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Jean-Luc Vialle
jluc.vialle@gmail.com 2009-2010
Objectifs
• Maitriser les techniques utilisées dans les
domaines: - De
l’agroalimentaire (lipides, glucides, protides)
- Connexes à la production
(environnement, culture, élevage)
• Approfondir quelques techniques majeures et
discriminatives
Sommaire
• Liées au personnel
• Liées au matériel
• Liées aux méthodes
• Liées à l’aspect économique et à l’aspect
délai
21 Personnel compétent
• Production : Faibles compétences
Analyses simples (globales)
Automatisation
• Laboratoire d’analyse: Niveau de
compétence + élevé Analyses
discriminatives Automatisation
• Laboratoire de recherche: Niveau de
compétence très élevé Interprétation
des analyses
22 Contraintes matérielles
• Coût d’investissement: -
Routine (Production) : 15.000 Euros -
Analyse discriminative: 15.000 Euros par
ligne d’analyse
- Analyse structurale:
Quelques centaines de milliers d’Euros
par technique.
• Coût de fonctionnement et de maintenance
23 Contraintes Normatives et Légales
• Normes ISO, Afnor, Din, Asae… font
références et sont incontournables si
obligations légales
• Méthodes officielles: AOAC pallient
l’absence de normes
• Méthodes interprofessionnelles
Ex: Test de sédimentation de Zélény,
saccharimétrique dans l’industrie
sucrière, MS chez la pomme de
terre.
• Méthodes internes (propres à l’entreprise)
24 Contraintes économiques et temporelles
• Liées à l’aspect légal ou marketting de
l’analyse.
• Liées à l’impact sur la production
(Immobilisation)
• Internalisation / Externalisation de l’analyse
Impact sur le délai et sur le coût
• Liées au volume d’activité de l’entreprise et
à la valeur ajoutée de la production
• C < 15 Euros , D < 3 jours MS, pH,
Gravimétrie, Brix, tests simples
• 15 < C < 50 Euros, D < 3 jours
Titrimétrie, Complexiométrie, AA, Absorption
moléculaire
• 100 > C > 50 Euros, D < 3 jours
Techniques chromatographiques
internalisées, simples
• C > 100 Euros, D > 1 semaine
Analyse thermiques, structurales, analyses
chromatographiques externalisées
III°) Classifications des techniques
• Selon les propriétés du soluté (matrice).
• Selon le caractère ‘destructif’.
• Selon l”état de la matière.
• Selon le seuil de détection
• Selon le caractère discriminant de l’analyse
• Selon la ‘cible’ visée dans la molécule
• Propriétés du soluté (matrice)
Chimiques et µbiologiques - Physiques - Mécaniques -
Thermiques - Optiques - Electriques - Magnétiques -
Physico chimiques - Energétiques - Fragmentation
• Caractère destructif / non destructif
MEB, RX, RMN du solide, Near FTIR
• Etat de la matière: S, L G
• Seuil de détection:
– 0,1% (1000 ppm)
Titrimétrie - Thermiques - IR - RMN - Gravimétrie
- 1 ppm:
AA, AM , Chromatographie…
P r o p r ié té s C h im iq u e s
R é a c tiv ité p H m é t r ie P o t e n t io m é t r ie
C h im iq u e
A r g e n t im é t r ie P e r i o d i m é t r ie
R é a c tio n s p é c ifiq u e s C o m p le x io m é t r ie
M a n g a n im é t r ie C h r o m im é t r ie
C é r i m é t r ie C h lo m é tr ie
I o d o m é tr ie
B r o m o m é tr ie
P r o p r ié té s m o lé c u la ir e s e t io n iq u e s
+ / - s p é c ifiq u e s
P r o p r ié té s P h y s iq u e s
A n a ly s e é lé m e n t a ir e G r a v im é t r ie C a lo rim é trie A n a ly s e T h e rm iq u e R é f r a c to m é t r ie C o n d u c t im é t r ie
D e n s im é tr ie P o la r im é tr ie A m p é r o m é t r ie
E b u llio s c o p ie A .T .D
V o lu m é t r ie C r y o s c o p ie A .T .G V o lta m é t r ie
D .S .C
T o n o m é t r ie C o u l o m é t r ie
P o l a r o g r a p h ie
E le c tr o d e s
s p é c ifiq u e s
P r o p r ié té s M o lé c u la ir e s e t I o n iq u e s
S é le c tiv e s
I n té r a c tio n s P h y s ic o c h im iq u e s
C h r o m a t o g r a p h ie E le c tr o p h o r è se
S u rfa ce V o lu m e S u rfa ce V o lu m e
C .P C .C .M H PLC C PG P a p ie r G el E le c tr o p h o r è se
H P C C M P h a s e liq u id e P h a se g a zu e se c a p illa ir e
P r o p r ié té s E n e r g é tiq u e s d e s m o lé c u le s
S p é c ifiq u e s
C ib le u t ilis é e
( E c r o is s a n t e )
M o lé c u le A to m e
S p e c t r o s c o p ie S p e c t r o s c o p ie A b s o r p tio n F l u o r im é t r ie
I n fr a -r o u g e R am an m o lé c u la ir e E m is s io n A b s o r p tio n
U V - V i s ib le a to m iq u e A to m iq u e
F la m m e F la m m e
F r o id e
T orche à Four
P la sm a
P r o p r ié té s d u
N o y a u A to m iq u e
P r o p r ié té s d u n o y a u
e t d e l'a to m e
M a g n é tiq u e s R a d io a c tiv e s P h y s iq u e s
R .M .N S c i n t i g r a p h ie M ic r o s c o p ie D iffr a c tio n X
E le c t r o n iq u e
à b a la y a g e
Chapitre N° 2
La quantification
Sommaire
• Introduction Les calculs d’incertitudes
• Les méthodes ‘Absolues’ Methodes directes
Dosages chimiques
• Les méthodes comparatives Etalonnage
interne et externe Les ajouts dosés
• Conclusion
I°) Introduction
• Analyse = Quantification
• Structurale = Identification
• Rappels sur les incertitudes
Incertitudes absolues n x
Incertitudes relatives x /x
II°) Les méthodes ‘absolues’
• Mesure de paramètre physiques
Exemple Taux de cendres NF V 18-101
• Méthodes basées sur l’application d’une loi
simple Exemple ;
L’amidon (3ème directive du JO du 23/11
1980)
• Méthodes basées sur des réactions chimiques
• Acido-basique
• Rédox
• Complexiométrie - Précipitation
• Etalonnage interne
• Domaine d’utilisation
• Principes
• Application à l’analyse des FAME (NF T 60-234)
• Avantages et inconvénients
• Choix de l’étalon interne
33 Méthode des ajouts dosés
• Analyse de traces
• Application en chromatographie
• Avantages et inconvénients
Chapitre N° 3
Introduction à la
Chromatographie
Sommaire
• Introduction
• Aspect thermodynamique
• Aspect cinétique
• Facteurs liés à la chromatographie
I°) Introduction
• Technique séparative
• Dualité Analytique / Préparative Lié à
la valeur ajoutée
• Les différents états de la matière solide –
liquide – gaz – critique
• Classification des techniques séparatives
- Suivant les forces mises en jeu
- Suivant l’état de la matière
Un peu d’histoire…
• Khrômatos = Couleur Graphikos = Tracé
• 1903 Tswett: CaCO3 Colonne ouverte
• 1940 Martin et Synge : Théorie de la
partition
• 1950 Snyder: Théorie de l’adsorption
• 1950 Martin et James CPG
• 1960 CCM
• 1970 HPLC et phase inverse
• 1975 CPG Capillaire
• 1985 HPLC en phase supercritique
Glossaire
• Soluté: Espèce à séparer / à doser
• Solvant: Solubilise le soluté
• Eluant: Phase mobile
• Eluat: Phase mobile (+ soluté)
• Phase stationnaire:
Phase immobilisée dans le
système chromatographique
Schéma d’un chromatographe
Réserve Système de Injecteur
Eluant Mobilité
Passeur
Gradient Séparateur
Micro
Proesseur
Détecteur
Traitement
du signal
Collecteur
Classification des techniques
chromatographiques
• Suivant la technologie: Surface / Volume
• Suivant la nature des phases:
Phase mobile: Liquide ou
Gazeuse (Critique)
Phase stationnaire: Solide ou
Liquide immobilisé
Récapitulatif
Phase Phase Technologie Application Principe
Mobile Stationnaire
Liquide CPG Partage
Gaz Volume G/L
Solide CPG Adsorption
G/S Exclusion
Surface CCM Partage
Liquide L/L
Volume HPLC Partage
Liquide L/L
Surface CP Adsorption
Solide L/S Exclusion
Volume LC, HPLC Adsorption
L/S Exclusion
II°) Aspect Thermodynamique
Théorie des plateaux
• Un soluté P qui se distribue entre les deux phases stationnaire
et mobile = Equilibre K = [P]stat / [P]mob
• K varie avec la force des interactions
• Objectif: Multiplication du nombre d’équilibre : n
• Ecoulement discontinu ; 1 plateau = 1 équilibre
• y = fraction de P (stat) et x = fraction de P (mob) k’ =
y/x = cste x + y = qo = 1
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Stat. y
Mob. x
Transfert
n 0 1 2 n-1 n
Mob 0 x 0
Stat y 0 0
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy x²
stat y² xy
Transfert
n 0 1 2 n-1 n
Mob 0 xy x²
Stat y² xy 0
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy² 2x²y x3
Stat y3 2xy² x²y
Généralisation
• Après n transferts: Le soluté se
disperse suivant une loi du type (x + y)n
• Facteur de capacité: k’ = y / x Grandeur
caractéristique d’un soluté dans un système
chromatographique donné
• Qnp = f(n,p, q0)
Equation d’une Gaussienne Courbe
à maximum
• Après n transferts, la phase mobile a
parcourue une distance ln et l’extrémum se
situe à une distance lp tel que
lp / ln = 1 / (1+k’)
• H=A+B/u+Cu
• A = Anisotropie d’écoulement
• B = Diffusion longitudinale
• C = Résistance aux transferts de masse
• U = vitesse linéaire de la phase mobile
• Optimisation
IV°) Facteurs liés à la chromatographie
• La température: Fondamental k’ est
fonction de T Si T augmente k’
diminue
• La composition de la phase mobile (HPLC -
CCM)
• Le débit de la phase mobile (u)
• Loi de Darcy: Perte de charge dans un
écoulement à travers un tube rempli
Chap N°4 La CPG
Sommaire
• Introduction
• Les phases stationnaires en colonne remplie
• Transposition colonne remplie / colonne
capillaire
• L’injection
• La détection
• La dérivatisation
I°) Introduction
• 1ère technique développée dès 1950
• Simplicité de mise en œuvre
• Rapidité des analyses complexes
• Matériel disponible et peu onéreux
• Nombreuses applications :
• NF T60-234 FAME Carbowax 20 M DB 20
F.I.D NF T60-237 BHA et BHT DC
200 CP Sil 5F.I.D
NF T90-120 PcB et Organo-chlorés OV17
DB5 ECD
NF T90-121 Atrazine et Simazine DB5
Thermo ionique
NF T90-125 COV halogénés Carbowax
1500 CPSil 5 ECD
Squalane 0 0 0 0 0 0
SE 30 15 53 44 54 41 217
OV 17 119 158 162 243 202 884
FFAP 340 590 397 602 627 2546
OV 275 666 1001 895 1177 1099 4838
24 Choix raisonné des phases
stationnaires
• Classification des solutés en 5 catégories Liées
à la polarité
• Le Greffage
• La chromatographie en phase inverse
• La chaîne chromatographique
I°) Introduction
• Le dosage de l’aflatoxine B1 dans les aliments pour
animaux (NF V 18-200)
• Applications analytiques:
– Fonctionnalités Différentes
– Isomères
– Solutés peu et moyennement polaire
• Applications en extraction (purification)
Fixation des espèces plus polaires
• Ordre d’élution: suivant l’ordre de polarité
• Faible coût – Pb de la phase mobile
21 Mécanismes d’adsorption
• Adsorption / désorption en surface
• Equation de Snyder
• log k’ = log Va + B*(E° - As °) + log (Wa/Vm)
• k’ = facteur de capacité
– Phase stationnaire: Va, Wa et Vm , B*
– Phase mobile: B* , °
– Soluté: As et E°
Facteurs liés à la phase stationnaire
• Va, Wa et Vm Liés à la taille des particules et
au remplissage
Peu d’actions Influence la
transposition Surface / volume
• B*Etat d’activité de l’adsorbant (0<B*<1)
Séchage des plaques et conservation au
dessicateur
Facteurs liés à la phase mobile
• ° et B*
• B* liée à la teneur en eau de la phase mobile
Solvant isohydrique utilisation d’acide et de
base pour réduire l’activité
• °: Force éluante Série éluotropique si °
Augmente, alors Rf augmente
(k’ diminue)
Développement isocratique et en gradient de
concentration.
Utilisation de mélanges binaires et ternaires
Facteurs liés au soluté
• As et E°
• As: surface spécifique : Pas d’action si ce n’est
une dérivatisation Changement de la
nature du soluté et des interactions
• E°: même remarque
III°) Le greffage
• Adsorption Contraintes
Activité du support
Isohydrie de la phase mobile Limites
2 types de phase : Silice
(alumine) échelle de polarité limitée
problèmes de traînées de pics
• 1970 Le greffage
II°) Le Greffage
• Modification du support siliceux par greffage
chimique d’espèces liquides: Si-OH Si-O-
Si-R R = Alkyl (C18, C8, C3, C2)
Phényl Amino
alkyl Nitro alkyl
Diols , Cyano….
• Notion de chromatographie de partage
• Echelle de polarité inversée / Adsorption
• End-Capping
Soluté Polaire Moyennement Moyennement Non
Polaire Polaire Polaire
L’Injection
• Couramment : 20 µl (1 à 50 µl)
• Injection en boucle Etalonnage
externe
• Vanne d’injection Six Voies
• Automatisation Passeurs automatiques
La détection - Généralités
• Notion de dérive (1 heure) bruit à long
terme (10 mn)
bruit à court terme (1 mn)
• Sensibilité:Pente de la courbe:
Réponse = f (Concentration initiale)
• Concentration minimale détectable: n fois le
bruit à court terme
• Détection directe et différentielle
Les différents Détecteurs
Détecteurs Détecteurs Détecteurs
Simples semi Informatifs intelligents