AU 2022/203

Module : METHODES DE SEPARATION (C514)

Travaux dirigés, Serie 6

Exercice 1 : Détermination du temps mort en CPG

La méthode la plus connue d’estimation du temps mort tM consiste à mesurer le
temps de rétention d’un composé non retenu (couramment le méthane en CPG).
On propose ici une autre méthode faisant appel à la relation utilisée dans
l’établissement des indices de rétention, à savoir que dans une série homologue de
composés organiques on peut écrire, si la température de la colonne ne varie pas :
log(tR − t M ) = a • n + b
tR représente le temps de rétention du composé à n atomes de carbone, a et b
sont des constantes qui dépendent de la classe des solutés et de la phase stationnaire
choisie.

Calculer tM à partir de l’expérience suivante : on injecte un mélange d’alcanes linéaires

à 6, 7 et 8 atomes de carbone. Les temps de rétention sont respectivement 271, 311 et
399 s en régime isotherme à 80 °C.

Exercice 2 : HPLC
Dans cette expérience, un mélange de 5 peptides est analysé en chromatographie liquide.
L’échantillon (1µl) est injecté dans une cap HPLC avec une colonne capillaire de phase
inverse C18.

Le gradient d’élution est composé de deux solvants A et B:

A: H2O / Acetonitrile (98:2) B: Acetonitrile / H2O (80:20)
Le gradient appliqué durant la chromatographie est représenté en pointillés sur le
chromatogramme suivant.

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Module : METHODES DE SEPARATION (C514)

Travaux dirigés, Serie 6

Les espèces non retenues sortent à 3 min après l’injection.

Peptide Temps de rétention Largeur de pic (min)

1 15.242 (min) 0.273
2 17.084 -
3 17.300 -
4 19.434 0.296
5 22.167 0.249

1) Déterminer le facteur de rétention k’ de chaque peptide ainsi que le facteur de

séparation a pour les couples de peptides 1/2, 2/3, 3/4 et 4/5.
2) À partir des facteurs de rétention et de séparation des peptides 4 et 5, déterminer la
résolution de la colonne.

Les temps de rétention et largeur de pic pour chaque peptide, déterminés à partir du
chromatogramme précédent sont indiqués dans le tableau suivant:

3) Calculer le nombre de plateaux théoriques et la hauteur équivalente de plateaux

théoriques de la colonne HPLC utilisée.
À votre avis, est-ce suffisant pour avoir une séparation convenable ?
4) Pourquoi les peptides 2 et 3 sont-ils élués quasiment en même temps ?

Exercice 3
Les coefficients de partage entre l’eau et l’hexane pour deux composés M et N sont
respectivement 6.01 et 6.20 (KD = CH2O / CHexane ). Les deux composés sont
élués par l’hexane sur une colonne compacte remplie de gel de silice, à la surface
de laquelle est adsorbée de l’eau. Le rapport de phase pour le remplissage est 0.422.

a) Calculer le facteur de capacité pour chacun des solutés.

b) Calculer le facteur de sélectivité.
c) Combien de plateaux sont nécessaires pour obtenir une résolution de 1.5 ?
d) Quelle doit être la longueur de la colonne si la HEPT est 2.2·10-3 cm ?
e) Si le débit dans la colonne est de 7.10 cm/min, combien de temps faut-il pour
éluer les deux composés ?