE

Rapport de déplacement R (appelé également Transfer Ratio ou « TR »)

ΔRº»1 ΔRº»1 : Changement de concentration de

GS = −
R
BGE dans la zone contenant l’analyte
R : concentration de l’analyte

Fonction de régulation de Kohlrausch et rapport de déplacement

BGE BGE

Anion : A Anion : B Anion : A

Cation : C Cation : C Cation : C

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 69
2016
 RAPPORT DE DÉPLACEMENT - THÉORIE
N N Î Î
Zone = + Electroneutralité N N = Î Î
N Î

< < ¸} }
¶< = ¸} } + = 8 + 8w
8} 8w 8} 8w }

µ µ
N N º º Î Î
Zone W = + + Electroneutralité µ
N N + º º = µ
Î Î
N º Î

µ µ
N N º º N N º º
W = + + +
N º Î Î

< < < <

¶: = ¸µ} } + + ¸X X +
8} 8w 8X 8w

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 70
2016
 RAPPORT DE DÉPLACEMENT - THÉORIE

= W

¸} } < < < <

8} + 8w = ¸µ} } + + ¸X X +
8} 8w 8} 8w 8X 8w

µ
Posons Δ N = N − N
1 1
Δ +
N º º Î
=
1 1
º N +
N Î

ϸ} X 8} 8X + 8w
= = Hz
¸X } 8X 8} + 8w

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 71
2016
 ABSORBANCE – THÉORIE

ÐÑ = GS × Z- − Z •
∆A : variation d’absorbance lors du passage de l’analyte i
TR : rapport de déplacement
εc : coefficient d’extinction molaire du chromophore/BGE
εi : coefficient d’extinction molaire de l’analyte i
b : trajet optique
ci : concentration de l’analyte

Limite de détection en absorptiométrie EC

Î
R±0’ =
En pratique,

GS × §Ò
pour un DR = 104,
cc = 10–2 M, TR = 1,
R±0’ : concentration minimale détectable Cdet ≈ 10-6 M
TR : rapport de déplacement
NÓ (VÔÓ Õ-Ó )
§S : facteur de réserve défini par §S = ª¤ -’ ‘’ T ¤ ÖT0 ±0 Õ‘«0
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 72
2016
 ABSORPTIOMÉTRIE – OPTIMISATION

Pour augmenter le rapport signal/bruit :

• Eviter la complexation (charge ionique la
plus élevée possible) car TR avec la charge
ionique moyenne.
• Augmenter TR : ⇒ les mobilités du
chromophore et de l’analyte doivent être les
plus proches possibles.
• Travailler avec un chromophore à εc élevé

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 73
2016
 OPTIMISATION – TR VS CHARGE

Eviter la complexation (charge ionique la plus élevée possible)

80

70

60
Surface corrigée (µV)

50

40

30

20

10

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Charge ionique
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 74
2016
 OPTIMISATION – TR VS MOBILITÉ

les mobilités du chromophore et de l’analyte doivent être les plus proches

possibles

12000

12000 10000

8000

10000 6000

4000

8000 2000
Hauteurt (µV)

-2 -1 0 1 2

6000

4000

2000

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
T em ps d e m ig ra tio n rela tif (m in )
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 75
2016
2016
27 SEPTEMBRE

S
p
100

150

200

100

150

200
50

50
0

OPTIMISATION – TR VS MOBILITÉ, EXEMPLES

-3

-3
----1-naphthylamine

----Ephedrine
----φ-tMe-NH
----φ-tMe-NH
-2

-2
4

Tem ps de migration relatif (min)

4

----1-naphthylamine
----UV Cat 1
-1

-1 ----Ephedrine
----Pyridine
----UV Cat 2
----Imidazole
----UV Cat 1
0

----UV Cat 2

CERIUM
----Imidazole
SODIUM
1

----Pyridine
2

2
3

3
100

150

200

250

300

100

150
50

50
-3

-3
-2

-2

----1-naphthylamine
-1

-1

----Ephedrine
L’électrophorèse capillaire | PAGE 76

--UV---------UV
Cat 1 Cat 2
φ-tMe-NH ---
0

4
-
LANTHANUM

----Imidazole
UV Cat 2----
COPPER
1

----Pyridine
Ephedrine----
UV Cat 1----
2

Imidazole----
Pyridine----
3

3
 OPTIMISATION – TR VS MOBILITÉ, EXEMPLES
Pyridine
Ephédrine
Naphthylamine
220
φ-tMe-NH
4
200 Uv Cat 1
Imidazole
180

160

140

120
p
S

100

80

60

40
Am Cm
20
K 4

Sm

Tm
NH

Mg
Mn

Gd
Rb

Ca
Na

Cd
Co

Ce

Nd

Cu

Ho
Cs

Dy
Ba

Pb

Be

Eu

Yb
Tb
Zn

La

Lu
Cr
Sr

Pr

Er
Ni
Tl
Ti

Li

U
Y
£×
×¢ =27 SEPTEMBRE Element
2016 ×
L’électrophorèse capillaire | PAGE 77
 SEPARATIONS ANIONS/CATIONS
Utilisation de complexant(s)
Unité d'absorbance (V) (x1E-3)
Li
Capillaire 60cm, V=20kV,
27,2 [18-crown-6]=2mM,
[HIBA]=7,7mM,
t=30s, UV 185 nm Be
26,7 Na Sr
Ba
Ca Mg
NH4
Rb K
26,2 Cs

25,7

Unité d'absorbance (V) (1E-3)

25,2 Na
2 3 4 28,5 5Capillaire 60cm, V=20kV,
6 Cs, Rb : 3,0 mg/l
Ca NH4, K : 1,0 mg/l
[tropolone]=5mM, Ca, Na : 1,0 mg/l
Temps (min) [18-crown-6]=2mM, Sr : 1,5 mg/l
27,5 [UV-Cat2]=3mM Sr Mg : 0,4 mg/l
U.V. 185 nm Mg
Ba : 2,0 mg/l
Li Li : 0,2 mg/l
NH 4 Ba
26,5 K
Rb

Cs
25,5

24,5
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Temps (min)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 78
2016
 SEPARATIONS ANIONS/CATIONS

µ du chromophore
Unité d'absorbance (V) (x1E-3)
28,4
Li Terres rares : 5,0 mg/l
Capillaire 60cm, V=30kV, La Lithium : 1,0 mg/l
27,9 [HIBA]=4mM, Ce Magnésium : 1,0 mg/l
[UV Cat 1]=10mM, Sodium : 1,0 mg/l
t=30s, U.V. 214 nm Pr Calcium : 2,0 mg/l
27,4 Mg Potassium : 5,0 mg/l
Ca
K Nd Eu
Na Sm
26,9 Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu

26,4

25,9

25,4
1 2 3 4 5 6
Temps (min)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 79
2016
 SEPARATIONS ANIONS/CATIONS
Effet longueur et tension
Unité d'absorbance (V) (x1E-3)
Li
27,2 Capillaire 60cm, V=20kV,
[18-crown-6]=2mM,
[HIBA]=7,7mM,
t=30s, UV 185 nm Be
26,7 Na Sr
Ba
Ca Mg
NH4
26,2 Rb K
Cs

25,7

25,2
2 3 4 5 6
Temps (min)
Unité d'absorbance (V) (x1E-4)
Li Cs, Rb : 3,0
271 mg/l
Capillaire 100cm, V=30kV,
[18-crown-6]=1,9mM, NH 4, K : 1,0
269 Ca Na mg/l
[HIBA]=7,7mM, Ba
t=30s, UV 185 nm Mg Sr Ca, Na : 1,0
mg/l
267 NH 4 Sr : 1,5 mg/l
K Be Mg : 0,4 mg/l
265 Rb Ba : 2,0 mg/l
Li : 0,2 mg/l
Cs
263

261

259
5 6 7 8 9 10 11
Temps (min)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 80
2016
 SEPARATIONS ANIONS/CATIONS
Unité d'absorbance (V) (x1E-4)
269

267

265

263

261

259

257

255
5 7 9 11 13 15
Unité d'absorbance (V) (x1E-4)
Temps (min)
269 P b : 2 ,0 m g /l
Ni Li B e : 0 ,4 m g /l
267 Zn
N i : 1 ,0 m g /l
265 Be L i : 0 ,2 m g /l
Z n : 1 ,0 m g /l
263
Pb
261
259
257
255
9,165 9,365 9,565 9,765 9,965
Temps (min)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 81
2016
 SEPARATIONS ANIONS/CATIONS
Effet âge du capillaire C a p illa ire n e u f

Unité d'absorbance (V) (x1E-4)

C a p illa ire 6 0 c m ,
259 F
-
V=20kV,
O F M = 2 ,5 m l,
-
M oO4 [C h ro m a te ]= 5 m M ,
-
- H 2P O 4 t= 3 0 s ,
257 C lS O 24-
U V 254 nm
- 2-
NO2 WO4 -
- C lO 3
NO3 -
-
Br SC N
255 - -
C lO 4 HCO3
I-

253

251
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Temps (min)

C a p illa ire u s a g é

Unité d'absorbance (V) (x1E-4)

259
B ro m u re : 2 ,0 m g /l C a p illa ire 6 0 c m , V = 2 0 k V ,
C h lo ru re : 1 ,0 m g / l F -
O F M = 2 ,5 m l,
258 S u lfa te : 1 ,0 m g /l
N itrite : 1 ,0 m g / l
Cl -
SO 4
2-
-
H 2P O 4 [ C h ro m a te ]= 5 m M ,
N itra te : 1 , 0 m g /l - t=3 0 s , U V 2 5 4 n m
M oO4 -
M o ly b d a te : 2 ,0 m g /l -
NO2 C lO 3
257 T u n g s ta te : 2 , 0 m g /l
C h lo ra te : 2 , 0 m g /l
2-
W O4 SCN
-

T h io c y a n a te : 2 ,0 m g /l -
P e rc h lo ra te : 2 ,0 m g /l B r- NO3
256 F lu o ru re : 1 ,0 m g /l
-
P h o s p h a te : 2 ,0 m g /l C lO 4
C a rb o n a te : 2 ,0 m g /l
-
HCO
255 3

-
I

254

253
27
2 SEPTEMBRE
2,5 3 3,5 4 4,5 5
L’électrophorèse capillaire | PAGE 82
2016 Temps (min)
 COURBE DE CALIBRATION

ÐÑ = GS × Z- − Z •

r = 0,99948
1300 pente = 1033 ± 3
1200
1100
1000
Surface corrigée (µV)

900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2

[NO -] (mg/l)
2

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 83
2016
 NORMALISATION DES SURFACES
x xt
¾! = =
(! 8#• + 8! ;

¾€ ⟹ (€ ⟹ 8€
¾< ¾: ¾r
(< (: (r

La surface du pic est dépendante de la vitesse à échantillonnage constant !

(pour une même concentration, un ion lent aura une surface plus grande qu’un ion rapide)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 84
Fréquence
2016 échantillonnage signal = 2 – 32 Hz
 DÉTECTION - LIF

• ≈ Ø|> ;¸#xx Ù! P! ¸!
k : efficacité de collection lumière
I0 : intensité d’excitation
Vcell : volume illuminée dans la cellule
Φi = rendement quantique de fluorescence
εi : coefficient d’absorption molaire
Ci : concentration de l’analyte i

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 85
2016
 DÉTECTION LIF – FLUORESCENCE INVERSE

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 86
2016
 CONDUCTOMÉTRIE - EXEMPLES

conductivité

Ampérométrie

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 87
2016
 DÉTECTEUR – SPECTROMÈTRE DE MASSE

Avantage : détecteur très sensible

UV detector
ICP

Fused-silica
capillary

UV window

nebulizer

Inconvénient: c’est un spectromètre de masse !

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 88
2016
 INTERFAÇAGE EC-ICPMS

Exposé du problème :
Æ W
0 = r, •. <> ( ? )

Calculer le débit en sortie de capillaire

On prendra d = 50 µm, V = 20 kV, longueur totale du capillaire = 60 cm

Calcul de la vitesse du flux électroosmotique

Calcul du volume d’un cylindre

27 SEPTEMBRE
2016
L’électrophorèse capillaire | PAGE 89
 ICPMS - NÉBULISEURS

D = 1000 µL/min D > 100 µL/min

Nébuliseur PFA
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 90
2016
 ICPMS – MICRO-NÉBULISEUR (D > 2 µL/MIN)

Parallel Concentric
parallel nebulizer Capillary

Mira Mist CE

electrode Pt
Mini chamber
efficiency 100%
Make up at 10 µL.min-1
© Burgener Research, Canada
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 91
2016
 COUPLAGE - PARAMÈTRES

Location of the capillary outlet x mm

from the nozzle
Capillary

electrode Pt

Mini chamber
Ar pressure x bar Temperature x °C

Flow rate x µL.min-1 : 2 % HNO3 + x % ethanol

Temperature x °C

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 92
2016
 OPTIMISATION
238
U sensitivity in function of the amount of ethanol 0 2 4 6 8 10
1000
60000
70000

900
55000 60000

U count rate (s )
-1
800
50000
Count rate (s )

50000
-1

40000 700

45000
30000 600

40000 20000
500

10000

238
35000 400

0
300
30000 0 2 4 6 8 10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

% ethanol in the make up solution make up flow rate (µl/min)

Positive effect up to 16 % At 10 µl/min dilution is x100

2.7x10
-5 At 1 µl/min dilution is only x10
9µl/min
2.6x10
-5
6µl/min Optimum at 5-6 µl/min
Cm (cm².V .s )
-1

-5
2.5x10
-1

-5
2.4x10

-5
2.3x10
-5
2.2x10

-5
2.1x10
248

-5
2.0x10
f.w.h.m for

Best resolution at 1.25 mm back to the

-5
1.9x10

-5
1.8x10

1.7x10
-5 nozzle for a flow rate of 6 µl/min !
-5
1.6x10
-5 -4 -3 -2 -1 0
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 93
2016 Capillary outlet location from the nozzle (mm)
 EC-ICPMS - EXEMPLES
Am
Cm
Cf
Eu
Neutr
-4
5.10 M DTPA al
speci
-4
10 M DTPA Catio es Anio
nic nic
-5 speci spec
3.10 M DTPA es
ies
pH 6.045
-5
10 M DTPA

-6
8.10 M DTPA
pH 6.503

-6
3.10 M DTPA
pH 7.114
neutral
6500
0 M DTPA
6000 pH 7.488
-0,0002 -0,0001 0,0000 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006
5500
2 -1 -1 Pu(IV)EDTA 400 500 600 700 800 900 1000
Am
3+ Mobility (cm .s .V ) 5000
2-
1.0 Migration time (min)
AmDTPA
0.9 4500
3+
Am 1.0

Count rate 4000

0.8
2-

-4
PA

0.9
µ = -1,04 10
α

0.7
DT

3500
Am

0.8
α

0.6 -
0.7
3000 Pu(IV)OH(EDTA)
-4
+ 5-
-3
0.6
PuO2 PuO2(CO3)3
2500
AmH
DTPA

0.5
-2 100
log C

-4
DTPA

0.5
1.0
1.5
2.0
-1
-3 2000 -4
-

2.5
2.0x10
Am
DTPA

3.0
pH 0 -2
3.5
4.0
1500 24.5 %
log C

0.5
1.0 -1 75.5% -
1.5
2.0
pH
2.5
3.0
3.5 0 1000
PuO2CO3
4.0
80
-4
2+ 500 1.0x10
Pu(OH)2
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800

µapp. (cm .V .s )
-1
3000 0.0 60
Time (s)

-1
+
Pu(OH)3

2
2500
-4
5.0 -1.0x10 3- 40
4.5 PuO2(CO3)2
Count rate (s )
-1

2000 4.0
3.5
-4
3.0 -2.0x10
2.5
1500 20
2.0
1.5
µ

1.0 -4
-3.0x10
1000 3+
0.5
PuOH 0.0
0
49 -0.5

500
43 -1.0 5 6 7 8 9 10 11 12
-1.5

8
-2.0
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7 -6
10 10
-5
10
-4 -3
10 10
-2
10
-1
10
0
pH
DTPA
0 27 SEPTEMBRE
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 L’électrophorèse capillaire | PAGE 94
2016 Time (s)
 DÉTECTEURS - COMPARAISON

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 95
2016
 COMPLEXATION EN EC - THÉORIE

8! = Ú! 8!
!

Exemple : complexation d’un métal M3+ par un ligand anionique L–

Supposons les équilibres successifs :

J BW
+B ⇌ BW Û = J B

J
BW
+ 2B ⇌ BW ÛW = J B W

BJ
J
+ 3B ⇌ BJ ÛJ = J B J

J
Bl
+ 4B ⇌ Bl Ûl = J B l

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 96
2016
 COMPLEXATION EN EC - RÉSOLUTION

M3+ ML2+ ML2+ ML3 ML4–

C0(1–α1–α2–α3–α4) α1C0 α2C0 α3C0 α4C0

1
+Û Û Û Û
B
1 Ü Û
ÛW + ÛW ÛW ÛW
B W ÜW ÛW
× Ü =
1 J ÛJ
ÛJ ÛJ + ÛJ ÛJ Ül Ûl
B J

1
Ûl Ûl Ûl + Ûl
B W

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 97
2016
 EXEMPLE DE DIAGRAMME DE SPÉCIATION

1,0

0,8

UO 2+
0,6 2
UO (αHiB)+
2
0

UO (αHiB)
C/C

2 2
0,4 UO (αHiB) -
2 3

0,2

0,0

1E-4 1E-3 0,01 0,1 1

C (α HiB) (M)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 98
2016
 COMPLEXATION EN EC Q VS K

Stabilité d’un complexe métal-ligand

M + L 
→ ML
form k
k form
Constante de K ML =
ML  
→ M * + L *
k diss k diss
complexation
forte 16
ln( 1 /2 )
Demi-vie du
t1 / 2 = − 14
complexe k diss
12
Complexes stables

ML
10
Si t1/2 >> temps d’analyse :

log K
Complexe stable. 8
Déséquilibre
6
potentiel
Si t1/2 << temps d’analyse : 4
Complexe labile.
2 Complexes
labiles
Si t1/2 ~ temps d’analyse : 0
10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6
Déséquilibre potentiel. faible
log k form
rapide lente

27 SEPTEMBRE
Sonke, J. E.; Salters, V. J. M., Analyst, 2004, 129, 731-738. L’électrophorèse capillaire | PAGE 99
2016
 COMPLEXE LABILE

Cation Ligand µ av = µ M .ϕ M + ∑ µ ML .ϕ ML
n n n
-- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- -- -- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- --
+ + + + + + + + + M
+ 80%
+ + +M +50%+ + M+20%
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
M ML 20% ML 50% ML 80%ML

40

20

average mobility
Key parameter: mobility µ 0

-20

-40

0 200 400 600 800 1000

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +0 + + +20+ + + 40+ + + 60 80
+ + + + + + +100+ + + + +
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Time
- - - -(s)- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Concentration
- - - - - - - -of- ligand
--- -- -- ---- -- -- ---- --

Moving referential = Ligand

µ M + ∑ β nI .[ L]n .µ ML n
µ M − µ av
µ av = n
= β I .[L]
1 + ∑ β nI .[ L]n µ av − µ ML
n
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 100
2016
 EXEMPLE – SYSTÈME SIMPLE (1 CSTE + 1
NEUTRE)
UO22+/SO42- =0

µ = µUO 2+ αUO 2+ + µUO2 SO4 αUO2 SO4

2 2

1.2
1.1
1.0 CSO 2-
4

0
0.9 -6
10
0.8 log β1o = 3.19 ± 0.09
-5
10
-4
0.7 10
log β1o ( lit.) = 3.15 ± 0.02
-4
5×10
0.6 1
2+

-3
10
UO2

β1
-3
0.5 3×10
φ

-2
10
0.4
0.3
0.2 -1
Theoretical curve (I = 0.11 moL.L ) 480 500 520 540 560 580 600 660 680 700 720
0.1 -1
Experimental data (I = 0.11 mol.L ) Migration time (s)

0.0
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
10 10 10 10 10 10 10 Formation of UO2(SO4)22-
27 SEPTEMBRE -1
CSO (mol.L )
2-
L’électrophorèse capillaire | PAGE 101
2016 4
 EXEMPLE – SYSTÈME SIMPLE (1 CSTE)
1.6 (Pu/Np)O2+/SO42-
Np(V) Pu(V)
µ AnO − µ avAn
+
2
= β1.[ SO42 − ] 0.55
µ An
av − µ AnO SO − 1.038.10
-4
1.139.10
-4
0.50 Im=0.357 m
2 4
1.4 Im=0.725 m
0.45
Im=1.051 m 2-
0.40 [SO4 ] = 0.15 M
Im=1.617 m

(µPuO -µav)/(µav-µPuO SO )
-
4
+ 4D -4
0.35 -4
1.441.10 1.525.10

2
1.2
0.30 2-
-

[SO4 ] = 0.08 M
PuO2SO4

0.25
-4 -4
1.910.10 0.20 1.964.10
Im

+
2
log β

1.0 0.15 2-
[SO4 ] = 0.03 M
0.10 -4
2.301.10
-4 2.341.10
0.05

0.8 0.00 2-
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 [SO0.10
4
] = 0 M 0.12 0.14 0.16
2-
[SO4 ] (M)
-4 -4 -4 -4 -4 -4
1.0x10 1.5x10 2.0x10 2.5x10 3.0x10 3.5x10
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
2 -1 -1
µepg (cm .V .s ) -1
Im (mol.kg )

log β PuO
Conditions:0[Np] = 10-7 M; [Pu] = 10-9 M
log β NpO SO − = 1.32 ± 0.13 0
SO −
= 1.28 ± 0.06
Na22SO4
4 / NaClO4 medium; Im = 0.725 m 2 4

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 102
2016
S. Topin, J. Aupiais, et al., Anal. Chem, 81 (2009) 5354-5363
 PREDICTION MOBILITÉ DES COMPLEXES
From limiting conductivity and Anderko’s model zcomplex
λ 0
complex = 1
 n   3

3
Accuracy ± 25 %
∑  zi  
 i =1  λ0  
  i 
Species Mobility - Experiment Mobility - Estimation Average Deviation (%)

MgCl+ 31.1 27.3 −12.2

BaCl+ 31.1, 22.8 to 39.4 32.3 +3.9

CdCl+ 26.4, 26.9, 29.2, 27.3 −9.8

34.2, 34.6
PbCl+ 46.6 35.2 +24.5

LaSO4+ 24.0 21.8 −9.2

CdI+ 34.73, 35.9 27.3 −22.7

UO2F+ 33.2 28.3 −14.8

Fe(CN )6
4−
−111.5 −103.8 −6.9

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 103
2016
Anderko A., Lencka M. M., Ind. Eng. Chem. Res., 36 (1997) 1932-1943
 µ M + ∑ β nI .[ L ]n .µ ML n
EXEMPLE – 4 ESPÈCES µ av = n
1 + ∑ β nI .[ L ]n
n
+ 5-
PuO2 PuO2(CO3)3
100
-4
2.0x10
-
PuO2CO3
-4
Extrapolation I = 0 80
1.0x10
logβ1 = 4.95±0.10
logβ2 = 6.34±0.10
µ app. (cm .V .s )

logβ3 = 5.61±0.16
-1

0.0 60
-1
2

-4
-1.0x10 3- 40
PuO2(CO3)2

-4
-2.0x10
20

-4
-3.0x10
0
5 6 7 8 9 10 11 12
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 104
2016 pH
 COMPLEXE STABLE
Cation Ligand

ML
-- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- -- -- -- -- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- --
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 80% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

M
20%
Key parameter: corrected area Ac

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -0- - - - - - - -200
- - - - - - - -400
- - - - - - - -600
- - - - - - - -800
- - - - - - - -1000
-- -- -- ---- -- -- ---- -- -- ---- --
Time (s)
Moving referential = Ligand

SCM SCML
φM = φ ML =
SCM + SCML SCM + SCML
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 105
2016
 EXEMPLE – PU/TRANSFERRINE
Capillaires « coatés » pour éviter l’adsorption de la protéine sur la paroi du capillaire
TM
Pu(NTA)2 N-CHO
(alcool polyvynilique)
1.0 TM
Neutral Cap
(polyacrylamide)

0.8
Tf 50 µM Tf 250 µM

0.6
Tf 0.05 µM

Pu(NTA)2

PuTf
PuTf

PuTf
0.4 Pu(NTA)2

Pu(NTA)2

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

t (s)

0.2

PuTf

0.0
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

∗
[Tf] (M)
27B–— Ý
SEPTEMBRE = 24,7
-7
x
2016 0 Þ ®ª
=(8.7±1.1)10 L’électrophorèse capillaire | PAGE 106
 TRAITEMENT DES CAPILLAIRES

La séparation des anions n’est pas favorisée pour les capillaires en silice fondue
en raison de l’apparition de charges négatives à pH > 2 et donc de la présence
d’un flux électroosmotique dirigée vers la cathode.
Dans ce cas, on peut accélérer la séparation en inversant le flux
électroosmotique, c’est-à-dire en modifiant la surface interne par adsorption de
molécules cationiques.

D’une manière générale, le traitement des capillaires est requis pour :

• Supprimer les interactions des protéines avec la surface en silice
• Contrôler finement la magnitude du flux électroosmotique

• Ces traitements sont réalisés soit par :

• Liaisons chimiques ou adsorption – traitement permanent
• Interactions chimiques/physiques réversibles – traitement dynamique
(dans ce cas la molécule modifiant l’état de surface doit être présente
dans l’électrolyte pendant toute la séparation)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 107
2016
 EXEMPLES – « COATING » PERMANENT

Coating :
• Acrylamide : silane contenant un groupement
fonctionnel, puis polymérisation in situ, stable et faible
eof
• PEG : adhérence physique obtenue par dépôt sur la
surface puis réaction avec un agent liant
• Alcool polyvinylique : chauffage à 150 °C

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 108
2016
 EXEMPLES – « COATING » DYNAMIQUE

Avantages :
• Facile à mettre en œuvre (ajout d’un agent supplémentaire dans l’électrolyte)
• Utilisation de capillaires standards et bon marché
• Peu coûteux
• Applicable à des électrolytes variés

Précautions :
• Ne doit pas interférer avec la détection (transparent en optique ou pas
d’interférences isobariques pour la masse)

Les plus connus : les surfactants, en dessous de la CMC (concentration

micellaire critique) ils s’adsorbent à la surface.
Ils peuvent être :
anioniques
cationiques
zwitterioniques
non ioniques

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 109
2016
 DOUBLE COUCHE – INVERSION EOF

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 110
Ex 2016
: CTAB – CétylTrimethylAmmonium Bromide
 SÉPARATION DE PROTEINES

CTAB = dynamique
(présent dans électrolyte)
DDAB = semi-permanent
(non présent dans électrolyte)

CTAB partiellement efficace

contre adsorption des
protéines (3 détectées)

DDAB efficace contre

adsorption des protéines (5
détectées)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 111
2016
 VARIANTE – MULTI-COATING (PLUS STABLE)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 112
2016
 ASPECT PRATIQUE - ELECTROLYSE

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 113
2016
 ASPECT PRATIQUE – PH

pH 5 → 5,18 : μ0 = +25%

• Electrolyte tampon obligatoire

• Si analyte possède un pKa, alors
l’électrolyte doit tamponner à
pKa – 1 < pH < pKa + 1

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 114
2016
 ASPECT PRATIQUE – EFFET MÉMOIRE

Ne pas utiliser le même capillaire

pour des expériences à pH très
acide et à pH très basique

De préférence, utiliser un capillaire par méthode

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 115
2016
 MÉTHODES DE SÉPARATION PAR EC

• Electrophorèse capillaire de zone (CZE)

• Chromatographie électrocinétique micellaire
(MEKC)
• Electrochromatographie capillaire (CEC)
• Electrophorèse capillaire sur gel (CGE)
• Isotachophorèse capillaire (CITP)
• Focalisation isoélectique capillaire (CIEF)

CEC = HPLC sur capillaire rempli d’une phase inverse + champ électrique
CGE = EC sur capillaire rempli par un polymère (exclusion stérique)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 116
2016
 AUTRES MÉTHODES SÉPARATIVES - MEKC
Séparation d’espèces neutres

S = soluté

Utilisation de surfactants (cationique ou anionique)

Représentation de micelle au dessus de leur CMC (concentration micellaire
anionique et cationique critique)
Puisque les micelles sont chargées, elles migrent sous un champ électrique

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 117
2016
 MEKC - THÉORIE

¾' − ¾> ;=
Facteur de capacité :
µ
Ø = =y
¾' ;9
¾> < −
¾9

¾' = temps de rétention du soluté

¾> = temps de rétention du soluté non retenue se déplaçant à ( = (#•Â
¾9 = temps de rétention de la micelle
y = coefficient de partage
;= = volume de la phase micellaire
;9 = volume de la phase mobile

Temps de rétention : < + Ø′ ¾#•Â

¾' = ¾#•Â
< + Ø′
¾9

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 118
2016
 MEKC – TEMPS DE MIGRATION

1) Composé neutre (M) dans micelle (*)

∗
1 Q′ ∗ (< + ص
)¾#•Â
â = 0 ª + ∗
¾€ =
1 + Q′ 1 + Q′ ¾#•Â
< + Ø′ ∗
i i i ¾
∗ ∗
â = ∗ 0 ª = = ∗
â 0 ª

1) Composé chargé (M) dans micelle (*)

1 Q′
∗
â = 0 ª + â + ∗ (< + ص )¾€
1 + Q′ 1 + Q′ ¾∗€ = ¾
< + Ø′ €
i ¾∗
0 ª+ â =
â
27 SEPTEMBRE
2016

L’électrophorèse capillaire | PAGE 119

 MEKC - EXEMPLE

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 120
2016
 MEKC – QUELQUES DÉTERGENTS

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 121
2016
 SEPARATION PAR MEKC

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 122
2016
 AUTRES MÉTHODES SÉPARATIVES - CITP

CITP = Capillary IsoTachoPhoresis (isotachophorèse capillaire)

Principe :
Cette méthode est fondée exclusivement sur la séparation des molécules
suivant leur mobilité électrophorétique. Les ions se déplacent tous à la même
vitesse, les plus mobiles en tête et les plus lents en queue.

Un tube capillaire est rempli d’un électrolyte constitué d’un ion ayant une
mobilité supérieure à celle de tous les ions à séparer (appelé ion pilote).
L’extrémité du capillaire où est placée l’électrode de même signe que ceux des
ions à séparer (cathode pour des anions, anode pour des cations) est remplie
d’un électrolyte constitué d’un ion ayant une mobilité inférieure à celle de tous
les ions à séparer (ion dit terminal).

L’isotachophorèse est régit par la fonction de régulation de Kohlrausch

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 123
2016
 MIGRATION

Champ électrique faible dans l’électrolyte « leader » → ralentissement

Champ électrique fort dans l’électrolyte « terminal » → accélération
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 124
2016
 PRINCIPE

Premier constat :
les ions LE et TE vont migrer à la même vitesse et encadrer la zone de
présence des espèces avec ã1 = ã1 ã1 = ®1 ®1 = ®1
t et H sont différents et compensent 8t et 8H .

Deuxième constat :
les ions à analyser vont se séparer petit à petit jusqu’à satisfaire N = º = Î =
⋯
H > } > X > w > ⋯ > t . Les champs locaux compensent les 8!
Entre zone d'une espèce ionique, il existe un gradient de champ électrique qui dépend de la différence de
mobilité avec les ions voisins. Un ion qui sort de son domaine y est forcément ramené puisqu'il passe dans
une zone de champ plus forte ou plus faible.

Troisième constat :
L’intensité du courant est la même dans tout le capillaire
si on utilise des solutions d'ions de tête (LE) et de queue (TE)concentrées (donc favorisant une intensité
de courant élevée), elles vont conduire à la concentration des ions i au sein de leurs domaines respectifs
(concentration)
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 125
2016
 ITPGRAMME - EXEMPLE

Analyse par conductimétrie, à gradient de

potentiel : hauteur des paliers (analyse
qualitative)
Signal dérivé : longueur des paliers (analyse
quantitative)

NB : la concentration des ions au sein de

chaque zone est rigoureusement constante

Etalement d’une frontière entre 2 zones i et j:

4SG ¬
∆ =
ã1 − ¬

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 126
2016
 ITP – ÉQUATIONS SPÉCIFIQUES

1) Absence d’électroosmose – courant imposé

2) Loi d’Ohm – conservation du flux de charges :

æ W)
å = = › = R? (Ñ.
×
›ã1 ã1 = › = › ®1 ®1 5) Adaptation des concentrations des
solutés (relation approchée)
)
3) Etat stationnaire -
1− )
ã1 ã1
ã1 = = ®1 ›ã1 › › ®1 æ’= B )
ç = =
ã1 ã1 = = ®1 ®1 ã1 Î
®1 1− )

4) Conservation du contre-ion
ã1
Î
1−
ã1 ã1
R ’ = R ’
Î
1−

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 127
2016
 ITP – CHOIX DES ÉLECTROLYTES

ITP Anionique Cationique

Ion meneur LE Cl– K+
Contre-ion Base faible Acide faible
pKc > pki – 1 pKc < pki + 1
Ion terminal TE OH– H+
Acide faible Base faible
µ = 5-10.10–5 µ = 5-10.10–5
cm²/Vs cm²/Vs

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 128
2016
 FOCALISATION ISOÉLECTRIQUE (CIEF)

Séparation d’ampholytes (protéines, peptides)

Migration dans un gradient de pH en absence d’électroosmose
Trois électrolytes différents
Vitesses de migration décroissantes
Existence d’un état stationnaire
Effet de concentration, fronts de séparation étroit (peu de diffusion)

Limitations :
Instabilité du gradient de pH (instable dans le temps et l’espace)
Convection

Résolution : ∆(pI) = 0,05 pH

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 129
2016
 CIEF – MÉTHODE : REMPLISSAGE

1 – Remplissage du capillaire par l’échantillon dans un mélange d’ampholytes

pH

pHB pHI pHJ pHK pHA

Catholyte basique (ex: NaOH)

Echantillon dans un mélange d’ampholyte (ex: LKB, pH 3,5-10 à 4 % ; Biolyte

5/7 ; etc.)
Anolyte acide (ex: H3PO4)

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 130
2016
 CIEF – MÉTHODE : FOCALISATION

! ↘ à V constant

pH

pHB pHI pHJ pHK pHA

Quand le courant se stabilise, les

substances sont immobilisées dans le
gradient de pH → état stationnaire

27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 131
2016
 CIEF – MÉTHODE : MOBILISATION
On change l’anolyte si mobilisation anodique
! ↗ à V constant

pH

pHB pHI pHJ pHK pHA

Si mobilisation anodique C+ ≠ H+ (par exemple Na+)

Si mobilisation cathodique, alors c’est le compartiment

qui est changé avec A– ≠ OH– et reste inchangé et
la courbe de pH est inversée.

Ici = NaOH =
27 SEPTEMBRE
L’électrophorèse capillaire | PAGE 132
2016