Année académique : 2023-

2024

Université de Lomé
Faculté des Sciences
Département de Biochimie

BCH 211 : TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE

STRUCTURALE

Rapportdu
Rapport duTP
TPN°1
N°1: :Chromatographie
Chromatographiesursurpapier
papierd’acides
d’acides
aminésaminés et détermination
et détermination du Phi du pHi
de la de la caséine
caséine

Membres du groupe 6 :

Noms Prénoms N° de carte Parcours

GBODO Kossivi Zikpi 504703 BPA
Benjamin
GNANDJA Kansouguidame 524993 BPV
ISSA Mohaméd-Hawal 507423 BPA
 PLAN

INTRODUCTION

I- CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER D’ACIDES AMINES

1) BUT
2) PRINCIPE
3) MATERIEL
4) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
5) RESULTATS
6) INTERPRETATION

II- DETERMINATION DU pHi DE LA CASEINE

1) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
2) RESULTATS
3) INTERPRETATION

 Partie réponses aux questions

CONCLUSION
 INTRODUCTION

Les acides aminés sont à la base de la constitution des protéines

possédant à la fois une fonction amine(-NH 2), une fonction carboxyle(-
COOH) et une partie variable appelé radical qui change d’un acide aminé
à un autre. Après hydrolyse d’une protéine, le fractionnement ou la
séparation des acides aminés dans le mélange peut se réaliser par
chromatographie (ou par électrophorèse). La chromatographie est une
technique séparative analytique et/ou préparative. Elle consiste à faire
migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile, à
l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente. Le pH
isoélectrique(pHi) est le pH auquel une molécule chargée a une charge
nette égale à zéro. Il peut être utilisé pour déterminer le point où une
protéine se précipitera dans une solution. La chromatographie et le pHi
ont pour importance la séparation et la purification des protéines ; notre
étude portera sur la chromatographie sur papier (WHATMAN N°1) des
acides aminés et sur la détermination du pHi de la caséine.

I. CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER D’ACIDES AMINES

1. BUT
Le but de cette manipulation consiste à la séparation des acides aminés
par chromatographie sur papier, la détermination des rapports frontaux
des différents acides aminés composant le mélange.

2. PRINCIPE
La chromatographie sur papier permet de séparer et d’identifier des
espèces chimiques d’un mélange. Elle est basée sur leur différence
d’affinité pour deux phases : la phase stationnaire ou phase fixe et la
phase mobile constituée d’un solvant ou d’un mélange de solvant. Le
papier chromatogramme est constitué de fibres de cellulose disposées
parallèlement. Ces fibres de cellulose sont imbibées d’eau qui constitue la
phase fixe ; la phase mobile se déplace par gravité ou par capillarité.

3. MATERIEL
Lors de la chromatographie sur papier, on a eu à utiliser deux papiers
WHATMAN N°1 (un pour essai et l’autre pour la chromatographie
proprement dite) ; un solvant constitué de 40ml de butanol, 10ml d’acide
acétique concentré et 50ml d’eau distillée ; une cuve en verre hermétique
avec couvercle en plaque de verre ; un bécher ; un séchoir à main ; une
solution de lysine, de leucine et de mélange d’acides aminés inconnus et
une solution de la ninhydrine pour la révélation des acides aminés.

4. PROTOCOL EXPERIMENTAL
Sur une feuille de papier WHATMAN N°1, la séparation des acides aminés
par chromatographie de partage est réalisée. On évalue le nombre de
gouttes nécessaires pour obtenir une bonne séparation
chromatographique en réalisant un essai sur un papier à essai sur lequel
est représenté les intersections de 1 à 5. A la première intersection on
dépose une goutte d’un des acides aminés à notre disposition et à la
deuxième intersection on dépose deux gouttes et ainsi de suite jusqu’à
cinq gouttes à la dernière intersection. Après dépôt, on détermine
l’intersection à laquelle le dépôt a un diamètre inférieur ou égale à 4mm ;
et dans ce cas précis c’est le dépôt d’une goutte de la première
intersection. Dans la suite de l’expérience chaque dépôt correspondra à
une goutte.

 Préparation du solvant
Le volume total du solvant est de 100 ml et est réparti comme suit :
40 ml de butanol ; 10 ml d’acide acétique concentré et 50 ml d’eau
distillée.
 Préparation du chromatogramme
A 2,5cm du bord inférieur du papier, nous avons tracé finement
une ligne droite à l’aide d’un crayon et avons marqué sur la ligne 6
croix séparées par un même intervalle (repère de dépôts) et avons
 indiqué Lys pour la Lysine, Leu pour Leucine et Mel pour le
mélange d’acides aminés (cf. chromatogramme).
A l’aide d’un tube capillaire, on dépose au niveau d’un repère une
goutte de la solution correspondante à ce qui est inscrit en dessous
du repère. Pour chaque dépôt, on a utilisé une pipette paster
appropriée et par suite on a séché les dépôts par un séchoir à air
chaud après chaque dépôt.
A l’aide d’un scotch soutenant le papier par le bord supérieur, on a
introduit le papier dans la cuve de chromatographie et on a fermé
la cuve en laissant le papier dans le solvant pendant 1h30min, puis
on a retiré le papier en marquant le front de migration à l’aide d’un
crayon. Ensuite on a séché complètement le papier à l’aide du
séchoir, et on recouvre le tout avec une solution de ninhydrine
dans le sens de la migration. On a séché de nouveau à l’air chaud
pendant environ 5 min, ou jusqu’à ce que les taches apparaissent.
A la fin, on a entouré chaque spot avec un crayon.

5. RESULTATS
a- Observation
Sur le chromatogramme, on a constaté une migration de la
Lysine, la leucine et du mélange.
Par rapport à la ligne de dépôt, on observe que la leucine en
coloration violette est plus distante que la lysine en coloration
violette. Au niveau du mélange, on observe 3 spots dont les
deux des extrémités sont de couleur violette et l’intermédiaire de
couleur jaune. Le spot le plus bas du mélange(M1) coïncide avec
la lysine, le spot le plus haut du mélange (M3) coïncide avec la
Leucine et spot M2 de couleur jaune est intermédiaire aux deux
autres.

b- Détermination du rapport frontal de chaque acide aminé

 l
Rf =
L

Rf = Rapport frontal
l = Distance parcourue par l’acide aminé
L = Distance parcourue par le solvant

 Moyenne de distance parcourue par les composés

l(dépot 1)+l(dépot 2)
l=
2

Avec l(lys) = 1,1cm/1,1cm ; l(leu) = 5,4cm/5,4cm ; l(M1) = 1,1cm/1,1cm

l(M2) = 2,7cm/2,7cm ; l(M3) = 5,4cm/5,4cm

Le tableau ci-après représente la moyenne de distance parcourue par les

composés et le rapport frontal de ces derniers :

AA L l Rf
Lysine (lys) 8,4Cm 1,1cm 0,13
Leucine (leu) 8,4Cm 5,4cm 0,64
M1 8,4Cm 1,1cm 0,13
Mélange M2 8,4Cm 2,7cm 0,32
M3 8,4Cm 5,4cm 0,64

6. INTERPRETATION
La ninhydrine est un dérivé aromatique qui qualitativement permet de déceler
tous les acides aminés qui donnent avec lui une coloration violette sauf pour la
proline et l’hydroxyproline qui donnent une coloration jaune, et qui permet
quantitativement de les doser. La présence de couleur jaune au niveau du
mélange affirme la présence soit de la proline ou soit de l’hydroxyproline (M 2).
En présence d’oxydants doux comme la ninhydrine, les acides aminés sont
désaminés, décarboxylés pour être transformé en aldéhydes. Elle réagit avec
ces derniers ayant une fonction acide et une fonction amine libre (acides
aminés primaires). La réaction se déroule en trois étapes et conduit à la
formation d’un composé de couleur bleu-violette (le pourpre de Ruhemann
absorbe à 570nm).
Le rapport frontal de la lysine (0,13) étant inférieur au rapport frontal de la
leucine (0,64), donc la lysine migre moins vite que la leucine. Le poids
moléculaire de la lysine, PM=146g/mol est un acide aminé à fonction radicale
hydrophile (présence de deux fonctions amines et une fonction acide) donc plus
soluble dans l’eau que dans le solvant alors que la leucine de poids moléculaire,
PM=131g/mol a un radical hydrophobe, donc plus soluble dans le solvant que
dans l’eau, elle a tendance à migrer avec le solvant : C’est ce qui explique la
différence de rapport entre les acides aminés. La solubilité et le pHi aussi
peuvent expliquer la différence de rapport frontal des acides aminés. Pour un
solvant acide, les acides amines à radical aliphatique migrent plus vite que les
acides aminés à radical aminé.
La proline ou l’hydroxyproline ne possède pas de fonction amine et carboxylique
libre, c’est un acide aminé secondaire. Elle fait partie des iminoacides qui se
colorent en jaune en présence de la ninhydrine et dont le maximum
d’absorption de la soution se situe au voisinage de 440 nm. La réaction se
déroule ainsi :
Au niveau du mélange le spot1 a une coloration violette et a le mème rapport
frontal que celui de la Lysine d’où l’acide aminé M1 au niveau du mélange est la
Lysine. Parallèlement au niveau du spot3 du mélange, on en déduis que l’acide
aminé M3 est la Leucine(même Rf et même coloration). Le spot2 du mélange
ayant une coloration jaune correspond à la proline.

II. DETERMINATION DU pHi DE LA CASEINE

La caséine est un mélange complexe de protéines, une substance albuminoïde

blanche que contient le lait. Elle joue un role dans la facilitation de la perte des
graisses durant la période de sèche, dans le développement de la prise de
masse musculaire et dans l’amélioration de la récupération musculaire.
On a plusieurs types de caséines : α1, α2, β, γ et K. Ils s’organisent en micelles
qui sont des agrégats de plusieurs molécules de caséine. Le but de cette
deuxième manipulation est d’arriver à déterminer le pHi (pH isoélectrique) de la
caséine en recherchant le minimum de sa solubilité (maximum de floculation)
en solution.
Lors de cette manipulation nous avons utilisé une série de 9 tubes, 3 pipettes
de différentes graduations, une fiole jaugée à 100ml, une solution de caséine et
une pro- pipette.

1- PROTOCOL EXPERIMENTAL
Après avoir pesé 0,5g de caséine et verser dans un bécher, nous avons ajouté
40ml d’eau distillée et 10ml de soude 1N et le tout transvasé dans une fiole
jaugée de 100ml par l’intermédiaire de l’assistante. Une fois à la solubilité
complète de la caséine, nous avons ajouté 10ml d’acide acétique 1N et on a
agité, en suite on a complété avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge
(100ml). On a obtenu ainsi une solution de caséine dans l’acétate de sodium
N/10, et tout ceci par l’intermédiaire de l’assistante. En suite nous avons
préparé une série de 9 tubes selon le tableau suivant :
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Eau 8,4 7,75 8,75 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4
distillée
(ml)
Acide 0,6 1,25
N/100
(ml)
Acide 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0
N/10
(ml)
Acide N 1,6
(ml)
pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
Acide = acide acétique
Nous avons ajouté dans chaque tube 1ml de la solution de caséine et on a
homogénéisé en agitant chaque tube. Nous avons noté l’aspect des différents
tubes aussitôt après homogénéisation et après 20min.
 2- RESULTATS
Le tableau ci-après représente les résultats obtenus après homogénéisation des
tubes :
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Aspects
Juste Fond Fond Fond Faiblement Un Un Un Un
après le clair clair clair flou peu Flou peu peu peu
mélange flou flou flou flou
Après 20 Très
min Pas de floculation Peu floculé flocul Floculé Pas de
é floculation

Après préparation des solutions dans les 9 tubes, on constate que dans les
tubes 1,2,3,8 et 9 ne présentent pas de floculation. On remarque une
floculation nette dans les tubes 4,5,6 et 7 mais assez conséquente dans le tube
6.

3- INTERPRETATION
Après 20 minutes les tubes N°4, N°5, N°6 et N°7 présentent une floculation
nette. Le maximum de floculation est observé dans le tube N°6 qui correspond à
un pH de 4,4. Nous pouvons déduire que la caséine a un pH isoélectrique (pHi)
voisin de 4,4. Les caséines forment des micelles portant des charges
électronégatives et se repoussent les uns des autres en constituant une
suspension colloïdale. Ce sont elles qui donnent la couleur blanche du lait. Le
pHi de la caséine étant d’environ 4,4, en milieu à pH égal à celui du tube N°6,
sa charge globale est nulle. Dans le dit milieu, la caséine se comporte comme
un ampholyte (zwitterion). Par conséquent, dans un milieu à pH voisin de 4,4,
les micelles de caséine ne se repoussent plus et les caséines précipitent en
coagulant por donner des flocons : c’est la floculation.

4- Réponse aux questions

 En prenant pour exemple la leucine et lysine, quels sont les facteurs

différenciant leurs migrations chromatographiques ?
  La masse molaire : plus la masse molaire de l’acide est faible, plus
il migre vite.
 La solubilité : tout dépend du coefficient de partage des composés
dans deux solvants, c’est-à-dire de leur affinité pour le solvant dont
l’un constitue la phase stationnaire car elle reste immobile et
l’autre, phase mobile car elle remonte le long du papier
chromatogramme.
 Le rapport frontal : un acide aminé ayant un rapport plus
grand(leucine) a tendance à migrer plus vite que celui ayant un
rapport frontal plus petit(lysine).
 La nature de l’acide de l’aminé : un acide aminé aliphatique migre
plus vite que celui non aliphatique ou basique.
 La polarité d’un acide aminé : dépend de la structure de ses
chaines latérales. La molécule sera plus polaire si la déférence
d’électronégativité entre les atomes est plus grande.

 Quel est le devenir du rapport frontal de chaque acide aminé étudié dans
un mélange ?
 Le rapport frontal de la lysine et de la leucine dans le mélange est
légèrement supérieur à ceux n’étant pas dans le mélange. Ceci
serait dù aux interactions régnantes entre les acides aminés
présent dans le mélange où suite à une erreur de dépôt.

CONCLUSION
La technique de chromatographie sur papier nous a permis de séparer et
d’identifier acides aminés composant un mélange en se référant aux rapports
frontaux des témoins. La migration d’un acide aminé dépend de plusieurs
facteurs tels que le poids moléculaire, la solubilité, l’affinité pour le solvant et la
nature du solvant de migration. Pour la détermination du pHi de la caséine, le
maximum de floculation qui n’est rien d’autre que le minimum de solubilité de
la caséine s’observe en milieu ayant un pH voisin de 4,4. Ainsi, on en déduit
que le pHi de la caséine est voisin de 4,4.