Ce travaille est réalisé par : HANANE HMIDANI FILALI / GROUPE : 8

Rapport de travaux pratiques de techniques

chimiques pour la Biologie

Introduction :
Dans le cadre de notre module de technique chimique en biologie, nous avons mené deux expériences
de laboratoire visant à explorer des techniques analytiques clés. La chromatographie sur couche mince
(CCM) et la séparation des pigments de paprika ont été les deux domaines d'étude de ces expériences.
Ces techniques sont largement utilisées en chimie et en biochimie pour la séparation, l'identification et
la caractérisation de composés organiques complexes. Ce rapport détaille les méthodes
expérimentales, les résultats obtenus et les conclusions qui en découlent, démontrant l'importance de
ces techniques dans le contexte de la recherche biologique et chimique.

1) La chromatographie sur couche mince (CCM) :

Objectif :

utilisation de la technique de chromatographie sur couche mince pour analyser qualitativement les
acides aminés présents dans un échantillon donné, en se basant sur la réaction caractéristique de la
Ninhydrine. Cela implique la compréhension des principes de base de la CCM, la détermination du Rf
pour chaque acide aminé, et l'identification des acides aminés en les comparant avec des échantillons
témoins connus, ce qui permettra une meilleure appréhension des applications pratiques de la
chromatographie sur couche mince en biochimie et en chimie analytique.

Methologie :

Dans le cadre de notre expérience d'analyse des acides aminés, nous avons préparé un support
chromatographique en utilisant une plaque CCM spécifique. Nous avons déposé un échantillon
contenant des acides aminés, y compris un acide aminé témoin, sur cette plaque. Ensuite, nous avons
développé la plaque en utilisant un système solvant composé de butanol, d'acide acétique glacial et
d'eau. Cette étape a permis la séparation des acides aminés en fonction de leur polarité.

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Le développement de la plaque a été réalisé de manière méticuleuse, en veillant à ce que la ligne de

base et le rapport frontale soient correctement évalués. Une fois que le front d'élution des acides
aminés a été atteint, la plaque a été retirée et révélée. Pour cette révélation, nous avons utilisé un
réactif à la ninhydrine, qui réagit avec les acides aminés pour former des composés colorés. La
présence de ces couleurs nous a permis d'identifier et d'analyser les acides aminés dans
notre échantillon.

Matériel :

1. Papier Whatman N°1 ou plaque CCM-gel de silice (10 cm x 5 cm) : utilisé comme support pour la
chromatographie.

2. Système solvant : mélange de butanol, acide acétique glacial et eau dans un rapport de 12/3/5.

3. Réactif à la Ninhydrine : 0,2 g dissous dans 100 ml d’acétone pour la révélation des acides aminés.

4. Acides aminés témoins : utilisés comme référence pour l'identification des acides aminés dans
l'échantillon (Alanine,Leucine et Aspartique) .

5. Étuve ou plaque chauffante à 105°C : pour le chauffage de la feuille de chromatographie après la

révélation à la Ninhydrine.

6. Micropipettes : utilisées pour déposer avec précision les échantillons d'acides aminés sur la ligne de
dépôt.

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Résultats :

On observe des taches distinctes correspondant à différents acides aminés sur la plaque de
chromatographie.

Mesure de rapport frontale (Rf):

on utilise la formule suivante pour calculer le Rf :

Distance parcourue par l'acide aminé /Distance parcourue par le front d'élution du solvant

Pour le premier acide aminé :

Rf = 1,9 cm /7,3 cm= 0,26

Pour le deuxième acide aminé :

Rf = 2 cm /7,3 cm = 0,27

Pour le troisième acide aminé :

Rf = 0,8 cm 7,3 cm = 0,11

calculons le rapport frontal (Rf) pour chaque acide aminé dans l'échantillon donné :

Pour le composant X :

Rf = 0,8 cm /7,3 cm = 0,11

Pour le composant Y :

Rf = 1,7 cm /7,3 cm ≈ 0,23

Pour le composant Z :

Rf = 4,5 cm /7,3 cm ≈ 0,62

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En comparant les valeurs de Rf, on observe que le composant X a un Rf similaire à celui du troisième
acide aminé connu, tandis que le composant Y a un Rf plus proche de celui du deuxième acide aminé
connu. Le composant Z, cependant, présente un Rf plus élevé, ce qui suggère une mobilité plus grande
par rapport au solvant par rapport aux acides aminés témoins connus. Ces résultats indiquent la
présence probable des acides aminés correspondants X et Y dans l'échantillon, avec une possible
identification du composant Z comme un acide aminé différent.

En conclusion, la méthode de chromatographie sur couche mince (CCM) s'est avérée efficace pour
l'analyse qualitative des acides aminés dans l'échantillon étudié. En utilisant des valeurs de Rf, nous
avons pu identifier avec succès les acides aminés X et Y dans l'échantillon, en les comparant avec les
acides aminés témoins connus. Cependant, la présence d'un troisième composant, Z, avec un Rf
différent de ceux des acides aminés témoins, souligne la limitation de cette méthode en termes
d'identification précise des acides aminés non inclus dans les témoins. Ainsi, bien que la CCM offre une
méthode relativement simple et rapide pour l'analyse qualitative des acides aminés, elle nécessite une
validation complémentaire à l'aide d'autres techniques pour une identification plus précise, en
particulier lorsqu'il s'agit de composants inconnus. Malgré cette limitation, la CCM reste un outil
précieux pour une analyse qualitative initiale des acides aminés dans un échantillon donné, offrant
une approche rentable et pratique pour la détection rapide de plusieurs composants.

2) Séparation des pigments du paprika :

Objectif :

l'extraction et l'analyse des pigments contenus dans le paprika commercial. Cela comprend
l'identification du nombre de pigments, la détermination des pigments prédominants, lcomparaison
des différentes méthodes d'extraction, et enfin, l'évaluation du degré de pureté des extraits. En
résumé, l'objectif central est d'étudier la composition des pigments du paprika et de comprendre
comment ces pigments peuvent être extraits et analysés en utilisant diverses techniques
chromatographiques.

Méthologie :

Dans le cadre de notre expérience de séparation de pigments de paprika, nous avons exploré plusieurs
méthodes d'extraction pour extraire ces pigments du paprika commercial. L'une des méthodes que
nous avons employées est l'extraction par solvant organique à froid, qui implique l'utilisation d'un
cylindre d'extracteur, d'un ballon de solvant et d'un réfrigérant pour maintenir le solvant à une
température basse. Une autre méthode que nous avons explorée est l'extraction par solvant organique
à chaud, réalisée à l'aide d'un chauffe-ballon pour amener le solvant à ébullition. De plus, nous avons
utilisé la méthode SOXHLET, qui est une technique d'extraction par solvant organique à chaud en circuit
fermé. Toutes ces méthodes d'extraction ont été menées avec des solvants spécifiques tels que CH2Cl2
et de l'eau.

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Ensuite, nous avons effectué des extractions par eau chaude et par eau froide en utilisant un
équipement d'agitation magnétique et des erlémeyers. Une fois les extractions réalisées, nous avons
filtré les échantillons pour éliminer les particules solides. L'analyse des extraits obtenus a été réalisée
par chromatographie sur couche mince (CCM) pour identifier les pigments prépondérants. Le CH2Cl2 a
été utilisé comme solvant d'élution.

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Pour une analyse plus approfondie, nous avons également utilisé la spectrophotométrie pour mesurer
le spectre d'absorption des extraits. Cette analyse a permis de déterminer la longueur d'onde
maximale correspondant au maximum d'absorption des pigments, offrant des informations précieuses
sur leur nature. En outre, nous avons effectué une analyse par HPLC, qui implique la pompe, l'injecteur,
les colonnes, les solvants et les détecteurs. Cette technique a fourni des données sur le nombre de
pigments présents dans l'extrait, leurs caractéristiques et leur degré de pureté.

En fin de compte, nous avons pu comparer les résultats des différentes méthodes d'extraction et
réaliser une analyse judicieuse du chromatogramme obtenu en HPLC. Cela nous a permis d'identifier le
pigment prépondérant dans le paprika commercial et de comprendre les conditions expérimentales qui
influencent la séparation des pigments.

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Matériel :

1. Erlenmeyer de 250 ml et de 100 ml

2. Ballon de 100 ml

3. Papier filtre

4. Extracteur Soxhlet

5. Réfrigérant

6. Chauffe-ballon

7. Support et pinces

8. Cuve en quartz pour le spectrophotomètre

9. Colonne de chromatographie liquide à haute pression (HPLC)

10. Pompe pour HPLC

11. Injecteur pour HPLC

12. Détecteur UV/visible ou autre détecteur approprié

13. Intégrateur/enregistreur

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Resultats :
D’après l’analyse chromatographie on observe trois taches :

Les pigments de Paprika contient donc 3 espèces chimiques colorées.

Calcul du rapport frontal de la première tache orange :

Rf= 0,9 cm /4,6 cm = 0,2

Calcul du rapport frontal de la deuxième tache rouge intense :

Rf= 2,3 cm / 4,6 cm = 0,5

Calcul du rapport frontal de la troisième tache jaune :

Rf= 3,7 cm / 4,6 cm = 0,8

Résultat de spectrophotométrie :

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La spectrophotométrie a été une méthode efficace pour caractériser les propriétés d'absorption de la
lumière des pigments extraits du paprika. Les résultats obtenus ont révélé des longueurs d'onde
maximales d'absorption (λmax) spécifiques pour chaque pigment, mettant en évidence leurs profils
d'absorption distincts. L'identification de la longueur d'onde maximale d'absorption à 450 nm avec une
absorbance de 3 a confirmé la présence significative du pigment spécifique étudié dans l'échantillon de
paprika. Cette information est cruciale pour déterminer la concentration relative de ce pigment et pour
évaluer son potentiel d'utilisation dans divers domaines tels que l'alimentation et la cosmétique. La
spectrophotométrie s'est révélée être une technique précise et sensible pour l'analyse des pigments de
paprika, offrant des données utiles pour la caractérisation et la compréhension de leurs propriétés
optiques et moléculaires.

résultats d'analyse par HPLC

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l'analyse par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) a fourni des chromatogrammes
détaillés montrant la séparation efficace des différents pigments présents dans le paprika. Les
temps de rétention distincts et les aires sous les pics chromatographiques ont permis de
déterminer la distribution relative des pigments dans l'échantillon, mettant en évidence la
présence de plusieurs composés, y compris la capsanthine, la capsorbine et le β-carotène

En combinant les résultats de la spectrophotométrie et de l'HPLC, il est possible d'affirmer que

le paprika commercial contient plusieurs pigments caroténoïdes, avec la capsanthine comme
pigment principal. Ces conclusions fournissent des informations cruciales pour la
caractérisation complète des pigments de paprika, ce qui peut avoir des implications
importantes pour leur utilisation dans divers domaines, notamment dans l'industrie
alimentaire et la recherche scientifique.

Conclusion :
Les expériences menées sur l'analyse des pigments de paprika et des acides aminés par
chromatographie sur couche mince (CCM) ont permis de caractériser avec succès la
composition et les propriétés des composés étudiés. La CCM s'est avérée être une méthode
efficace pour séparer et identifier les différents pigments de paprika ainsi que les acides
aminés présents dans les échantillons testés. L'utilisation de la Ninhydrine en tant que
révélateur a permis de visualiser les acides aminés sous forme de taches colorées distinctes,
tandis que la spectrophotométrie et la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) ont
fourni des informations détaillées sur les profils d'absorption et les concentrations relatives
des pigments de paprika.

L'ensemble des données recueillies a permis de mieux comprendre la composition des

pigments de paprika, ainsi que la présence et la distribution des acides aminés dans
l'échantillon testé. Ces résultats sont d'une importance cruciale pour l'industrie alimentaire, la
recherche scientifique et la biologie moléculaire, fournissant des informations essentielles
pour la caractérisation des composés bioactifs présents dans les échantillons biologiques. La
combinaison de ces techniques analytiques avancées a ouvert de nouvelles perspectives pour
l'étude et l'application des pigments de paprika et des acides aminés dans divers domaines de
la recherche et de l'industrie.

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