Institut des sciences vétérinaires -Blida 1-

Redha BELALA
Associate Professor (Senior Lecturer) at ISV/Univ.BLIDA1
Carnivore Reproduction Veterinarian of EVSSAR
Head of Carnivore Reproductive Biotechnologies Platform/Univ.BLIDA1
 Plan
• Objectifs pédagogiques
• Anatomie
• Cycle œstral
• Techniques de suivi du cycle œstral
– Frottis vaginal
– Dosage de la progestérone

• Démarche de suivi du cycle œstral

• Mise en situation
 Objectifs pédagogiques:
• Objectifs de connaissance et de compréhension:
– Décrire les différentes phases du cycle
– Décrire les modifications cliniques, histologiques, physiologiques au
cours du cycle œstral chez la chienne.
– Décrire les particularités anatomiques histologiques et physiologiques
et expliquer leurs conséquences chez la chienne.
– Décrire les différentes méthodes subjectives de suivi et expliquer leurs
échecs.
– Décrire les méthodes objectives (techniques médicales) de suivi et
expliquer leurs avantages et leurs limites.
• Objectifs de synthèse:
– Arrêter une démarche de suivi du cycle en combinant frottis vaginal
et progestéronémie.
– Déterminer la période optimale de fécondabilité et arrêter un
protocole de saillie naturelle ou d’IA (semence fraîche ou congelée).
 Je vous présente « Hidy »
Vous allez devoir la supporter jusqu’à la fin du cours

Hey vets,
I have very important
things to tell you about
« Heat screening »

I apologize since i don’t

speack french but your
teacher will translate for
you !
Estrous Cycle
Hey vets,
Four things you should
absolutely know about
me:
monoestrienne à fonctionnement
sexuel intermittent
Imprégnation ostrogénique
« E2 → kératinisation »
La lutéinisation pré-ovulatoire du
follicule cavitaire.
Pas de facteur lutéolytique en
absence de fécondation.
Ovocytes pendus immatures
(maturation sous 48-56h)
Particularities and consequences
Intérêt d’un bon suivi du cycle
et gestion de l’inter-oestrus.
IK = marqueur cytologique de
« début, mi et fin » du proestrus
P4 = marqueur biologique
de ovulation
P4 ≠ marqueur biologique
de la gestation
ovulation ≠ moment optimal
de fécondabilité
Estrous Cycle Le cycle œstral chez la chienne
DUREE
PHASE EVENEMENT INTERVALLE
MOY

Prœstrus Maturation folliculaire 09 jours (08 – 17 j)

Maturité folliculaire +
Œstrus
ovulation
09 jours (08 – 21 j)

Metoestrus 60 jours
Phase lutéale (50 – 80 j)
(Dioestrus) 70 jours
03 – 05 mois
Anœstrus Repos sexuel 02 – 10 mois

Durée de l’ interœstrus:
5 à 7 mois
4 à 12 mois

Représentation schématique des quatre phases du cycle œstral chez la

chienne [EILTS BE; 2007a]
Quel est le principe du frottis vaginal ?

E2

Muqueuse vaginale:
+++ Desquamation
+++ Différentiation
+++ Multiplication (© DUMON 2009)
 50%
60%
80%
90%

70%

30%
40%

20%

10%
100%
IK

Début Pro-oestrus

30%
Milieu Pro-oestrus

50% Fin Pro-oestrus

70%

80-100 Oestrus
Œstrus :
IK = 80-100%

50%

Transition
Oestrus-metoestrus
Estrous Cycle Modifications hormonales pendant le cycle

P4

PLT

Fig 2.4: Représentation schématique des modifications endocriniennes au cours du cycle ovarien de la chienne non
gestante [CONCANNON PW; 1986]
Estrous Cycle Correspondance entre P4, LH et Ovulation

Fig 2.5: Correspondance Entre taux de LH et début d'augmentation de la Progestérone

[FONTBONNE A; 1992]

Tableau 2.1 : Progestéronémie et ovulation chez la chienne

(Prelaud P, Rosenberg D, Fornel P.; 2002)

Jour de la période Progestéronémie Progestéronémie

ovulatoire (nmol/l) (ng/ml)
Pic de la LH 3–6 1-2
Pic de la LH + 1 jours 6 – 12 2-4
Pic de la LH + 2 jours 12 - 30 4 - 10
 Lutéinisation pré ovulatoire du follicule cavitaire

Follicules Préovulatoires
Follicule ayant subi une lutéinisation
préoculatoire

Ce phénomène est du à une expression « acquisition » précoce

des récepteurs à LH sur les cellules de granulosa.
 Par recoupements

© England & Concannon, 2002

Estrous monitoring techniques Introduction

Nb de jours de
chaleurs
Ces méthodes subjectives sont
Acceptation du
mâle par la toutes très imparfaites et n’offrent
Critères chienne aucune fiabilité conduisant souvent
Subjectifs Acceptation de à des résultats aléatoires et
la chienne par le décevants dans le suivi des chaleurs
mâle

Aspects des
Objectif du suivi : écoulements
Suivi du Cycle Détermination de la
période de
fécondabilité
optimale. Endoscopie
Le critère fiable :
Déterminer le moment de l’ovulation
Frottis vaginal « Critère temporel pour la période de
Critères
fécondabilité ».
Objectifs
Dosage de la P4
sérique
Evaluons ces critères par rapport à cet
objectifs
Echographie
ovarienne
 (745 chiennes suivies au CERCA).
40% : fécondables entre le 10ème et le 13ème jour,
10% : avant… et 50% après.
 Which criteria for estrous monitoring?
(Vieilles pratiques à rompre avec)
Hey vets,
You should get rid of some
stereotypes and unreliable
creteria in estrous
screening:
It’s time for Quiz!
So, please answer by:

L’ovulation survient entre Jx Si la femelle accepte

et Jy à compter du début des l’acouplement par le mâle
chaleurs. c’est qu’elle est prête.

Mon étalon (souffleur) renifle L’aspect des écoulements

les chaleurs, s’il monte une renseigne de façon fiable sur
chienne c’est qu’elle est prête. la période de fécondabilité.
Vaginal cytology
(vaginal smear)
 Qu’est ce qu’un frottis vaginal ?

Examen cytologique de la muqueuse vaginale

(Cytologie exfoliative vaginale).

Frottis d’imprégnation Frottis

FROTTIS VAGINAL
hormonale cytopathologique

Cellules épithéliales. Cellules non épithéliales

« Kératinisation E2-induite » « Processus pathologiques »

Stades du Infertilité sans Troubles du

Hématies
Cellules
Leucocytes
cycle œstral troubles du cycle cycle œstral tumorales
Estrous monitoring techniques 1). Vaginal smear (Réalisation)

Techniques d’étalement d'un frottis vaginal

[EILTS BE; 2007] [BOWEN; 2000]

Technique d’écouvillonnage chez la chienne

[EILTS BE; 2007] [BOWEN; 2000]

Matériel pour coloration de MG-Giemsa modifiée : Diff-Quick® Matériel pour coloration d'Harris-Schorr.
[ENGLAND G, CONCANNON PW.; 2002] [PIERSON P et al.; 1999]
 Le frottis vaginal Harris-Schorr (15mn)
Diff-Quick® (15s)
(Quelle coloration choisir?)

15 secondes 15 minutes
Quelles sont les cellules visibles sur
la lame de FV ?
(D’où viennent ces cellules ?)

Cellules non épithéliales

Spermatozoïdes

Cellules Intermédiaires

Cellules Superficielles

Bactéries
Amas de Cellules superficielles
Estrous monitoring techniques 1). Vaginal smear (Interpretation)

Prœstrus

Prœstrus précoce (x400) Prœstrus moyen (x400) Prœstrus tardif (x400)

Œstrus

Faible grossissement (x 100) Fort grossissement (x 400)

Métœstrus

Metoestrus précoce (x 400) Metoestrus tardif (x 400)

Anœstrus

Faible grossissement (x 100) Fort grossissement (x 400)

Fig. 2.15 : Microphotographies de lames de frottis vaginaux aux différents stades du cycle œstral de la chienne
(colorés au trichrome d'Harris- Shorr) [FONTBONNE A; GUERIN C; 2003]
 Début pro-œstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis sale
✓ Prédominance: intermédiaires basophiles
nucléés.
✓ Indice de kératinisation < 30 %
✓ Présence habituelle de: GR.
 Milieu pro-œstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis sale, riche en cellules

✓ Nb équivalent de: cellules basophiles et
acidophiles.
✓ Indice de kératinisation = 50 %
✓ Présence de: GR.
 Fin pro-œstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis assez propre, riche en cellules

✓ Prédominance de: cellules acidophiles,
intermédiaires et superficielles.
✓ Cellules non regroupées en amas.
✓ Indice de kératinisation > 70 %
✓ Présence de: GR.
 Œstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis propre, riche en cellules

✓ Prédominance de: cellules acidophiles,
superficielles.
✓ Cellules regroupées en amas «chevauchées».
✓ Indice de kératinisation > 80 %.
✓ Absence de: GR*
Transition oestrus-metoestrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis +/- propre, riche en cellules.

✓ Nb équivalent de: cellules nucléés
basophiles et acidophiles.
✓ Indice de kératinisation = 50 %.
✓ Absence habituelle de: GR & PMN.
 Metœstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis sale, riche en cellules.

✓ Prédominance: cellules basophiles
intermédiaires et parabasales.
✓ Cellules regroupées sans se chevaucher.
✓ Indice de kératinisation < 20 %.
✓ Présence de: MPN.
 Anœstrus

Harris-Shorr x100 Harris-Shorr x400

✓ Frottis sale, pauvre en cellules.

✓ Présence quasi-exclusive de cellules
basophiles parabasales et intermédiaires.
✓ Indice de kératinisation < 10 %.
✓ Présence rare de: GR ou PMN en nb faible.
 Quelle valeur pour le frottis vaginal?
Hey vets,

What do you think

now about the
vaginal endoscopy ?

Examen de choix : (simple – peu onéreux – accessible en clinique –

résultat immédiat).
Moyen fiable pour définir chaque phase du cycle (Différencie entre
début, moitié et fin proestrus, localise l’œstrus et marque la transition œstrus-
metoestrus).
Pas de précision: (moment de l’ovulation & pic de LH).
Comment l’utiliser: Doit être associé à un autre marqueur objectif
(P4) pour un suivi convenable des chaleurs.
 50%
60%
80%
90%

70%

30%
40%

20%

10%
100%
IK

Début Pro-oestrus

30%
Milieu Pro-oestrus

50% Fin Pro-oestrus

70%

80-100 Oestrus
Œstrus :
IK = 80-100%

50%

Transition
Oestrus-metoestrus
Progesterone measurement
Principe de dosage de la P4
(Lutéinisation pré-ovulatoire)
 Quelles techniques de dosage de la P4 ?
Semi quantitative
Quantitatives
« Tests colorimétriques »

RIA ELISA CHEMILUMINESCENCE

(Gold Std Quantitative Assays

ELECSYS Progestérone II®, MinividasTM, Biomérieux

Roche diagnostics

CERCA-ENV-Alfort

Photo © CRBP/Univ-Blida1
CRECS Toulouse & CIAC-ENV Nantes & CRBP-U.Blida1.
Tous les laboratoires d’analyse en dispose
Variabilité Intertechnique & étalonnage externe (Courbe d’interpretation)
 Valeurs usuelles (intervalle d’ovulation)

Notion d’étalonnage clinique du laboratoire

(Comment se faire)

4-10ng/ml
(England, Verstegen, Concannon) (Prelaud P, Rosenberg D, Fornel P)

5-8ng/ml (6,25 +/-1,55ng/ml)

(Fontbonne « CERCA-Alfort)
Chemiluminescence assay, Progestérone II®, Roche diagnostics, Germany).
7-10 réajusté à 9-14ng/ml
(Levy: CRECS-Toulouse & Belala: CRBP/UnivBlida1)
Electro-chemiluminescence assay, MinividasTM, Biomérieux, France).
NB/ Unités de mesure : ng/ml & nmol/L (1ng=2,8nmol/L)
 La variabilité des valeurs usuelles de P4
(Est-ce un problème de physiologie ou de technologie ?

Variabilité technologique:

Hey vets,
We (bitches) are not
responsable for your troubles
with P4-values variability and
interpretation. This is related to
your technologies !

We all ovulate close to the same Variabilité physiologique:

amount of P4, we just don’t
ovulate at the same moment of Quel impact sur le
the cycle ! protocole de suivi ?
 Stabilité (invariabilité) de la progestéronénie au moment de l’ovulation:

Confirmé par une méta-analyse récente (Hollinshead FK, Hanlon DW, 2019)
effectuée sur une période de 11ans (2007-2017) et sur 1420 cycles œstraux
(4213 dosages) répartis sur 84 races canine.

Intervalle d’ovulation : 4,8±09ng/ml (LH+2j) - 7,2±1,3ng/ml (LH+3j)

Roche Modular E170 analyzer (Roche Diagnostics, Auckland, New Zealand)
Electrochemiluminescence Assay

Mais cette ovulation peut survenir au début, à la moitié ou à la fin des chaleurs
(Offrant une évolution variable de la courbe de P4)

Ovulation précoce: Ovulation habituelle: Ovulation tardive:

5-50ng (en 3-4j) 5-10ng (en 2j) & 10-50ng (en 4j) 5-10ng (en >1semaine)

NB/ On y reviendra lors de la gestion des cas extrêmes et des pièges du suivi
 Quel intérêt pour le dosage de la P4?
Hey vets,
What do you think now
about progesterone
measurement?

Can you tell me about its

advantages and also about
its limits ?

Intérêt: Moyen précis pour évaluer la date du pic de L.H. et

de l’ovulation.
Comment l’utiliser: A cause du coût , doit être utilisé
conjointement avec une autre méthode objective (Pour
réduire le nb de dosages par cycle).
Estrous monitoring protocol Conclusion

Les protocoles de suivi des chaleurs les plus largement

répandus utilisent conjointement:
le frottis vaginal et la progestérone.

« Reflet de la phase ostrogénique » Moyen précis:

Moyen d’orientation (imprécis):

« Déterminer le moment idéal de doser la P4 » « Déterminer le moment d’ovulation »

Comment faire concrétement ma démarche de suivi ?

(Combiner entre frottis vaginal & dosage de P4)
 Comment faire ma démarche de suivi ?
(Combining vaginal smear & P4 measurement)
Je diagnostique l’œstrus par le frottis vaginal
(Fonction du taux de kératinisation)
– Si IK : 30% Début pro-oestrus
– Si IK : 50% Moitié pro-oestrus
– Si IK : 70% Fin pro-oestrus
– Si IK : 80-100% Œstrus (Commencer le dosage de P4)

Je diagnostique l’ovulation par dosage de P4

(Fonction de la technique utilisée si elle est étalonnée pour suivi du cycle)
Valeurs usuelles de P4 (Mini-vidas® Bio Mérieux):
– Pic de LH: 3-5ng/ml (P4)
– 24-48h preovulation: 5-8ng/ml
– Ovulation en cours: 9-14 ng/ml (Dater l’ovulation)
– 12-36h post ovulation: 15-25ng/ml (P4)
– >36h post ovulation: >25ng/ml (P4)
– Fin de fécondabilité: ??? (P4>35ng/ml) : cas extrêmes ?
 Protocole de suivi
• Commencer le frottis 3-4j du début des chaleurs.
• Répéter à intervalle de 2-5j jusqu’à 80% de kératinisation
(Œstrus):
– Si IK: 30% (début pro-oestrus) répéter dans 5 jours
– Si IK: 50% (mi-pro-oestrus) répéter dans 2-3 jours
– Si IK: 70% (fin pro-oestrus répéter dans 2 jours
• A 80% (IK): commencer dosage P4.
• Répéter à 1-2j d’intervalle (selon les valeurs) jusqu’à la valeur
comprise dans l’intervalle d’ovulation:
– Si P4 < 3ng/ml répéter dans 3 jours
– Si P4 (3-5)ng/ml répéter dans 2 jours
– Si P4 (5-8 ng/ml) répéter dans 1 jours
– Si P4: 9-14 ng/ml : Ovulation en cours (Dater l’ovulation et
passer au protocole de saillie)
 Attention aux pièges du suivi !
Débat !
Attention aux ovulations précoces et tardives
(chienne suivie pour la 1ère fois avec problèmes d’échec à la saillie):

✓ Serrez l’intervalle de dosage de la P4

✓ Méfiez vous des profils cytologiques inchangé (passez

au dosage avant 80% de kératinisation)

Ovulation précoce: Ovulation habituelle: Ovulation tardive:

5-50ng (en 3-4j) 5-10ng (en 2j) & 10-50ng (en 4j) 5-10ng (en >1semaine)
 Why monitoring estrous cycle ?
(Quelle problématique?)
Hey vets,
Do you know why i want
you to screen my cycle ?

Your mission is:

to schudule succefull
appointments between
lovers !
 Du protocole de suivi au protocole de saillie (d’IA)
Qu’est ce qu’il faut savoir ?

Quelques Valeurs physiologiques:

Ovulation: 48h post Pic de LH (2-3j).

Maturation ovocytaire: 48h post ovulation (1-3j).

Durée de vie des ovules (après maturation):

2-3 jours (cas extrêmes et rares 2-5)

Durée de vie des spz:

Frais: 48h (théoriquement 2 – 5jours et plus) Réfrigéré 24h, Congelé: 12-24h.
 © England & Concannon, 2002

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fécondabilité
Pic de LH (>25ng/ml)
(3-5ng/ml) Ovulation Atrésie
(9-14ng/ml) ovocytaire
 Comment établir un protocole de SN ou IA ?
1st 2nd
Protocole SN/IAF (1):
Sperme frais

1st 2nd
(viable 48h)

Protocole SN/IAF (2):

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Maturation Fécondabilité
Pic de LH (15-25ng/ml) (>25ng/ml)
Ovulation Atrésie
(3-5ng/ml)
(9-14ng/ml) ovocytaire
1st 2nd
Protocole IAR(1) :
Sperme réfrigéré

1st 2nd
(viable 24h)

Protocole IAR(2) :

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Maturation Fécondabilité
(15-25ng/ml) (>25ng/ml)
Pic de LH Ovulation
(3-5ng/ml) (9-14ng/ml) Atrésie
Sperme congelé

ovocytaire
(Viable 12-24h)

1st 2nd
Protocole IAC :

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Maturation Fécondabilité
Pic de LH (15-25ng/ml) (>25ng/ml)
Ovulation Atrésie
(3-5ng/ml)
(9-14ng/ml) ovocytaire