Cas9

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Cas9

Présentation
Type
Ribonucléoprotéine, protéine
Partie de
CRISPR-associated endonuclease Cas9, HNH nuclease domain, protein family (d),
CRISPR-associated endonuclease Cas9, bridge helix, protein family (d), CRISPR-
associated endonuclease Cas9, PAM-interacting domain, protein family (d), Cas9-type
HNH domain, protein family (d), CRISPR-associated endonuclease Cas9, REC lobe,
protein family (d)
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Une structure du Cas9 de S. aureus dans un complexe avec un ARN guide (haut) et son
ADN cible (bas)1.
Cas9 (CRISPR associated protein 9) est une protéine d'origine bactérienne aux
propriétés anti-virales. Sa capacité à couper l'ADN au niveau de séquences
spécifiques en a fait un outil de biologie moléculaire aux vastes perspectives
d'utilisation.
C'est une endonucléase d'ADN guidée par ARN, c'est-à-dire une enzyme spécialisée
pour couper l'ADN avec deux zones de coupe actives, une pour chaque brin de
la double hélice.
La protéine Cas9 est associée au système immunitaire adaptatif type II
de CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Cette enzyme
peut être utilisée en génie génétique pour modifier facilement et rapidement
le génome des cellules animales et végétales. Des outils permettant d'éditer le
génome existaient depuis les années 1970 mais étaient bien moins efficaces, plus
complexes et bien plus coûteux que Cas9. Cette technique Crispr-Cas9, dite des
« ciseaux moléculaires », fait beaucoup parler d'elle, entre espoirs de guérir des
maladies génétiques et risques de dérives éthiques. Ces questions liées à la
modification génétique renvoient directement à la Convention sur les droits de
l'homme et la biomédecine de 1997, dont l'article 13 est consacré aux interventions
sur le génome humain. Il est écrit qu'« une intervention ayant pour objet de
modifier le génome humain ne peut être entreprise que pour des raisons préventives,
diagnostiques ou thérapeutiques et seulement si elle n'a pas pour but d'introduire
une modification dans le génome de la descendance. »2
Depuis sa découverte, la protéine Cas9 a été largement utilisée comme outil
d'ingénierie du génome pour produire des ruptures du double brin d’ADN ciblé. Ces
cassures peuvent conduire à l’inactivation de gènes ou à l'introduction de gènes
hétérologues par jonction d'extrémités non homologues ou par recombinaison
homologue chez de nombreux organismes. Parallèlement aux nucléases à doigt de
zinc et aux protéines TALEN, Cas9 est devenu un outil de premier plan dans le
domaine de la génomique. Cas9 a gagné en popularité de par sa capacité à couper
l’ADN précisément à n’importe quel emplacement complémentaire de son ARN guide3.
Contrairement aux méthodes TALEN et à doigts de zinc, le ciblage de l'ADN par Cas9
est direct et ne requiert pas de modification de la protéine mais seulement de
l'ARN guide4,5. Des versions modifiées de la protéine Cas9 qui se lient mais ne
coupent pas l'ADN peuvent être de plus utilisées pour localiser des activateurs ou
des suppresseurs de transcription de séquences d'ADN spécifiques afin de contrôler
l'activation et l’inactivation de la transcription de certains gènes6,7. Le ciblage
Cas9 a été notamment simplifié grâce à la création d’ARN chimérique unique. Des
scientifiques ont suggéré que la technologie Cas9 avait le potentiel pour modifier
les génomes de populations entières d'organismes8. En 2015, des scientifiques
en Chine ont utilisé Cas9 pour modifier le génome d'embryons humains pour la
première fois9. Depuis 2015 et toujours en Chine, des patients atteints notamment
de cancers, sont traités à l'aide de CRISPR-Cas910.
En octobre 2020, le prix Nobel de chimie a été attribué à Emmanuelle
Charpentier et Jennifer Doudna pour le développement d'une méthode d'édition du
génome, en l’occurrence, le système d'édition CRISPR-Cas911
Fonctionnement[modifier | modifier le code]
Cas9 est associée aux séquences CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats ou « courtes répétitions palindromiques regroupées et
régulièrement espacées ») dans l'immunité adaptative de Streptococcus pyogenes,
parmi d'autres bactéries.
Streptococcus pyogenes utilise l'outil Cas9 pour détecter et défaire l'ADN
étranger, tels que l'invasion de l'ADN de bactériophages ou d'un ADN plasmidique3.
Cas9 effectue cette détection par déroulement de l'ADN étranger et la vérification
de complémentarité avec la région longue d'espacement d'une vingtaine de paires de
base de l'ARN guide12. Si une séquence d'ADN est apparentée à l'ARN guide, Cas9
découpe l'ADN invasif. En ce sens, l'outil CRISPR/Cas9 a un certain nombre de
ressemblances avec le mécanisme de l'interférence par ARN chez les eucaryotes1.
Invention et brevetage[modifier | modifier le code]
La technique d'édition de génome CRISPR-Cas9 a été découverte par l'équipe de la
chercheuse française Emmanuelle Charpentier avec l'aide de l'Américaine Jennifer
Doudna à l'université de Californie à Berkeley. Elle a été par la suite développée
à partir de 2012 par plusieurs chercheurs, dont notamment le biologiste
moléculaire Feng Zhang, du Broad Institute (associé à Harvard et au MIT). Berkeley
conteste devant une commission d'appel de l'United States Patent and Trademark
Office le brevet accordé au Broad Institute pour cette découverte13. Le 15 février
2017, l'United States Patent and Trademark Office a considéré que les brevets
déposés par le Broad Institute sur l'usage de CRISPR/Cas9 dans le cas de cellules
eucaryotes étaient valides. Pour autant, les revendications de l'université de
Berkeley (à l'origine des dépôts de brevets de Jennifer Doudna et d'Emmanuelle
Charpentier) quant à l'emploi de CRISPR/Cas9 sur tous types de matériel génétique
(y compris les cellules eucaryotes) n'ont pas été rejetées14,15.
Outil de génie génétique[modifier | modifier le code]
Outre sa fonction d'origine bactérienne dans l'immunité, la protéine Cas9 est
utilisée comme un outil du génie génétique pour induire des cassures double brin
dans l'ADN. Ces ruptures peuvent conduire à l'inactivation du gène ou à
l'introduction de gènes hétérologues à travers deux types de réparation : la
jonction d'extrémités non-homologues et la recombinaison homologue chez de nombreux
organismes modèles de laboratoire.
Ce genre d'outil existait déjà avec les Transcription activator-like effector
nucleases (TALEN) et les nucléases à doigt de zinc mais Cas9, grâce à son
efficacité, sa rapidité et son faible coût devient un outil de premier plan dans le
domaine de la thérapie génique.
La compréhension de l'outil CRISPR/Cas9 a progressé au cours des années 2010, car
il peut découper pratiquement toutes les séquences complémentaires de l'ARN
guide16. Grâce à la spécificité de la cible de Cas9 qui provient de l'ARN guide et
de la complémentarité de l'ADN et non pas des modifications de la protéine elle-
même (comme TALEN et les nucléases à doigt de zinc), l'outil Cas9 peut cibler un
nouvel ADN assez facilement17. La souplesse de conception couplée avec les versions
de Cas9 qui lient mais ne découpent pas d'ADN apparenté a aussi un potentiel pour
la correction et désactivation des gènes en localisant l'activateur ou
les répresseurs des séquences spécifiques d'ADN18,19. Une simplification plus
poussée a été fournie dans une étude inédite en 2012 qui représente la création
d'un ARN chimérique de guidage unique, plutôt que l'ARN guide original composé de
deux ARN disparates qui s'associent à de l'ARN-CRISPR, et la trans-activation de
l'ARN16. Les scientifiques suggèrent que les lecteurs de gènes à la base de Cas9
peuvent être capables d'éditer les génomes de populations entières d'organismes20.
Tout comme la révolution de la biologie moléculaire qui a accompagné la découverte
des enzymes de restriction dans les années 1970, la « boîte à outils Cas9 » détient
également un grand potentiel.
Applications[modifier | modifier le code]
Les premières applications ont été réalisées sur des animaux et notamment des
primates21. Grâce à Crispr-Cas9 et son coût de développement réduit, des
scientifiques ont déjà créé des vaches sans cornes (pour éviter qu'elles ne se
blessent). D'autres prévoient de ressusciter des espèces disparues comme
le mammouth par exemple22.
L'industriel Monsanto, filiale de Bayer, a acquis fin 2016 les droits
d’exploitation de Crispr-Cas923.
Modification d'embryons humains[modifier | modifier le code]
Le 18 avril 2015, des chercheurs de Canton ont publié un article dans Protein &
Cell (en) annonçant avoir utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour modifier
génétiquement des embryons humains24,25. Selon Junjiu Huang, qui a dirigé ces
recherches, cet article aurait été refusé26 par Science et Nature à cause des
problèmes éthiques que posent de telles recherches. L'article note une sensibilité
et une spécificité insuffisantes de la technique pour qu'elle puisse être utilisée
en thérapie génique à ce stade.
En décembre 2015, au vu des multiples questions de sécurité et d’éthique, un
meeting organisé par l’Académie américaine des sciences et de la médecine,
l’Académie chinoise des sciences, et la Société royale de Londres, a recommandé
un moratoire. Malgré cela, repoussant les accusations d'eugénisme, de nombreux
bioéthiciens et scientifiques ont soutenu que si des anomalies dans des gènes
particuliers causant des conditions fatales et débilitantes pouvaient être
corrigées dans un embryon, alors elles devaient l’être.
En janvier 2016, la Grande-Bretagne autorise la manipulation génétique sur des
embryons humains à l'Institut Francis Crick situé à Londres. Cela permettrait
d'étudier le début du développement de l'embryon et d'identifier ce qui provoque la
réussite ou l'échec d'une fécondation in vitro mais relance néanmoins le débat sur
l'éthique et la finalité de telles études27.
Fredrik Lanner, un scientifique suédois de l’Institut Karolinska à Stockholm,
utilise cette enzyme dans le but de trouver de nouveaux traitements concernant
l’infertilité et les fausses couches. Cette enzyme désactive les gènes CRISPR-cas9
dans les embryons afin d’observer leurs rôles dans le développement précoce de
ceux-ci28,29.
En juillet 2017, une équipe de chercheur de Portland dans l'Oregon annonce avoir
modifié avec succès des embryons humains30,31,25,32. Les chercheurs auraient
corrigé efficacement des gènes défectueux à l'origine de maladies héréditaires.
Aucun embryon n'a été autorisé à se développer pendant plus de quelques jours (la
limite de 14 jours est imposée à la recherche sur l’embryon humain33). Le processus
appelé « ingénierie de la lignée germinale » modifie le génome des enfants qui
pourrait ensuite être transmis aux générations suivantes grâce à leurs
propres gamètes. Les chercheurs auraient notamment pu montrer de façon convaincante
qu'il était possible d'éviter les erreurs dues aux effets « hors cible »34 relevées
par une autre étude en 201735 finalement rétractée36. La plausibilité de ces
résultats fait débat37 mais les auteurs publient en 2018 de nouveaux éléments de
preuve étayant leurs travaux38.
En novembre 2018, He Jiankui, un chercheur chinois annonce dans une vidéo diffusée
sur YouTube la naissance des premiers bébés génétiquement modifiés, deux
jumelles39. Il affirme avoir utilisé la technique CRISPR-Cas9 sur les embryons
(conçus par FIV) afin de les protéger d'une infection par le VIH40, leur père
étant séropositif39. Son université, la Southern University of Science and
Technology (en) de Shenzhen, se désolidarise de son professeur41 et, à la demande
de la commission nationale de la santé chinoise, les autorités sanitaires de
la province du Guangdong ouvrent une enquête42. Sans évaluation par les pairs, avec
en plus de la vidéo, un simple communiqué à Associated Press, problématiques sur le
plan bioéthique, ces travaux suscitent un tollé dans la communauté
scientifique43,42,44 et Jiankui He annonce le 28 novembre au 2nd International
Summit on Human Genome Editing de Hong Kong qu'il suspend ses travaux45.
Thérapie génique[modifier | modifier le code]
Grâce à CRISPR-Cas9, une équipe américaine a réussi à rendre un moustique résistant
au paludisme et prévoit de le libérer dans la nature pour transmettre ce gène de
résistance à l'ensemble de l'espèce évitant ainsi les 500 000 victimes humaines
annuelles liées à cette maladie46.
CRISPR-Cas9 ouvre également la voie à de nombreuses solutions de thérapie
génique telles que la guérison du cancer, de la mucoviscidose, de
l'hémophilie ou Alzheimer. En somme, « rendre les humains plus résistants » et
rallonger notre espérance de vie22. En mai 2017, les premiers tests de lutte contre
le SIDA effectués sur des souris ont été concluants47.
Des chercheurs chinois ont utilisé Crispr-Cas9 en août 2016 sur des patients
atteints d'un cancer du poumon48. C'est la première fois que Crispr est utilisé sur
des humains adultes. Lu You, oncologue de l'université chinoise de Sichuan, tente
de modifier les lymphocytes T des patients avec Crispr. En cas de cancer, les
lymphocytes T n'attaquent pas les cellules tumorales, car elles sont incapables de
les distinguer des cellules saines. Les chercheurs chinois vont extraire des
lymphocytes T du patient, puis tenter d'utiliser Crispr-Cas9 pour « couper » un
gène bien particulier, appelé PD-1. La cellule génétiquement modifiée est
multipliée in vitro, et le tout est réinjecté au patient49 (voir aussi Récepteur
antigénique chimérique et Transfert adoptif de cellule).
Aux États-Unis, un essai similaire est en attente d'une autorisation de la FDA, le
« gendarme » américain de la santé. L'autorisation pourrait arriver d'ici à la fin
de l'année.
Une jeune entreprise américaine spécialisée sur Crispr et financée par Bill
Gates souhaite également réaliser ses premiers essais sur un être humain pour venir
à bout d'une maladie rare touchant les yeux.
En 2017, la technologie CRISPR-Cas9 a permis également d'importantes avancées
des thérapies de transfert adoptif de cellules en immunologie en facilitant la
reprogrammation des cellules immunitaires avec des premiers succès thérapeutiques.
Dans une publication parue dans Nature en 2017, des chercheurs de l'université de
Pittsburgh ont utilisé CRISPR-Cas9 pour modifier directement l'ADN des cellules
cancéreuses par l'intermédiaire d'un virus. Les essais chez la souris ont montré
une réduction des tumeurs sans nuire aux cellules saines. Au terme de l'étude,
toutes les souris traitées étaient encore en vie contrairement au groupe témoin où
toutes les souris avaient péri50.
En 2019, c'est au contraire l'ADN des lymphocytes T de patients atteints d'un
cancer (sarcome ou myélome multiple) qui a été modifié grâce à CRISPR-Cas9.
L'opération a consisté à éteindre les gènes d'un récepteur qu'activent les cellules
cancéreuses pour bloquer le système immunitaire, et d'un autre récepteur qui peut
entraver le ciblage des cellules cancéreuses51.
Forçage génétique[modifier | modifier le code]
Article détaillé : Forçage génétique.
Améliorations variétales[modifier | modifier le code]
De nombreuses applications sont en cours pour la création et l'amélioration
de variétés végétales52.
L'utilisation du système CRISPR/Cas9 pour la sélection variétale permet d'accélérer
et d'améliorer considérablement les méthodes utilisées actuellement par les
créateurs de nouvelles variétés.
Des tolérances à des maladies sur le blé, le riz et le concombre sont déjà au
point. La maturation chez la tomate peut être améliorée. Dans le futur, de
nombreuses autres applications pourront se développer, tels des tolérances
aux stress abiotiques (sécheresse, salinité, température, …), des facteurs de
qualité améliorés (composés nutritionnels), …
Inconvénients[modifier | modifier le code]
En décembre 2015, Jennifer Doudna elle-même exprime ses craintes53.
Des chercheurs de l’université Columbia (États-Unis) alertent sur les résultats
observés chez deux souris35. Traitées avec succès pour une cécité génétique grâce à
CRISPR Cas9, les deux rongeurs présentaient, après la thérapie, 1 500 mutations
inattendues sur l’ensemble de leur génome en dehors des zones prévues
d’intervention54. Plus inquiétant encore, CRISPR-Cas9 aurait causé 100 insertions
ou délétions de séquences d’ADN. Suite à l’édition de leur génome, les souris ne
semblaient pas souffrir de pathologies particulières mais ces mutations sont
potentiellement dangereuses, et peuvent provoquer des cancers ou d’autres maladies
génétiques. Cependant, dans la semaine qui a suivi la publication de l'étude, des
scientifiques ont pointé du doigt des erreurs dans l'étude notamment
l'identification comme mutation d'erreurs dues en fait à des différences
naturelles, le faible nombre d'animaux étudiés ainsi que des erreurs
d'identification de gènes55. Des scientifiques des entreprises Intellia
Therapeutics et Editas Medicine, créées en 2016 pour développer des thérapies
basées sur la technologie CRISPR56 dénoncent les résultats et demandent le retrait
de la publication57 : « Il est clair que les auteurs ne sont pas des experts en
CRISPR Cas9, ni en séquençage de génome, ni en génétique de base. Leur
identification de « mutations inattendues » démontre clairement leur manque de
perspicacité scientifique sur ce sujet58. »
L'Institut national de la santé et de la recherche médicale, dans une note du
Comité d'éthique de février 2016, développe son avis sur les technologies d'édition
du génome. Dans le point numéro 5, l'Inserm rappelle qu'avec l'édition du génome,
la médecine touche à une question plus philosophique. En effet, l'édition du génome
mettrait en tension la plasticité du vivant et l'idée d'une nature humaine
biologiquement invariante. Il désire ainsi mettre en place une réflexion sur la
question59.
Le Comité international de bioéthique (CIB) de l'Unesco a demandé un moratoire sur
les « techniques d'édition de l'ADN des cellules reproductrices humaines afin
d’éviter une modification « contraire à l’éthique » des caractères héréditaires des
individus, qui pourrait faire resurgir l’eugénisme ». L'Unesco propose d'ailleurs
un principe général de précaution dans son rapport de 2015 (proposition 10560).
Le 14 février 2017, « un rapport conjoint de l'Académie des sciences et de
l'Académie de médecine américaines a levé un tabou » relatif à ces inconvénients
« en avalisant l'utilisation de cet outil pour modifier le matériel génétique de
l'embryon humain, quitte à ce que ces modifications se transmettent à sa
descendance future61 ».
Des "kits CRISPR" sont même disponibles sur internet pour 150$. Un rapport de la
CIA a classé le CRISPR-Cas9 dans la catégorie des "armes de destruction massive"
potentielles62. Un biohacker comme Josiah Zayner a fondé une société en 2016 en
Californie pour commercialiser ce type de kits, ce qui provoque une bataille
juridique63.
En décembre 2020, plus de 150 ONG internationales demandent "un moratoire sur le
forçage génétique"