Application des techniques

d’extraction et d’analyse aux

substances naturelles

Pr Zerzouf

(S2) 2023
I. INTRODUCTION
La nature fournit à l’homme depuis des millénaires
tout ce que dont il a besoin :
sa nourriture;
de quoi s’abriter et s’habiller;
de quoi se soigner grâce aux drogues extraites des
plantes et des micro-organismes.
L’homme a appris des animaux
ex: Certains singes sauvages ingurgitent des feuilles
d’Aspilia : rugueuses et hérissées de petits poils,
elles provoquent l’expulsion rapide des parasites
intestinaux.
éxp: au Congo des chimpanzés orphelins élevés par
des humains, une fois relâchés en milieu naturel,
intègrent dans leur alimentation des plantes
utilisées en médecine traditionnelle.
Dans ce domaine, les animaux se sont montrés plus
savants que les hommes.
Ces plantes, classées sous le nom générique de
Plantes Aromatiques et Médicinales PAM ou
Plantes à Parfum, Aromatiques et Médicinales
PPAM, produisent de petites molécules, qui parce
qu’elles ne participent pas aux processus
physiologiques primaires comme le font les lipides,
les glucides et les acides aminés, sont nommées
métabolites secondaires.
Dès le 5ème siècle, chaque monastère (autarcie)
possédait un carré de jardin (carré des simples)
composé d’au moins seize « simples » estimées
nécessaires à la thérapeutique. On y trouve le
lys, la rue, la tanaisie, la sarriette, la sauge, la
rose, le fenouil, la menthe.
Ces plantes qui sont aromatiques, sédatives
ou curatives peuvent se révéler redoutables!
 Les vertus thérapeutiques des PAM
peuvent varier avec la partie de la plante
utilisée ou encore selon le type de plantes
que l’on associe entre elles.
 Une plante aromatique se différencie des
autres plantes médicinales par la
présence en certains de ses tissus de
principes volatils, odoriférants et
parfumés appelés « essences naturelles,
oléorésine ou gommes ».
II. UTILITÉS DES MÉTABOLITES SECONDAIRES POUR
LES PLANTES
Les métabolites secondaires sont à la source d’odeurs
jouant le rôle à la fois d’attractifs et de répulsifs envers
les prédateurs, de pigments permettant de capter le
rayonnement solaire mais aussi de protéger la plante de
ce rayonnement.
Dangers et menaces pour les plantes:
- Facteurs climatiques;
- virus et bactéries;
- prédateurs
- d’autres plantes concourantes …
Certains insectes introduisent incidemment un virus ou
une bactérie qu’ils véhiculent et le problème est
majeur en l’absence de prédateurs naturels de ces
insectes.
Les parties internes des plantes, riches en nutriments, sont
protégées par une première défense constituée par leurs
tissus de revêtement : de la silice, l’écorce et même des
épines.
Ces défenses peuvent cependant être contournées de
plusieurs manières.
Les plantes interagissent avec les prédateurs de deux
manières: interaction antagoniste ou interaction
mutualiste.
 Interaction antagoniste (défense chimique)
Les plantes peuvent empoisonner leurs ennemis de
plusieurs façons.
De nombreuses plantes contiennent des toxines qui
tuent, ou rendent malades …
Certaines espèces de plantes produisent des glycosides
cyanogènes qui libèrent du cyanure lorsqu’ils sont
ingérés.
La caféine, la nicotine, la cocaïne et la morphine
(alcaloïdes) agissent sur de nombreux processus
cellulaires, la plante peut tuer, surexciter ou
calmer ses prédateurs.
Ces toxines ne nuisent pas à la plante qui les
produit parce qu’elles sont , soit séquestrées
dans des vésicules délimitées par une
membrane; soit elles sont produites sous forme
de métabolites non toxiques tant qu’ils n’ont pas
été métabolisés.
Certaines toxines protègent des plantes vis-à-vis
d’autres plantes. Un signal chimique sécrété par
les racines d’une espèce inhibe la germination
de graines proches ou la croissance de plantes
voisines.
 Interaction mutualiste.
L’un des aspects de l’écologie est la diversité des
interactions entre les espèces.
Ces interactions sont issues d’un processus de l’évolution.
Certaines espèces évoluent parallèlement en s’influençant
mutuellement: la notion de coévolution.
Un des meilleurs exemples de cette notion de coévolution
est la pollinisation. Le pollen étant transporté par une
espèce animale (pollinisateur) d’une plante à l’autre.
C’est une relation du type « donnant-donnant » ou
mutualisme.
La plante « offre » le nectar au pollinisateur qui se couvre
de pollens susceptibles de se déposer lors de la visite
d’une autre plante de la même espèce.
Ce ci favorise la fécondation croisée et assure la diversité
génétique au sein de populations végétales.
Les odeurs, la couleur et/ou à la morphologie,
des fleurs sont utilisées par les plantes pour
attirer les pollinisateurs.
Les métabolites secondaires sont donc utiles
pour attirer les pollinisateurs ou repousser les
agents pathogènes, dégouter les prédateurs et à
protéger les organes vulnérables des plantes
contre les insectes et les microbes.
Les hommes utilisent ces propriétés depuis
l’antiquité et les exploitent pour éviter le
pourrissement des denrées.
Le clou de girofle dont un des principaux
constituants est l’eugénol était employé pour
empêcher les viandes et les plats cuisinés de
moisir.
Si les épices sont toxiques pour les
microbes et les insectes, pourquoi ne le
sont-elles pas pour l’homme aussi?
En fait, elles le sont, mais tout est une
question de quantité de composés toxiques
par rapport à la masse corporelle.
Pour être utilisés à des fins thérapeutiques
ou dans la parfumerie, ces métabolites
secondaires doivent d’abord être extraits
selon des processus spécifiques leur
gardant leurs propriétés sans être altérées.
III. EXTRAITS DES PLANTES MÉDICINALES
a. Méthodes générales d’extraction
i. La macération:
La plante (ou partie de la plante) est laissée
dans le solvant approprié à température
ambiante pendant au moins trois jours.
Le liquide est filtré et accommodé à l’utilisation ou
à la conservation.
« La drogue est en contact avec le solvant à
température ambiante ».
ii. L’infusion:
Le solvant chaud est versé sur le végétal et on
laisse refroidir.
« La drogue est mise en contact avec le solvant à
l’ébullition et on laisse refroidir la suspension »
iii. La digestion:
C’est une forme de macération sous douce ébullition. Elle est
utilisée quand une température modérée n’altère pas la
qualité de l’extrait.
« La drogue est en contact avec le solvant à une température
inférieure au point d’ébullition mais supérieure à la
température ambiante »
iv. La décoction:
Utilisée pour les racines, l’écorce et les tiges des plantes.
Ces parties nécessitent un traitement plus énergétique.
La matière première est portée à ébullition dans un
volume du solvant, jusqu’à réduction d’une partie de ce
dernier (1/4 à 1/3). La solution obtenue est plus
concentrée en constituants solubles.
« La drogue est en contact avec le solvant à la
température d’ébullition »
v. La percolation:
Cette méthode consiste à laisser couler un
solvant généralement chaud sur un lit du
solide finement divisé, afin de dissoudre les
composés solubles qui y sont contenus; la
préparation du café relève de cette
opération. Si le solvant utilisé est l’alcool, on
obtient des teintures.
« le solvant chaud coule sur et à travers la
drogue »
vi. Extraction par soxhlet: (laboratoire)
La matière première finement divisée est placée dans une
cartouche en fibre.
Cette cartouche est placée dans une chambre (timbale)
surmontée d’un réfrigérant.
Le solvant d’extraction est placé dans le ballon. Les
vapeurs de ce solvant se condensent dans le réfrigérant et
viennent imprégner la matière première et extraire les
constituants solubles.
Quand le niveau du solvant dans la timbale du soxhlet
atteint le sommet de la tubulure latérale (siphon) du
soxhlet, il y a siphonage, le liquide chargé en constituants
solubles retourne dans le ballon.
Le même processus se répète plusieurs fois jusqu’à ce que
tous les constituants soient extraits en totalité.
Cette technique a l’avantage d’utiliser peu de solvant pour
extraire le maximum de constituants.
Elle a aussi l’inconvénient de dégrader les substances
sensibles à la chaleur.
 b. Etapes de l’extraction:
 Avant d’entamer toute extraction (toute étude), il faut d’abord
s’assurer de l’identification de la matière végétale et de
déterminer les constituants à extraire et dans quelle partie de
la plante ils se trouvent, ce qui guidera le choix de la méthode
d’extraction.
 Après l’identification de la plante, il faut procéder à un tri de la
matière végétale et d’éliminer toute source de contamination
biologique (autres plantes, insectes ou autres) et aussi
s’assurer que la matière première n’a pas été contaminée
chimiquement (pesticides, herbicide …).
 On procédera alors à la découpe de la matière végétale
grossièrement ou en menus morceaux ou la piler (écorce,
racines, graines …).
 Après cela, cette matière est placée dans un récipient que
l’on peut fermer hermétiquement si nécessaire.
 L’étape suivante est de verser le solvant sur la matière
végétale en quantité suffisante pour l’opération.
 Le solvant doit être bouillant dans le cas d’une infusion
et froid dans le cas de la macération, la digestion ou la
décoction.
 Dans le cas de la décoction, une fois le solvant froid
ajouté, on procède alors au chauffage progressif
jusqu’à l’ébullition.
 A la fin de l’opération de l’extraction, la phase liquide
est transvasée, le solide (marc) restant est pressé pour
en faire extraire le maximum du liquide. Les liquides
ainsi obtenus sont rassemblés et clarifiés par filtration
ou décantation.
La dernière étape consiste à éliminer le solvant pour
obtenir l’extrait final concentré.
IV. EXTRAITS DES PLANTES AROMATIQUES
a. Définitions:
i. Arôme: (grec aroma: parfum)
• Emanation qui s’exhale de certaines substances végétales
ou animale;
• Principe odorant agréable de certaines substances
végétales;
ii. Substances organoleptiques capables d’affecter un récepteur
sensoriel. Odeur : Impression particulière que certains
corps produisent sur l’organe de l’odorat par leurs
émanations volatils.
iii. Goût: celui des sens par lequel l’homme et les
animaux perçoivent les saveurs.
iv. Saveur: qualité qui est perçue par le sens du goût.
 Le mot arôme désigne l’ensemble des composés
organiques volatils responsables de la perception
d’arôme, alors que dans le cas des odeurs, on
parlera de parfum (Fragrance).
Les constituants des arômes sont des molécules
simples, de faible masse moléculaire (M<400) et
dont la tension de vapeur, à la pression
atmosphérique et la température ambiante, est
suffisamment élevée pour qu’elles se retrouvent
en partie à l’état de vapeur dans l’atmosphère
gazeuse et puissent au contact de
 Flaveur: Ensemble des sensations (odeur, goût,
…) ressenties lors de la dégustation d’un aliment.
 Fragrance: Odeur suave, parfum agréable; la
muqueuse olfactive provoquer un stimulus.
c. Aromate :
Plante ou substance d’origine végétale, odoriférante et
utilisée dans les domaines de la parfumerie, de la
médecine ou de la cuisine;
 En parfumerie: patchouli, rose, lavande, santal;
 En médecine: sauge, thym,
 En cuisine: badiane, laurier, sauge, cannelle.
Rq: Toutes les plantes médicinales ne sont pas des aromates; il en
existe de nombreuses qui ne sont pas parfumées: le saule, la
verveine officinale…
d. Les extraits aromatiques:
i. Pommade:
On dit aussi pommade florale. C’est un corps gras parfumé
obtenu à partir de fleurs soit par « enfleurage à froid »:
diffusion des constituants odorants de fleurs dans la
graisse; soit par « enfleurage à chaud »: digestion ou
immersion des fleurs dans la graisse fondue.
ii.Résinoïdes:
Les résinoïdes sont des produits obtenus à partir d’une matière
première sèche d’origine naturelle.
Ils sont composés essentiellement de matières non volatiles et
sont le résultat de l’extraction à l’aide de solvants organiques
non aqueux et volatils ou de fluides supercritiques à partir des
exsudats suivants:
Matières résineuses végétales naturelles desséchées non
cellulaires (oléorésine ou oléo-gomme, résines naturelles)
•Matières résineuses animales naturelles desséchées:
(castoréum, civette ou musc;)
Exsudat: Bot. Suc perlant à la surface d’une feuille, d’une tige,
chez certaines plantes.
Les oléorésines d’extraction, connues également sous le nom
d’oléorésines préparées ou d’oléorésine d’épices, sont des
produits obtenus à partir de matières végétales naturelles
brutes cellulaires (épices ou plantes aromatiques) par
extraction à l’aide de solvants organiques ou de fluides
supercritiques.
Ces extraits contiennent des principes odoriférants volatils
(Essences naturelles) et des principes aromatisants non
volatils (résines, huiles grasses, constituants âcres) qui
définissent l’odeur ou la saveur de l’épice ou la plante
aromatique.
La teneur en Essences aromatiques de ces oléorésines
d’extraction varie dans de forte proportions suivant l’épice
ou la plante aromatique dont elles proviennent.
iii. La concrète:
Les essences naturelles ont la propriété de se
solubiliser dans la plupart des solvants organiques
en particulier les hydrocarbures aliphatiques.
Les solvants purs ou en mélange sont choisis en
fonction de leur polarité, leur réactivité et la
possibilité d’être recyclés. Ils doivent être non
miscibles avec l’eau à cause de la teneur élevée
en eau des matières végétales fraîches.
Les solvants utilisés sont le pentane, l’hexane, l’éther de
pétrole, l’éther di-éthylique et aussi le chlorure de
méthylène et des carbures fluoro-chlorés.
L’extraction directe des plantes fraîches avec ces
solvants entraîne divers constituants avec les Essences
naturelles. L’extrait récupéré est appelé « concrète », il
contient des pigments, des matières grasses et d’autres
composés.
La matière végétale à extraire est immergée dans le
solvant ou vient y plonger périodiquement. Le solvant va
solubiliser les cires naturelles contenues dans les
cellules de la plante.
Lorsque l’extraction est terminée, on décante l’eau
entrainée et la solution parfumée est concentrée par
distillation. Les concrètes obtenues renferment, outre les
éléments odorants, des cires végétales insolubles dans
l’éthanol.
iv. Absolue ou « essence absolue »:
L’absolue est une matière odorante naturelle obtenue
à partir de concrètes ou de résinoïdes. Après dilution
de ces dernières dans l’alcool éthylique (lavage), les
solutions alcooliques sont le plus souvent glacées à
des températures entre 0 et -15°C. La cire qui se
forme est filtrée et l’alcool est éliminé par distillation
sous pression réduite.
Les absolues sont généralement des liquides visqueux
très concentrés qui peuvent dans certains cas devenir
solides.
L’intérêt de l’absolue est d’être soluble dans l’alcool.
L’absolue peut être mélangée à d’autres absolues pour
créer un parfum original. Tout le talent du parfumeur
sera d’associer des senteurs différentes pour obtenir
un produit original.
 V. LES HUILES ESSENTIELLES
Les molécules constituant les métabolites secondaires
sont de petite taille, de masse faible par rapport aux
molécules des métabolites primaires.
Parmi les métabolites secondaires, les « Huiles
Essentielles » sont les plus étudiées et présentent un
grand intérêt commercial.
a. Les Huiles essentielles selon les normes AFNOR.
Une norme désigne un ensemble de spécifications
(caractéristiques essentielles) décrivant un objet, un
être ou une manière d’opérer. Il en résulte un principe
servant de règle et de référence technique.
A priori une norme n’est pas obligatoire, son adhésion
est un acte volontaire. Mais certaines sont rendues
obligatoires par un texte réglementaire ou décret de
loi.
Les normes sont élaborées par des
organismes dont voici quelques exemples:
 l’ISO (International Organization for Standardization)
1947;
 la CEI (Commission Electrotechnique Internationale);

 l’UIT (Union Internationale de Télécommunications);

 le CEN (Comité Européen de Normalisation) 1961;

 L’AFNOR (Association Française de Normalisation).

L’AFNOR est subdivisée en 31 bureaux (ou plus!)de

normalisation sectoriels composés de plus
20 000 experts.
b. Définition de l’Huile Essentielle.
D’après la pharmacopée Européenne, une Huile
Essentielle est « un produit odorant,
généralement de composition complexe, obtenu
à partir d’une matière végétale botaniquement
définie, soit par entrainement à la vapeur d’eau,
soit par distillation sèche, soit par un procédé
mécaniquement approprié sans chauffage.
L’Huile Essentielle est le plus souvent séparée de
la phase aqueuse par un procédé physique
n’entraînant pas de changement significatif de sa
composition.
La matière première végétale peut être fraîche,
flétrie (fanée), sèche, entière, contusée ou
pulvérisée, à l’exception des fruits du genre citrus
qui sont toujours à l’état frais ».
L’AFNOR (Norme NF T75-006) la définit comme étant «
Le produit obtenu à partir d’une matière première
végétale, soit par entraînement à la vapeur soit par
distillation sèche. L’huile essentielle est ensuite séparée
de la phase aqueuse par des procédés physiques ».
Il existe un recueil de normes AFNOR destiné aux
producteurs d’Huiles Essentielles, aux laboratoires, aux
fabricants de cosmétiques et à certaines industries
alimentaires; y figurent notamment les normes relatives
au vocabulaire, à l’emballage et étiquetage, à
l’échantillonnage, aux méthodes d’analyses et aux
spécifications pour les Huiles Essentielles.
Parmi ces normes, on trouve les profils
chromatographiques permettant le contrôle de la qualité
et de l’authenticité des Huiles Essentielles ainsi que les
chromatogrammes types.
c. Exemples de Plan de monographie:
Plan d’une monographie d’une drogue végétale
1. Nomenclature: titre français et titre latin
2. Définition:
• État de la drogue;
• Dénomination scientifique latine complète;
• Partie utilisée;
• Teneur minimale en constituants quantifiés et en cas de
mélange teneur totale.
3. Caractères
• Caractères organoleptiques
• Caractères botaniques (macroscopique et microscopique)
4. Identification:
 Caractères macroscopiques
 Caractères microscopiques
 CCM (pour l’identification)
5. Essai:
 Cendres totales
 Cendres insolubles dans HCl
 CCM (falsification, identification)
 CPG ou CL( limite en constituants, contrôle de certains constituants)
 Éléments étrangers
 Indice de gonflement
 Indice d’amertume
 Matières extractibles
 Perte à la dessiccation
 Teneur en eau
 Essais spécifiques
6. Dosage:
 Spectrophotométrie
 Détermination des tanins
 Titrage volumétrique
 Détermination des H.E.
 CL et CPG.
7. Conservation
8. Réactifs
Plan d’une monographie d’une Huile
Essentielle:
1. Définition;
2. Caractères
3. Identification:
 CCM
 Chromatographie;
4. Essais:
 Densité;
 Indice de réfraction;
 Angle de rotation optique;
 Profils chromatographiques.
5. Conservation
EXEMPLE LE THYM
 Définition
Le Thym est constitué par les feuilles et les
fleurs entières, détachées des tiges
préalablement séchées de Thymus vulgaris L.
ou de Thymus zygis L., ou par un mélange de
ces 2 espèces.
Il contient au minimum 12 ml/kg d'H. E et au
minimum 0,5 % m/m de phénols volatils,
exprimés en thymol (C10 H14 0 Mr 150,2), les
deux teneurs étant calculées par rapport à la
drogue anhydre.
 Identification :
A. La feuille de Thymus vulgaris a généralement
une longueur de 4 mm à 12 mm et une largeur de
3 mm au maximum ; elle est sessile ou très
brièvement pétiolée. Le limbe est coriace, entier,
lancéolé à ovale, recouvert sur les 2 faces d'un
indument gris à gris-vert, le bord est fortement
enroulé vers la face abaxiale.
La nervure médiane est déprimée à la face
adaxiale et très proéminente à la face abaxiale. Le
calice est vert, souvent parsemé de violet,
tubuleux ; il comporte à son extrémité 2 lèvres
dont la supérieure est recourbée et se termine en
3 lobes, et dont l'inférieure, plus longue, a 2 dents
ciliées.
Le tube du calice, après floraison, est obturé par
une couronne de poils longs et raides. La corolle,
environ 2 fois plus longue que le calice, est le
plus souvent brunâtre à l'état desséché, et
faiblement bilabiée.
La feuille de Thymus zygis a généralement une
longueur de 1,7 mm à 6,5 mm et une largeur de
0,4 mm à 1,2 mm, elle est aciculée à linéaire-
lancéolée et ses bords sont fortement enroulés
vers la face abaxiale. Le limbe est concolore,
vert à gris-vert, avec une nervure médiane
colorée parfois en violet ; ses bords, en
particulier au niveau de la partie basale, sont
garnis de longs poils blancs. Les fleurs
desséchées sont très semblables à celles de
Thymus vulgaris.
Réduisez le Thym en poudre. La poudre des 2 espèces est
vert-gris à brun-vert. Examinez au microscope en utilisant
de la solution d'hydrate de chloral R. Les épidermes des
feuilles présentent des cellules à parois anticlinales
sinueuses, à épaississements en forme de chapelet et des
stomates de type diacytique; de nombreux poils sécréteurs
composés de 12 cellules sécrétrices dont la cuticule
commune est soulevée par la sécrétion et affecte la forme
d'une vésicule globuleuse à ovoïde ; des poils glanduleux à
pédicelle unicellulaire et à tête globuleuse à ovoïde, des
poils tecteurs de l'épiderme adaxial, communs aux 2
espèces, à paroi verruqueuse, en forme de dents pointues,
des poils tecteurs verruqueux de l'épiderme abaxial, de
plusieurs types : unicellulaires dressés ou légèrement
incurvés et bicellulaires ou tricellulaires, articulés, le plus
souvent coudés (Thymus vulgaris) - des poils bicellulaires
ou tricellulaires, plus ou moins dressés (Thymus zygis).
 Les fragments du calice sont recouverts par de
nombreux poils articulés, unisériés, formés de 5 ou 6
cellules, à parois faiblement striées. Les fragments de la
corolle portent de nombreux poils tecteurs unisériés,
souvent collabés et des poils sécréteurs composés
généralement de 12 cellules. Les grains de pollen,
relativement rares, sont sphériques, lisses, à 6 pores
germinatifs en fente et mesurent 35 μm environ de
diamètre. La poudre de Thymus zygis contient, en outre,
de nombreux faisceaux épais de fibres provenant des
nervures principales et des fragments de tiges.
 Opérez par chromatographie sur couche mince (2.2.27)
en utilisant une plaque recouverte d'un gel de silice
approprié contenant un indicateur de fluorescence dont
l'intensité est maximale à 254 nm.
 Solution à examiner: A 1,0 g de Thym pulvérisé (355),
ajoutez 5 ml de chlorure de méthylène R et agitez
pendant 3 min. Filtrez sur 2 g environ de sulfate de
sodium anhydre R. Utilisez le filtrat comme solution à
examiner.
 Solution témoin: Dissolvez 5 mg de thymol R et 10 μl
de carvacrol R dans 10 ml de chlorure de méthylène
R.
Le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner
présente, un peu au-dessus de la bande due au thymol,
une autre bande d'atténuation de fluorescence,
beaucoup plus marquée et quelques bandes
d'atténuation de fluorescence dans le tiers inférieur du
chromatogramme. Pulvérisez 10 ml de solution
d'aldéhyde anisique R pour une plaque de 200 mm de
côté.
Déposez séparément sur la plaque, en bandes, 20
μl de chaque solution. Développez 2 fois sur un
parcours de 12 cm avec du chlorure de méthylène
R. Laissez sécher la plaque à l'air. Examinez en
lumière ultraviolette à 254 nm. Marquez les zones
d'atténuation de fluorescence.
Les chromatogrammes obtenus avec la solution
témoin et avec la solution à examiner présentent
en leur milieu une bande d'atténuation de
fluorescence due au thymol.
Chauffez la plaque à 100-105°C pendant 10 min. Le
chromatogramme obtenu avec la solution témoin
présente en son milieu une bande rose-brun
correspondant au thymol et, immédiatement au-dessous,
une bande violet clair correspondant au carvacrol.
Le chromatogramme obtenu avec la solution
à examiner présente en son milieu ces 2
bandes plus ou moins prononcées, en
fonction de l'espèce examinée. Entre ces
bandes et la ligne de départ, 4 bandes
d'intensité similaire sont visibles ; par ordre
décroissant de la valeur R (Rf) ces bandes
sont : rose, violet (cinéole et linalol), brun-
gris (bornéol) et bleu-violet. Près du front du
solvant, une bande intense rouge-violet à
violet-gris est visible. D'autres bandes,
proches de la ligne de départ, sont
également visibles.
 Essai :
Eléments étrangers (2.8.2). Le Thym ne contient
pas plus de 10 pour cent de tiges dont le
diamètre ne dépasse pas 1 mm et dont la
longueur ne dépasse pas 15 mm. Des feuilles
portant de longs poils à leur base et faiblement
pubescentes aux autres parties, ne sont pas
présentes (Thymus serpyllum L.).
Teneur en eau (2.2.13). Déterminée par
entraînement sur 20,0 g de Thym pulvérisé
(355), la teneur en eau n'est pas supérieure à
10,0 pour cent.
Cendres totales (2.4.16). Le taux des cendres
totales n'est pas supérieur à 15,0 pour cent.
 Cendres insolubles dans l'acide
chlorhydrique (2.8.1). Le taux des cendres
insolubles dans l'acide chlorhydrique n'est
pas supérieur à 3,0 pour cent.
 Dosage :
 Huile Essentielle. Effectuez la détermination des
Huiles Essentielles dans les drogues végétales
(2.8.12). Utilisez 30,0 g de Thym, un ballon de 1
000 ml et 400 ml d'eau R comme liquide
d'entraînement. Distillez à un débit de 2 ml/min
à 3 ml/min pendant 2 h, sans xylène R dans le
tube gradué.
 Phénols. En prenant soin de transférer le moins
possible d'eau R, transvasez l'Huile Essentielle
obtenue lors du dosage des Huiles Essentielles dans
un ballon jaugé de 50 ml à l'aide de petites quantités
d'alcool à 90 pour cent V/V R en rinçant le tube
gradué de l'appareil et complétez à 50,0 ml avec le
même solvant. A 5,0 ml de solution, ajoutez 40 ml
d'alcool à 90 pour cent V/V R et complétez à 100,0
ml avec de l'eau R. Placez 5,0 ml de cette solution
dans une ampoule à décantation et ajoutez 45 ml
d'eau R, 0,5 ml d'ammoniaque diluée R2 et 1 ml
d'une solution d'aminopyrazolone R à 20 g/l.
Mélangez et ajoutez 4 ml d'une solution récemment
préparée de ferricyanure de potassium R à 20 g/l et
mélangez à nouveau. Laissez reposer pendant 5
min, ajoutez 25 ml de chlorure de méthylène R et
agitez.
 Séparez la couche de chlorure de méthylène et filtrez
sur un tampon de coton, imbibé de chlorure de
méthylène R, dans un ballon jaugé de 100 ml. Agitez la
couche aqueuse avec 2 fois 25 ml de chlorure de
méthylène R et avec 10 ml de chlorure de méthylène R.
Filtrez les couches de chlorure de méthylène sur le
tampon de coton, rincez le tampon avec du chlorure de
méthylène R et complétez à 100,0 ml avec le même
solvant. Mesurez l'absorbance (2.2.25) à 450 nm en
utilisant le chlorure de méthylène R comme liquide de
compensation.
 Calculez la teneur pour cent en phénols,
exprimée en thymol, en prenant 805 comme
absorbance spécifique.
 Conservation
 En récipient bien fermé, à l'abri de la lumière et de
l'humidité.
HUILE ESSENTIELLE :
Définition
 L'Huile Essentielle de Thym est obtenue par
entraînement à la vapeur d'eau des parties
aériennes fleuries fraîches de Thymus vulgaris
L., de Thymus zygis Loefl. ex L. ou d'un mélange
des 2 espèces.
 Caractères
 Liquide mobile, limpide, de couleur jaune à
brun-rouge très foncé et d'odeur caractéristique,
aromatique, épicée, rappelant celle du thymol,
miscible à l'éthanol, à l'éther et à l'éther de
pétrole.
 Identification
 Première identification : B.
 Seconde identification : A.
 A. Opérez par chromatographie sur couche mince
(2.2.27) en utilisant une plaque recouverte d'un gel
de silice approprié.
 Solution à examiner. Dissolvez 0,2 g d'Huile
Essentielle de Thym dans du pentane R et complétez
à 10 ml avec le même solvant.
 Solution témoin. Dissolvez 0,15 g de thymol R, 25 μl
de terpinén-4-ol R et 40μl de linalol R dans de
pentane R et complétez à 10 ml avec le même
solvant.
 Déposer séparément sur la plaque, en bandes, 20
mg de chaque solution.
 Développer sur un parcours de 15 cm avec un
mélange de 5 volumes d'acétate d'éthyle R et de 95
volumes de toluène R. Laissez sécher la plaque à
l'air. Pulvérisez de la solution d'aldéhyde anisique R.
Chauffez la plaque à 100-105 °C pendant 5 min à
10 min tout en l'observant. Examinez les
chromatogrammes à la lumière du jour. Le
chromatogramme obtenu avec la solution à examiner
présente trois bandes semblables quant à leur
position et leur coloration à celles du
chromatogramme obtenu avec la solution témoin :
une bande violette correspondant au terpinén-4-ol,
une bande violette correspondant au linalol et une
bande rose-brun correspondant au thymol et
immédiatement dessous, une bande violet pâle
correspondant au carvacrol.
 Le chromatogramme obtenu avec la solution à
examiner présente également une bande
importante, violette, au front du solvant
(hydrocarbures).
Examinez les chromatogrammes obtenus dans
l'essai «Profil chromatographique».
Les pics principaux du chromatogramme
obtenu avec la solution à examiner sont
semblables, quant à leur temps de rétention,
aux pics du chromatogramme obtenu avec la
solution témoin.
 Essai
 Densité relative (2.2.5). 0,915 à 0,935.
 Indice de réfraction (2.2.6). 1,490 à 1,505.
 Profil chromatographique. Opérez par
chromatographie en phase gazeuse (2.2.28).
 Solution à examiner. Huile essentielle de thym à
examiner.
 Solution témoin : Dissolvez 0,15 g de β myrcène R,
0,1 g de γ terpinène R, 0,1 g de p-cymène R, 0,1 g de
linalol R, 0,2 g de terpinén-4-ol R, 0,2 g de thymol R
et 0,05 g de carvacrol R dans 5 ml d'hexane R.
 La chromatographie peut être réalisée en utilisant
 une colonne de silice fondue, d'une longueur de 25 m à
60 m et d'un diamètre intérieur de 0,3 mm environ,
recouverte de macrogol 20 000 R,
 comme gaz vecteur, de l'hélium pour chromatographie R,
 un détecteur à ionisation de flamme,
 un rapport de division 1 : 100,
 en maintenant la température de la colonne à
60 °C pendant 15 min, puis en l'augmentant
de 3 °C par min jusqu'à 180 °C et en la
maintenant à 180 °C ; en maintenant la
température de la chambre à injection à 200
°C environ et celle du détecteur à 220 °C.
 Injectez 0,2 μl environ de solution témoin.
Lorsque les chromatogrammes sont enregistrés
dans les conditions prescrites, les constituants
éluent dans l'ordre donné pour la préparation
de la solution témoin. Notez les temps de
rétention de ces substances.
 L'essai n'est valable que si
 le nombre de plateaux théoriques calculé sur le pic
du p-cymène à 80 °C n'est pas inférieur à 30 000,
 la résolution entre les pics correspondant
respectivement au thymol et au carvacrol n'est pas
inférieure à 1,5.
 Injectez 0,2 μl environ de solution à examiner. A
l'aide des temps de rétention déterminés avec
le chromatogramme obtenu avec la solution
témoin, localisez sur le chromatogramme
obtenu avec la solution à examiner, les
composants de la solution témoin. Ne tenez
pas compte du pic dû à l'hexane.
 Déterminez la teneur pour cent de ces composants
par le procédé dit « de normalisation ».
 Ces teneurs sont comprises entre les valeurs
suivantes :
 β-Myrcène 1,0 pour cent à 3,0 pour cent
 γ Terpinène 5,0 pour cent à 10,0 pour cent
 p-Cymène 15,0 pour cent à 28,0 pour cent
 Linalol 4,0 pour cent à 6,5 pour cent
 Terpinén-4-ol 0,2 pour cent à 2,5 pour cent
 Thymol 36,0 pour cent à 55,0 pour cent
 Carvacrol 1,0 pour cent à 4,0 pour cent
 Conservation
 En récipient étanche et bien rempli, à l'abri de la
lumière et de la chaleur.
d. Localisation des Huiles Essentielles:
Pour certains auteurs, il est important de
distinguer essences naturelles et huiles
essentielles.
 Essences naturelles; sécrétions naturelles
élaborées par l’organisme végétal, contenues
dans divers types d’organes producteurs
variables selon la partie de la plante
considérée.
 Huile essentielle: extrait naturel de matières
premières d’origine végétale obtenu par
distillation sèche ou entrainement à la vapeur
d’eau.
Les essences naturelles se retrouvent
exclusivement chez les spermaphytes: familles des
conifères, Lamiacées, Myrtacées, Apiacées,
Lauracées, Rutacées et Astéracées.
Toutes les parties des plantes aromatiques peuvent
contenir de l’Huile essentielle.
o Les fleurs: (Oranger (néroli); rose; lavande; girofle
(bouton floral), ou les bractées (ylang ylang).
o Les feuilles: eucalyptus; menthe; thym; laurier;
sarriette; sauge; aiguilles de pin et sapin;
o Les organes souterrains: racines (vétiver);
rhizomes (gingembre; jonc).
o Les fruits: le fenouil, anis, épicarpes des citrus;
o Les graines: noix de muscade, coriandre;
o Le bois et les écorces: cannelle, santal, bois de rose.
Les Essences naturelles (H.E.) sont produites par
diverses structures spécialement différenciées
dont le nombre et les caractéristiques sont très
variables:
 Les poils sécréteurs épidermiques rencontrés souvent
chez les lamiacées, géraniacées et verbénacées. Ils
produisent les essences dites superficielles;
 Les organes sécréteurs sous-cutanés comprenant des
cellules et des poches sécrétrices qui sont
généralement disséminées au sein du tissu végétal
chez les Myrtacées ainsi que des canaux sécréteurs
chez les Apiacées.
e. Composition chimique des Huiles
Essentielles.
Les molécules constituantes des huiles
essentielles proviennent de deux grandes
voies métaboliques: la voie des
mévalonates et shikimates.
La première voie comprend les terpènes qui
sont formés d’unités d’isoprène (2-
méthylbuta-1,3-diène) et classés en:
- monoterpènes (C10) qui peuvent aussi être
monocycliques ou bicycliques;
H3C H3C H3C
CH3
CH3 CH3
H3C H2C OH H3C H3C
OH HO

Linalol Géraniol Nérol

H3C H3C
CH2 CH2
CH2 CH3 CH3 CH2

Ocimène Myrcène
 CH3 CH2
CH3 CH3
O

OH

H3C CH3 H3C CH3

H3C CH2 H3C CH3 H3C CH3

Limonène Carvone Menthol -Phellendrène

-Phellendrène

CH3 CH2
H3C CH3
CH3 CH3
H3C H3C CH3
O
H3C H3C
CH2
-Pinène
-Pinène Camphène Camphre
- les sesquiterpènes (C15); caryophyllène
(essence de clou de girofle), cédrol (alcool
tricyclique qui donne au bois de cèdre son
odeur caractéristique); les humulènes, etc
CH3
CH3 CH3
H3C
H3C
OH

CH3 H3C H3C

CH3 CH2
H3C
CH3 CH3

Cédrol Humulène Caryophylène

H3C OH

CH3 CH3 CH3

Phytol
- Les diterpènes (C20); ces composés à point
d’ébullition élevé se rencontrent surtout
dans les résines (résines des conifères;
sapins, pins, épinettes, …)
CH3

CH3
CH3

H3C COOH

Acide abiétique
 La voie des shikimates comprend les composés en
C6-C3 (aldéhyde cinnamique, eugénol, …) et les
composés en C6-C1 (Vanilline).
O
HO
CH2
H3C O

Eugénol Aldéhyde cinnamique

CH3
CH3
OH

OH

H3C CH3
H3C CH3

Thymol Carvacrol

O CH3
O
O
OH H2C
O

Vanilline Safrole
f. Qualité des Huiles Essentielles:
La qualité d’une Huile Essentielle dépend de
l’état de maturation de la matière première et
de sa provenance (feuille, fruits, rhizomes); du
lieu de récolte (conditionne sa composition
chimique), du procédé d’obtention et des
conditions de conservation.
g. Propriétés physico-chimiques des H.E.
Les Huiles Essentielles sont très volatiles et
photolabiles. Elles sont généralement liquides
à température ambiante. Elles sont
généralement incolores ou jaunes pâles,
toutefois, des H.E. colorées existent (H.E. de
camomille: bleue; H.E. de cannelle: rouge; H.E.
absinthe: verte).
 La majorité des H.E. est moins dense que l’eau
mais il en existe quelques unes plus denses.
(Densité varie de 0,75 à 1,096)
Elles possèdent des températures d’ébullition
variant de 160°C à 240°C. Elles possèdent
également des indices de réfraction élevés,
ainsi que des pouvoirs rotatoires (molécules
chirales).
Les Huiles Essentielles dissolvent les graisses,
l’iode et le soufre.
h. Extraction par expression:
L’expression est une technique utilisée pour
recueillir l’H.E. contenue dans la peau ou
zeste des hespéridés ou agrumes (orange,
citrons, mandarines, pamplemousse,
bergamote).
 Les zestes sont pressés à froid à l’aide d’un procédé
mécanique (cylindres équipés de lames) afin que les
vésicules contenant l’Huile Essentielle éclatent.
Les molécules de l’H.E. sont drainées par l’eau et
centrifugées, on obtient l’H.E. d’agrumes.
i. Extraction par enfleurage:
Cette technique est basée sur la capacité des corps
gras à absorber les fragrances et elle peut se réaliser
à froid ou à chaud.
L’enfleurage à froid convient pour les fleurs fragiles
dont l’odeur disparait rapidement après la cueillette.
Les fleurs sont disposées dès leur récolte sur une
couche de graisse dans laquelle elles abandonnent
leur H.E. La matière grasse était, auparavant, de
l’huile végétale ou un mélange de graisse de porc et
de graisse de bœuf épuré et stabilisé avec de
benzoïn (résine).
Mais la vaseline se substitue peu à peu aux
huiles. Les fleurs sont laissées pour une
durée variable, retirées puis remplacées par
de nouvelles fleurs jusqu’à ce que l’élément
gras soit saturé de parfum. La graisse est
ensuite lavée à l’alcool et l’évaporation de ce
dernier conduit à une pommade appelée «
absolue ».
L’enfleurage à chaud est identique mais
avec de la graisse chauffée au bain marie et
après filtration et évaporation de l’éthanol,
on obtient une crème parfumée.
j. Extraction par hydro-distillation:
L’entraînement à la vapeur et l’hydro-
distillation sont deux procédés d’extraction
apportés par la civilisation arabe au IXème
siècle. L’appareil utilisé pour ces opérations
est l’alambic.
Pour l’hydro-distillation, la matière première
végétale est immergée dans l’eau, et
l’ensemble est porté à ébullition à pression
atmosphérique. La distillation peut s’effectuer
avec ou sans recyclage, dans l’alambic de
l’eau recueillie à la sortie de l’appareil après
séparation de l’H.E.
Le chauffage permet la formation de la vapeur
d’eau qui détruit les cellules végétales, libère
les molécules contenues et entraîne les plus
volatiles en les séparant du substrat
cellulosique.
La vapeur d’eau entraîne ainsi un mélange
d’eau et de molécules organiques. Il s’agit de la
formation d’un azéotrope entre l’eau et chacun
des constituants du mélange.
L’évaporation de ces métabolites secondaires
se fait à une température d’ébullition inférieure
à celle de chaque composé et à celle de l’eau.
Ainsi, des substances possédant des points
d’ébullition assez élevés peuvent être extraites.
Le mélange azéotropique se condense dans le
serpentin de l’alambic avant d’être récupéré
dans un essencier. Les parties insolubles dans
l’eau de condensation sont décantées et en
raison de sa faible densité, l’H.E. se place au
dessus de la phase aqueuse.
La phase aqueuse contenant les composés
hydrosolubles est appelée hydrolat ou eau
florale.
L’hydrodistillation
constitue la technique
la plus utilisée et la
plus facile à mettre en
œuvre pour la
production d’H.E. elle
est aussi la plus
rentable.
Elle peut être utilisée
au laboratoire avec un
appareil de type
Clevenger.
k. Facteurs produisant l’altération des H.E.
Au cours de l’hydrodistillation, le milieu aqueux
possédant un pH compris entre 4 et 7 (résultat
de l’immersion du matériel végétal) peut
atteindre occasionnellement des valeurs
inférieures à 4 pour certains fruits.
Les constituants de l’essence native (naturelle)
sont soumis aux effets combinés de l’acidité et
de la chaleur et peuvent subir des conversions
chimiques.
L’Huile Essentielle récupérée peut être un
produit différent sensiblement de l’essence
originelle, si l’ébullition est longue et le pH faible.
Dans ces conditions, les constituants de l’huile
essentielle font l’objet de réactions chimiques
diverses.
Hydrolyse, déprotonation, hydratation et
cyclisation sont catalysées par des métaux
présents à l’état de trace dans la plante,
provoquant ainsi des transformations
chimiques des constituants.
L’hydrolyse d’esters est la première réaction qui
se produit durant le chauffage du végétal. Elle
conduit à la formation d’acides organiques qui
à leur tour catalysent les réactions de
cyclisation et de déshydratation.
En exemple, des modifications chimiques du Sabinène
ont été observées. Des études ont montré qu’en milieu
acide dilué, ce composé se transforme en terpinèn-4-ol.
Le réarrangement de ce composé produit aussi l’-
terpinène, le -terpinène et du terpinolène.
CH2

H3C CH3

CH3 CH3 CH3

CH3

OH

H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3

terpinène terpinène terpinolène terpinèn-4-ol

VI. MÉTHODES D’IDENTIFICATION CHIMIQUE DES
HUILES ESSENTIELLES
L’analyse des huiles essentielles comporte
généralement plusieurs séquences :
La première séquence consiste à analyser les huiles
essentielles par Chromatographie en Phase gazeuse
(CPG) ; cette technique chromatographique permet
l’individualisation des constituants, leur
quantification et le calcul de leurs indices de
rétention (Ir), puis à les analyser par le couplage « en
ligne » d’une technique chromatographique,
généralement la CPG, avec une technique
d’identification spectrale, généralement la
spectrométrie de masse (SM).
L’identification est ensuite réalisée par
comparaison des indices de rétention (Ir) et des
données spectrales (spectres de masse) des
constituants individualisés avec les
caractéristiques de produits de référence
contenus dans des bibliothèques de spectres.
Une deuxième séquence est mise en œuvre
lorsque l’huile essentielle est complexe ou qu’elle
contient des composés pouvant co-éluer ou
encore lorsque l’analyse est réalisée dans une
optique de recherche.
Un fractionnement de l’huile essentielle est alors
effectué, le plus souvent par chromatographie
liquide sur colonne ouverte de silice ou d’alumine.
Les fractions obtenues sont ensuite analysées de la
façon décrite dans la première séquence. Cette
étape est à privilégier lorsque l’on veut étudier les
différentes familles de composés (esters, alcools,
cétones…).
Enfin, une troisième séquence peut être mise en
œuvre lorsqu’un ou plusieurs constituants de l’huile
essentielle sont inconnus des bibliothèques de
comparaison et qu’ils ne sont pas décrits dans la
littérature.
Il est alors nécessaire de les purifier par distillation
fractionnée ou par des techniques
chromatographiques préparatives telles la
Chromatographie sur Couche Mince (CCM), la
Chromatographie liquide sur Colonne ouverte (CC),
la Chromatographie Liquide Haute Performance
(CLHP) ou encore la Chromatographie en Phase
Gazeuse Préparative (CGP).
L’objectif est d’aboutir à leur identification
structurale par les techniques spectroscopiques
usuelles : (RMN- 1H) et (RMN- 13C), SM, IRTF, etc.
Une nouvelle voie d’analyse est le recours à la RMN
du carbone-13 et à la spectrométrie Infra rouge à
transformées de Fourier (IRTF) sur mélange.
A- Chromatographie en phase gazeuse
monodimensionnelle.
La CPG est la méthode de référence dans
l’analyse des huiles essentielles et des COVs
(composés organiques volatils); elle permet
l’analyse de mélanges qui peuvent être très
complexes de nature et de volatilité très
variées.
La CPG se base sur la répartition des solutés
dans deux phases: Phase stationnaire (PS) –
remplissage de la colonne- et phase mobile
(PM) - gaz vecteur.
La constante d’équilibre de cette répartition est
appelée rapport de distribution k (UICPA).
k est égale au rapport des concentrations du
soluté dans les deux phases:
k(A) = [A]stat / [A]mob

Les relations de la thermodynamique

s ’appliquent aux équilibres de distribution.
∆G° = -RT Ln(k)
Les temps de rétention peuvent donner une
information sur la nature des molécules et les
aires des pics fournissent une quantification
relative. L’identification d’une substance peut
donc être facilité par la connaissance de son
temps de rétention.
Une meilleure information peut être obtenue grâce
à l’utilisation des indices de rétention, mesurés
sur les colonnes apolaires et polaires, qui sont
plus fiables que les temps de rétention.
Ils sont calculés à partir d’une gamme d’étalon
d’alcanes linéaires ou plus rarement d’esters
méthyliques linéaires.
Le calcul peut se faire pour une expérimentation à
température constante par interpolation
logarithmique: indice de KOVATS (I), ou en
programmation de température par interpolation
linéaire: indice de VAN DEN DOOL et KRATZ (Ir).
KOVATS, a proposé l’indice de rétention comme
paramètre d’identification des solutés. Le
chromatogramme en régime isotherme d’un
mélange d’alcanes linéaires montre que les
log(t’R) croissent en fonction du nombre n
d’atomes de carbone.
Par définition I(n-alcane) = 100* nombre d’atomes
du carbone: (I = 100*n), indépendamment du
remplissage de la colonne, de la température T et
des autres conditions de chromatogramme.
I( soluté) peut être
obtenu à partir d’un
mélange du soluté et
d’au moins deux
alcanes normaux
(hydrocarbures
aliphatiques linéaires
saturés CnH2n+2) qui
encadrent le soluté.
B- Chromatographie en phase gazeuse couplée à
l’olfactomètre (CPG/O)
Les huiles essentielles obtenues renferment très
souvent des centaines de composés volatils. Le
couplage CPG/O combine la séparation des
composés volatils par CG avec l’évaluation
olfactive (utilise le nez humain en tant que
détecteur sensoriel), la plupart de temps associé à
une détection physique classique.
En sortie de colonne, une partie des composés
élués est envoyée vers un cône de détection
nasale qui permet l’évaluation olfactive en même
temps que l’enregistrement du chromatogramme.
Tous les types de détecteurs peuvent être utilisés
en parallèle au port d’olfaction, mais ce sont les
détecteurs FID (détecteur à ionisation de flamme)
ou de masse qui sont les plus fréquemment
utilisés.
Afin d’éviter l’inconfort dû aux effluents chauds et
la déshydratation de la muqueuse nasale qui
conduit à une perte de sensibilité, de l’air humide
est ajouté en sortie de cône.
L’opérateur enregistre ses données olfactives
grâce à divers dispositifs de suivie (bouton
pressoir, curseur, enregistrement vocal …) reliés à
un ordinateur.
La CPG/O trouve de nombreuses application tant
en recherche et développement qu’en contrôle
qualité.
C- Chromatographie en phase gazeuse à deux
dimensions.
La chromatographie bidimensionnelle consiste
à coupler deux colonnes de polarités
différentes pour avoir une séparation parfaite.
Cette méthode est appliquée aux mélanges
complexes présentant de nombreuses co-
élutions.
Parmi les méthodes de chromatographie à
deux dimensions, on distingue la méthode dite
par piégeage « heart-cutting: coupe à cœurs»,
notée CPG-CPG; et la chromatographie totale
noté GC x GC ou CPG-2D.
i- Chromatographie à deux dimensions heart-cutting.
Cette méthode consiste à sélectionner une
fraction du chromatogramme qui est mal résolue
sur la première colonne pour la séparer sur la
seconde colonne.
Cette méthode utilise deux colonnes, deux
détecteurs et un système de piégeage. Le plus
souvent, la première colonne est une colonne
apolaire (PDMS) de dimension classique. La
seconde colonne est alors polaire (PEG); mais bien
plus courte et de plus faible diamètre pour
permettre une élution rapide. Il est également
fréquent d’utiliser une colonne chirale comme
seconde colonne.
Les deux colonnes peuvent être placées ou non
dans le même four. Le piégeage d’une fraction à la
sortie de la première se fait le plus souvent à
l’aide d’une trappe cryogénique. Elle permet de
stocker les composés élués de la fraction jusqu’à
ce que la seconde colonne soit disponible pour
l’analyse.
ii- Chromatographie totale CPG-2D
La chromatographie totale, ou chromatographie
compréhensive GC x GC, permet d’étudier tous les
composés élués de la première colonne sur la
seconde, non pas comme la CPG-CPG où une
fraction subit une séparation sur la deuxième
colonne.
Elle a pour principe l’injection continue de petites
fractions éluées de la première colonne dans la
seconde. Tout comme dans la CPG-CPG, on utilise
deux colonnes de polarités différentes, la seconde
ayant une dimension beaucoup plus faible (0,5 à
1,5 m, diamètre interne compris entre 0,1 et 0,25
mm, épaisseur du film de 0,1 μm).
Ainsi, les différentes fractions sont analysées et
conduisent chacune à de petits
chromatogrammes. L’ensembles des
chromatogrammes enregistrés au cours de
l’analyse est représenté dans un diagramme à
deux dimensions, communément nommé contour
plot , sur lequel l’abondance des composés
détectés est traduite en couleurs variables.
 Le seul détecteur de masse parfaitement adapté au
couplage CPG-2D est le détecteur de masse à temps de
vol (GCxCG/TOF-MS).
Le spectromètre possède la vitesse d’acquisition des
spectres (>500 Hz), autorisant l’enregistrement de 10 à
20 spectres par pic, nécessaires au couplage à la CPG-
2D.
D/ La Résonance Magnétique Nucléaire du
carbone-13 (RMN-13C)
Cette technique s’applique aux mélanges sans
séparation préalable et offre des potentialités
fortement intéressantes.
Le principe consiste à attribuer les raies de
résonance de chacun des carbones de chaque
composé à partir du spectre unique du mélange et
de les comparer à des produits de référence
répertoriés dans des bibliothèques.
Il s’agit de l’observation et l’individualisation des
différentes raies de résonance dans le spectre du
mélange et l’attribution de chacune de ces raies de
résonance à un produit donné permettant son
identification.
L’individualisation de tous les signaux dans le
spectre du mélange dépend de plusieurs
paramètres :
- la complexité du mélange mais également le
nombre de carbones constitutifs de chacun des
constituants ;
- les différences entre les concentrations relatives
des divers constituants ;
- les similitudes observées au niveau de tout ou
partie des squelettes carbonés de molécules
provoquant une augmentation du nombre de
superpositions des carbones possédant des
environnements magnétiques moyens identiques.
L’informatisation de la recherche, réalisée par un
logiciel, permet de comparer le déplacement
chimique de chaque carbone dans n’importe quel
spectre expérimental avec ceux des atomes de
carbone de composés purs répertoriés dans la
bibliothèque de spectres élaborée par l’équipe qui
fait la recherche à partir d’échantillons
authentiques et/ou dans la bibliothèque construite à
partir des données décrites dans la littérature.
Ainsi, l’informatisation de la recherche permet, en un
laps de temps très court, l’édition de toutes les
informations nécessaires à la caractérisation des
constituants d’un mélange complexe (attribution des
raies de résonance, variation des déplacements
chimiques, superpositions).
La RMN du carbone-13 appliquée à l’analyse d’un
mélange complexe permet l’identification de certains
composés dont l’analyse par les techniques
conventionnelles est problématiques, dès lors que leur
teneur est supérieure a 0,5% et qu’ils sont présents
dans les bibliothèques de référence.
E/ Les couplages CPG-IRTF
La spectroscopie infrarouge renseigne en général sur
les fonctions chimiques présentes dans les molécules et
permet également de différencier les isomères, par
l’examen de la partie du spectre dite « des empreintes
digitales »
L’avènement de la spectroscopie Infra-Rouge à
Transformées de Fourier (IRTF), autorisant une grande
vitesse d’acquisition, a permis de réaliser le couplage
CPG-IRTF.
Les limites de détection de l’IRTF ont
considérablement été améliorées grâce au
développement d’interfaces performantes. Le
spectre obtenu peut être comparé à ceux
contenus dans une bibliothèque informatisée de
spectres Infra-Rouge.
Le couplage CPG-IRTF peut s’appliquer à
l’analyse de diverses familles de composés. Son
efficacité a été démontrée notamment pour
l’étude de molécules présentant des spectres de
masse superposables tels que les
stéréoisomères du farnésol et du menthol