Abstract

The search for new anti-inflammatory drugs with less side effects requires simple, fast and reliable screening methods. In
this context, we have developed a sensitive thin-layer chromatographic (TLC) assay on silica gel plates to detect
cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibition. COX-2 catalyzes two sequential enzymatic reactions: a first oxygenation step that
converts arachidonic acid into prostaglandin G2, and a subsequent reduction of prostaglandin G2 into prostaglandin H2.
Our test is based on the co-oxidation during this peroxidation step of a co-substrate, N,N,N′,N′-tetramethyl-p-
phenylenediamine (TMPD), leading to a blue-grey product. Therefore, COX-2 inhibitors appear on the TLC plate after
revelation as clear spots against the colored background. Parameters such as concentrations of enzyme, substrate, and
chromogenic reagent have been optimized. The limit of detection was found to be below the microgram for standard COX-2
inhibitors such as celecoxib or ibuprofen. The developed TLC assay was also conclusive when applied to 60 various natural
pure compounds and some complex natural extracts. Results demonstrated a COX-2 inhibitory activity mostly for triterpene
and sterol derivatives. This COX-2 TLC assay appears as a suitable low-cost and reliable strategy for the screening of natural
extracts to discover new anti-inflammatory compounds.

Keywords: thin-layer chromatography; cyclooxygenase-2 inhibition; enzyme assay; TMPD; naturals extracts; anti-
inflammatory drugs

Abstrait
La recherche de nouveaux médicaments anti-inflammatoires ayant moins d'effets secondaires nécessite des méthodes de
dépistage simples, rapides et fiables. Dans ce contexte, nous avons mis au point un test sensible par chromatographie en
couche mince (CCM) sur plaques de gel de silice pour détecter l'inhibition de la cyclooxygénase-2 (COX-2). La COX-2 catalyse
deux réactions enzymatiques séquentielles : une première étape d'oxygénation qui transforme l'acide arachidonique en
prostaglandine G2, et une réduction ultérieure de la prostaglandine G2 en prostaglandine H2. Notre test est basé sur la co-
oxydation pendant cette étape de peroxydation d'un co-substrat, la N,N,N′,N′-tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD),
conduisant à un produit bleu-gris. Par conséquent, les inhibiteurs de COX-2 apparaissent sur la plaque CCM après révélation
sous forme de taches claires sur le fond coloré. Les paramètres tels que les concentrations de l'enzyme, du substrat et du
réactif chromogène ont été optimisés. On a constaté que la limite de détection était inférieure au microgramme pour les
inhibiteurs standard de la COX-2 tels que le célécoxib ou l'ibuprofène. Le test TLC développé a également été concluant
lorsqu'il a été appliqué à 60 composés naturels purs différents et à certains extraits naturels complexes. Les résultats ont
démontré une activité inhibitrice de la COX-2 principalement pour les dérivés de triterpènes et de stérols. Ce test TLC COX-2
apparaît comme une stratégie fiable et peu coûteuse pour le criblage d'extraits naturels afin de découvrir de nouveaux
composés anti-inflammatoires.

Mots clés : chromatographie en couche mince ; inhibition de la cyclo-oxygénase-2 ; test enzymatique ; TMPD ; extraits naturels ;

médicaments anti-inflammatoires.

‫ملخص‬
‫ و في هذا‬.‫ سريعة و موثوقة‬، ‫البحث عن أدوية جديدة مضادة لاللتهاب و لها أقل تأثيرات سلبية يستدعي وسائل تحري بسيطة‬
‫ هذا اإلنزيم محفز مهم‬.2-‫ لقد طورنا طريقة تحليل حساسة على ورق السيليسيوم إليجاد مضادي إنزيم السيكلوأوكسيجيناز‬،‫السياق‬
‫ و الثانية هي تحول هذا‬2‫ األول وهي مرحلة األكسدة و التي فيها يتحول الحامض األراشيدوني إلى البروستاغالندين ج‬: ‫في تفاعلين‬
‫ اختبارنا مبني على األكسدة المتزامنة في مرجلة البيروكسيد للمادة الفاعلة " مفاعل ووستر " الذي‬.2‫األخير إلى البروستاغالندين ه‬
‫ مضادي هذا اإلنزيم يتراؤون على ورق السيليسيوم كبقع بيضاء على عكس المساحة‬، ‫ و لذلك‬.‫رمادي‬-‫يشير إلى منتوج أزرق‬
‫ المادة الفاعلة و المادة متزامنة التفاعل و قد طورناها توافقا مع ما وجدناه من نتائج‬، ‫ التعديالت كانت أساسا تركيز اإلنزيم‬.‫الملونة‬
.‫أولية‬
‫ الطريقة المطورة يمكن‬.‫وجدنا حدود الكشف بكميات أقل من الميكروغرام لمواد مضادة االلتهاب كالسيليكوكسيب و أيبوبروفان‬
‫ تشير النتائج إلى وجود تفاعل كبير و إلى حد هام في المشتقات‬.‫استعاملها لستين نوع طبيعي مختلف و بعض المستخرجات المعقدة‬
.‫التريتيربينية و الستيرول‬

‫يمكن اإلشارة بوسيلة التحري هذه على أنها مناسبة و ليست مكلفة و استراتيجية موثوق منها للتحري في مستخرجات طبيعية عديدة‬
‫إليجاد مضادات التهاب جديدة‬