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At Traitements Thermiques Du Lait
At Traitements Thermiques Du Lait
AT de biotechnologies
L’objectif de la séance est de réaliser une pasteurisation du lait avec différents protocoles de
chauffage. Au cours du chauffage des prélèvements seront réalisés à différents temps pour
suivre l’efficacité du traitement. On réalisera :
-un contrôle direct de la pasteurisation, par numération des germes totaux au cours du
temps.
à la fin de la pasteurisation, on étudiera la cinétique de décroissance des germes afin de
proposer un barème de pasteurisation temps / température efficace pour chaque protocole.
La phosphatase alcaline est une enzyme naturellement présente dans le lait non thermisé.
Lorsque le lait est chauffé suffisamment, la phosphatase alcaline est progressivement
dénaturée, donc devient inactive. En conséquence, si la pasteurisation d’un lait a été réalisée
correctement, on ne doit donc pas pouvoir mesurer dans ce lait une activité PAL significative.
La détermination de l’activité phosphatasique permet donc indirectement de
savoir si la pasteurisation a été réalisée correctement.
On dispose d’un lait cru dont la contamination bactérienne est estimée à environ 106
bactéries / mL. On réalisera 3 essais de pasteurisation :
-50°C / 30 min (quadrinôme 1),
-60°C / 30 min (quadrinôme 2),
-70°C / 30 min (quadrinôme 3).
Mode opératoire :
Par quadrinôme :
-introduire le flacon de lait à pasteuriser, et laisser pré-incuber maximum 1 minute,
-déclencher le chronomètre à t=0,
Pour chaque prélèvement (t=0, 10, 20 et 30 min), à partir de la première dilution décimale
du lait, réaliser le nombre de dilutions décimales nécessaires pour permettre le
dénombrement des germes en masse en gélose nutritive.
On fait agir le lait traité sur un substrat synthétique, le phénylphosphate, en respectant les
conditions permettant une mesure d’activité :
- concentration en substrat saturante permettant d’obtenir une Vi m,
- pH et température constant, et proche de l’optimum (pH 10 et 37°C).
Cette méthode deux points est nécessaire car le phénol n’ayant pas de propriétés spectrales
particulières, on ne peut pas suivre en continu la réaction. Après arrêt de la réaction on
ajoute un réactif de coloration (réactif de Gibbs) permettant la formation d’un complexe
coloré à partir du phénol.
L’absorbance du complexe coloré, qui est proportionnelle à la quantité de phénol, est
mesurée à 610 nm.
Les essais seront comparés à une gamme d’étalonnage de phénol et l’activité sera exprimée
en µg de phénol libéré par heure et par g de lait (à pH 10 et à 37°C).
2-Mode opératoire
La couleur du lait rend les tubes opaques et empêche d’y mesurer une absorbance. Cette
opacité provient de protéines lactiques (caséines) et d’émulsions de matières grasses. On
élimine ces composés parasites par défécation
Pour cela, ajouter dans les tubes 1 mL de solution défécante. Homogénéiser le précipité
obtenu puis filtrer.
Le lait testé est contaminé : il est donc nécessaire d’éliminer dans une poubelle
DASRI le matériel jetable en contact avec le lait (tubes plastiques, filtre…).
Le matériel non jetable devra être placé dans un sac à autoclave en prévision
d’une décontamination à l’autoclave (entonnoirs).
-A l’aide d’une fiole de 50 mL réaliser une dilution au 1/10 d’une solution de métaborate de
sodium.
Tubes 0 1 2 3 4 5
Réflexion préliminaire
Q1. Prévoir les dilutions décimales à réaliser en jour 1 pour l’étude de la cinétique de
décroissance bactérienne.
Q4. Expliquer le choix des valeurs 37 et 100°C pour le protocole de détermination d’activité.
Exploitation
Q7. Proposer un tableau de résultats du dénombrement pour chaque temps testé et pour
chaque dilution.
Q9. Mutualiser les résultats dans le tableau de synthèse proposé dans le document n°2.
Q10. Tracer la courbe cinétique de destruction thermique des bactéries UFC/mL = f(t) pour
chaque protocole de pasteurisation testé dans la salle (les tracés seront superposés sur le
même graphique).
Q14. Exploiter les résultats issus du témoin 2 afin de calculer pour chaque essai et pour le
témoin 1, la masse de phénol apparue dans le tube de coloration suite à la seule action de la
phosphatase alcaline.
Q16. Calculer l’activité phosphatasique du lait non traité et du lait traité. Conclure sur
l’efficacité du protocole de pasteurisation étudié.
Synthèse
Q17. A l’aide de l’ensemble des résultats obtenus, argumenter afin de proposer un barème
de pasteurisation (temps / température) permettant de traiter efficacement le lait.
Concentration bactérienne
réelle (UFC/mL) à 45°C
Concentration bactérienne
réelle (UFC/mL) à 55°C
Concentration bactérienne
réelle (UFC/mL) à 65°C
… pour un lait convenablement pasteurisé, l'activité phosphatasique doit être inférieure à une masse de 4 µg de
phénol libéré / h / par g de lait à pH=10 et 37°C.
Afin de vérifier que cette masse de phénol provient bien de la catalyse enzymatique par la phosphatase alcaline,
il est nécessaire de vérifier l’évolution spontanée de la réaction non catalysée afin de retrancher éventuellement
la masse de phénol qui apparaitrait spontanément sans lien avec l’action enzymatique…
Définition : l’activité d’une enzyme est la quantité de substrat qu’elle peut transformer par
unité de temps dans des conditions opératoires précises : lorsque la concentration en
substrat est saturante, pH et t°C constants, non dénaturants et si possible optimum.
Une activité s’exprime en nombre de moles de substrat transformé par unité de temps :
• Même si par définition une activité enzymatique s’exprime à l’aide d’un nombre de moles
de substrat transformé, il n’est pas toujours possible d’avoir recours à cette valeur. En effet,
on mesure parfois l’apparition d’un produit :
• L’activité peut également être exprimée à partir de grandeur dérivant du nombre de moles
de substrat ou de produit : masse ou concentration de substrat ou produit…