TRAVAUX PRATIQUES

Ces protocols sont décrit par Anavella Gaitán errera DANS

Psychrotrophic Microorganisms Agar Plate Methods,
Homogenization, and Dilutions

1.
Introduction
L'isolement et le dénombrement des micro-organismes présents dans
les aliments exigent généralement un traitement préliminaire des
échantillons afin de libérer dans un milieu liquide les micro-
organismes présents qui peuvent être inclus dans le aliments. Dans une
procédure de mélange connue sous le nom de "stomacher",
l'échantillon alimentaire (voir note 1) et le diluant sont placés dans un
sac en plastique stérile qui est vigoureusement frappé sur ses surfaces
extérieures par des palettes à l'intérieur d'un stomacher, les forces de
compression et de cisaillement brisant les morceaux solides de
l'aliment. Une fois les échantillons prélevés pour l'analyse, le sac et
son contenu restant peuvent être jetés et l'équipement est prêt à
l'emploi. Si un stomacher n'est pas disponible, un mixeur électrique
avec des lames de coupe tournant à grande vitesse peut être utilisé
(voir note 2).
La nature du diluant utilisé est un autre facteur très important. Les
diluants Comme l'eau du robinet ou l'eau distillée, les solutions salines,
les tampons de phosphate et la solution de Ringer sont toxiques pour
les micro-organismes, surtout si le temps de contact est indûment
1
 prolongé. Pour cette raison, nous suggérons que l'utilisation d'une
solution de peptone à 0,1 %, solution saline physiologique additionnée
de peptone à 0,1 %, est la source la plus fiable. La peptone à 0,1%
dans une solution saline à 0,85% de NaCl est recommandée par
l'Organisation internationale de normalisation (voir notes 3 et 4).
Le nombre de micro-organismes par numération sur plaque est l'une des
méthodes microbiologiques les plus couramment utilisées pour
déterminer la qualité des denrées alimentaires. Cette méthode indique
l'adéquation de l'assainissement et la formation d'une opinion sur
l'altération naissante (voir note 5). La numération sur plaque s'applique
tout particulièrement aux denrées alimentaires importées pour contrôler
les normes d'hygiène appliquées dans les établissements de fabrication
(1).
Les trois méthodes couramment utilisées pour dénombrer les micro-
organismes sont la numération sur plaque standard, également appelée
numération sur plaque aérobie ou plaque de coulée, la méthode de la
"plaque de surface" ou de la "goutte d'eau" et la méthode de la "goutte
d'eau" (voir note 6). Aucune de ces procédures ne permet de répertorier
tous les types d'organismes présents dans les échantillons testés. De
nombreuses cellules peuvent ne pas se développer en raison de conditions
spécifiquement défavorables de nutrition, d'aération, de température ou
de durée d'incubation (1).

La température choisie dépend de l'objectif de l'examen. La

température d'incubation des micro-organismes présente différentes

2
plages de température de croissance, telles que 0-7oC pour les
psychrotrophes, 30-35oC pour les mésophiles et 55oC pour les
thermophiles. Aucune température d'incubation n'exclut absolument
tous les organismes d'un autre groupe (voir notes 7 et 8). Les
incubateurs doivent présenter une fluctuation ou une variation
minimale de la température dans l'ensemble de la chambre
d'incubation. Tous les incubateurs doivent être vérifiés et étalonnés
fréquemment (2).
Les micro-organismes psychrotrophes ou psychrophiles peuvent se
développer pendant 7 à 10 jours (voir note 9) à des températures de
réfrigération commerciale (0-7oC). Les espèces d'Achromobacter,
d'Acinetobacter, d'Alcaligenes, de Bacillus, de Flavobacterium, de
Streptococcus et de Pseudomonas font partie des bactéries
psychrotrophes. En outre, certaines levures et moisissures, dont
Penicillium, Aspergillus, Geotrichum et Botrytis, sont capables de se
développer en grand nombre dans les denrées alimentaires
réfrigérées (voir note 10). Ces micro-organismes peuvent être à
l'origine de mauvais goûts et de défauts physiques dans les aliments.
Leur taux de croissance dépend fortement de la température (voir
note 11).
Leur présence indique un potentiel élevé d'altération au cours d'un
stockage prolongé. La plupart de ces micro-organismes sont détruits
par un traitement thermique doux, mais certains types résistants à la
chaleur, comme certaines espèces de Bacillus et de Clostridium,
peuvent survivre. La présence de micro-organismes psychrotrophes

3
 dans les aliments traités thermiquement implique une contamination
post-traitement. Ils sont la source d'enzymes protéolytiques et
lipolytiques résistantes à la chaleur (3) qui affectent négativement la
qualité des denrées alimentaires pendant leur stockage après le
traitement thermique (voir note 12).
La présence de micro-organismes psychrotropes est également
importante dans des aliments tels que la dinde ou le poulet fro- zen
lorsqu'ils sont décongelés.
2. Homogénéisation et dilution : Méthode 1
2.1. Matériels

1. Mixeur mécanique, modèle à deux vitesses ou à une seule vitesse

avec contrôle par rhéostat.
2. Bocaux en verre ou en métal d'une capacité de 1 L, avec couvercle,
résistant aux températures autoclaves. Un bocal stérile (autoclavé à
121oC pendant 15 minutes) est nécessaire pour chaque échantillon à
analyser.
3. Balance avec poids. Capacité d'au moins 2500 g, sensibilité de 0,1 g.
4. Instruments pour la préparation des échantillons : couteaux,
fourchettes, pinces, ciseaux, cuillères, spatules et abaisse-langue, tous
stérilisés à l'autoclave ou à l'air chaud.
5. Pipettes : 1, 5 et 10 ml.
6. Réfrigérateur refroidi à 2-5 oC.

4
7. Liquide de dilution peptoné ou liquide de dilution de sel peptoné,
stérilisé dans l'autoclave pour chaque échantillon : 450 ml dans un
flacon ou une bouteille, 90 ou 99 ml de blancs dans des bouteilles de
dilution ou des récipients similaires.
8. Hachoir mécanique, mélangeur mécanique, fonctionnant à un régime
d'au moins 8 000 tours/minute et d'au plus 45 000 tours/minute.
9. Pour la méthode 1, points 2 à 4 et 6 :
a. Pipettes bactériologiques
b. Tubes de culture stériles pour le liquide de dilution, d'une capacité
de 15 à 20 ml c. Liquide de dilution à base de sel de peptone

3. Microogranismes : Méthode de la plaque d'agar

1. Boîtes de Petri en verre (100 × 15 mm) ou en plastique (90 × 15 mm)
(voir note 7).
2. Pipettes bactériologiques stériles de 1, 5 et 10 ml.
3. Bain-marie ou incubateur pour tempérer la gélose, 44-46oC.
4. Incubateur, 29-31oC.
5. Compteur de colonies.
6. Registre de comptage.
7. Gélose pour la numération sur plaque (gélose des méthodes standard)
(voir notes 5 et 6).
8. Armoire de séchage ou incubateur pour le séchage de la surface des
plaques de gélose, de préférence à 50 oC.
9. Étendoirs en verre (spatules de Drigalski ; tiges de verre en forme de
crosse de hockey).
5
10. Pipettes bactériologiques, stériles, avec des divisions de 0,1 ml ou
moins.

3.1. Matériel
1. Incubateur à basse température capable de maintenir une
température de 1 à 7 oC.
2. Milieux gélosés non sélectifs tels que le bouillon standard ou le
bouillon trypticase soja.
3. Gélose sélective, cristal violet ou gélose au tétrazolium.
4. Pipettes bactériologiques stériles de 0,1 ml
5. Matériel pour la préparation et la dilution de l'homogénat
alimentaire, tel qu'il est énuméré au point 2.1.
6. Boîtes de Petri, telles que décrites précédemment.
7. Compteur de colonies.

4. Méthodes
4.1. Homogénéisation et dilutions : Méthode 1
1. Commencer l'examen dès que possible après le prélèvement de
l'échantillon. Réfrigérer l'échantillon à 0-5oC si l'examen ne peut
pas commencer immédiatement après son arrivée au laboratoire. Si
l'échantillon est congelé, le décongeler dans son récipient d'origine
(ou dans le récipient dans lequel il a été reçu au laboratoire)
pendant un maximum de 18 heures dans un réfrigérateur à 2-5oC.

6
 Si l'échantillon peut être facilement broyé (comme dans le cas de
la crème glacée), procéder sans décongélation.
2. Tarez le bocal stérile vide du mixeur, puis pesez-y 50 g
représentatifs de l'échantillon alimentaire. Si le contenu de
l'emballage n'est manifestement pas homogène (dîner congelé),
prélevez un échantillon de 50 g sur un macérat de l'ensemble du dîner,
ou analysez chaque portion alimentaire séparément, en fonction de
l'objectif du test.
3. Ajouter au bocal du mixeur 450 ml de liquide de dilution à la
peptone ou de liquide de dilution au sel de peptone. Cela permet
d'obtenir une dilution de 10 (+/-) 1.
4. Mixer rapidement l'aliment et le liquide de dilution. Commencer à
basse vitesse, puis passer à haute vitesse en quelques secondes.
Chronométrez soigneusement le mixage pour obtenir 2 minutes à
vitesse élevée. Attendre 2 ou 3 minutes pour que la mousse se
disperse.

5. Mesurer 1 ml de la dilution 10 -1 du matériau mélangé, en évitant la

mousse, dans un blanc de dilution de 99 ml. Agiter vigoureusement cette
dilution et toutes les dilutions suivantes 25 fois dans un arc de 30 cm.
Répéter ce processus en utilisant les dilutions progressivement
croissantes 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5, ou les dilutions qui, d'après
l'expérience, sont souhaitables pour l'aliment testé.

4.2. Homogénéisation et dilutions : Méthode 2

7
 1. Commencer l'examen dès que possible après le prélèvement de
l'échantillon. De préférence, commencer l'analyse des échantillons non
congelés dans l'heure qui suit la réception de l'échantillon. Si
l'échantillon est congelé, le décongeler dans le récipient d'origine (ou
dans le récipient dans lequel il a été reçu au laboratoire) au
réfrigérateur à 2,5 oC et l'examiner dès que possible après une
décongélation complète ou au moins suffisante pour permettre le
prélèvement de sous-échantillons appropriés (durée maximale de
décongélation : 18 heures).
2. Passer à l'étape 3 si l'échantillon est difficile à mélanger, broyer et
mélanger deux fois dans le hachoir mécanique.
3. Peser dans un bocal mixte taré au moins 10 g d'échantillon
représentatif de l'aliment.
l'aliment. Ajouter neuf fois plus de liquide de dilution que
d'échantillon. On obtient ainsi une dilution de 10:1.
4. Le temps de broyage ne doit pas dépasser 2,5 min.
5. Mélanger le contenu du bocal en l'agitant et pipeter des doubles
portions de 1 ml chacune dans des tubes séparés contenant 9 ml de
liquide de dilution. Effectuer les étapes 7 et 8 sur chacune des portions
diluées.
6. Mélanger soigneusement les liquides en aspirant 10 fois avec une
pipette stérile.
7. Transférer, avec la même pipette, 1,0 ml dans un autre tube de
dilution contenant 9 ml de liquide de dilution et mélanger avec une
nouvelle pipette.

8
 8. Répéter les étapes 7 et 8 jusqu'à ce que le nombre requis de dilutions
soit atteint. Chaque dilution successive diminue la concentration de 10
fois.
4.2.1. Example 1

Dilution 10–1, 350, and 330: (350 + 330)/2 × 10 = 3400

Dilution 10–2, 26, and 28: (26 + 28) 2 × 100 = 2700

X = (3400 + 2700)/2 = 3050

30 × 102 CFU/g

4.2.3. Calcul du nombre estimé de plaques standard (ESPC)

1. Si les dénombrements sur des plaques individuelles ne se situent pas
dans l'intervalle 30-300 colonies, indiquer le dénombrement calculé
comme ESPC. Calculer la numération comme indiqué aux étapes 2 à 4.
2. Si les plaques de toutes les dilutions présentent plus de 300 colonies,
diviser chacune des plaques doubles de la dilution la plus élevée en
sections radiales pratiques (par exemple, 2, 4, 8) et compter toutes les
colonies dans une ou plusieurs sections. Multiplier le total de chaque cas
par le facteur approprié pour obtenir une estimation du nombre total de
colonies pour l'ensemble de la plaque. Faire la moyenne des estimations
pour les deux plaques, multiplier la dilution et indiquer le nombre obtenu
comme ESPC.
3. Si les trois colonies sont supérieures à 200 par huitième de plaque
préparée à partir de la suspension la plus diluée, multiplier 1600 (c'est-à-
dire 200 X 8) par cette dilution et exprimer l'ESPC comme étant

9
supérieur (>) au nombre obtenu. Dans tous ces cas, il est conseillé
d'indiquer la dilution utilisée entre parenthèses.
Le comptage standard des plaques
5.1. Méthodes
1. Préparer l'échantillon.
2. Dans deux séries de boîtes de Pétri, pipeter des aliquotes de 1 ml des
dilutions 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5, ainsi qu'une aliquote de 0,1 ml
de la dilution 10-5 pour obtenir 10-1 à 10-6 g de nourriture par boîte de
Pétri.
3. Verser rapidement dans les boîtes de Pétri 10-15 ml d'agar fondu et
tempéré. Mélanger immédiatement les aliquotes avec le milieu agar en
inclinant et en faisant tourner les boîtes de Pétri. La séquence des étapes
est la suivante :
a. Incliner la boîte cinq fois dans un sens et dans l'autre.
b. Tourner cinq fois dans le sens des aiguilles d'une montre.
c. Inclinez-la à nouveau cinq fois dans une direction
perpendiculaire à celle utilisée la première fois.
d. Faites-le tourner cinq fois dans le sens inverse des aiguilles
d'une montre.
4. Lorsque l'agar est solidifié, inverser les boîtes de Petri et incuber à
29-31°C pendant 48 +/- 3 h.

5.2. La plaque d'étalement de surface

1. Ajouter 15 ml d'agar de comptage fondu et refroidi (45-60°C) dans
chaque boîte de Pétri utilisée et laisser se solidifier.
10
2. Transférer 0,1 ml de chacune des dilutions sur la surface de l'agar.
Utiliser la même pipette pour chaque dilution. Tester au moins trois
dilutions, même si l'on connaît la fourchette approximative du nombre de
micro-organismes présents dans l'aliment. Commencer par les dilutions
les plus élevées et aller vers les plus basses, en remplissant et en vidant
la pipette trois fois avant de transférer la portion de 0,1 ml sur la plaque.
3. Étaler rapidement les portions de 0,1 ml sur la surface des plaques
d'agar à l'aide d'étaleurs en verre (spatules de Drigalsky). Utiliser un
étaleur différent pour chaque plaque. Laisser sécher les surfaces des
plaques pendant 15 minutes.
4. Incuber les plaques en position inversée pendant 3 jours.
5.2.1. CALCUL DU NOMBRE STANDARD DE PLAQUES ET DU
NOMBRE ESTIME DE PLAQUES
5.2.1.1. LE NOMBRE STANDARD DE PLAQUES (CSP)
1. Sélectionner deux plaques correspondant à une dilution et présentant
entre 30 et 300 colonies par plaque. Compter toutes les colonies sur
chaque plaque, en utilisant le compteur de colonies et le registre de
comptage. Prendre la moyenne des deux comptages et la multiplier par
le facteur de dilution. Indiquer le nombre obtenu comme SPC.
2. Deux plaques doivent être comptées même si l'une d'entre elles
donne un nombre de colonies inférieur à 30 ou supérieur à 300. moins
de 30 ou plus de 300 colonies. Là encore, prendre la moyenne des deux
comptages et la multiplier par le facteur de dilution.
3. Si les plaques provenant de deux dilutions décimales consécutives se
situent dans l'intervalle dénombrable de 30 à 300 colonies, calculez la

11
valeur de la CPS. de 30 à 300 colonies, calculer la CPS pour chacune
des dilutions comme indiqué ci-dessus et indiquer la moyenne des deux
valeurs obtenues, sauf si le nombre calculé le plus élevé est plus de
deux fois supérieur au nombre calculé le plus bas, auquel cas indiquer le
nombre calculé le plus bas comme CPS.
4. N'indiquer que deux chiffres significatifs pour l'unité de formation
de colonies par gramme ou par millilitre.

5.2.1.4. MÉTHODE DE COMPTAGE SUR PLAQUE

UTILISANT DES MILIEUX SÉLECTIFS
1. Préparer les dilutions et les plaques comme décrit pour la numération
sur plaque de gélose, à l'exception de la gélose au tétrazolium violet cru
(CVT).
2. Incuber les plaques à 22°C pendant 5 jours ou à 30°C pendant 48
heures.
3. Compter les colonies rouges et calculer comme pour les plaques avec
milieu non sélectif (4).
6. Notes
1. Lorsque le stomacher de Colworth est utilisé, il est nécessaire de
disposer de sacs en polyéthylène à paroi fine (environ 200 gauge),
d'environ 18 × 30 cm. polyéthylène à paroi fine (environ 200
gauge), d'environ 18 × 30 cm, sont nécessaires.
2. Peser dans un sac taré au moins 10 g d'échantillon et faire
fonctionner pendant 60 s.

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 3. Si la présence de micro-organismes pathogènes dans les denrées
alimentaires est avérée ou suspectée, placer le sac dans un autre
sac pour éviter qu'il ne se brise. Travailler dans des laboratoires
ayant le niveau de confinement requis.
4. Pour les aliments riches en matières grasses (plus de 20 %), tels
que les viandes fumées, ajouter 1 % de Tween-80 ou un autre
agent tensioactif non toxique.
5. Il n'est pas indispensable que le milieu soit translucide, car toutes
les colonies croissent et se développent à la surface de la gélose.
6. Faire fondre l'agar dans de la vapeur ou de l'eau bouillante, mais ne
pas l'exposer à une forte chaleur pendant une période prolongée.
Porter la gélose à 44-46 ºC et contrôler soigneusement sa
température pour éviter de tuer les bactéries dans le milieu dilué.
7. Verser rapidement dans les boîtes de Petri 10-15 ml d'agar fondu et
tempéré. Moins de 20 minutes doivent s'écouler entre la dilution et
le versement de l'agar.
8. Une des plaques contenant du milieu gélosé inoculé et du liquide
de dilution inoculé doit être préparée comme contrôle.
9. Dans certains aliments réfrigérés, la majorité des bactéries
psychrotrophes responsables de la perte de qualité et de l'altération
ultérieure sont des bâtonnets Gram négatif.
10. Un test de conservation, dans lequel la numération sur plaque de
gélose est déterminée avant et après l'incubation préliminaire de
l'aliment (5-7 jours à la température de réfrigération commerciale),

13
 peut fournir des informations importantes sur le potentiel de
développement de la flore dans un aliment réfrigéré.
11. Les échantillons ne devraient pas être congelés en raison du risque
de mort ou de lésion des micro-organismes pendant la congélation.
Cela peut prolonger la phase de latence de la croissance et le
temps d'incubation est insuffisant pour les détecter.
12. La température d'incubation utilisée pour le comptage peut être
différente de celle à laquelle l'aliment est effectivement stocké.

References

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Microbiological Examination of Foods. Compiled by the APHA
Technical Committee on Microbiological Methods for Foods, 2nd
ed. (Speck, M. L., ed.), American Public Health Association,
Washington, DC.
2. Elliot, R .P., Clark, D. S., and Michener, H. D. (1978)
Microorganisms in Food 1.
Significance and Methods of Enumeration, 2nd ed., a publication of
the International Commission on Microbiological Specifications for
Foods (ICMSF) of the International Association of Microbiological
Societies, University of Toronto Press, Toronto, Ontario, Canada.
3. Griffiths, M. W., Phillips, J. D., and Muir, D. D. (1981)
Thermostability of pro- teases and lipases from a number of species

14
 of psychrophilic bacteria of dairy origin. J. Appl. Bacteriol. 50,
289–303.
4. American Public Health Association (1972) Standard Methods for
the Examination of Dairy Products, 13th ed., American Public
Health Association, New York.

15