DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

FILIERE : SCIENCES DE LA VIE

S3 – Année Universitaire 2021-2022

MODULE 4 :
Techniques chimiques pour la Biologie

Travaux Pratiques

TP2. CHROMATOGRAPHIE

Coordinateur du Module : Pr. ABDELLATIF HAFIDI

Responsable TP : Pr. LAILA EL BOUZIDI

Module 4 : Techniques d’Analyse Chimiques pour la Biologie TP2

INTRODUCTION

Les techniques de chromatographie sont des techniques séparatives analytiques et/ou

préparatives et ayant comme objectif la séparation des constituants d'un mélange. Cette
séparation est basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux
phases, l'une stationnaire ou fixe et l’autre mobile. Les méthodes chromatographiques sont
classées en fonction de la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en œuvre
dans la séparation.

- But de la manipulation :

Le but de cette séance de TP est de se familiariser avec certaines techniques

chromatographiques (Chromatographie sur couche mince et chromatographie d’exclusion).

A. Chromatographie d’exclusion ou tamisage moléculaire :

La chromatographie d'exclusion, est aussi appelée tamisage moléculaire, permet la

séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme (figure 1). Dans cette
technique chromatographique on utilise des gels poreux. La séparation est fondée sur la
possibilité de soluté à pénétrer ou de ne pas pénétrer à l’intérieur des pores de la phase
stationnaire (limite d’exclusion). Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes
du gel sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux
billes. Elles ont donc un trajet plus court à parcourir pour arriver en bas de la colonne. Elles
sortent les premières, à un volume d'élution (VM ou Vo) appelé volume mort de la colonne.

Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes du gel peuvent pénétrer
librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume
de liquide à l'intérieur des pores des billes plus volume de liquide à l'extérieur des billes ou
phase mobile). Les molécules de taille intermédiaire pénètrent dans les billes, en fonction de
leur taille et de leur forme ; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles
sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes. Les molécules de masse molaire
intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires et sont effectivement séparées.

On considère une colonne de volume total VT remplie d'un gel :

VT = V0 + Vi + Vg
V0 = volume d'eau externe aux granules du gel. Il correspond au volume d’élution des molécules
totalement exclues.

Vi = volume d'eau interne aux granules du gel.

Vg = volume du gel.

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Figure 1. Schéma de chromatographie d’exclusion.

1. Partie expérimentale :

1.1. But de la manipulation

Dans le cadre de ce travail, il s’agit de procéder à la séparation des protéines et des sucres
contenus dans le lait en utilisant la technique de chromatographie d’exclusion.

1.2. Séparation chromatographique

La séparation s’effectue sur des colonnes en plastique remplies par un gel de dextrane
hydroxypropylé réticulé (Sephadex G25). L’eau distillée est utilisée comme phase mobile.

- Commencer par vérifier que le niveau supérieur du gel est horizontal et qu’il y a assez
d’eau au-dessus du gel (1,5 à 2 cm).
- Ouvrir la sortie de la colonne (bouchon). Vérifier l’écoulement de la colonne de manière
à pouvoir compter les gouttes.
- Lorsque l’eau arrive au niveau supérieur du gel, déposer lentement 0,5 ml de lait dilué 4
fois.
- Commencer à recueillir les fractions.
- Lorsque l’échantillon de lait est passé, ajouter délicatement de l’eau distillée sur la partie
supérieure du gel (laisser couler l’eau sur la paroi de la colonne pour ne pas provoquer de
remous à la surface du gel). Vérifier à nouveau que le débit est régulier.
- Recueillir dans des tubes des fractions de 1 ml, en numérotant soigneusement les tubes
dans leur ordre de passage. Marquez le niveau du volume comme référence pour les autres
tubes.

1.3. Traitement des fractions

- Détection des protéines : Réaction de Biuret

Prélever 0,5 ml de chaque fraction dans une série de tubes à hémolyse. Ajouter dans chaque
tube :

- 1 ml de soude à 20% ;
- 5 gouttes de sulfate de cuivre à 1%.

Noter la couleur des tubes et commenter (coloration violette : réaction positive).

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- Détection des sucres : Réaction au phénol et acide sulfurique

Aux 0,5 ml restants, ajouter directement dans les tubes ayant servi au fractionnement :

- 4 gouttes de phénol à 5% ;
- 0,5 ml d’acide sulfurique concentré (couler lentement sur la paroi de tube).

Noter la couleur des tubes et commenter. (Présence d’anneau rouge orangé : réaction positive).

B/Chromatographie sur couche mince (CCM)

Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la répartition des solutés entre la phase
liquide mobile et l’adsorbant (phase stationnaire) fixé sur une surface inerte (une plaque de
verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium). Chacun des solutés
est soumis à une force de rétention (par adsorption) et une force d'entraînement par la phase
mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de
l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.

L’adsorption est la fixation des molécules dissoutes par la phase solide. Cette fixation est
due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la molécule
adsorbée: liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals.

La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une
phase stationnaire. Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les
substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

La position finale de la substance (ou spot) est caractéristique de la molécule. On lui

attribue une valeur Rf (Rapport frontal). Ce Rf est le rapport de la distance parcourue par le
composé (a) divisée par la distance parcourue par la phase mobile(b) (figure 2) :

Rf = a
b

Figure 2. Schéma de la chromatographie sur couche mince.

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Module 4 : Techniques d’Analyse Chimiques pour la Biologie TP2

1. Partie expérimentale :

1.1. But de la manipulation

Mise en évidence de la caféine dans un médicament par CCM.

1.2. Préparation de la CCM

La séparation par CCM sera réalisée sur une plaque d’aluminium recouverte de gel de
silice en phase normale (10cm×3cm).

Sur la plaque de silice, tracer au crayon un trait fin horizontal à 1 cm du bord inférieur.
Eviter de toucher la silice avec les doigts (risque de dépôt de matière grasse = empreinte). On
trace sur cette ligne deux croix à 1 cm d’intervalle pour repérer chacun des dépôts par une légère
marque au crayon : M (solution médicamenteuse) et C (caféine témoin).

1.3. Elution de la CCM.

Sur les croix déjà tracées M et C, déposer à l’aide d’une pipette pasteur quelques gouttes
de chacune des différentes solutions préparées. Sécher la plaque pour évaporer le solvant qui
accompagne les substances à analyser. Placer ensuite la plaque de silice dans la cuve de
développement préalablement saturée en phase mobile qui est un mélange de méthanol-eau
(12 : 8, v/v) et recouvrir avec le couvercle. Le niveau du solvant dans la cuve doit être sous la
ligne de dépôt (voir schéma ci-dessous) :

Laisser migrer la phase mobile jusqu’à 1 cm du bord supérieur. Puis retirer la plaque et
marquer le front de l’éluant.

1.4. Révélation de la CCM.

La plaque est séchée sur la paillasse pendant 10 minutes puis révélées sous la lampe UV à
254 nm. Les taches révélées sont entourées au crayon.

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Résultats et discussion
I. A. Chromatographie d’exclusion
1. Remplir le tableau suivant en indiquant le résultat de chaque fraction par + ou – (+ :
réaction positive, – : réaction négative)

Fraction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sucres

Protéines

2. Interpréter les résultats obtenus.

I. B.Chromatographie d'adsorption en phase liquide

1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

1. Reproduire le chromatogramme obtenu sur le schéma suivant :

C :Caféine ;

M : médicament.

C M

2. Le médicament M étudié est-il une espèce chimique pure ou un mélange de principes

actifs ? Justifier votre réponse.
3. Calculer le rapport frontal Rf des différentes espèces chimiques étudiées.
4. Le médicament M contient-il de la caféine ? Justifier votre réponse.