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Hemoglobine Version FRA
Hemoglobine Version FRA
CERBA
Recommandations pour la mise en œuvre
et l’interprétation de l’étude de l’hémoglobine
SOMMAIRE
RAPPELS SUR L’HÉMOGLOBINE
1) Structure de la molécule d’Hb p. 3
2) Gènes de l’Hb p. 3
3) Différentes Hb humaines p. 3
HÉMOGLOBINOPATHIES
1) Types d’hémoglobinopathies p. 4
2) Variants fréquents p. 4
HbS p. 4
HbC p. 6
HbE p. 7
3) Thalassémies p. 8
α-thalassémies p. 8
β-thalassémies p.10
δβ-thalassémies et persistance héréditaire de l’HbF p.11
δ-thalassémies p.11
ETUDE DE L’HÉMOGLOBINE
1) Circonstances de prescription p.12
2) Conditions nécessaires à l’interprétation des résultats p.12
3) Prélèvement p.12
4) Valeurs normales p.12
5) Techniques p.12
6) Nomenclature des actes de biologie médicale (janier 2010) p.13
2 7) Recommandations de la S.F.B.C. p.13
8) Caractéristiques des différentes techniques de l’étude de l’hémoglobine p.14
γ
(unités arbitraires)
ζε http://globin.cse.psu.edu/globin/hbvar/menu.html
HbS
Seuls 1/3 d’entre eux ont des répercussions
cliniques, la mutation intervenant dans une zone L’HbS est un mutant de la chaîne β où l’acide
δ critique pour le fonctionnement de la molécule. glutamique en position 6 est remplacé par une
Trois Hb anormales occupent une place valine. Elle définit la drépanocytose, maladie
prépondérante de par leur fréquence et leur génétique à transmission autosomique récessive.
Grossesse en semaines Naissance Age en mois
caractère pathogène : HbS, HbE et HbC.
Répartition géographique
Les Hb anormales peuvent être classées en L’HbS est fréquente chez les sujets originaires
4 groupes : d’Afrique noire (jusqu’à 25 % de la population
LES HEMOGLOBINOPATHIES 1] Les variants qui sont à l’origine de problèmes de dans certaines régions) et également retrouvée
santé publique majeurs. Il s’agit surtout des HbS aux Antilles (10-12 %), au Maghreb, en Sicile,
4 1) Types d’hémoglobinopathies dans la population africaine et des HbE dans les en Grèce, dans tout le Moyen-Orient et aux Indes.
populations du sud-est asiatique ;
Les hémoglobinopathies sont de deux types : Diagnostic biologique et clinique
2] Les variants plus rares mais présents dans les L’HbS est détectée par les techniques
- le premier correspond à la présence d’une Hb populations où l’HbS a une forte prévalence. C’est électrophorétiques et/ou chromatographiques, un
de structure anormale, entraînant ou non des le cas des HbC, O-Arab et D-Punjab, qui par elles- seul test n’étant pas suffisant pour affirmer son
signes fonctionnels ; mêmes n’ont qu’un effet pathogène minime, mais existence. Il est recommandé de confirmer sa
- le second à un défaut de synthèse, partiel ou qui, associées à l’HbS, conduisent à des syndromes présence par des tests fonctionnels (test de solubilité,
total des chaînes α et/ou β, qui s’exprime dans le drépanocytaires majeurs ;
test de falciformation) pour différencier l’HbS des autres coéluer avec l’HbA2. Le tableau I résume les infections bactériennes. Ces formes nécessitent une
variants migrant ou coéluant en même temps. Le caractéristiques cliniques et biologiques des prise en charge précoce par un centre spécialisé.
dosage précis des différentes fractions est différentes formes de drépanocytose. Les formes Chez un hétérozygote symptomatique, une étude
indispensable pour affiner le diagnostic. sévères, appelés syndromes drépanocytaires complémentaire est nécessaire pour rechercher une
Le taux d’HbA2 mesuré par CL-EC majeurs, associent trois grandes catégories de mutation supplémentaire sur les gène β ou α, en cis
(Chromatographie Liquide-Echange de Cations) peut manifestations cliniques : anémie hémolytique ou en trans. C’est le cas pour identifier l’HbS-Antilles,
être légèrement augmenté chez un porteur d’HbS en chronique avec épisodes d’aggravation aigus, pour laquelle une seconde mutation (β 23 Val/Ile) sur
raison de la présence de dérivés de l’HbS pouvant phénomènes vaso-occlusifs, susceptibilité aux le gène de l’HbS favorise la polymérisation de l’Hb.
N : normal
* : Le taux d’HbF est variable et doit être déterminé avec précision car il est admis que dès qu’il dépasse 10 %, il suffit à inhiber partiellement la polymérisation et à retarder la falciformation.
V : variable car le dosage de l’HbA2 peut être l’objet d’une contamination par des fractions dérivées de l’HbS
** : HbD-Los Angeles est aussi appelé D-punjab
Dans les syndromes drépanocytaires majeurs, Conseil génétique HbC
l’existence d’une α-thalassémie associée doit La présence d’HbS chez des parents
également être recherchée car elle semble asymptomatiques doit donc être prise en L’HbC est un variant de la chaîne β où l’acide
associée à certaines complications. Elle peut être compte dans le conseil génétique de la glutamique en position 6 est remplacé par une
suspectée sur des arguments indirects (constantes drépanocytose. Ces couples doivent être lysine. Elle définit l’hémoglobinose C.
hématologiques, taux d’HbS, présence d’Hb informés du risque de syndrome
Bart’s ou d’HbH) ou recherchée spécifiquement drépanocytaire majeur dans leur Répartition géographique
par des techniques de biologie moléculaire. descendance. C’est un variant caractéristique de l’Afrique de
l’Ouest (jusqu’à 20 % de la population dans
certaines régions), présent également aux
Tableau II : caractéristiques biologiques et cliniques des hémoglobinoses C Antilles (3 %).
Diagnostic biologique
Diagnostic biologique et clinique
Statut génétique Expression clinique Etude de l’Hb
NFS Le tableau II résume les caractéristiques cliniques
HbA (%) HbC (%) HbF (%) HbA2 (%) et biologiques des différentes formes génétiques
Hémoglobinose C Normale, parfois de l’hémoglobinose C. La présence exclusive
60-65 35-40 <1 <3 d’HbC chez un individu est à l’origine d’une
hétérozygote discrètement microcytaire
30 et 35(1 seul
anémie hémolyptique chronique généralement
Hémoglobinose C Asymptomatique
Microcytose sans carence gène α délété) modérée.
hétérozygote et 60-75 <1 <3
martiale associée 25-30 (2 gènes α
α-thalassémie associée délétés) Conseil génétique
Anémie hémolytique C’est l’association HbS/HbC qui est grave
chronique modérée puisqu’elle conduit à un syndrome
Anémie (Hb > 8g/dl)
Mécanisme : drépanocytaire majeur.
microcytaire
Hémoglobinose C cristallisation de l’HbC La présence d’HbC doit donc être prise en
CCMH (38 %) 0 > 90 <3 <3
homozygote -> déshydratation cel-
cellules cibles++
compte dans le conseil génétique de la
lulaire et moindre drépanocytose.
microsphérocytes
déformabilité Les couples risquant d’avoir un enfant avec une
des hématies
hémoglobinopathie SC doivent être informés du
6
Anémie (7-10 g/dl) risque de syndrome drépanocytaire majeur dans
Hétérozygotie
composite
Thalassémie microcytaire
0 > 90 2-10 <3 leur descendance.
intermédiaire cellules cibles++
C/β°-thalassémie
microsphérocytes
Anémie modérée
Hétérozygotie Anémie hémolytique microcytaire
20-30 60-80 2-10 <3
C/β+-thalassémie chronique modérée cellules cibles++
microsphérocytes
HbE démasque un site d’épissage alternatif qui conduit Répartition géographique
à une synthèse avortée pour une partie de la Elle concerne essentiellement les populations du
L’HbE est un mutant de la chaîne β où l’acide chaîne β mutée. Le problème n’est donc pas celui sud-est asiatique où sa prévalence peut s’élever
glutamique en position 26 est remplacé par une d’une protéine anormale mais celui d’une jusqu’à 60 % dans certaines régions.
lysine. Elle définit l’hémoglobinose E. C’est sans synthèse en quantité insuffisante de cette protéine En raison d’une forte immigration des populations
doute la plus fréquente des Hb anormales au anormale. Les chaînes β mutées sont en trop faible du sud-est asiatique vers les pays occidentaux, on
niveau mondial. L’HbE constitue un modèle quantité pour se lier aux chaînes α disponibles et l’observe aujourd’hui partout dans le monde.
particulier de β+-thalassémie. La mutation conduisent à un tableau β+-thalassémie.
4
Mort fœtale in utero dans
α°-thalassémie homozygote un tableau d’hydrops Etude moléculaire Sud-est asiatique, Chine,
4 gènes α non fonctionnels
(--/--) foetalis avec anasarque indispensable bassin méditerranéen
foetoplacentaire
β-thalassémies ces régions. La présence d’un gène Les anomalies moléculaires sont le plus souvent
thalassémique assure un certain degré de des mutations ou de courtes délétions ou
Répartition géographique protection contre le paludisme, ce qui explique insertions, limitées à quelques nucléotides. Plus
Les β-thalassémies sont très fréquentes dans une cette large répartition. de 200 lésions différentes ont été décrites mais
large région qui englobe le bassin une dizaine seulement est responsable de 80 %
méditerranéen, l’Afrique, le Moyen-Orient, le Génotype et phénotype des cas. Lors du typage d’une mutation, l’origine
sous-continent indien, le sud-est asiatique, la Le tableau VI résume les caractéristiques cliniques géographique du patient est un élément
Mélanésie et de nombreuses îles du Pacifique. La et biologiques des β-thalassémies. d’orientation important car chaque zone
fréquence de l’anomalie varie de 1 à 20 % dans géographique présente un spectre de mutations
caractéristique.
β-thalasssémies Définition clinique : Anémie microcytaire - HbF Sur le plan moléculaire, on retrouve :
intermédiares expression plus sévère que (Hb entre 6 et - HbA2 - homozygoties ou hétérozygoties composites pour des tha-
celle d’une thalassémie mi- 9 g/dl) - HbA absente ou ↓ lassémies peu graves (exemple : HbE/β-thalassémie) ;
neure sans toutefois attein- - thalassémie majeure dont l’expression est atténuée par une
10 dre celle d’une thalassémie Remarque : autre anomalie (exemple : synthèse élevée d’HbF) ;
majeure => transfusions Taux variables en fonction du type d’anomalies moléculaires en cause -> doit - association aggravant une atteinte hétérozygote
sanguines exceptionnelles être complétée par des techniques de biologie moléculaire qui précisent la nature (exemple : triplication α aggravant une β-thalassémie) ;
=> conseil génétique des anomalies et permettent de rechercher une α-thalassémie associée. - association thalassémie/Hb instable.
Ref. : Lainey E, Boirie M, Fenneteau O. Hémogramme en pédriatrie : variations physiologiques. Rev Fr Lab 2009 ; 419 : 49-59 Le tableau IX résume les caractéristiques des
différentes techniques d’étude de l’Hb.
6) Nomenclature des actes de biologie . 4055 (B400) : deux mutations Il est à noter que ce travail ne prenait pas encore
médicale (janvier 2010) . 4056 (B600) : plus de deux mutations en compte l’essor croissant de l’électrophorèse
. si les recherches précédentes n’ont identifié capillaire dont les performances pour mesurer les
Chapitre “Hématologie” qu’une ou aucune mutation : étude indirecte taux d’HbA2 et F sont actuellement jugées
par analyse de la ségrégation de équivalentes à celles de la CL-EC.
- 1113 (B60) : Electrophorèse de polymorphismes de l’ADN : 4057 (B700)
l’hémoglobine en gel de polyacrylamide Figure 5 : Stratégie proposée par la SFBC
- 1114 (B60) : Electrophorèse de Ces analyses s’entendent par individu étudié. pour la recherche d’une anomalie de l’Hb
l’hémoglobine en citrate agar Elles ne sont pas cumulables.
Les cotations de ces deux examens 1113 et
1114 ne sont cumulables que lorsque - diagnostic prénatal d’une α-thalassémie :
Electrophorèse pH alcalin
l’électrophorèse en gel de polyacrylamide . 4058 (B500) : avec antécédents familiaux connus ou isoélectrofocalisation
suggère la présence d’HbC ou E. . 4059 (B700) : sans antécédents familiaux
TECHNIQUES ELECTROPHORETIQUES
Electrophorèse A pH 8.5, la molécule d'Hb char- Simple à mettre en œuvre - pas suffisamment précise pour Technique la plus utilisée
à pH alcalin gée négativement migre vers quantifier les fractions mineures, -> 73 % des participants lors de la
sur acétate de cellulose l'anode -> les hémoglobines qui HbA2 et HbF dernière opération de contrôle de
ont un gain de charge positive - faible pouvoir résolutif qualité organisée par l’AFSSAPS
migrent plus lentement. -> impossible de distinguer des en 2004
variants de même migration :
HbS/D-Punjab ou
HbE/HbC/HbO-Arab
-mise en défaut chez le
nouveau-né où l’HbF est mal sé-
parée des HbA et HbS
Electrophorèse La mobilité de la molécule Contribue à l’identification Extrêmement sensible aux La nomenclature la réserve au cas
sur gel d’agar d'hémoglobine dépend des des Hb anormales préalable- conditions expérimentales où l’électrophorèse en gel de poly-
à pH acide modifications structurales ment identifiées par l’électro- -> reproductibilité difficile acrylamide suggère la présence
induites par la mutation dans cer- phorèse à pH alcalin ou la d’HbC ou E.
taines régions positivement char- focalisation isoélectrique
gées de la protéine
Focalisation isoélectrique Utilise la différence de point - Permet traiter de grandes sé- - Technique semi automatisée, Méthode utilisée pour le
sur gel d’agarose isoélectrique des Hb ries plus longue et plus complexe à dépistage néonatal
ou de polyacrylamide - Très bonne résolution mettre en œuvre que l’électropho-
-> méthode de choix pour la rèse sur acétate de cellulose
détection des Hb anormales - Pas suffisamment précise pour
quantifier les fractions mineures,
HbA2 et HbF
- ne différencie pas
HbS/HbD/HbG/HbLepore, non
plus que HbC/HbE/HbO-Arab.
Electrophorèse capillaire - Rapide Plusieurs variants ayant le même Tend à devenir une technique de
14 - Automatisée comportement que les Hb anor- choix de première intention pour
- Performances satisfaisantes males les plus courantes, il reste l’étude de l’Hb
pour doser les fractions mi- impératif de confronter les résul-
neures, HbA2 et HbF tats à ceux obtenus par une autre
- Bonne résolution : à l’écran, technique
en plaçant le curseur sur le pic
anormal, le logiciel indique
pour chaque zone définie par
le constructeur, une liste de
variants potentiels
TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES
Chromatographie Les différentes fractions d’hémo- - Automatisée et adaptée à de D’autres variants pouvant coéluer Considérée par de nombreux la-
globine sont séparées par un gra- grandes séries avec les Hb anormales les plus boratoires comme la méthode de
liquide* sur colonne - Calibrée -> excellente préci-
dient de tampons de force ionique courantes, il reste impératif de choix pour dépister et quantifier
échangeuse de cations et de pH croissants sion pour le dosage des frac- confronter les résultats à ceux les différentes fractions d’Hb nor-
(CL-EC) tions HbA2 et HbF obtenus par une autre technique males et anormales (cf pro-
- Identification présomptive grammes de contrôle de qualité
des variants les plus courants internationaux)
(HbS, HbC) faite par leur
* CLHP temps d’élution à l’intérieur
de « fenêtres » définies par le
constructeur
Chromatographie liquide Etude séparative des chaînes de - Contribution à la séparation Réservée aux laboratoires spéciali-
globine et l’identification des variants sés pour l’étude de l’Hb
haute performance en rares (exemple : HbS Antilles)
-> les chaînes polypeptidiques
phase inverse (RT- sont séparées en fonction de leur - Caractérisation des Hb
HPLC) hydrophobicité fœtales (diagnostic de PHHF) 15
TESTS SPECIFIQUES
- Anomalies qualitatives :
. cas simples : HbA + présence
d’un variant fréquent S, E ou C (fig.10) Bilan martial
. cas complexes : absence d’HbA + présence
d’un variant fréquent S, E, C ou présence d’un
variant rare (fig.11) Absence
Carence
de carence
en fer
en fer
NFS
Bilan martial
Absence Carence
de carence en fer
en fer
NFS NFS
Contexte clinique ?
Taux d’HbA ?
Microcytose, hypochromie
Absence de microcytose +/-pseudopolyglobulie
+/- anémie (> 10 g/dl)
Anémie (< 10 g/dl) + microcytose
HbF < 5 %
-> augmentation modérée HbF > 5 %
. Contexte clinique de
-> Grossesse ? thalassémie majeure
-> iPHHF -> iδβ-thalassémie -> iPHHF ou intermédiaire
-> Diabète ? hétérozygote ? hétérozygote homozygote
-> Hyperthyroïdie ?
-> Eryhtropoïèse de stress : . Chez un enfant :
. phase régénérative d’une enquête familiale pour confirmer la présence de l’anomalie chez
anémie carentielle ou les parents, dépister les porteurs de l’anomalie au sein de la famille -> iδβ-thalassémie
d’une anémie hémolytique ?
. Au cours de la grossesse: homozygote 21
. chimiothérapie ?
. traitement par EPO ? étude de l’ Hb du conjoint : si risque d’hémoglobinopathie majeure,
. myélodysplasie ? conseil génétique pour un diagnostic anténatal
22
-> Hétérozygotie -> Hétérozygotie -> Hétérozygotie
icomposite i composite i composite Confirmation des génotypes
S/β+-thalassémie ? C/β+-thalassémie ? E/β+-thalassémie ?
Au cours de la grossesse -> étude de l’ Hb du conjoint -> si risque d’hémoglobinopathie majeure, conseil génétique
-> si nécessaire, confirmation et identification moléculaire des anomalies dans un laboratoire spécialisé en vue du diagnostic anténatal Laboratoire spécialisé dans l’étude de l’Hb
EXEMPLES Exemple 1 : Profil normal
Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM
Génotype Age Origine
1) Profil normal (T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl)
Pourcentage (%)
6) β-thalassémie intermédiaire
7) β-thalassémie majeure
8) Drépanocytose hétérozygote
9) Drépanocytose homozygote
10) Hémoglobinose H
11) Hb Lepore hétérozygote Temps (minutes)
Ferritine
41 ng/ml
Temps (minutes)
Exemple 3 : β-thalassémie mineure Exemple 5 : δβ-thalassémie mineure
Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM
Génotype Age Origine Génotype Age Origine
(T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl) (T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl)
Hétérozygotie Hétérozygotie
36 Italie 5,49 11,8 21,5 31,7 3,37 68 (δβ) Sicile (13,4 34 Italie 6,32 12,9 20,4 33,2 38,9 62
(β°) cod 39 Kb délétion)
Pourcentage (%)
Temps (minutes) Temps (minutes)
Pourcentage (%)
HbA = 42,6 %
Ferritine
1137 ng/ml
Temps (minutes) Temps (minutes)
Exemple 7 : β-thalassémie majeure Exemple 9 : Drépanocytose homozygote
Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM
Génotype Age Origine Génotype Age Origine
(T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl) (T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl)
Hétérozygotie Homozygotie
(β°) cod 51/ HbS [β6 (A3) 11 Niger 3,91 7,9 23,3 30,6 26,0 66
Hb Lepore 8 Roumanie 3,18 6,9 21,7 30,8 22,4 70 Glu->Val]
(δ-β hybride)
Gγ-158 C->T
HbA2 = 2,4 %
HbF = 0,4 %
HbA2 = 5,4 %
HbA = 0 %
Pourcentage (%)
HbF = 94,3 %
Pourcentage (%)
HbS = 83,7 %
HbA = 0%
Ferritine Ferritine
Pourcentage (%)
Ferritine
853 ng/ml
Temps (minutes) Temps (minutes)
Exemple 11 : Hb Lepore hétérozygote Exemple 13 : Hémoglobinose E hétérozygote + α-thalassémie
Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM
Génotype Age Origine Génotype Age Origine
(T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl) (T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl)
Hétérozygotie Double hétérozy-
Hb Lepore 18 Italie 6,12 12,9 21,1 30,8 42 68 gotie [β26 Glu -> 34 Vietnam 6,89 14,7 21,4 31,9 46,2 67
(δ-β hybride) Lys] +(α°) -- SEA
Pourcentage (%)
Ferritine
203 ng/ml
Temps (minutes) Temps (minutes)
35 Togo 4,87 14 28,7 36 39 80 [β6 Glu -> Val/ 14 Jamaïque 4,03 10,5 26 32 33 82
[β6 Glu->Lys] β6 Glu -> Lys]
Hétérozygotie Hétérozygotie
HbD-Los An- HbJ-Broussais
73 France 4,09 13,9 34,1 34,3 40,6 99 79 France 4,41 13,1 29,8 32,5 40 92
geles [β121 [α 1 90
Glu->Gln] Lys->Asn]
Pourcentage (%)
HbF = 0,3 % HbJ = 17,1 %
HbA = 52,7 % HbA = 68,5 %
Exemple 16 : Variant bêta + variant alpha + α-thalassémie Exemple 18 : Variant bêta instable : Hb Köln
Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM Hématies Hb TCMH CCMH Hématocrite VGM
Génotype Age Origine Génotype Age Origine
(T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl) (T/l) (g/dl) (pg) (%) (%) (fl)
Hétérozygotie Hétérozygotie
HbS + hétéro- Hb Köln [β98 10 France 3,95 10,7 27,2 29,2 36,7 93
zygotie HbG Val->Met]
71 Antilles 5,73 12,8 22 31 39 68
Philadelphie
+ α-thalassémie
[-α G /-α]
HbA2 = 3,3 %
HbA2 = 3,9 % HbF = 2,1 %
27
HbA = 32,7 % HbA = 77 %
Pourcentage (%)
Pourcentage (%)
℡ : +33 1.34.40.97.76
: +33 1.34.40.21.29
: intfr@lab-cerba.com
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