Ali Mentai Re

Laboratoire d’expertises et
d’analyses alimentaires
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR

L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE 1
LEAA-REF-MIC-550
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LEAA-REF-MIC-550 Page 1 de 17 AEV 2013-05-09

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
TABLE DES MATIÈRES
1. INTRODUCTION ....................................................................................... 4
2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE........................................................... 4
3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS ............ 5
3.3.1 Généralités .................................................................................. 5
4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE ........................................................................... 6
4.3.1 Tous les aliments .......................................................................... 7
4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides ................................................... 8
4.3.3 Regroupement des unités d’analyse (unité composite) pour la recherche
de bactéries pathogènes (exemple : Salmonella, Listeria
monocytogenes, etc.) .................................................................... 8
4.3.4 Viandes en bloc ............................................................................ 8
4.3.5 Poisson entier cru ......................................................................... 8
4.3.6 Mollusques crus ............................................................................ 8
4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits ........................................... 9
4.3.8 Volaille crue avec peau .................................................................. 9
4.3.9 Œufs........................................................................................... 9
4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la recherche des salmonelles sur la
coquille et à l'intérieur des œufs ............................................... 9
4.3.9.1.1 Extérieur........................................................................... 9
4.3.9.1.2 Intérieur ........................................................................... 9
4.3.9.2 Procédure de prélèvement pour l’analyse de l’intérieur de l’œuf
seulement ........................................................................... 10
4.3.10 Laits secs................................................................................... 10
4.3.11 Produits chambrés ...................................................................... 10
4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras.... 10
4.3.13 Produits secs déshydratés (exemples : épices, céréales, légumineuses
sèches, riz sec)........................................................................... 10
4.3.14 Procédure de prélèvement pour la recherche de salmonelles dans les
graines de germes (luzerne, radis, etc.) ......................................... 11
4.3.15 Produits très salés (5 %) ............................................................ 11
4.3.16 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d’érable, etc.) ................. 11
4.3.17 Conserves.................................................................................. 11
4.3.18 Procédure pour la recherche des bactéries pathogènes à la surface des
fruits frais entiers (cantaloups, melons, etc.) .................................. 12
4.3.19 Écouvillons................................................................................. 12
4.3.19.1 Écouvillon reçu dans un tube contenant 10 ml de tampon
neutralisant : ....................................................................... 12
4.3.19.2 Écouvillon reçu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon
neutralisant: ........................................................................ 12
4.3.20 Éponges .................................................................................... 12
5. DILUANTS ..............................................................................................12
6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION .............................................................13
7. DILUTIONS DES ÉCHANTILLONS ...............................................................14

7.1.1 Définition................................................................................... 14
7.1.2 Procédure .................................................................................. 14
7.2.1 Définition................................................................................... 14
7.2.2 Procédure .................................................................................. 15
8. BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................16
9. APPROBATION ........................................................................................17

1. INTRODUCTION
Le prélèvement des échantillons effectué dans le but de réaliser une analyse

microbiologique est une étape très importante de la chaîne analytique. Il est
primordial de s'assurer de l'intégrité et de la représentativité des échantillons. Le
prélèvement des échantillons peut grandement influencer les résultats obtenus. La
préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique comprend plusieurs
étapes : la réception des échantillons, le prélèvement et la pesée, le broyage et
l’homogénéisation et la dilution des échantillons (solution mère et dilutions
décimales suivantes). Les échantillons doivent être en tout temps minutieusement
manipulés en respectant l’ensemble des règles d’asepsie de manière à éviter toute
contamination.
L’ensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionnés dans ce

document se retrouve dans le document LEAA-REF-MIC-100.
2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE
- Appareil à dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire) ou balance

analytique de portée suffisante avec une précision de lecture de 0,1 g;
- Diluants ou bouillons d'enrichissement;
- Instruments de prélèvement (couteaux, fourchettes, spatules, pinces,
ciseaux, scalpels, cuillères, etc., stériles);
- Alcool 95 % pour flambage, si nécessaire;
- Alcool 70 %;
- Homogénéisateur de type péristaltique avec des sacs stériles de plastique;
- Pipettes sérologiques stériles;
- Réfrigérateurs 1 à 6 oC;
- Congélateurs -9 à -30 oC;
- Micropipettes;
- Tubes 9 ml de peptone-sel ±2 %;
- Bain-marie;
- Savons et détergents germicides.

3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES

ÉCHANTILLONS
3.1 VÉRIFICATION DES CONDITIONS DE TRANSPORT ET DE L’INTÉGRITÉ DES

CONTENANTS
Lorsque les délais de transport (≤ 36 heures) et que la température de conservation

(≤ 6 °C) des échantillons sont adéquats, vérifier les contenants afin de détecter tout
défaut physique. Inspecter minutieusement les sacs de plastique, les bouteilles et
autres contenants afin de vérifier s'il y a présence de trous, de fissures ou de perte
de liquide. Vérifier si l'eau de la glacière ne s'est pas infiltrée dans l'échantillon.
S'assurer que les sacs de plastique (type Whirl-pak) sont très bien roulés et fermés
hermétiquement. Vérifier que les échantillons d’eau ne sont pas congelés lors de
leur réception au laboratoire. N'importe laquelle des irrégularités citées
précédemment invalide l'échantillon pour l’analyse microbiologique et le client
concerné doit en être informé afin de procéder à un autre prélèvement, si
nécessaire.
3.2 IDENTIFICATION ET ENREGISTREMENT DES ÉCHANTILLONS

S'assurer que chaque échantillon est étiqueté et accompagné d'une demande de
service analytique (demande d’analyse électronique Hermès ou formulaire procès-
verbal de prélèvement) lui attribuant un numéro de laboratoire officiel et renfermant
l'ensemble des informations y étant rattachées. Vérifier la correspondance entre la
description de l'échantillon sur la demande et la nature des échantillons expédiés.
Compléter la description, particulièrement si elle a un impact sur l’interprétation des
résultats (exemples : produit cru, cuit, congelé, fermenté, etc.). Procéder à la
détermination et à l’enregistrement des paramètres analytiques.
3.3 ENTREPOSAGE DES ÉCHANTILLONS
3.3.1 GÉNÉRALITÉS
Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les échantillons

immédiatement, ou dans le plus court délai après leur réception au laboratoire. À
moins d’indication contraire, les échantillons d’aliments périssables doivent être
analysés dans un délai maximal de 36 heures entre le prélèvement et l’analyse au
laboratoire. Si exceptionnellement l'analyse doit être reportée, entreposer les
échantillons au congélateur, à la température de la pièce, ou au réfrigérateur, selon
la nature de l’échantillon. L'interprétation des résultats devra tenir compte de cette
période d’entreposage.
Pour les Campylobacters thermotolérants et les bactéries anaérobies strictes, ainsi

que pour tout autre microorganisme dont la survie est susceptible d'être fortement

compromise par des conditions d'entreposage prolongées ou par une congélation,

l'analyse doit être effectuée le plus rapidement possible.
Les produits non périssables, les conserves ou les aliments secs doivent être
conservés à la température de la pièce. Les aliments reçus congelés au laboratoire
doivent être entreposés congelés jusqu'au moment de l'analyse.
Pour la réalisation des prélèvements, les échantillons doivent être sortis du

réfrigérateur pendant un maximum de 15 minutes à la température de la pièce.
Lorsque le prélèvement est terminé, les échantillons sont immédiatement réfrigérés.
Par la suite, ils sont conservés pendant une période à déterminer en fonction des
besoins. Les échantillons doivent toujours être classés et conservés dans un endroit
propre et à l'abri de toute contamination extérieure.
3.4 DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS

Les échantillons sont décongelés au réfrigérateur jusqu’au lendemain.
4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE
4.1 DÉFINITIONS
ÉCHANTILLON : Quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des analyses en
laboratoire. Un échantillon peut consister en une ou plusieurs unités
d’échantillonnage.
UNITÉ D’ÉCHANTILLONNAGE : Portion ou contenant individuel de produit prélevé au

hasard dans un lot. Une unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.
UNITÉ D’ANALYSE : La quantité de produit prélevée de l’unité d’échantillonnage pour

analyse.
UNITÉ COMPOSITE : Regroupement des unités d’analyse ou d’échantillonnage pour

l’analyse.
4.2 MESURES D’HYGIÈNE ET DE SALUBRITÉ

La salle de prélèvement (murs et planchers) doit être propre en tout temps. Les
surfaces de travail doivent être lavées et désinfectées à l'aide d'un détergent
germicide. Des contrôles de la qualité de l'air et des surfaces de travail doivent être
effectués régulièrement.
Les manipulations doivent être effectuées de façon aseptique afin d’éviter la

contamination des produits étudiés. La propreté des mains et des ongles est
primordiale et le personnel n'oubliera pas que les vêtements, les cheveux, les mains
et l'air expiré contiennent ou supportent toujours des microorganismes.

Le prélèvement comprend la pesée et l’ajout du diluant. L’enceinte de sécurité

biologique (ESB) doit être utilisée pour les échantillons nécessitant une asepsie plus
rigoureuse, un environnement stérile - comme dans le cas d’une conserve - ou
lorsque le prélèvement est susceptible de produire des aérosols infectieux, des
concentrations élevées ou de grands volumes de matières infectieuses, comme c’est
le cas avec le lait cru, la moulée, un essai d’aptitude, un aliment déshydraté ou en
poudre, etc.
Les instruments utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles et ne

servir que pour un seul échantillon. Ils doivent être nettoyés et stérilisés à nouveau
avant chaque utilisation. Certains instruments (pince, ciseau, etc.) peuvent être
stérilisés par flambage à l’alcool 95%.
4.3 PRISE DE L'UNITÉ D'ANALYSE ET PESÉE
4.3.1 TOUS LES ALIMENTS
Toute observation anormale constatée lors du prélèvement d’un échantillon

(exemples : mauvaise odeur, couleur anormale, présence de moisissures, etc.) doit
être signalée à un professionnel.
Pour chaque pesée, les informations suivantes doivent être enregistrées : le numéro
de l’échantillon, le nom du technicien qui prélève, la date et l’heure du prélèvement,
la quantité d’échantillon prélevée, le nom et le numéro de lot du diluant utilisé, la
quantité de diluant utilisée, le poids total de l’échantillon avec le diluant, le facteur
de dilution et l’identification de l’appareil à dilution automatique utilisé.
L'extérieur des contenants des échantillons doit toujours être propre avant le
prélèvement. Si nécessaire, nettoyer et désinfecter avec de l’alcool 70 %.
Peser environ 25 g de l'échantillon (au minimum 10 g) dans un sac stérile de

polyéthylène préalablement taré. Il est important de prélever à 4 ou 5 endroits dans
l'échantillon afin d'obtenir un échantillonnage représentatif. Lorsque la quantité
d'aliment prélevée diffère de 25 g, la raison doit être enregistrée et un professionnel
doit être avisé, sauf pour le prélèvement des épices et assaisonnements pour
lesquels l’unité d’analyse est toujours réalisée à partir d’une pesée de dix grammes.
Si l’échantillon est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé

dans une proportion sensiblement équivalente à celle qu'il représente; l'unité
d'analyse devra comporter des prélèvements en surface et en profondeur, dans les
mêmes proportions que dans l'aliment, sauf lors de spécifications particulières.
L’analyse de certaines portions de l’échantillon peut être réalisée séparément, à la

demande du professionnel (exemple : analyser seulement la garniture d’un gâteau).
Si la totalité de l'échantillon est de moins de 25 g, peser l'échantillon au complet et

additionner le diluant requis jusqu’à l’obtention d’une dilution 10-1. Le volume total
de liquide doit couvrir l'échantillon.

4.3.2 ALIMENTS LIQUIDES OU SEMI-LIQUIDES
Mélanger jusqu’à homogénéisation complète et prélever 25 g.
4.3.3 REGROUPEMENT DES UNITÉS D’ANALYSE POUR LA RECHERCHE DE BACTÉRIES

PATHOGÈNES
La recherche de bactéries pathogènes telles que Salmonella, Listeria

monocytogenes, etc. peut être faite sur une unité composite, c’est-à-dire le
regroupement de deux unités d’analyse. Éviter de regrouper des échantillons relatifs
aux toxi-infections, aux plaintes de consommateurs et aux saisies.
Protocoles :
Ne regrouper que des produits de composition et de caractéristiques physico-

chimiques similaires (Exemple : pH). Respecter les numéros de lots s'il y a lieu.
Peser 25 g de chacun des 2 échantillons dans un même sac à homogénéisateur de

type péristaltique. Ajouter environ 225 g du diluant approprié et homogénéiser les 2
prélèvements ensemble. Par la suite, compléter à environ 500 g avec le diluant et
homogénéiser manuellement. Incuber et poursuivre l’analyse.
Si le résultat s'avère positif, il peut être nécessaire de reprendre l'analyse des 2

échantillons séparément ou de refaire prélever par le client.
4.3.4 VIANDES EN BLOC

Prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits à l'aide d'un instrument
stérile.
4.3.5 POISSON ENTIER CRU
Enlever la peau à l'aide d'instruments stériles et prélever le premier centimètre de
surface à 4 ou 5 endroits.
4.3.6 MOLLUSQUES CRUS
- Trier et écarter les coquillages morts ou ayant la carapace abîmée. Les

mollusques vivants se ferment complètement et rapidement avec une
pression. Dans le cas contraire, ils ne doivent pas être utilisés pour l’analyse.
- Les coquilles des mollusques doivent être lavées et brossées à l'eau potable
courante, principalement au niveau de la zone d’ouverture. Éviter de rincer
l’intérieur des coquilles.
- Égoutter les mollusques propres et assécher avec un papier absorbant.
- Utiliser des instruments stériles pour ouvrir les coquilles. Récupérer le liquide
et détacher la chair avec un couteau et des pinces en évitant toute
contamination par l’extérieur de la coquille.
- S’il y a présence de byssus, le couper avec un ciseau stérile (flambé à l’alcool)
avant ouverture, mais ne pas l’arracher.
- L’analyse des mollusques prend en compte la chair et l’eau intervalvaire.
- Regrouper plusieurs mollusques pour constituer l’unité d’analyse (5 à 7 au
minimum).

- Les mollusques doivent être homogénéisés manuellement deux minutes pour

éviter de perforer le sac de prélèvement.
4.3.7 CRUSTACÉS NON DÉCORTIQUÉS CRUS OU CUITS
Les crustacés tels que le homard et le crabe sont décortiqués avec des instruments
stériles et la chair est prélevée à 4 ou 5 endroits de l'échantillon (pinces, abdomen,
pattes, etc.).
Les petites crevettes sont décortiquées et la chair est prélevée. Plusieurs crevettes
constituent alors l’unité d’analyse.
4.3.8 VOLAILLE CRUE AVEC PEAU
En général, prélever une proportion de peau avec les premiers centimètres du

muscle, à 4 ou 5 endroits sur la coupe de volaille.
4.3.9 ŒUFS
4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la recherche des salmonelles sur

la coquille et à l'intérieur des œufs
Grouper 4 à 6 œufs par échantillon. Ceux-ci ne doivent présenter aucune

craquelure.
4.3.9.1.1 EXTÉRIEUR
Manipuler les œufs l'aide d'une pince stérile. Déposer délicatement les œufs dans un
sac stérile contenant 225 g d'eau peptonée tamponnée. Laver les coquilles avec le
diluant, retirer les œufs un à un et les déposer dans un contenant d'alcool 70 %.
Incuber l'eau peptonée tamponnée selon le protocole de la méthode d’analyse

utilisée.
4.3.9.1.2 INTÉRIEUR
Les 4 à 6 œufs préparés selon la méthode précédente (4.3.9.1.1) sont

immédiatement retirés du bain d'alcool 70 % et déposés sur un papier absorbant
pour enlever l'excès d'alcool. Ne pas laisser tremper les œufs dans l’alcool. Par la
suite, lorsque l’alcool est évaporé, les œufs sont cassés dans un sac stérile. Le
technicien doit porter une nouvelle paire de gants pour prélever un nouvel
échantillon (composé de 4 à 6 œufs).
Bien mélanger les œufs avec l’homogénéisateur de type péristaltique pendant

environ 15 secondes. Pour un échantillon composé de 4 à 6 œufs, prélever 50 g du
mélange et ajouter environ 200 g d’eau peptonée tamponnée préchauffée à 35°C.
Agiter avec l’homogénéisateur de type péristaltique pendant un minimum de 30
secondes, compléter à environ 500 g avec le diluant afin d’obtenir une dilution 10-1
et agiter manuellement.

4.3.9.2 Procédure de prélèvement pour l’analyse de l’intérieur de l’œuf

seulement
Laver les œufs à l'eau et au savon germicide. Mettre les œufs dans l’alcool 70 % et
les retirer immédiatement pour les déposer sur un papier absorbant pour enlever
l'excès d'alcool. Lorsque l’alcool est évaporé, poursuivre le prélèvement tel
qu’indiqué précédemment (section 4.3.9.1.2).
4.3.10 LAITS EN POUDRE
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en le secouant de façon

répétée. L’échantillon (pesée et ajout du diluant) doit être prélevé dans une ESB.
Laisser tremper l’échantillon dans le diluant 30 minutes à température de la pièce
avant d'homogénéiser, afin de revivifier les cellules microbiennes endommagées.
4.3.11 PRODUITS CHAMBRÉS
Les produits chambrés doivent être entreposés à la température de la pièce jusqu’au

moment de l’analyse. Les diluants utilisés pour les produits chambrés doivent
également être à la température de la pièce.
4.3.12 PRODUITS GRAS (BEURRE, MARGARINE, SAINDOUX, ETC.) ET FROMAGES
Utiliser un diluant contenant du citrate de sodium 2 % comme dispersant pour le

prélèvement des fromages gras et des produits gras tels le beurre, la margarine, le
saindoux, etc. Le diluant doit être préalablement chauffé à 45 oC pour permettre une
émulsion complète du gras avant l'homogénéisation. Homogénéiser et prélever dans
la phase aqueuse en évitant de prélever du gras.
Lorsqu’elle est consommée, la croûte des fromages doit être prélevée en fonction de
la proportion qu’elle représente.
4.3.13 PRODUITS SECS DÉSHYDRATÉS (ÉPICES, CÉRÉALES, LÉGUMINEUSES SÈCHES, RIZ

SEC, ETC.)
Mélanger soigneusement l’échantillon de produits secs avec un ustensile stérile

avant de prélever. Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes à température de
la pièce est nécessaire avant d'homogénéiser, afin de revivifier les cellules
microbiennes endommagées
Pour connaître le bouillon non–sélectif approprié à la recherche de Salmonella spp.,

se référer au Tableau 1 de la méthode MFHPB-20 de Santé Canada (Isolement et
identifications des salmonella dans les aliments et les échantillons
environnementaux). Par exemple, le bouillon trypticase renfermant 0,5 % de K2SO3
doit être utilisé pour les poudres d’oignons et les poudres d’ail, tandis que les
produits laitiers (à l’exception des fromages) doivent être dilués avec une solution
aqueuse de vert brillant.
Pour la recherche de Salmonella spp. ou autre pathogène nécessitant une étape de

pré-enrichissement, des rapports de dilution (poids/volume) entre les épices ou

assaisonnements et le bouillon d’enrichissement sont recommandés (autre que

10-1). Certaines épices sont bactéricides ou bactériostatiques, c’est pourquoi une
dilution supérieure est nécessaire. Pour connaître les rapports recommandés entre
les épices et assaisonnements et le bouillon de pré-enrichissement, se référer au
Tableau III de la méthode MFHPB-20.
4.3.14 PROCÉDURE DE PRÉLÈVEMENT POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLES DANS LES

GRAINES GERMÉES (LUZERNE, RADIS, ETC.)
Peser de façon stérile 125 g de graines dans un contenant stérile (par exemple, un
sac à homogénéisateur péristaltique inséré dans un bécher) et ajouter de l'eau
déminéralisée stérile jusqu'à ce que le niveau dépasse les graines. Recouvrir de
façon stérile et incuber à 30 °C pendant trois jours.
Le premier volume d'eau ajouté sera absorbé rapidement. Après environ deux
heures, ajouter encore de l'eau pour rétablir le niveau et continuer de surveiller le
niveau d'eau pendant le reste de la période d'incubation. Ajouter de l’eau
déminéralisée stérile au besoin.
Le processus de germination devrait débuter après trois jours d'incubation, selon la

variété de graines: les enveloppes devraient avoir éclaté et une certaine germination
devrait être apparente. Peser de façon stérile 25 g du mélange de graines germées
et d'eau et ajouter 225 g de diluant. Incuber de 18 à 24 heures à 35 °C. Poursuivre
l’analyse selon la méthode MFHPB-20, à partir de l’étape de l’enrichissement en
milieu sélectif.
4.3.15 PRODUITS TRÈS SALÉS (5 %)
Pour le dénombrement de la microflore générale (bactéries, levures et moisissures),

le diluant utilisé doit contenir 5 % de NaCl. Utiliser ce diluant pour la suspension
mère et les dilutions décimales subséquentes.
4.3.16 PRODUITS TRÈS SUCRÉS (MIEL, SUCRERIES, SIROP D’ÉRABLE, ETC.)
Pour la recherche d’une microflore générale (bactéries, levures et moisissures),

lorsqu’un aliment renferme plus de 25 % de sucre, utiliser un diluant à 40 % de
sucre (exemple : eau peptonée 0,1% + 40% glucose) afin d’éviter la perte des
cellules osmophiles. Utiliser ce diluant pour la suspension mère et les dilutions
décimales subséquentes. Le milieu de culture devra aussi contenir 40 % de sucre
(exemple : Sabouraud dextrose agar 40%).
4.3.17 CONSERVES
Se référer à la méthode LEAA-M-MIC-020.

4.3.18 PROCÉDURE POUR LA RECHERCHE DES BACTÉRIES PATHOGÈNES À LA SURFACE DES

(CANTALOUPS, MELONS, ETC.)
FRUITS FRAIS ENTIERS
Déposer l’échantillon en entier dans un sac stérile. Le diluant est déterminé selon la
méthode utilisée et est préchauffé à la température d’incubation de l’échantillon.
Recouvrir entièrement l’échantillon avec le diluant et incuber à la température
demandée par la méthode d’analyse.
4.3.19 ÉCOUVILLONS
4.3.19.1 Écouvillon reçu dans un tube contenant 10 ml de tampon

neutralisant :
À la réception de l’échantillon, il est considéré que la dilution est 10-1. Ce tube est
utilisé pour la préparation des dilutions décimales subséquentes.
4.3.19.2 Écouvillon reçu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon

neutralisant:
À la réception de l’échantillon, il est considéré qu’il n’y a pas de facteur de dilution.
Procédure :
1. À partir d’un tube 9 ml de peptone-sel, mettre 1 ml de diluant dans le

tube contenant l’écouvillon;
2. Mélanger le tube au vortex;
3. Remettre tout le liquide dans le même tube de départ de 9 ml;
4. Toujours à partir du même tube de départ de 9 ml de peptone-sel, rincer
l’écouvillon une deuxième fois en répétant les étapes 1 à 3;
5. Le tube ainsi obtenu correspond à la dilution 10-1;
6. Utiliser ce tube pour la préparation des dilutions décimales subséquentes.
4.3.20 ÉPONGES
Ce type de prélèvement est considéré comme une dilution de 10-1. Le diluant

approprié est ajouté jusqu'à l’obtention d’un poids de 100 g (dilution 10-2).
5. DILUANTS
Le choix d’un diluant est fonction du microorganisme recherché et de la méthode

d’analyse réalisée. La nature du produit à analyser peut également être un facteur
déterminant dans le choix d’un diluant. La méthode d’analyse et les normes
spécifiques aux produits servent à choisir le diluant approprié.
5.1 DILUANT D’EMPLOI GÉNÉRAL

Le diluant général « Peptone-Sel » semble le plus approprié pour la majorité des
aliments lorsque la recherche de salmonelles n’est pas requise.

5.2 DILUANT À UTILISER POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLA SPP.

Le diluant utilisé pour la recherche de Salmonella spp est l’«eau peptonée
tamponnée», sauf pour quelques aliments tels les confiseries, produits laitiers,
épices et assaisonnements. Le Tableau 1 de la méthode MFHPPB-20 de Santé
Canada indique le bouillon non-sélectif approprié au type d’aliment.
5.3 BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT INITIAUX

Les bouillons d’enrichissement initiaux doivent toujours être utilisés à la
température ambiante (jamais réfrigéré) sauf pour les méthodes d’isolement d’E.coli
O157 (le bouillon Doyle doit être préalablement chauffé à 35 °C) et d’isolement de
Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. (méthode MFHPB-30; le bouillon LEB
doit être préalablement chauffé à 30°C).
Lors du regroupement des unités d’échantillonnage et pour les unités

d’échantillonnage d’un poids supérieur à 25 g, les bouillons d’enrichissement initiaux
doivent être chauffés à la température d’incubation avant de procéder à la dilution
des échantillons,
De plus, pour l’analyse des produits gras (beurre, fromage, etc.), le diluant
contenant du citrate de sodium 2 % utilisé comme dispersant doit préalablement
être chauffé à 45 °C (voir la section 4.3.12).
Les bouillons préchauffés doivent être utilisés dans la journée.
5.4 BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT SECONDAIRES

Pour les bouillons d’enrichissement secondaire et pour les unités d’échantillonnage
de 25 g ou moins, la température du bouillon doit être à la température ambiante
avant de procéder à l’analyse.
6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION
Il est suggéré d'utiliser un homogénéisateur de type péristaltique plutôt qu'un

mélangeur de type rotatif pour le broyage des échantillons. Une homogénéisation
complète de l'aliment n'est pas nécessaire. Les microorganismes seront délogés de
l'échantillon par de forts jets de liquide et par écrasement de l'aliment. L'aliment
devrait normalement être homogénéisé pour une période de deux minutes. Il est
important d’observer l’échantillon après l’homogénéisation pour vérifier l’efficacité
du broyage. Dans le cas contraire, l’homogénéisation doit être recommencée.
L'homogénéisateur péristaltique ne doit pas être utilisé pour des produits

alimentaires susceptibles d'entraîner des perforations du sac (présence de particules
pointues, dures ou sèches) à moins d’utiliser deux sacs stériles ou plus afin

d’empêcher la perforation et un débordement possible de l’échantillon. Une

homogénéisation manuelle peut également être effectuée.
7. DILUTIONS DES ÉCHANTILLONS
7.1 SUSPENSION MÈRE (PREMIÈRE DILUTION)
7.1.1 DÉFINITION
Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée (unité

d’analyse) du produit à analyser ait été mélangée, avec un homogénéisateur si
nécessaire et en observant des précautions appropriées, avec une quantité neuf fois
égale de diluant, sauf exception, en laissant se déposer les particules grossières, s’il
y en a.
7.1.2 PROCÉDURE
Prélever l’aliment de façon représentative et le peser tel qu’indiqué à la section 4.3.

Ajouter une quantité de diluant égale à 9 fois la masse de l’aliment (généralement
25 g d’aliment avec 225 g de diluant). Cette première dilution correspond à la
dilution 10-1.
Note 1 : Dans certains cas, il peut être nécessaire d’ajouter davantage de diluant,
notamment en présence d’une suspension mère trop visqueuse ou trop
épaisse avec la dilution 10-1. L’information doit être consignée et un
professionnel doit être avisé afin d’en tenir compte dans la suite des
opérations et dans l’expression des résultats.
Note 2 : S’il est souhaitable pour des dénombrements dans certains produits de
descendre au-dessous de ce seuil, il est possible de réaliser une
suspension avec une quantité inférieure de diluant. Par exemple, la
méthode MFLP-74 de Santé Canada (Dénombrement de Listeria
monocytogenes dans les aliments) exige la préparation d’une dilution
selon un rapport 1 :5. Par contre, il est convenu que l’ensemencement de
cette suspension peut entraîner des difficultés liées au déséquilibre du
rapport inoculum/milieu (inhibition de la croissance microbienne par une
concentration accrue des composants de l’aliment).
7.2 DILUTIONS DÉCIMALES SUBSÉQUENTES
7.2.1 DÉFINITION
Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déterminé de la

suspension mère avec un volume neuf fois égal de diluant, et en répétant cette

opération pour chaque dilution préparée, jusqu’à l’obtention d’une gamme de

dilutions décimales appropriées pour l’inoculation des milieux de culture.
7.2.2 PROCÉDURE
Transférer à l’aide d’une micropipette 1 ml de la suspension mère dans un tube

contenant 9 ml de peptone sel ou du diluant approprié. À l’aide d’un agitateur
mécanique, mélanger le tube pendant 5 à 10 secondes afin d’obtenir la dilution 10-2.
Si nécessaire, répéter ces opérations pour la dilution 10-2 et les dilutions décimales
suivantes afin d’obtenir les dilutions 10-3, 10-4, 10-5, etc., jusqu’à l’obtention d’une
gamme de dilutions décimales appropriées.
7.3 MESURE DU PH DES DILUANTS ET DES BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT

Bien que cela ait été mentionné dans les versions précédentes de certaines
méthodes, l’ajustement du pH du diluant avec la matrice alimentaire avant
l’ensemencement n’est pas recommandé pour les méthodes quantitatives, sauf
lorsque précisé par le fabricant. Ceci permet au produit d’être évalué tel que
présenté au consommateur, empêchant tout biais (positif ou négatif) qui en
découlerait si le pH était ajusté avant l’ensemencement.
Pour les méthodes qualitatives, l’ajustement du pH du bouillon d’enrichissement

avec la matrice alimentaire doit être réalisé lorsque cela est indiqué dans la méthode
utilisée.
7.4 DURÉE DES OPÉRATIONS

Après le broyage ou l'homogénéisation, la suite de l'analyse (les dilutions et
l'ensemencement) doit avoir lieu le plus rapidement possible pour éviter une
multiplication des microorganismes dans le liquide de dilution enrichi par le produit
alimentaire. L’échantillon doit être ensemencé au maximum 10 minutes après la
réalisation des dilutions décimales. L'ensemble des manipulations, de la préparation
de la suspension mère jusqu'à l'ensemencement sur gélose ou bouillon, doit être
effectué dans un délai maximum de 45 minutes.

8. BIBLIOGRAPHIE
LUECHTEFIELD, N.W., WANG, W.-L., BLASER, M.J., & L. RELLER, Evaluation of

Transport and Storage Techniques for Isolation of Campylobacter fetus subsp jejuni
from Turkey Meat Specimens, J Clin Microbiol. 1981 Mar ;13:438-43
Direction générale de la protection de la santé, Santé-Canada, Compendium de

méthodes, volume 1 - MFHPB-20; Isolement et identification des Salmonella dans les
aliments.
Direction générale de la protection de la santé, Santé-Canada, Compendium de

méthodes, volume 1 - Annexe I et supplément à l’annexe I.
ISO 6887-1: 1999 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la

suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique --
Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension mère et des dilutions
décimales.

Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation des viandes et produits à base de
viande.

Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation des produits de la pêche.

Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de produits autres que les produits
laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.
ISO 6887-4:2003/Amd 1:2011: Microbiologie des aliments -- Préparation des

échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen
microbiologique -- Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de produits autres
que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche –
AMENDEMENT 1.

Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation du lait et des produits laitiers.

9. APPROBATION
François Bigonnesse, Microbiologiste

Service de microbiologie
Geneviève Bouchard, chargé qualité

Pascal Daigle, chef de service


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Laboratoire d’expertises et

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR

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TABLE DES MATIÈRES

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LEAA-REF-MIC-550 Page 3 de 17 AEV 2013-05-09

Le prélèvement des échantillons effectué dans le but de réaliser une analyse

L’ensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionnés dans ce

2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE

- Appareil à dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire) ou balance

LEAA-REF-MIC-550 Page 4 de 17 AEV 2013-05-09

3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES

3.1 VÉRIFICATION DES CONDITIONS DE TRANSPORT ET DE L’INTÉGRITÉ DES

Lorsque les délais de transport (≤ 36 heures) et que la température de conservation

3.2 IDENTIFICATION ET ENREGISTREMENT DES ÉCHANTILLONS

3.3 ENTREPOSAGE DES ÉCHANTILLONS

Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les échantillons

Pour les Campylobacters thermotolérants et les bactéries anaérobies strictes, ainsi

LEAA-REF-MIC-550 Page 5 de 17 AEV 2013-05-09

compromise par des conditions d'entreposage prolongées ou par une congélation,

Pour la réalisation des prélèvements, les échantillons doivent être sortis du

3.4 DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS

UNITÉ D’ÉCHANTILLONNAGE : Portion ou contenant individuel de produit prélevé au

UNITÉ D’ANALYSE : La quantité de produit prélevée de l’unité d’échantillonnage pour

UNITÉ COMPOSITE : Regroupement des unités d’analyse ou d’échantillonnage pour

4.2 MESURES D’HYGIÈNE ET DE SALUBRITÉ

Les manipulations doivent être effectuées de façon aseptique afin d’éviter la

LEAA-REF-MIC-550 Page 6 de 17 AEV 2013-05-09

Le prélèvement comprend la pesée et l’ajout du diluant. L’enceinte de sécurité

Les instruments utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles et ne

4.3 PRISE DE L'UNITÉ D'ANALYSE ET PESÉE

4.3.1 TOUS LES ALIMENTS

Toute observation anormale constatée lors du prélèvement d’un échantillon

Peser environ 25 g de l'échantillon (au minimum 10 g) dans un sac stérile de

Si l’échantillon est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé

L’analyse de certaines portions de l’échantillon peut être réalisée séparément, à la

Si la totalité de l'échantillon est de moins de 25 g, peser l'échantillon au complet et

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4.3.2 ALIMENTS LIQUIDES OU SEMI-LIQUIDES

Mélanger jusqu’à homogénéisation complète et prélever 25 g.

4.3.3 REGROUPEMENT DES UNITÉS D’ANALYSE POUR LA RECHERCHE DE BACTÉRIES

La recherche de bactéries pathogènes telles que Salmonella, Listeria

Ne regrouper que des produits de composition et de caractéristiques physico-

Peser 25 g de chacun des 2 échantillons dans un même sac à homogénéisateur de

Si le résultat s'avère positif, il peut être nécessaire de reprendre l'analyse des 2

4.3.4 VIANDES EN BLOC

- Trier et écarter les coquillages morts ou ayant la carapace abîmée. Les

LEAA-REF-MIC-550 Page 8 de 17 AEV 2013-05-09

- Les mollusques doivent être homogénéisés manuellement deux minutes pour

4.3.7 CRUSTACÉS NON DÉCORTIQUÉS CRUS OU CUITS

4.3.8 VOLAILLE CRUE AVEC PEAU

En général, prélever une proportion de peau avec les premiers centimètres du

4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la recherche des salmonelles sur

Grouper 4 à 6 œufs par échantillon. Ceux-ci ne doivent présenter aucune

Incuber l'eau peptonée tamponnée selon le protocole de la méthode d’analyse

Les 4 à 6 œufs préparés selon la méthode précédente (4.3.9.1.1) sont

Bien mélanger les œufs avec l’homogénéisateur de type péristaltique pendant

LEAA-REF-MIC-550 Page 9 de 17 AEV 2013-05-09

4.3.9.2 Procédure de prélèvement pour l’analyse de l’intérieur de l’œuf

4.3.10 LAITS EN POUDRE

Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en le secouant de façon

4.3.11 PRODUITS CHAMBRÉS