Letourneux Adrien

Séparation et quantification d’Acides Gras par HPLC

But:
Trouver les conditions d’élution optimales pour séparer des acides gras C10, C12, C14 et
C18-OH marqués par la PFB afin de les identifier et de les quantifier ensuite grâce à la
méthode des ajouts dosés.

Principe:
La chromatographie liquide haute pression (HPLC) est réalisée pour séparer les molécules.
C'est une méthode de chromatographie ayant un pouvoir de séparation supérieur à celui
d'une chromatographie liquide à colonne ouverte, car la surface d'interaction entre la phase
stationnaire et la phase mobile est augmentée grâce à la réduction de la taille des particules
de la phase stationnaire (elles varient entre 3 et 50 μm). Les molécules recherchées dans la
solution sont des acides gras, apolaires, et donc, pour les retenir lors de la chromatographie,
il faut créer des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire. C'est pourquoi l'HPLC
réalisé dans ce TP est dit en ‘’phase inverse’’ ; les particules utilisées dans la colonne
d'HPLC sont des colonnes de silice ultrapure modifiée avec des groupes C18, également
hydrophobes, utilisées pour créer des interactions apolaires.

La phase mobile est binaire et constituée d’un mélange miscible de méthanol et d'eau, avec
un gradient de méthanol allant de 92% jusqu’à 100%. Cette phase mobile sera introduite à
un débit d’1 ml/min dans la colonne grâce à deux pompes, permettant ainsi la réalisation
d’un gradient binaire haute pression.

Dans ce TP, notre objectif est d'optimiser l'élution pour atteindre une résolution parfaite où
les pics sont bien séparés, en réduisant au maximum le temps d'analyse tout en préservant
une haute sensibilité. Pour y parvenir, nous ajusterons différents paramètres lors de chaque
test, comme la concentration initiale de méthanol dans la phase mobile ou la durée du
gradient, afin de voir comment différentes forces d'élution affectent les résultats. Après la
traversée des molécules de la colonne grâce à la pompe, les différents acides gras doivent
être détectés. L'outil de marquage des différents acides gras est un détecteur UV à
monologue d’ondes variables, et comme les acides gras eux-mêmes n'absorbent pas d’UV
pour être repérés et ensuite étudiés, l'étude a été faite avec une solution de quatre esters de
PFB d'acides gras C10, C12, C14, et C18-OH pouvant être captés par le détecteur, sachant
que le PFB absorbe le mieux à 262 nm.

Pour identifier les différents composés, selon le principe de la chromatographie en phase

inverse où la phase stationnaire (C18) est apolaire et la phase mobile (méthanol) est polaire,
les molécules qui seront élués en premier auront la plus faible interaction avec la phase
stationnaire et la plus forte interaction avec la phase mobile, et seront donc les moins
apolaires (et les plus polaires). Suivant ce principe, C10 est supposé être élué en premier,
suivi par C12 et enfin C14. Il reste C18-OH, possédant un groupement hydroxyle rendant la
molécule plus polaire, ce qui rend difficile de savoir spécifiquement le moment de son élution
avant de réaliser le travail pratique.

Enfin, pour quantifier les différents acides gras, la méthode des ajouts dosés est utilisée. Une
quantité connue de l'un des acides gras est ajoutée de façon croissante au mélange à
analyser, alors que la concentration des autres composants reste constante (dans notre cas,
c'était C18-OH). Quatre ajouts croissants successifs sont effectués sur S0. Après
superposition des courbes obtenues après les différents résultats, et comme l'aire sous la
courbe est proportionnelle à la concentration de molécules dosées, l'aire sous courbe de
C18-OH devrait augmenter quatre fois (car sa concentration augmente quatre fois avec
quatre ajouts), alors que l'aire sous courbe des autres molécules devrait rester constant
après les différents ajouts.

Resultats:

Pour chaque manipulation on va injecter approximativement 25 µL du mélange S0 contenant ces 4

acides gras et seulement 20µL seront introduits dans la colonne par la machine qui élimine le surplus
et maximise les résultats et évite les imprécisions.

Ensemble des chromatogrammes obtenus lors de la chromatographie HPLC selon les différentes
conditions d’élution
Première manipulation

On fait une élution bimodale utilisant un gradient continu en passant d'une concentration en
méthanol de 92% à 100% en 5 minutes, suivie par une élution isocratique pendant 5 minutes
à une concentration à 100% de méthanol.

Observation manipulation 1(1er graphe) :

Après 10 minutes on observe 5 pics :
- Le premier pic représente le PFB en excès dans la solution introduite dans
l’HPLC pour s’assurer de marquer tous les acides gras dans notre solution. Il
sera élués au bout de 2 minutes car c’est le composé le plus polaire de notre
solution.
- Ensuite on observe 4 pics distincts représentant les 4 acides gras du mélange

Pour conclure, il est important de remarquer que les 4 derniers pics sont très éloignés du
premier, En effet ceux-ci apparaissent à 5 minutes environ sur 10 minutes d'expérience. Il
faudrait optimiser ce temps en le diminuant afin de réaliser une manipulation plus courte. On
cherchera dans une prochaine expérience à augmenter la force éluante et diminuer la
résolution entre les différents pics.