UE Bio 300

Dr. KOMI KOUKOURA Komi, Enseignant-Chercheur/ESTBA –Département-AMB/UL

Chapitre 1 : L’ADN RECOMBINANT

Objectifs spécifiques :
A la fin de ce chapitre l’apprenant doit être capable de :
1- Décrire comment on utilise les endonucléases de restriction et les ligases pour
l’obtention de l’ADN recombinant.
2- Expliquer comment on peut séparer des fragments d’ADN par électrophorèse en
gel et quand celle-ci est utile.
3- Décrire la construction et les applications des banques d’ADN recombinant.

La biotechnologie n’est pas nécessairement une discipline du 20e siècle. Par exemple, la
première domestication des chiens à partir des loups par nos ancêtres chasseurs-cueilleurs, il y
a quelque 15000 ans, et ensuite leur sélection, ont abouti aux 180 races actuelles. Plus tard,
nos ancêtres agriculteurs ont commencé à domestiquer les plantes, et le développement du
maïs hybride au début du 20e siècle a notablement augmenté les rendements. Les découvertes
récentes en biologie moléculaire et en génétique ont ouvert les portes d’une ère moderne
d’innovation et de découverte en biotechnologie. La possibilité d’isoler et de manipuler
l’ADN a révolutionné la biotechnologie, accéléré les découvertes et permis de nouvelles
applications. La construction de l’ADN recombinant, molécule unique construite à partir de
deux sources différentes, a débuté au milieu des années 1970. Le développement de cette
technologie, a l’origine de tout le domaine de la biotechnologie, repose sur des enzymes
utilisables pour la manipulation de l’ADN.
En 1972, Paul erg créait la première molécule d’ADN recombinant en insérant un ADN
viral dans l’ADN bactérien. En 1973, se basant sur les travaux de erg, Herbert oyer et
Stanley Cohen introduisirent des gènes d’un crapaud, Xenopus laevis, dans des bactéries et
montrèrent que les gènes pouvaient passer de génération en génération et s’exprimaient dans
les bactéries.
C’était la preuve incontestable que les gènes d’animaux à reproduction lente pouvaient se
répliquer et s’exprimer dans des bactéries à croissance beaucoup plus rapide. Au cours des
trois décennies suivantes, les découvertes de Berg, Boyer et Cohen devaient être à la base de
biotechnologies allant du séquençage de génomes complets à la production d’insuline par les
bactéries.
.
1.1 Les endonucléases de restriction coupent l’ADN à des sites spécifiques.
Ces expériences de clonages furent parmi les premières à utiliser les nouveaux outils que
sont les enzymes de restriction. Fruits d’une recherche de base sur la manière dont peut être
limitée la gamme d’hôtes d’un virus bactérien, ces enzymes reconnaissent des séquences
spécifiques d’ADN et fonctionnent comme des nucléases pour couper l’ADN. Identifiée à
l’origine par Werner Arbor alors qu’il étudiait le phénomène de restriction d’hôtes, la
première enzyme coupant l’ADN a son site de reconnaissance fut isolée par Hamilton Smith à

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partir de la bactérie Haemophilus influenzae, et pour cela, appelée HindIII. Arbor, Smith et
Daniel Nathans se partagèrent, en 1978, le prix Nobel de physiologie et médecine pour ce
travail. La découverte des endonucléases de restriction est importante pour deux raisons.
D’abord pour leur faculté de couper l’ADN en fragments spécifiques et, en second lieu, pour
leur utilisation dans la création des cartes de génomes.

1.1.1 Comment fonctionnent les endonucléases de restriction.

Il existe trois types d’enzymes de restriction, mais seul le type II agit à des endroits précis,
permettant la création de molécules recombinantes. Ces enzymes reconnaissent une séquence
d’ADN spécifique, longue de 4 à 12 bases, et coupent l’ADN au niveau d’une base
particulière de cette séquence (Figure 17.1). Les sites de reconnaissance de la plupart des
enzymes de type II sont des palindromes. Un palindrome est un mot ou une phrase qui se
lisent de façon identique dans un sens comme dans l’autre, comme le mot . Une
séquence d’ADN palindrome se lit de 5’ à 3’ dans un brin et dans le brin complémentaire.
Avec ce type de séquence, la coupure de l’ADN au niveau d’une même base sur les deux
brins peut produire des coupures décalées et des , ou extrémités
cohésives. Ces courtes séquences non appariées seront les mêmes pour tout ADN coupé par
cette enzyme. Ces bouts collants permettent donc de les réunir facilement (voir figure 17.1).
Bien que moins fréquentes, certaines enzymes de restriction de type II, comme PvuII, peuvent
couper les deux brins au même endroit et donner des extrémités émoussées et non collantes.
On peut réunir ces extrémités émoussées à d’autres extrémités émoussées.
Cette activité de coupure à un endroit spécifique, longtemps recherchée par les
biologistes moléculaires a été découverte à l’occasion d’une recherche fondamentale sur la
façon dont les virus bactériens peuvent infecter certaines cellules plutôt que d’autre. On a
parlé de restriction d’hôte. Les bactéries produisent des enzymes capables de découper
l’ADN des virus qui les infectent au niveau de séquences spécifiques. Les cellules protègent
leur propre ADN en le modifiant aux sites de scission. Les enzymes de restriction ne coupent
pas cet ADN modifié. Depuis la première découverte de ces endonucléases de restriction, on
en a isolé des centaines d’autres qui reconnaissent et coupent des sites de restriction différents.
La faculté de couper l’ADN à des endroits spécifiques est importante pour deux raisons : elle
permet d’abord de construire des cartes physiques basées sur la position des sites de coupure
par les enzymes de restriction. Ces cartes de restriction sont une source essentielle de
renseignement pour l’identification et la manipulation des molécules d’ADN.
En second lieu les endonucléases de restriction permettent de construire des molécules
recombinantes. Cette faculté est essentielle pour la recherche, par ce que beaucoup d’étapes
du processus de clonage et de manipulation de l’ADN, reposent sur la possibilité de combiner
des molécules d’origines différentes.

1.1.2 Rôle biologique

Les enzymes de restriction produites par des bactéries constituent un mécanisme de défense
contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries. Lorsque le
virus injecte son ADN dans la bactérie, celui-ci est coupé par l'enzyme de restriction au
niveau de ses sites spécifiques. La destruction du génome du virus bloque ainsi l'infection. Le

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nom d'enzyme de restriction provient de ce mécanisme : la présence de ces enzymes dans les
bactéries restreint l'infectiosité des bactériophages.
Pour éviter que l'enzyme de restriction ne coupe l'ADN de son propre génome, la bactérie
fabrique aussi une deuxième enzyme appelée méthylase, qui reconnaît également le site de
restriction. La méthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie en lui rajoutant un groupement
méthyle sur un ou plusieurs nucléotides du site. Cette méthylation empêche la coupure par
l'enzyme de restriction.
Ce mécanisme de défense, appelé système de restriction/modification, associe
systématiquement ces deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de protection.

1.1.3. Propriétés
Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, c'est-à-dire des
enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur de
la chaîne d'un acide nucléique, et plus spécifiquement appartiennent à la classe des
endodésoxyribonucléases puisque spécifique à l'ADN. Les endonucléases diffèrent des
exonucléases, puisqu'elles peuvent cliver les brins d'acide nucléique de manière interne, alors
que les exonucléases n'attaquent la molécule d'acide nucléique qu'au niveau de ses extrémités.

Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître spécifiquement et uniquement une

courte séquence de l'ADN de 4 à 10 paires de bases, et de cliver les deux brins du duplex
d'ADN au site reconnu. Cette propriété a depuis longtemps été utilisée en biologie
moléculaire, puisqu'elles permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite en
coupant à des sites définis.

Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour établir une carte génétique (appelée «
carte de restriction ») d'une molécule d'ADN. La carte de restriction donne l'ordre des sites de
restriction le long de cette molécule, et la taille des fragments produits. Cette technique de
caractérisation des acides nucléiques, très utilisée voici une vingtaine d'années, est supplantée
par le séquençage direct, devenu bien moins coûteux et réalisé de façon routinière.

Elles peuvent être également utilisées pour faire produire à des cellules hôte (par exemple la
bactérie Escherichia coli) une protéine exogène. Les enzymes de restriction jouent un rôle
crucial dans ce processus car elles permettent, en coupant le brin à un endroit précis et de
manière asymétrique, l'intégration d'un brin d'ADN spécifique codant pour une protéine
précise dans un plasmide dans le but de l'exprimer dans une bactérie. Cette intégration peut
être faite, profitant de l'asymétrie créée par l'enzyme de restriction, en jouant sur l'homologie
de séquence au site de clivage (site d'intégration).
Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est possible de
distinguer trois types d'enzymes de restriction.

Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et coupent
en un endroit aléatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases (pb) pour le type I et de
25 pb pour le type III plus loin que le site de restriction. Ces 2 types ont également une

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activité méthylasique en plus de leur activité endonucléasique, ce qui les différencie du type II.
Les enzymes de types I et III sont moins précis et ne sont guère utilisés ni pour le clonage et
la manipulation de l’ADN.

Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et coupent
en un endroit spécifique de cette séquence. Les enzymes de type II permettent la création de
molécules recombinantes ; ces enzymes reconnaissent une séquence d’ADN spécifique,
longue de 4 à 12 bases, et coupent l’ADN au niveau d’une base particulière de cette séquence.
Les sites de reconnaissance de la plupart des enzymes de type II sont des palindromes. Un
palindrome est un mot ou une phrase qui peuvent être lus de façon identique dans un sens
ou dans l’autre. Une séquence d’ADN palindrome se lit dans le sens de 5’à 3’ dans un brin et
dans le brin complémentaire.

Avec ce type de séquence, la coupure de l’ADN au niveau d’une même base sur les deux
brins peut produire des coupures décalées et des <<bouts collants>>. Ces courtes séquences
non appariées seront les même pour tout ADN coupé par cette enzyme. Ces bouts collants
permettent donc de les réunir facilement. Bien que moins fréquentes, certaines enzymes de
restriction de type II, comme PvuII, peuvent couper les deux brins au même endroit et donner
des extrémités émoussées et non collantes. On peut réunir ces extrémités émoussées à d’autres
extrémités émoussées.
De manière générale, les enzymes de restriction sont bloquées par le monoazide d'éthidium.

1.1.4 Nomenclature
La nomenclature des enzymes de restriction est précise. Leur nom comporte 3 ou 4 lettres
correspondant entre autres à la bactérie à partir de laquelle on a extrait cette enzyme :
- La première lettre est en majuscule cela correspond à la première lettre du genre de la
bactérie
- La seconde et troisième lettre sont en minuscule et correspondent aux deux premières
lettres de l'espèce bactérienne.
- La quatrième lettre correspond à la souche bactérienne, elle est écrite en majuscule mais
n'est pas présente dans toutes les enzymes de restriction. Enfin un chiffre romain donne le
numéro d'ordre de caractérisation de l'enzyme.
Ainsi on a EcoRI : Enzyme de restriction d'Escherichia (genre) coli (espèce) souche RY317 la
première à être caractérisée (I)

Figure 1a : Quelques enzymes de restriction et leur site de reconnaissance

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Figure 1b :

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