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ADN ARN Reproduction partir de son matriel gntique par rplication Leur matriel gntique ne prsente aucune information pour la synthse des enzymes Parasite intracellulaire obligatoire: use mtabolisme de la cellule hte pour multiplication Structure du virus Gnome Capside Nuclocapside = lments cte Enveloppe
ADN
2/ La capside Symtrie cubique = icosadrique Symtrie complexe = poxovirus Symtrie en hlice = hlicodal 2
- Rsistants dans le milieu extrieur - Contamination indirecte par les aliments souills
- Fragiles dans le milieu extrieur -Transmission par contamination directe - Exception HBV et HCV
Nomenclature Famille . Viridae Sous famille Virinae Genre Virus Espce. ex : paramyxoviridae ex : paramyxovirinae ex : paramyxovirus, morbillivirus
Noms communs, romain sans capitale ex : rougeole Multiplication Virale Intracellulaire dtournement de la machinerie cellulaire son profit. Evnement commun tous les virus = Cycle de multiplication virale Dure variable Dpend de la cellule infecte Sensibilit 1/Sensibilit Les cellules sensibles dterminent le spectre dhtes: - Certains virus infectent de nombreux types cellulaires. - Dautres infectent un seul type de cellules pour un animal donn Large Notion de tropisme Etroit Tropisme dun virus: toutes les cellules capable dtre infectes par ce virus, elles prsentent un rcepteur. Permissivit
2/Permissivit Une cellule permissive = cellule qui permet aux virus de se multiplier et de reproduire de nouveaux virions. Droulement du programme de dveloppement du virus est interrompu diffrents stades. Etapes du cycle viral Stratgies diffrentes Le plus important pour un virus est de : - se rpliquer amplification du gnome - Produire de lARNm protines virales - Nouveaux virions Etapes de la multiplication Virale 1/ Reconnaissance du rcepteur de la cellule hte et fixation restriction dans linfection. Les rcepteurs ne sont pas des structures spcifique mais des glycoprotines de la surface cellulaire dotes de fonctions biologiques diverses 2/ Pntration Fusion (Virus env) Endocytose (Virus nus) Transfert du matriel viral travers la mbr cellulaire
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3/ Dcapsidation = destruction totale ou partielle de la capside libration de lA.N. virale (plusieurs mcanismes: pH, modification de conformation des protines virales dstabilisation de la capside). - Dcapsidation couple la pntration, elle seffectue dans le cytoplasme ou dans le noyau 4/ Expression et rplication du gnome viral. Rplication = duplication de lA.N. Stratgie de rplication diffrente suivant la nature et la structure de lA.N 4
Virus ADN :
SS : multiplication dpendante de lhote
Virus ADN
DS : Multiplication ressemble a la multiplication des gnes cellulaires
- Les virus ADN utilisent de nombreuses protines cellulaires pour leur rplication: ADN polymrase, ADN ligase . Et peuvent synthtiser dautres protines qui leur sont propres - La multiplication: - au niveau du cytoplasme - au niveau du noyau ADN bicatnaire Expression se fait grce aux ARN polymrases de la cellule hote. Gnes viraux Systme cellulaire ARNm Transcription
Pntration du virus dans le cytoplasme Pntration du gnome dans le noyau Achvement de la synthse du brin + ADN circulaire double brin Brin de lADN est transcrit en ARN/ lARN polymrase de la cellule hte en: ARN correspondant lensemble du gnome = prgnome ARN = ARNm RT +
protines capsidiales ARN m protines denveloppe RT Prgnome ARN ADN -
Au cours de llongation le prgnome est dgrad sous laction dune enzyme laissant lextrmit 5 terminale du prgnome. Cette extrmit sert damorce pour la synthse du brin complmentaire (ADN+) 5
ADN monocatnaire Gnome + ou Expression en passant par une forme intermdiaire dADN bicatnaire
Nouveaux gnomes
Virus ARN :
ARN polarit positive (ARN+) Virus ARN ARN polarit ngative (ARN-) Virus ARNARN- = ARN complmentaire lARNm ARN Transcriptases virales
ARN+
Nouveau ARN-
>>>>Pntration dans la cellule ARN >>>>>> les protines structurales >>>>>> ARN polymrase ARN Dpendante
ARNPas dintermdiaires 6
ARN+ = ARNm et V
Exemples de rtrovirus : Rtrovirus ARN+ Enzymes dorigines virales ADN bicatnaire Intgration dans le gnome de la cellule hote ARN viraux Enzymes dorigines virales
ARN virionique
Intgration de lADN
Virions Virus ARN bicatnaire Utilisation dune transcriptase virale pour la transcription dun ARNm partir de lARN bicatnaire ADN (sb) monocatnaire (Exe : Parovirus) ADN (db)
ARNm
ARN(db)
7/ Assemblage= Phnomne spontans, indpendant de toute activit enzymatique cellulaire 8/ Sortie: - Destruction de la cellule - Bourgeonnement Acquisition de lenveloppe: - la sortie du noyau - la sortie de la cellule/ bourgeonnement
Les diffrents types dinteractions (Virus Cellule) Productive : Libration de nouveaux virus :
-Cycle lytique (phages) -Cycle vgtatif/productif
Abortive : La cellule survit ou meurt ; pas de multiplication : problme ? Permissivit. Restrictive : Permissivit transitoire. Intgrative (latente) : Provirus ou forme libre. Expression continue de certaines protines
du gnome.
Variabilit gntique
Trois mcanismes : - Mutations - Recombinaisons - Rassortiments Mutations : Cause principale de la variabilit. Taux de mutation diffrents suivants la nature de lacide nuclaire (A.N). ADN : 10 -8 10 -11 ARN : 10-3 10-4, cause de pandmie. Mutations spontanes : Elimines si pas davantage slectif. Persistes sil portent sur des marqueurs Taux de rplication. Pouvoir pathogne. Rsistances aux agents physiques et chimiques. Rsultats, grande htrognit voire lintrieur dune souche quasi espce Recombinaisons gntiques : Dmontre lors de co-infections : o Cas de poliovirus type 2 3. o Immunodprims surinfectes par plusieurs types dadnovirus (7-35) Rassortiments gntiques : Surtout virus gnome segment. - en cas de co-infection, au moment du bourgeonnement : change de segments au hasards (gne de lhmagglutinine lors dune infection mixte ; grippe H2N2 + virus aviaire H3N2 responsable dune pandmie meurtrire en 1968 (grippe de Hong Kong))
Consquences : Apparition de nouvelles souches. Problme de diagnostic. Prophylaxie spcifique. Thrapeutique ; dsinfection et antisepsie. Facteurs de virulence
Bactrie : virulence >>> scrtions de toxines, production de capsule. Virus : virulence multifonctionnelle. o Polygnique. o Hte : tat du systme immunitaire. o Conditions dinoculation (voie dinoculation et importance de linoculum)
Pathogense des infections virales, voies dinoculation Peau = Piqre, blessure, morsure, arthropodes Voie sanguine Voie respiratoire Voie digestive Organes gnitaux. Conjonctives. Passage transplacentaire. o Entre >>> diffusion (tissu cibles)
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Voies dexcrtion :
Respiratoire Salive Larme Lsions cutanes Selles, urines Scrtions gnitales Lait
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Transformation
Le virus intgre son propre matriel gntique au gnome cellulaire expression continue de certaines fonctions virales. La cellule acquit de nouvelles proprits de croissances cellules tumorales ; virus oncognes.
Lorganisme infect
Les cellules, tissus ou organes de lhte infects par un virus subissent des dommages dimportance variable. Ractions des cellules : Multiplication virale >> altration dans la structure et dans le fonctionnement de la cellule. Ractions des tissus : o Reconstitution rapide de la muqueuse (intestin) o Elimination des cellules lses et des virus Ractions de lorganisme : o Dfense non spcifique : Barrire cutano-muqueuse : peau, revtement muqueux Interfrons Phagocytose et action des macrophages o Dfenses spcifiques Anticorps Lymphocytes T 11
-Diagnostic directe - Isolement par mise en culture et identification. - Dtection directe du virus ou de ses Ag dans les cellules provenant de tissus infects. - Recherche des A.N. viraux -Diagnostic indirecte - Recherche des AC (IgG, IgM, IgA) produit par lhte en rponse linfection 12
Les milieux de cultures doivent tre riches en : Eau, sels minraux, glucoses, acide amins, vitamines = Facteur de croissance = Milieu de base
Srum animal
ATB, ATF et Substance tampon -Les cellules les plus utilises sont: 1/ Les cultures primaires et secondaires: Cellules provenant de tissus humains ou animale normaux. Ces cellules sont obtenues sous action de la Trypsine et places dans un milieu de culture. Cellules + milieux de culture multiplication un tapis continu de cellules (parois du rcipient) = = Culture primaire Trypsine = Culture secondaire 2/Les lignes continues - Capacit de prolifration infinie. - Origine = tumeurs malignes (ex: HeLa) ou transformation de cultures Iaire ou IIaire (ex: vero ou MK2) La culture du virus seffectue en inoculant le prlvement sur une culture cellulaire et incubation sous 5% de CO2
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Identification du Virus Multiplication virale (ATB et antiparasitaires) Modifications morphologiques caractristiques = Effet cythopathogne (ECP). Temps dapparition de lECP Variable: - Titre infectieux de linoculum - cycle de multiplication du virus ECP visible - ltat frais (forme des cellules) - aprs fixation et coloration des cellules. ECP souvent vocateur dune famille ou dun virus Identification prcise: - techniques immunologiques - techniques de virologie molculaire Indications : (pourquoi ?) Isoler un virus dans un prlvement biologique. Prouver le caractre infectieux du virus. Caractriser le phnotype dune souche virale (rsistance aux anti-viraux par exemple). Avantages (de la mise en culture des virus) Bonne sensibilit + + +. La culture demeure la rfrence laquelle toutes les nouvelles mthodes sont compares. Elle est indispensable pour disposer de souches, utilises par exemple dans la mise au point des vaccins (ex : vaccin anti-grippal chaque anne). Cot raisonnable. Limites : (inconvnients)
Dlai usuel dobtention du rsultat : 48 heures 10 jours. Subjectivit de la lecture : exprience de l'observateur +++. La culture est pratique dans peu de laboratoires. Certains virus ne sont pas cultivables en dehors de laboratoires de recherche trs spcialiss.
Techniques immunologiques : Dtection des Ag viraux
Immunofluorescence Agglutination Techniques immunoenzymatique Utilisation dAC spcifique ACp et ACm
Comment obtient t-on des ACp ? Injection du Virus ou dune protine virale un animal. Lanimal produit des AC dirigs contre le virus Rcupration du sang (srum) de lanimal qui contient plusieurs AC reconnaissant plusieurs dterminants Antigniques du mme virus 14
Immunofluorescence :
Principe : Visualisation directe de la prsence de lAg laide dun AC spcifique: Technique : * Fixation de lAg sur un support solide * addition dun AC* (fluorochrome) *Observation microscopique Marquage des AC par une molcule: isothiocyanate de fluoresceine Use Microscopie UV
Immunofluorescence directe AC*= AC anti virus Marquage des AC par une autre molcule: Peroxydase = Immunoperoxydase Use Microscope Optique Avantages : Immunofluorescence directe
- Rapide (temps de ralisation est de moins de 2 heures) - simple + ractifs commercialiss Champs dapplication: - Virus respiratoire syncytial, virus grippaux, adnovirusdans nasopharynges - Virus herpes simplex, VZV dans les lsions cutano-muqueuses.
les
secrtions
Agglutination
Principe: + Sur des particules inertes (latex) on fixe des AC (anti virus x) + Addition du prlvement Si prsence de lantigne: Fixation sur lAC = agglutination visible l nu. il Si pas dAg= pas de raction Inconvnients: sensibilit? Avantage: ralisation trs rapide Applications: Rotavirus et Adnovirus dans les selles.
Technique immunoenzymatiques
+ELISA directe : 1) Adsorption de lACp sur une plaque 2) Lavage et addition dAg, lavage 3) Addition dun anticorps conjugus la phosphatase alcaline >>>>> Fixation de lAg, lavage 4) Rvlation par addition du substrat 5) Si fixation >>>> dgradation de la liaison : Virus recherch Si il ny a pas de fixation >>>>>>> pas de coloration
Avantages des Techniques immunoenzymatiques : - Rapide, simple + ractifs commercialiss - Possibilit dautomatisation Champs dapplication - Rotavirus et Adnovirus dans les selles - HBV et HCV dans le srum
Techniques des diagnostic rapides : Dvelopps pour crt virus: (CMV, HSV, VZV, entrovirus, ADV) Centrifugation de linoculum + dtection des Ag viraux avant apparition de lECP Use ACm + test immunoenzymatiques ou immunofluorescence
+Diagnostic direct rapide Avantages: - simple - rapide (24 h) - pas besoin de maintenir linfectiosit du virus matriel peut-tre conserv 4C pls heures Inconvnients: - peu sensible application limite aux infections ou le virus est produit en qtt . - pas possible de raliser les antivirogrammes
Techniques Molculaires
Principe gnral: Capacit dune squence monocatnaire dA.N. (ADN ou ARN) se lier spcifiquement sa squence complmentaire = Hybridation Conditions bien dfinies Hybridation sans amplification du gnome - Hybridation entre acide nuclique cible et une sonde nuclotidique connue marque A chaud : radioactif Sonde marque 16
A froid : Fluorescent - manque de sensibilit Hybridation avec amplification du signal = ADN branch - use pour la quantification des gnomes viraux ADN branch Extraction de lARN cible Hybridation avec un mlange de sondes Spcifique de lARN cible Spcifique de lARN branch Capture sur une microplaque Addition du bDNA Addition de sondes marques (phosphatase alcaline) qui reconnaissent le bDNA : Donc coloration
NB : Partie shybridant avec lAN Bonde Partie shybridant avec lADN branch ou ADN de capture Addition du substrat Mesure du signal
Squenage: Intrt dans ltude de la rsistance aux antirtroviraux, le gnotypage (HCV) et les tudes pidmiologiques. Avantages des techniques damplification gnique - Trs sensible, rapide - Tous les tissus et tous les liquides biologiques peuvent faire lobjet dun prlvement pour le diagnostic. Limites: - Contaminations: faux positifs - Substances inhibitrices: faux ngatifs - Labo spcialiss, - Coteuse
Diagnostic indirect
= diagnostic srologique qui consiste rechercher les AC synthtiss par lhte en rponse une infection = dmarche de choix surtout pour le diagnostic des infections persistantes. Recherche des AC dans le srum sang dans tube sec + Centrifugation Recherche rare dans les autres liquides biologiques (LCR) 17
Dfinitions
Linfection virale peut tre affirme si on observe: Sroconversion = Passage dun srongatif (AC=O t=o) un sropositif (Ac+ t1).
= Il sagit dune primo-infection (PI) Si laugmentation du taux dAc est significative (Taux t1= 4x taux t0 ), il sagit dune rinfection (RI) Mise en vidence dAc de la classe IgM
IgG
IgM
Interprtation
+ + +
+ +
Infection en cours (active) Infection de date non limite (inactive) Primo-infection Rinfection
Ag + AC
- Ag Ac
K= Ac - Ag
k: constante davidit Ac - Ag
Augmentation de laffinit avec la maturation de la rponse humorale Avidit + pdt RI / rapport la PI. + lavidit est plus la liaison AC-Ag est solide. Techniques permettant la dissociation du complexe AC-Ag Utilisation de lure comme tampon Mesure du degrs de dissociation des complexes AC-Ag / ELISA
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ElISA sandwich :
Chaque molcule dIgG est capable de fixer deux Mlc dAg (divalence). Revtement par lAg Addition du Srum (recherche de lAC) Addition de lAg marqu avec une enzyme. Addition du substrat
Si coloration: rsultat + Si pas de coloration: rsultat ELISA comptition :
Revtement par lAg x Addition dun AC antix marqu synthtique Addition du Srum (recherche de lAC) Addition du substrat
Si coloration: rsultat Si pas de coloration: rsultat + Immunofluorescence indirecte :
Le support sensibilis est constitu de cellules infectes fixes sur une lame Le srum (Ac?) est dpos sur cette prparation Addition dune antiglobuline humaine marque la fluorscene lecture en microscopie optique fluorescence Fluorescence = prsence dAc
Inhibition de lhmagglutination :
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Les antiviraux
Dfinition des antiviraux :
Antiviraux:
substances artificielles introduites l'intrieur de l'organisme pour lutter contre les virus. Antiviraux agissent au moment de la multiplication virale. Tout mdicament qui interfre significativement avec la rplication virale peut tre extrmement toxique pour la cellule hte. Les molcules antivirales disponibles traitent uniquement quelques maladies Obstacles de la chimiothrapie antivirale: - Effet cytotoxique. - Molcule antivirale nagit quau moment de la rplication virale ne permet pas dradiquer linfection virale latente. - Isolement de mutants rsistants. - Plusieurs infections virales: signes cliniques apparaissent aprs multiplication virale dans la cellule et constitution de lsions. Cible des antiviraux : diffrents stades de multiplication Attachement la cellule hte Dcapsidation - (Amantadine) Synthse de lARNm et traduction de lARNm viral (Interferon) Rplication de lARN ou de lADN - (Analogues nuclosidiques) Maturation protines virales nouvellement synthtises (inhibiteurs des protases) Assemblage et le bourgeonnement des virions (ex: inhibiteurs des neuraminidases)
Effet: Inhibition de certaines enzymes (ADN polymrase). Proprit : Spectre daction troit >>>> chaque molcule est active sur un virus ou sur un groupe de virus donn 21
Analogues de structure des nuclosides - Analogue = forme modifie - modification chimique des sucre ou bases puriques ou pyrimidiques ex: * trifluridine = analogue de la thymidine * ribavirine = analogue de ladnosine * acyclovir =analogue de la guanine A- Analogues nuclosidiques actives sur lADN polymrase :
L'Acyclovir (Zovirax) est un analogue de la guanosine. Il sincorpore dans l'ADN en formation et bloquer sa synthse. Il agit sur l'activit de l'ADN polymrase virale, en particulier sur celle des virus HSV et
VZV. Il possde de plus une faible affinit pour l'ADN polymrase d'eucaryotes, ce qui en fait un bon antiviral avec peu d'effets indsirables. Autres molcules agissant sur lADN polymrase : 5 iododsoxyuridine (IdU) active sur HSV Gancyclovir (Cymvan): active sur le CMV LAdnine arabinoside= Vidarabine (Vira A): active sur : HSV et VZV B- Inhibiteur non nuclosidique actifs sur lADN polymrase : - Foscarnet (Foscavir): Traitement des infection CMV Actif aussi sur les VZV et HSV. C- Molcules agissant sur lARN polymrase : Chez les virus ARN+, lARN est synthtis grace une ARN polymrase virale Ribavirinae : Inhibe lARN polymrase. =Inhibiteur non spcifique >>>>> Effets secondaires (RSV, fivre de assa, HCV) D- Action sur la transcriptase reverse :
L'AZT (azidothymidine) est un analogue de la Thymidine. La 3-TC (ou lamivudine) est un analogue de la cytidine. Leur rle est comparable celui de l' acyclovir. Incorporation dans la molcule dADN en cours dlaboration. Il bloquent laction de la reverse transcriptase du virus HIV.
La 3-TC est un inhibiteur slectif de la rplication du VIH-1 et du VIH-2 in vitro. Ces antirtroviraux doivent tres utiliss en association (avec dautres molcules):
viter lmergence de virus mutants rsistants
pour
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Un schma ici
C'est une nouvelle gnration d'antiviraux (qui tentent d'tre synthtis, en particulier pour
la lutte contre le VIH.) L'intgrase du VIH est une enzyme qui catalyse l'incorporation de l'ADN proviral
Inhibiteurs des neuraminidases Neuraminidases : libration des virus (de la grippe) noforms. Zonamivir et Oseltamivir : inhibition de lacion des neuraminidases
Action prventive et curative sur linfection grippale
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