1ère  BTK  –  03/12/2015  

TP  11:  Détermination  du  nombre  de  levures  dans  une  colonie  de  
Saccharomyces  cerevisiae  
 
 

OBJECTIFS  :  
§ Découvrir  3  techniques  différentes  de  dénombrement  ;  
§ Comparer  les  résultats  des  dénombrements  entre  eux  ;  
§ Conclure  sur  le  nombre  de  levures  présentes  dans  une  colonie.  
 
 
Contexte  :   Saccharomyces   cerevisiae   est   le   ferment   de   base   de   panification.   On   cherche   à   connaître   le  
nombre  de  levures  présents  dans  une  colonie  de  Saccharomyces  cerevisiae  isolée  sur  une  gélose  Sabouraud.  
 
I. Observation   macroscopique   et   dissociation   d’une   colonie   de   levure   dans   un   bouillon  
Sabouraud  
 
ü Matériels  :  
Ø Une   gélose   Sabouraud   sur   laquelle   a   été   déposée   une   culture   pure   de   Saccharomyces  
cerevisiae  ;  
Ø Une  pipette  Pasteur  ;  
Ø Un  bouillon  Sabouraud  de  10  mL  ;  
Ø Un  bac  à  glace.  
 
ü Mode  opératoire  
Ø Observer  les  colonies  de  levures  et  en  choisir  une  bien  isolé  de  taille  moyenne.  
Ø Prélever  l’intégralité  de  cette  colonie  à  l’aide  d’une  pipette  Pasteur.  
Ø La  dissocier  dans  les  10  mL  debouillon  Sabouraud,  puis  agiter.  
Ø On  nommera  cette  suspension,  suspension  «  S  ».  
 
è  La  suspension  S  constitue  le  matériel  biologique  pour  les  activités  expérimentales  suivantes.  Elle  sera  
conservée  dans  la  glace  jusqu’à  la  fin  des  manipulations,  ou  à  défaut  à  4°C.  
 
ü Compte  rendu  
 
Q1  :  Rédiger  sous  forme  d’un  tableau  les  résultats  de  l’examen  macroscopique  des  colonies  de  levures.  1  
 
 
 
 

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II. Estimation   du   nombre   de   levures   dans   une   colonie   de   S.cerevisiae   par   numération  
directe  en  cellule  de  Malassez  
 

Cette  partie  concerne  la  1ère  méthode  de  dénombrement.  

 

ü Matériels  :  
Ø Une  cellule  de  Malassez  ;  
Ø P100  +  cônes  ;  
Ø Un  microscope  optique  ;  
Ø Un  bac  à  glace  ;  
Ø Suspension  S  de  S.cerevisiae.  
 
ü Mode  opératoire  
Ø Prélever   la   suspension   S   et   la   déposer   dans   la   chambre   de   comptage   de   la   cellule   de  
Malassez.  
Ø Attendre  2  minutes  pour  que  les  levures  sédimentes  bien.  
Ø Parmi   tout   le   quadrillage,   procéder   à   la   numération   des   levures   dans   10   rectangles   (è   se  
référer  à  la  fiche  technique  "Cellule  de  Malassez").  
 

ü Compte  rendu  
 

Q2  :  Présenter  les  résultats  de  la  numération  de  levures  de  la  suspension  S.  
Q3  :  Établir  l’équation  aux  grandeurs  permettant  de  trouver  la  concentration  en  nombre  de  levures  dans  la  
suspension  S  (CN  (levure  ;  suspension  S))  en  levures.mL-­‐1.    
Q4  :Établir  l’équation  aux  unités  puis  aux  valeurs  numériques.  2  
Q5  :Présenter  le  résultat  de  la  numération,  sachant  que  l’incertitude  associée  à  la  mesure  est  de  10  %.  0,5  
Q6  :En  déduire  le  nombre  total  de  levures  dans  une  colonie.  1  
 
 
III. Estimation   du   nombre   de   levures   d’une   colonie   de   S.cerevisiae   par  
spectrophotométrie  
 

Cette  partie  concerne  la  2ème  méthode  de  dénombrement.  

 

ü Donnée  :  
Ø Une  absorbance  de  1  à  620  nm  correspond  à  une  concentration  en  nombre  de  levures  de  
1.108  levures.mL-­‐1.    
 

ü Matériels  :  
Ø 1  cuve  de  spectrophotomètre  ;  
Ø Compte-­‐goutte  stérile  ;  
Ø Un  bouillon  Sabouraud  stérile  de  1  mL  en  cuve  ;  
Ø Suspension  S  ;  
Ø Bac  à  glace  ;  
Ø Spectrophotomètre  réglé  à  620  nm.  
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ü Mode  opératoire  
Ø Agiter  vigoureusement  la  suspension  S.  
Ø Remplir  la  cuve  de  la  suspension  S  à  l’aide  d’un  compte  goutte  stérile.  
Ø Mesurer  l’absorbance  à  620  nm  de  la  suspension  contre  le  0  (bouillon  Sabouraud)  puis  noter  
la  valeur  obtenue.  
Ø Si  cette  valeur  est  supérieur  à  1,500,  diluer  la  suspension  S  au  1/2.  
 
ü Compte  rendu  
 
Q7  :  Estimer  la  concentration  en  nombre  de  levure  dans  la  suspension  S.  0,5  
Q8  :  Comparer  avec  le  résultat  obtenu  par  numération  en  cellule  de  Malassez  (II.).    
 
IV. Estimation  du  nombre  de  levures  d’une  colonie  de  S.cerevisiae  par  dénombrement  
des  colonies  en  surface  
 

Cette  partie  concerne  la  3ème  méthode  de  dénombrement.  

 

ü Matériels  :  
Ø Deux  tubes  de  10  mL  d’eau  physiologique;  
Ø P100  +  cônes;  
Ø Une  gélose  Sabouraud  appelée  Gélose  S;  
Ø Un  râteau;  
Ø Un  bac  à  glace;  
Ø Suspension  S;  
Ø Étuve  réglée  à  30°C.  
 

ü Mode  opératoire  
Ø Prélever  0,1  mL  de  la  suspension  S  et  les  déposer  dans  10  mL  d’eau  physiologique.  
Ø Prélever  0,1  mL  de  la  dilution  précédente  et  les  déposer  dans  10  mL  d’eau  physiologique.  
Ø Prélever  0,1  mL  de  cette  dernière  suspension  et  les  déposer  à  la  surface  de  la  gélose  S.  
Ø Étaler  à  l’aide  du  râteau.  
Ø Incuber  24  à  48  heures  à  30°C.  
Ø JOUR  2  :  compter  le  nombre  d'UFC  sur  la  gélose  S  et  noter  le  résultat.  
 
ü Compte  rendu  
 
Q9  :  Retrouver  le  facteur  de  dilution  Fd  de  la  suspension  initiale  S.  1  
Q10  :  Calculer  CN  (UFC  ;  suspension  S)  en  UFC.mL-­‐1  en  faisant  les  3  équations.  2  
èAttention,  ne  pas  oublier  le  facteur  de  dilution  dans  les  calculs  !!  
Q11  :En  déduire  le  nombre  de  levures  présents  dans  une  colonie  de  taille  moyenne  de  S.cerevisiae.  1  
Q12  :  Comparer  ce  résultat  avec  celui  obtenu  par  numération  en  cellule  de  Malassez  (II.).  1  

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