Dosage de la Glutathion S-transfèrase (GST)

Selon Habig et al. (1974)

1. Préparation des produits :

I- Tampon phosphate de sodium (0,1 M, pH 6) avec saccharose pour la conservation et

l'homogéinisation des échantillons

1)- Tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 6 :

a) Na2HPO4 (12 H2O) 35,8 g 1l H2O distillée

b) NaH2PO4 (1 H2O) 13,8 g 1l H2O distillée

- Mélanger 123 ml de (a) + 877 ml de (b) + 42 g de Saccharose

NB: Préparer le même tampon phosphate (0,1 M, pH 6) sans saccharose pour la préparation de la
solution ci-dessous

II- Soltion CDNB 1 mM / GSH 5 mM dans du tampon phosphate de sodium (0,1 M, pH 6) sans
saccharose

NB: Les deux quantités des deux produits càd 20,26 mg CDNB et 153,65 mg GSH sont toutes les deux
diluées dans 1ml d'éthanol puis dans la même quantité de tampon phosphate 0,1 M, pH 6 (sans
saccharose) càd 100 ml

2)- CDNB (1-chloro-2-4-dinitrobenzene) 1 mM : PM = 202,6

202,6 g 1M 1l

202,6 mg 1 mM 1l = 1000 ml

202,6 mg 1000 ml 202,6 x 100

X= = 20,26 mg
X 100 ml 1000

1 mM = 20,26 mg CDNB / 100 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6 sans saccharose

3)- GSH (glutathion réduit) 5 mM : PM = 307,3

307,3 g 1M 1l

307,3 mg 1 mM 1l 5 x 307,3
X1 = = 1536,5 mg
X1 5 mM 1l 1

1536,5 mg 5 mM 1l = 1000 ml

1536,5 mg 1000 ml 1536,5 x 100

X2 = = 153,65 mg
X2 100 ml 1000

5 mM = 153,65 mg GSH / 100 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6

Dr. Karima SIFI

2. Mode opératoire :
L'échantillon est homogénéisé
dans 1 ml de Tampon phosphate (0,1 M, pH 6) avec saccharose

Centrifugation à 14000 trs/mn pendant 30 mn

Le surnageant est récupéré est servira comme source d’enzyme

Pour le blanc : Pour l’échantillon :

1,2 ml du mélange 1,2 ml du mélange

(CDNB 1 mM + GSH 5 mM) (CDNB 1 mM + GSH 5 mM)

+ +

200 µl d’H2O distillée 200 µl du surnageant

Lecture des absorbances au spectrophotomètre à U.V toutes les 1 mn pendant 5 mn

à une longueur d’onde de 340 nm

2. Calcul de l’activité spécifique de la GST :

Δ DO/mn Vt
Activité spécifique de la GST = x mg de protéines
(µM/mn/mg de protéines) e Vs

 Δ DO: pente de la droite de régression obtenue après hydrolyse du substrat en fonction du temps
 e : Coefficient d’extinction molaire du CDNB = 9,6 mM-1 cm-1
 Vt : Volume totale dans la cuve = 1,4 ml [0,2 ml surnageant + 1,2 ml mélange CDNB/GSH]
 Vs : Volume du surnageant dans la cuve= 0,2 ml
 mg de protéines : Quantité de protéines exprimée en mg

Dr. Karima SIFI

 Dosage des protéines
Bradford (1976)

1. Préparation du BBC (Bleu Brillant de Coomassie) :

- BBC 100 mg
- Ethanol 95° 50 ml
- Agitation pendant 2 heures
- Acide orthophosphorique 85% 100 ml
- Complétez avec eau distillée jusqu’à 1000 ml
- Agitation pendant quelques minutes

2. Préparation de la solution mère :

* Solution mère de BSA (Albumine Sérum de Bœuf) à 1 mg / ml dans de l’eau distillée

- BSA 1 mg
- Eau distillée 1 ml

3. Réalisation de la gamme d’étalonnage :

Tubes à essai 1 2 3 4 5 6

BSA (µl) 0 20 40 60 80 100

H2O distillée (µl) 100 80 60 40 20 0

BBC (ml) 4 4 4 4 4 4

BSA (µg) 0 20 40 60 80 100

- Agiter les tubes par vortex

- Lecture des absorbances à une longueur d’onde de 595 nm Coloration bleue

4. Dosage des échantillons :

100 µl du surnageant
+
4 ml de BBC

Agiter les tubes par vortex

Lecture des absorbances à 595 nm

contre un blanc avec 100 µl d’eau distillée + 4 ml de BBC

Dr. Karima SIFI