Licence professionnelle des Industries

Pharmaceutiques,
cosmétologiques et de santé :
gestion, production et valorisation
Parcours CDA « (Contrôle et Développement Analytique) »

Notice d’utilisation du logiciel

Empower 3 pour piloter
la chaîne HPLC Alliance e2695 WATERS Double
détection UV-Vis 2489 et MS QDa

Carine SAUNIER, Julien POUARD, Nicolas THEGARID & Lionel GODIN

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 SOMMAIRE

I - Ouverture du logiciel Empower 3 et création d’une « Instrument Method »

p. 5

1) Purge du système chromatographique p. 5

2) Ouverture du logiciel et création d’une « Instrument Method » p. 5
a- Paramétrage du module de séparation p. 10
b- Paramétrage du détecteur de masse QDa p. 12
c- Paramétrage du détecteur UV-Visible 2489 p. 13

II - Création d’une « Method Set » p. 15

III - Création d’une « sample Set Method » p. 19

IV - Lancer une analyse « Run Sample » p. 25

1) Équilibration de la colonne p. 25
2) Effectuer un « Run Sample » p. 25

V – Visualisation et traitement des données chromatographique et spectrale

p. 30

1) Visualisation des données p. 30

2) Traitement des données p. 33

VI – Quantification pour la détection en UV-Visible

p. 34

1) Traitement des données pour obtenir la droite de calibration p. 34

2) Quantifier des échantillons p. 45

VII – Quantification pour la détection en masse

p. 47

1) Traitement des données pour obtenir la droite de calibration p. 47

2) Quantifier des échantillons p. 57

3
VIII – Injection direct de l’échantillon dans le spectromètre de masse (Infusion)

1) Remplissage et mise en place de la seringue dans le pousse-seringue p. 58

2) Utilisation de Empower et lancement d’un Run p. 59

IX – Mise à l’arrêt du système complet

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 PRISE EN MAIN DE LA CHAÎNE HPLC Alliance WATERS
Double détection UV-Vis 2489 et MS QDa

I – Ouverture du logiciel Empower 3 et création d’une « Instrument Method »

Allumer le PC en premier, en rentrant l’ID : administrator, puis le mot de passe : S4LU2466 et

attendre d’obtenir le bureau de windows 10 avant d’allumer les appareils. Mettre en place les
bouteilles de solvants :

Canalisation A et B : Eau UP et/ou Tampon

Canalisation C et D : ACN et/ou MeOH qualité LCMS (pureté > 99,95 %)

Canalisations Seal Wash : MeOH/Eau UP 20/80 (équivalent au solvant de repos)

Canalisations Needle Wash : ACN/Eau 50/50

Mettre en place la colonne. Allumer la chaine Alliance, le détecteur UV et le détecteur de masse,

puis laisser le système s’initialiser (seringue, needle et carrousel) jusqu’à voir apparaître idle sur
l’écran.

1) Purge du système chromatographique :

Directement sur le module de séparation Alliance série e2695

Appuyer sur le bouton Menu/Status

Sur Diag, faire un Prime Seal Wash. (la bouteille correspondante doit contenir 20/80 MeOH/Eau)

Sur Diag, faire un Prime Needle Wash. (la bouteille correspondante doit contenir 50/50 ACN/Eau)

Puis sur Direct Function et choisir 3. Wet Prime : faire une purge le temps qu’il n’y ait plus de bulles
dans les canalisations. Débit à 8mL/min et 100 % sur chacune des voies utiles pendant 4 min
chacune.

2) Ouverture du logiciel et création d’une « Instrument Method » :

Double cliquer sur « Empower » :

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Rentrer le nom d’utilisateur : system, puis le mot de passe : manager :

Cliquer sur OK

Sur la fenêtre qui apparaît : sélectionner “Browse Projects” :

Faire un clic droit pour en créer un nouveau, ou bien sélectionner un projet déjà existant CDA1-MN,
CDA1-OP, ou CDA2-QR et CDA2-ST.

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Puis cliquer sur OK. Une fenêtre apparaît, pour laquelle, on trouve plusieurs onglets.

Dans l’onglet Sample Sets, chaque ligne correspond à une séquence d’injection. Si on veut voir toutes les
injections qui ont été effectuées dans chacunes des séquences, il suffit de faire un clic droit sur la ligne
correspondant, puis sélectionner View As → Injection.

Dans l’onglet Channel, chaque ligne correspond à un canal associé à une séquence d’injection. Si on veut savoir
avec quel canal, telle ou telle injection a été réalisée, il suffit de faire un clic droit sur la ligne correspondant, puis
sélectionner View As → Injection.

Dans l’onglet Method, chaque ligne correspond à une méthode à laquelle est associée l’Instrument Method, le
processing, le report, etc….

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Création d’une « Instrument Method » : Cliquer dans File → New Method →Instrument Method, afin de
créer une nouvelle méthode, dans laquelle on va préciser les conditions opératoires :

On choisit le système avec lequel, on veut travailler, c’est-à-dire effectuer la détection, soit exclusivement en
masse LC_MS, soit exclusivement en UV LC_UV, ou en utilisant les deux détecteurs LC_UV_MS (système
complet).

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Choisissons, le système de détection complet, puis cliquer sur OK :

La fenêtre “Instrument Method Editor" s’ouvre :

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 a - Paramétrage du module de séparation chromatographique :

Sélectionner la partie HPLC Alliance, en cliquant sur l’icône de la chaine W2690/5 :

Dans l’onglet Flow, partie Programmed Flow, on indique le mode de travail, isocratic ou gradient, le débit (Total
Flow) à 0,8 mL/min, l’accélération n’est pas modifiée, ainsi que la proportion de solvant utilisée, 60 % du solvant
A pour 40 % du solvant C.

Dans l’onglet Temperature, on indique la

température de la colonne :

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 Dans l’onglet Solvents, on indique la
nature des solvants utilisés :

On réservera le solvant A au tampon

(ou à l’eau UP), et le solvant C à
l’ACN, le solvant D au MeOH :

Dans l’onglet Channel, côcher Enable Channel :

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 b - Paramétrage du détecteur de masse QDa :

Sélectionner la partie SM, en cliquant sur l’icône ACQ-QDA

Dans l’onglet General, partie MS Scan, on peut choisir l’échelle de masse (en Dalton = g/mol) sur
laquelle le spectromètre va effectuer son balayage, effectuer le réglage de la tension du cône (de 0 à
100 V) en ESI+ ou ESI-.
Dans la partie General, on indique la tension aux bornes du capillaire (entre 0,3 et 1,5 kV en ESI+ ; entre
0,3 et 0,8 kV en ESI-).

Choisir une échelle de masse de 100 à 300 Da.

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Dans l’onglet Events, on peut piloter la vanne permettant d’envoyer l’échantillon vers le spectromètre
de masse ou vers la poubelle, remplir la ligne 1 tel qu’indiqué ci-dessous afin que l’échantillon soit
envoyé automatiquement vers le détecteur de masse :

c - Paramétrage du détecteur UV-Visible 2489 :

Sélectionner la partie UV, en cliquant sur l’icône W2489

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Dans l’onglet Channel A, on règle la longueur d’onde de détection :

On effectue une sauvegarde de l’Instrument Method que l’on vient de programmer, en cliquant sur File
Save As…

À la place de la méthode TestReserpine, on indique le nom de la méthode sous la forme :

aa_lnm_60_40_TpACN_Ucone_Ucap_IM :

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Si besoin d’un Password : indiquer manager.
Quitter ensuite la fenêtre : “Instrument Method Editor" :

II – Création d’une « Method Set »

On revient sur la fenêtre de départ : “Project"

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À partir de la fenêtre « Project » : créer une « Method Set » qui est un groupe de méthodes englobant
les méthodes IM : Instrument Method, PM : Processing Method et RM : Report Method (si besoin).
Cliquer sur File New Method et Method Set :

Une fenêtre apparaît, cliquer sur No :

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La fenêtre Method Set Editor apparaît :

Sélectionner l’Instrument Method de votre choix, celle que vous aviez créée précédemment :
" aa_lnm_60_40_TpACN_Ucone_Ucap_IM ".

Sauvegarder la Méthode Set :

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Indiquer le nom de la méthode, ici " aa_lnm_60_40_TpACN_Ucone_Ucap_MS " avec l’extension MS,
et si besoin d’un Password : indiquer manager, puis cliquer sur Save :

Fermer la fenêtre : “Method Set Editor"

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III – Création d’une « Sample Set Method »

À partir de la fenêtre de départ : “Project"

Vous allez Créez une nouvelle "Sample Set Method" (La Sample Set Method contient des échantillons
qui chacun sont analysés selon une method set).
La Sample Set Method est une méthode que l’on applique à un groupe d'échantillons. Pour la créer,
cliquer sur File → New Method → Sample Set Method :

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Une nouvelle fenêtre s’ouvre : "New Sample Set Method Wizard - Untitled" :

cliquer sur Next :

Puis, cliquer sur Next.

20
Indiquer la position du vial dans lequel se trouve votre échantillon :

Dans la fenêtre suivante, on indique, le nombre d’échantillon, le nombre d’injection par vial, le volume
d’injection, ainsi que la durée d’analyse, puis on sélectionne la Method Set que vous avez
préalablement créée, comme indiqué ci-dessous :

Puis Cliquer sur Next.

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Cliquer sur Next :

Cliquer sur Next :

Rentrer le nom de l’échantillon dans Sample Name, puis Next :

22
Cliquer sur Finish.
Une ligne se crée dans le “Sample Set Method Editor" :

Vérifier l’exactitude des informations.

Remarque : on peut par la suite rajouter autant de ligne que l’on veut, en cliquant dans chaque ligne
que l’on complète ensuite.

Effectuer une sauvegarde de la « Sample Set Method » :

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Écrire le nom de la méthode avec l’extension _SSM dans la fenêtre "Save current sample set method"
et on rajoute le mot de passe « manager » si besoin :

puis on clique sur Save.

Fermer la fenêtre “Sample Set Method Editor" :

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IV – Lancer une analyse « Run Sample »

1) Équilibration de la colonne :

Directement sur le module de séparation Alliance série e2695

Appuyer sur le bouton Menu/Status
(utiliser les touches ◄ ▲ ► ▼ pour naviguer dans le menu)

Changer dans Composition, la composition des solvants, puis dans Flow, indiquer le débit voulu. La
colonne doit être équilibre au moins 15 minutes avant de lancer une analyse.

2) Effectuer un « Run Sample » :

Dans la fenêtre Project, cliquer sur « Run Sample »

Sélectionner le système chromatographique que vous voulez utiliser, ici "LC_UV_MS", puis cliquer sur
OK :

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Placer la fenêtre “Project" dans la barre des tâches de windows en cliquant sur

On aura de cette façon-là, la fenêtre « Run Samples » plein écran :

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Charger une Sample Set Method en cliquant dans File → Load Samples ... :

Cliquer sur OK :

Sélectionner la Sample Set Method de votre choix, puis cliquer sur Open :

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Une ligne correspondant à votre Sample Set Method apparaît dans la fenêtre : « Run Samples ».
Dans Instrument Method, en bas de la fenêtre, sélectionner votre Instrument Method (IM)

Cliquer sur le bouton "Monitor" :

Remarque : on peut rajouter autant de ligne d’analyse que l’on veut (par exemple pour passer une
gamme complète) en cliquant dans les lignes suivantes et en renseignant les colonnes correspondantes.

MISE EN PLACE ET RETRAIT DES ROUES

Ouvrir le panneau avant sur la chaîne HPLC Alliance, puis sélectionner la roue désirée (A, B, C, D ou E)

Vérifier avant de mettre la roue dans l’HPLC qu’il n’y ait pas de bulles au fond des vials.

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Pour lancer une analyse (ou une série d’analyse), il faut cliquer sur le bouton vert (RUN) dans la fenêtre
« Run Samples » :

Cliquer sur Run dans la fenêtre « Run Sample Set » qui apparaît :

Remarque : Si l’on veut arrêter l’analyse en cours de « RUN », il suffit de cliquer sur Abort.

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On observe, dans la partie droite de la fenêtre « Run Samples », plusieurs courbes. Du haut vers le bas,
la courbe de pression en tête de colonne, le chromatogramme fourni par le détecteur de masse
(Intensity = f(t)) et le chromatogramme fourni par le détecteur UV (A = f(t)) :

V – Visualisation et traitement des données chromatographique et spectrale

1) Visualisation des données :

Cliquer sur le bouton REVIEW

30
La fenêtre « Review [Main Window] » apparaît :

Pour observer le chromatogramme UV, cliquer sur le bouton :

Pour observer le chromatogramme de masse, cliquer sur le bouton.

Ou sélectionner le spectre de masse en courant ionique total (TIC) :

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On peut aussi cliquer sur l’onglet 2D Channels (en bas de la fenêtre), puis sélectionner en début de
ligne, les données à afficher.
On voit apparaître les différents composés dans l’écran en haut à gauche, le spectre de masse en
dessous. Cliquer sur le bouton "T "

On voit alors, apparaître le spectre de masse TIC, à droite de la fenêtre :

La petite fenêtre temporelle peut être simplement déplacer à l’aide de la souris.

32
 2) Traitement des données :

En positionnant le curseur sur le premier composé, son spectre de masse apparaît à droite :

En positionnant le curseur sur le deuxième composé, son spectre de masse apparaît à droite :

33
Remarque : on peut aussi cliquer à nouveau sur le bouton "T " afin d’extraire un autre spectre de masse,
en positionnant le deuxième curseur correctement, cet autre spectre de masse viendra se placer dans
la fenêtre de droite au-dessous du premier !

VI – Quantification pour la détection en UV-Visible

1) Traitement des données pour obtenir la droite de calibration :

Quand tous les échantillons ont été injectés :

Dans la fenêtre Project, onglet Injection

Sélectionner toutes les lignes qui correspondent aux standards, faire un clic droit et sélectionner Alter
Sample, et dans Sample Type, indiquer Standard :

En cliquant dans l’icône « amount », on peut rentrer la valeur de la concentration, ainsi que son unité.

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Lorsque tous les étalons ont été déclarés en standard :
Dans la fenêtre Project, onglet Channel

Sélectionner toutes les lignes qui correspondent aux standards en UV (W2489 Ch A) en maintenant la
touche Ctrl appuyée :

Faire un clic droit et sélectionner Review (ou appuyer sur l’icone Review)

35
La fenêtre Review (Main Window) apparaît : cliquer dans l’onglet 2D Channels (si ce n’est déjà fait)

Sélectionner le standard élevé.

File ® New Processing Method :

Processing Type : LC et cocher : Use Processing Method Wizard

Cliquer sur OK.

36
Cliquer sur Next,

Cliquer sur Next,

Indiquer une valeur au début et une à la fin, soit manuellement, soit à l’aide de la souris en
sélectionnant le(s) pic(s) d’intérêt(s) (on peut laisser sans rien) puis cliquer sur Next,

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On peut éliminer les pics parasites en indiquant un « minimum height ». Mettre une valeur (20000
environ) puis cliquer sur « test ». Tester différentes valeurs jusqu’à obtenir le meilleur résultat. Puis
cliquer sur Next,

Dans la page qui s’affiche, les 3 listes déroulantes doivent être sur Area – Amount et Linear.
Ne pas utiliser Concentration (cela a pour effet de multiplier la valeur de concentration réelle par le
volume d’injection) ! Puis cliquer sur Next,

Cliquer sur No,

38
Supprimer toutes les lignes se rapportant aux pics parasites s’il en reste et indiquer le nom du (des)
composé(s). Puis cliquer sur Next,

Compléter la valeur (Amount) et l’unité (Units) de chaque composé dans le standard ! Puis cliquer
sur Next,

Choisir External Standard Calibration, puis cliquer sur Next,

39
Cliquer sur Next,

Choisir un nom pour la méthode (Dosage_nom composé_initials groupe_PM). On peut laisser un

commentaire dans la case Method Comments. Rentrer éventuellement le mot de passe (manager) puis
cliquer sur Finish,

Cliquer sur Save.

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On revient sur la page avec le(s) chromatogramme(s).

Afficher la (les) ligne(s) verticale(s) correspondant au(x) composé(s) en cliquant sur « manually identify
peaks » (icone ou dans le menu Process) et intégrer manuellement le(s) pic(s) d’intérêt(s) en déplaçant
le curseur à la base du pic à l’aide de la souris :

S’il y en a, supprimer les lignes des pics parasites.

Vérifier que le(s) pic(s) sont bien intégrés et arranger l’intégration le cas échéant.

Cliquer sur Calibrate (icone en haut ou dans le menu Process)

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Cliquer dans l’onglet Peaks (en bas à gauche) et vérifier que la colonne « Amount » indiquée pour
chaque composé est correctement remplie.
Si ce n’est pas le cas, cela veut dire que la « sample set » a été mal remplie, il faut alors fermer la feneêtre
Review (Main Window), puis revenir sur l’onglet Injection de la fenêtre « Project » et modifier le
standard en faisant un clic droit et Alter Sample. Puis il faut recommencer la création de la Processing
Method…

Revenir sur l’onglet 2D Channels, puis sélectionner le standard (en W2489 ChA) suivant en utilisant
l’icone « next 2 D channel » :

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Afficher la (les) ligne(s) verticale(s) correspondant au(x) composé(s) en cliquant sur « manually identify
peaks » (icone ou dans le menu Process) et intégrer manuellement le(s) pic(s) d’intérêt(s) en déplaçant
le curseur à la base du pic à l’aide de la souris.

Cliquer sur Calibrate (bouton en haut ou dans le menu Process)

Faire de même avec tous les standards (en W2489 ChA) :

Puis vérifier la droite de calibration en cliquant sur windows ® Calibration Curve ou sur l’icone :

Remarque : On peut revenir sur la fenêtre principale (Main Window) en cliquant sur l’icone :

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Il faut modifier manuellement les concentrations des étalons dans la colonne X Value.
On peut ensuite imprimer courbe et tableau si besoin.

Ensuite File ® Save all

Puis File ® Save as Processing Method :

Cliquer sur Copy Curves.

Le logiciel demande si on veut “Overwrite”, cliquer sur YES, puis fermer la fenêtre.

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 2) Quantifier des échantillons (inconnues, étalons de contrôle…) :

Quand la droite de calibration est réalisée, dans la fenêtre « Project » :

- Dans l’onglet Channels, sélectionner la ligne de l’échantillon correspondant au détecteur UV,

puis cliquer sur le bouton Review.

- Ouvrir la « Processing Method » correspondante au run (File ® Open ® Processing

Method) :

- Sélectionner votre « Processing method », puis cliquer sur Open :

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Dans l’onglet 2D Channels, afficher la (les) ligne(s) verticale(s) correspondant au(x) composé(s) en
cliquant sur « manually identify peaks » (icone ou dans le menu Process) et intégrer manuellement le(s)
pic(s) d’intérêt(s) en déplaçant le curseur à la base du pic à l’aide de la souris.

- Intégrer manuellement le(s) pic(s), et cliquer sur Quantitate dans le menu Process.

Si problème (composé manquant), cela veut dire que le pic est peut-être trop loin de la barre et il faut
« forcer » en amenant la barre sur le pic.

Si le pic s’étire trop à droite ou possède un pic fille, on peut le « couper » selon 2 manières :

® soit de manière “droite” : on intègre le pic, on se positionne à l’endroit où l’on désire couper
puis on maintient le bouton ctrl appuyé tout en cliquant sur le chromato.

® soit de manière + douce : on choisit Manuel Exponential Skim dans le menu Option.

Le logiciel affiche la concentration dans l’onglet Peaks colonne Amount :

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VII – Quantification pour la détection en masse

1) Traitement des données pour obtenir la droite de calibration

2) Quantifier des échantillons

VIII – Injection direct de l’échantillon dans le spectromètre de masse (Infusion)

1) Remplissage et mise en place de la seringue dans le pousse-seringue

En infusion, la concentration de l’échantillon à injecter doit être environ 100 fois plus grande que lors
d’une injection LCMS, d’autre part, le débit doit être ajuster à 90 µL/min.

Remarque : le débit doit être ajusté en fonction de la concentration.

Selon le nombre d’infusion à réaliser remplir la seringue d’une quantité suffisante (par exemple pour
10 infusions d’une durée de 5 min, il faudra remplir la seringue avec environ 5 mL).

Sur le pousse-seringue, il suffit d’indique le diamètre de la seringue. Et de placer cette dernière sur le
pousse-seringue, comme indiqué sur la photo :

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Il faut ensuite visser l’embout de la seringue à la vanne d’injection :

2) Utilisation de Empower et lancement d’un Run

Aller sur la fenêtre « Run Samples » plein écran :

Dans Instrument Method, en bas de la fenêtre, sélectionner votre Instrument Method (IM)

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Cliquer sur le bouton "Setup", pour modifier la méthode de travail, c’est-à-dire fixer le débit à 0 mL/min,
et éventuellement modifier les caractéristiques du QDa :

Cliquer sur QDa Detector, pour monitorer les Channels, puis cliquer sur Customize pour supprimer les
graphes inutiles.
MISE EN PLACE ET RETRAIT DES ROUES

Ouvrir le panneau avant sur la chaîne HPLC Alliance, puis sélectionner la roue désirée (A, B, C, D ou E)
Et placer un vial vide à l’endroit désiré.

Pour lancer une analyse (ou une série d’analyse), il faut cliquer sur le bouton vert (RUN) dans la fenêtre
« Run Samples » :

Cliquer sur Run dans la fenêtre « Run Sample Set » qui apparaît :

Sans plus attendre, appuyer manuellement sur START du pousse-seringue.

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IX – Mise à l’arrêt (ou en standby) du système complet

1) Rinçage de la colonne avec de l’eau UP :

Placer les canalisations utilisées, dans la bouteille d’eau UP, et :

Directement sur le module de séparation Alliance série e2695

Appuyer sur le bouton Menu/Status
(utiliser les touches ◄ ▲ ► ▼ pour naviguer dans le menu)

Changer dans Composition, la composition des solvants A à 100 % (si la bouteille d’eau UP est en A) et
les autres à 0 %, puis dans Flow, indiquer le débit de 1mL/min. La colonne doit être nettoyée au moins
pendant 20 minutes.

2) Utilisation de la console pour la mise en veille des détecteurs :

Dans la fenêtre « Run Sample », cliquer sur la console du détecteur UV, afin de mettre la lampe à Off.

Faire de même, en cliquant sur la console du détecteur QDa.

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 3) Rinçage de la colonne avec de l’ACN :

Placer les canalisations utilisées, dans la bouteille d’ACN, et :

Directement sur le module de séparation Alliance série e2695

Appuyer sur le bouton Menu/Status
(utiliser les touches ◄ ▲ ► ▼ pour naviguer dans le menu)

Changer dans Composition, la composition des solvants C à 100 % (si la bouteille d’ACN est en C) et les
autres à 0 %, puis dans Flow, indiquer le débit de 1mL/min. La colonne doit être nettoyée au moins
pendant 20 minutes.

4) Nettoyage du système avec le solvant de repos (20% MeOH/80% Eau) :

Démonter la colonne si besoin (demander au professeur).

Placer les canalisations utilisées, dans la bouteille de solvant de repos, et :

Directement sur le module de séparation Alliance série e2695

Appuyer sur le bouton Menu/Status
(utiliser les touches ◄ ▲ ► ▼ pour naviguer dans le menu)

Changer dans Composition, la composition des solvants D à 100 % (si la bouteille de solvant de repos
est en D) et les autres à 0 %, puis dans Flow, indiquer le débit de 1mL/min. La colonne doit être nettoyée
au moins pendant 20 minutes.

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