Département de Pharmacie

Chimie Analytique —3eme Année Pharmacie TP I : Chromatographie sur colonne

CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE

Extraire et identifier des espèces chimiques.

• La chromatographie permet de séparer et d'identifier les espèces chimiques d'un mélange Elle est
basée sur leur différence d'affinité pour deux phases : la phase stationnaire, ou phase fixe, et la
phase mobile appelée éluant et constituée d'un solvant ou un mélange de solvants.

I- BUT DE LA MANIPULATION

Identifier et séparer par une chromatographie sur colonne, les constituants d'un sirop de menthe.

II- MATERIEL UTILISE

Seringue de 5 ml ; 2 béchers de 50 ml.: pipette pasteur ; 2 tube: éprouvette graduée : coton.

III- RE ACTIFS

Sirop de menthe ; gel de silice ; pissette d'eau distillée ; éthanol à 95 %

IV-PRINCIPE

L'échantillon est déposé en haut de la colonne. La phase fixe est de la silice, l'éluant s'écoule du
haut vers le bas de la colonne. La séparations basée sur la différence des vitesses d'entraînement des
substances contenues dans l'échantillon.

V- PREPARATION DE LA COLÔNNE

Une seringue de 5 ml sert de colonne

L'opération de remplissage de la colonne conditionne l'efficacité de la séparation
• Fixer verticalement la colonne à !'aide d'une pince
• Meure un morceau de coton au fond de la seringue en le tassant très légèrement.
• Ajouter de l'eau distillée afin de mouiller totalement le coton.
• Peser 1g de silice dans un bécher, ajoutez-y 5 mL d'eau distillée et agiter pour former un gel.
• Continuer d'agiter afin qu'il ne précipite pas.
• Introduire délicatement le gel de silice précédemment prépare à l'intérieur de la seringue et
laisser décanter 10 minutes.
• Meure en place le piston de la seringue et appuyer délicatement afin de faire s'écouler la quasi-
totalité de l'eau rapidement (pour ne pas former une silice trop compacte), en veillant à laisser un
petit volume d'eau au-dessus de la silice.
• Remonter le piston de la seringue jusqu'à le retirer afin de refaire passer l'eau qui s'est écoulée
lors de la première opération et qui contient encore de la silice
• Refaire l'opération plusieurs fois jusqu'à ce que l'eau s'écoulant de la seringue devienne
limpide (la colonne est ainsi prête).
Attention !!! : veiller à ce que la colonne ne soit jamais sèche.

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VI- DEPOT DE L'ECIIANTILLON A SEPARER

• Lorsque k niveau d'eau arrive à la limite supérieure de la silice, Déposer très doucement nec
un compte-gouttes 10 gouttes de sirop de menthe au sommet de la colonne : veiller à ne pas
déformer surface de la phase stationnaire pendant cette opération.

• Pousser la couche de sirop au-dessus de la silice A l'aide du piston de la seringue à

l'intérieur de la silice, veiller à laisser un peu de sirop au-dessus de la silice.

VII- RECI1E1L DU PREMIER COLORANT

• Ajouter régulièrement de l'eau dans la seringue et Appuyer sur le piston de cette dernière
jusqu'à l’élution totale du premier colorant.

• Recueillir (dans un petit tube placé sous la colonne) le premier colorant.

Remarque : Si le volume initiale d'eau ne suffit pas à élue le premier colorant, ajouter de
l'eau jusqu'à récupération de la totalité du premier colorant.

VIII- RECUEIL DU DEUMEME COLORANT

• Lorsque tout le premier colorant a été recueilli, Ajouter progressivement le deuxième éluant
(éthanol à 95 %) en haut de la colonne.

• Appuyer sur le piston de la seringue jusqu'à élution totale du second colorant.

• Meure un autre tube sous la colonne pour recueillir le second colorant.

Remarque : Si k volume initiale d'éthanol ne suffit pas à éluer le second colorant, ajouter de
l'éthanol jusqu'à récupération de la totalité du second colorant.

IX- QUESTIONS

• Quelles sont les teintes des solutions recueillies ?

• Quel est le rôle du coton ?
• Quel est l'éluant du premier colorant ?
• Le second colorant est-il plus soluble dans Peau ou dans l'éthanol ?