La Technique de Patch-Clamp dans la recherche sur

l’Electroporation.
L. WEGNER
Institute for pulsed power and microwave technology, Karlsruhe Institute of Technology, Allemagne

Résumé : L'exposition des membranes cellulaires à des champs électriques pulsés intenses soumet la
membrane à des valeurs de tension éloignées de la gamme habituelle pour une cellule. Les données
expérimentales sur les propriétés des membranes biologiques à ces tensions extrêmes sont encore
rares. Le patch-clamp est une technique de microélectrodes qui offre la possibilité unique de soumettre
les membranes cellulaires à des tensions définies et de façon homogène. La réponse en courant
déclenchée par une impulsion de tension fournit des informations sur la perméabilisation de la
membrane par des pores membranaires présumés. Cet article présente les bases de la technique de
patch clamp (procédure expérimentale, différentes configurations, propriétés spécifiques des
amplificateurs de patch-clamp) et discute les avantages et les limites de la technique comme outil dans
la recherche sur l’électroporation. Par la suite, l'interprétation des relations courant-tension et
conductance-tension à l'égard de la formation de pores et de la sélectivité des pores aux ions est
expliquée.

1. Quelles sont les lacunes des techniques
classiques pour étudier l'électroporation des
cellules biologiques et comment peuvent-elles
être surmontées ?
Quand une cellule est exposée à un champ électrique
homogène généré par deux électrodes externes, la
charge de la membrane est très hétérogène
(Figure 1A). Pour une cellule sphérique, l'impact du
champ est plus intense au niveau des pôles de la cellule
qui font face aux électrodes, et il diminue
progressivement lorsqu’on s’approche de l'équateur de
la cellule. C’est ce que décrit l’équation de Schwan
obtenue par résolution des équations de Laplace (pour
plus de détails, voir la contribution Poignard et Silve
dans ce numéro). Dans ces conditions, seules les
techniques optiques à haute résolution sont adaptées à
l’étude des effets du champ électrique sur les
changements (au niveau local) des propriétés de la
membrane. C’est le cas si l’on souhaite par exemple
déterminer la différence de potentiel seuil au-delà de
laquelle commence la formation de pores.
L'internalisation de molécules fluorescentes a été
souvent utilisée comme marqueur pour évaluer (au
niveau local) la perméabilité membranaire aux
macromolécules. Cependant ces données sont
généralement davantage qualitatives que quantitatives.
En outre, la chute de tension à travers la membrane
(que l’on appelle le «potentiel transmembranaire», voir
l’introduction à l’électroporation dans ce numéro), qui
régit les propriétés électriques des membranes au
repos, varie largement, non seulement en fonction de
la position sur la membrane, mais aussi avec le temps.
Cela complique encore les problèmes liés à l'évaluation
des propriétés de la membrane en fonction de la
tension. Par conséquent, il n'est pas surprenant de
constater que les données expérimentales fiables, par
exemple sur les propriétés des ‘électropores’, sont
encore peu nombreuses.
La connaissance détaillée des propriétés de la
membrane pendant et après une impulsion de champ
électrique ne présente pas seulement un intérêt
théorique. En effet, les effets physiologiques de ces
impulsions sur les cellules peuvent être très variés. Par
exemple, les impulsions peuvent stimuler la
prolifération cellulaire, ou induire l'apoptose, c'est à
dire qu'elles peuvent augmenter la vitalité des cellules
ou au contraire induire leur mort. Ceci est dicté par la
façon dont une séquence d'impulsions donnée (définie
par la longueur, la forme et l’amplitude individuelles
de chaque impulsion, par le nombre d’impulsions et par
leur fréquence de répétition) affecte les propriétés des
membranes. Par conséquent, les protocoles
d’impulsions doivent être adaptés en fonction du type
de cellule considéré et du but du traitement. Plutôt que
d'utiliser une approche purement empirique (comme ce
fut souvent le cas dans le passé), nous pourrions définir
des protocoles bien plus efficacement si l’on pouvait
quantifier la réponse de la membrane à une déviation
bien définie de la tension transmembranaire.
Une solution évidente au problème décrit ci-dessus
serait de charger la membrane de façon homogène
jusqu'à une tension bien définie pour une certaine durée
d'impulsion. Nous montrerons dans cet article que cela
peut être réalisé en appliquant des techniques de
microélectrodes, et notamment la technique de patch-
clamp [7].
2. Charge homogène des membranes cellulaires.
Les bases du patch-clamp.
Les avantages des techniques de microélectrodes pour
étudier l’électroporation sont mis en évidence dans la
Figure 1B. Via un microcapillaire de verre à pointe
fine, rempli avec une solution électrolytique, on peut
établir un contact à faible résistance avec le cytosol
d'une cellule (c'est-à-dire avec l’intérieur de la cellule).
Une contre-électrode est placée dans le bain extérieur,
de sorte qu'un gradient de champ homogène est généré
à proximité de la membrane cellulaire. Quand on
impose une impulsion de tension sur l’électrode
principale (un fil d'argent chloré placé à l'intérieur du
micro-capillaire), la membrane cellulaire est chargée de
façon homogène, au moins en première approximation.
Les avantages de l'utilisation de fils d'argent chlorés
pour les électrodes ne sont pas discutés plus en détail
ici, mais ils sont détaillés dans le chapitre 4 du livre
Axon guide for electrophysiology and biophysics [1].
Les courants induits par un changement de la
différence de potentiel sur la membrane reflètent alors
les propriétés diélectriques de la membrane, et
permettent de déduire les caractéristiques des protéines
de transport électrogènes (molécules dans la membrane
qui peuvent faire circuler des ions, par exemple les
canaux ioniques) ou des pores membranaires induits
par le champ électrique. Ce sont ces aspects que nous
développons plus en détail ci-dessous.
Figure 1 : Charge et électroporation de la membrane
cellulaire par un champ électrique homogène avec des
électrodes externes (A) et à l'aide de microélectrodes
permettant un accès électrique à l'intérieur de la cellule (B).
On remarque que la seconde méthode génère une densité de
pore uniforme dans la membrane contrairement à la
première. La polarité des électrodes est arbitraire et peut
être facilement inversée.
Comment la membrane cellulaire peut elle être
perforée localement pour obtenir un accès électrique à
l'intérieur de la cellule tout en perturbant de façon
minimum la cellule? Les plus grandes cellules peuvent
être empalées avec des microélectrodes à pointe fine.
Cette technique est connue depuis le début du 20e
siècle. Sa portée est cependant limitée et elle ne sera
donc pas traitée plus en détail ici. L'avènement de la
technique de patch-clamp dans les années 1970 a
révolutionné l'électrophysiologie. En effet, grâce à
cette technique, de nombreuses cellules
(particulièrement celles de petite taille) sont devenues
accessibles aux mesures électriques pour la première
fois. A l'origine, la technique a été conçue pour
enregistrer de minuscules fluctuations de courant de
quelques pA générées par un seul canal ionique dans
une très petite zone de membrane (un 'patch' de
membrane). Le défi était double: d’une part obtenir un
rapport signal à bruit suffisant, et d’autre part éliminer
les courants de fuite qui ne passent pas par la
membrane. E. Neher et B. Sackmann, les inventeurs de
cette technique, ont eu l'idée de placer un capillaire en
verre sur la surface de la membrane et d’aspirer une
petite bulle de membrane (toujours en contact avec la
cellule) dans la pointe même du capillaire en
appliquant une légère dépression. Il s'avère que la
surface de la membrane a tendance à se fixer
solidement à la paroi intérieure du capillaire de verre,.
On appelle ce contact le 'gigaseal' (de façon abrégé le
‘seal’). Ce processus est favorisé par la présence d’ions
cations bivalents, en particulier les ions Ca2+.
Habituellement, des capillaires préparés à partir de
verre borosilicate sont utilisés pour la fabrication des
capillaires de patch-clamp. (Pour plus de détails voir le
chapitre 4 de [1]). La Figure 1 illustre un seal réussi et
un seal défectueux. Lorsqu’un seal est réussi, plus
aucun courant ne circule directement entre l’électrode
de la pipette et l’électrode du bain. Dans ce cas, tous
les courants que l’on mesure traversent la membrane.
La résistance entre les deux électrodes est alors de
l’ordre du GΩ (d’où le nom de gigaseal).
Figure 2 : Illustration du seal. A gauche, le seal est réussi. A
droite le seal est défectueux et un courant peut circuler
directement de la pipette vers le bain. Les résistances entre
l’électrode de la pipette et l’électrode du bain sont
respectivement de l’ordre du GΩ et du MΩ.
Si la formation d'un gigaseal est réussie, on se retrouve
dans une configuration appelée ‘cell-attached’, soit
littéralement ‘cellule-attachée’ (Figure 4). Les courants
passant à travers la petite zone de la bulle de membrane
faisant face à la solution d'électrolyte contenue dans le
micro-capillaire peuvent maintenant être enregistrés.
Idéalement, un canal ionique unique est «piégé» dans
ce domaine de la membrane, et les fluctuations
spontanées des courants qui sont enregistrées reflètent
les transitions stochastiques entre (au moins) deux
configurations, «fermée» et «ouverte» du canal. Un
exemple de cellule pendant la procédure de formation
du gigaseal est présentée sur la Figure 3.
Figure 3 : photo d’une cellule et de la micropipette pendant
la procédure de création du seal.
Figure 4: Procédure de patch-clamp et configurations. Une pipette de verre est fermement positionnée sur la surface de la
membrane d'une cellule (1). Par la suite, une dépression est établie dans la pipette, et une bulle de membrane (bleb) est aspirée
dans la pointe (2). La surface de la membrane devient hermétiquement fixée à la paroi interne du capillaire, formant une
résistance giga-ohms (le 'gigaseal'). Cet état est appelé "configuration cell-attached". A partir de cette configuration, la surface de
la membrane séparant l'intérieur de la cellule (cytoplasme) du volume de la pipette peut être détruite par une brève impulsion
d'aspiration pour établir un accès à faible résistance à l'intérieur de la cellule ("configuration cellule entière"', 3).On peut
également retirer mécaniquement la pipette de la cellule, ce qui conduit à un morceau de membrane (patch) détaché de la cellule,
l'intérieur physiologique de la membrane étant exposé au bain ("configuration inside-out", 4) . Un patch cellulaire peut également
être formé à partir de la configuration cellule entière. Dans ce cas, l'orientation initiale de la membrane est conservée
("configuration outside-out", 5)

Les premiers enregistrements d’un canal unique furent
un jalon majeur de l’électrophysiologie. Ils valurent
aux inventeurs le prix Nobel en 1991. Il est vite devenu
évident que les applications de la technique du patch-
clamp pouvaient s’étendre bien au-delà de l’application
particulière pour laquelle elle fut initialement conçue.
En brisant la zone de membrane séparant la solution du
micro-capillaire du cytosol (par exemple en appliquant
une dépression intense de façon brève), on obtient la
configuration ‘cellule entière’. Cette configuration
fournit un accès faiblement résistif à l'intérieur de la
cellule (Figure 4). Elle offre la possibilité d'enregistrer
des courants ioniques qui traversent toute la surface de
la membrane plasmique, par exemple quand une
impulsion de tension rectangulaire est appliquée. Dans
la plage de tension physiologique (c’est à dire pour des
tensions proches de la différence de potentiel
transmembranaire intrinsèque de la cellule), ces
courants reflètent l'ensemble de tous les canaux
ioniques et d'autres transporteurs électrogènes de la
membrane. Un sous-ensemble de canaux ioniques peut
être étudié séparément en choisissant la composition
des solutions électrolytiques (celle contenu dans le
micro capillaire et celle du bain) de façon à priver les
canaux « indésirables » de leur substrat. Une manière
alternative de procéder consiste à ajouter des
inhibiteurs (bloqueurs) de canaux ioniques sélectifs
dans les solutions électrolytiques. Ces aspects
dépassent le cadre de cet article.
La configuration cellule entière est rapidement devenue
la configuration la plus répandue et la plus populaire de
la technique de patch-clamp en électrophysiologie. Les
canaux ioniques uniques sont aujourd'hui
principalement étudiés sur ce que l'on appelle des
patchs excisés, c’est à dire une portion de membrane
arrachée de la cellule. Cela peut être fait simplement en
éloignant le micro-capillaire de la cellule (à condition
que la cellule soit immobilisée sur son support). Il a été
démontré empiriquement (et confirmé à maintes
reprises) que le patch de membrane est orienté soit
‘inside out’ soit ‘outside out’, selon que l’on procède à
l’excision du patch à partir de la configuration
‘cell-attached’ respectivement ‘cellule-entière’. Dans la
configuration ‘inside out’ le feuillet interne de la
membrane de la cellule est en contact avec le bain,
tandis que dans la configuration ‘outside out’,
l'orientation naturelle de la membrane est maintenue,
c'est-à-dire que le feuillet interne est toujours en
contact avec la solution de la pipette (Figure 4).
Pour étudier l'électroporation des cellules, la
configuration cellule-entière est la plus appropriée. Elle
constituera l'objet de cet article. Cependant, les
données obtenues sur des patchs de membrane peuvent
également apporter des informations complémentaires
sur le phénomène d’électroporation.
3. Comment fonctionne un amplificateur de patch
clamp?
L'invention du patch-clamp n’a pas seulement
contribué à faire progresser l’électrophysiologie. Ce fut
également le moteur de nombreuses innovations dans
le domaine de la technologie des amplificateurs. La
conception des amplificateurs adaptés au patch clamp
était en effet une tâche exigeante: le bruit de fond
devait être minimisé à un niveau très faible (1 pA ou
moins). De plus, la bande passante doit être
suffisamment élevée, typiquement dans la gamme du
MHz (au minimum de l’ordre de 100 kHz). En outre,
pour que les expériences soient rigoureuses,
l'enregistrement doit être effectué dans un des deux
modes suivants : ‘voltage-clamp’ ou ‘curent-clamp’.
Ceci signifie que la tension (‘voltage-clamp’) ou le
courant (‘curent-clamp’) doivent être maintenus à une
valeur constante de consigne, indépendamment des
fluctuations temporelles de l'autre paramètre. Ceci
s’avère particulièrement difficile quand on utilise une
seule électrode intracellulaire. Nous l’expliquons ici
pour le mode ‘voltage clamp’ (le mode current-clamp
est moins utile pour les applications décrites dans le
reste de l’article). Pour enregistrer le courant généré au
travers de la membrane en mode voltage-clamp, le
courant doit être transformé en un signal de tension.
Ceci est réalisé en mesurant la chute de tension aux
bornes d'une résistance étalonnée. Quand une source de
tension est placée en série de cette résistance de mesure
afin de contrôler la tension sur la membrane, une partie
de la tension va chuter sur cette résistance. La chute de
tension dépendra de la valeur de la résistance mais
aussi de la résistance de la membrane. La tension sur la
membrane ne pourra donc pas être correctement
imposée. Ce problème peut être surmonté en utilisant
un amplificateur opérationnel comme le montre la
Figure 5. La source de tension est connectée à l'entrée
positive de l'amplificateur opérationnel (AOP), tandis
que l’électrode dans le micro-capillaire est connectée à
l'entrée négative. La source de tension est connectée à
l’entrée positive de l’AOP, et la pipette à l’entrée
négative. Les courants traversant la membrane
contournent l’AOP et circulent dans le convertisseur
courant/tension connecté à la sortie de l’AOP.
Figure 5 : Circuit électrique décrivant les principales
caractéristiques d'un amplificateur de patch-clamp
permettant d’imposer la tension sur la membrane et de
mesurer les courants de membrane avec une seule électrode.
amp op. = amplificateur opérationnel.
Dans ces conditions, la tension sera identique sur les
deux entrées de l’AOP. La tension de consigne
imposée par la source de tension se retrouvera
directement sur l’électrode de la pipette, sans être
perturbée par la mesure de courant. Ceci est une façon
élégante de découpler l’application de la tension de
consigne et la mesure du courant. On élimine ainsi les
erreurs sur la tension appliquée. Une telle approche est
cependant limitée à des courants inférieurs à
quelques µA. Ceci est le plus souvent largement
suffisant en patch-clamp, où les courants sont de
l’ordre du nA, voir du pA.
Dans ce type d’amplificateurs, de nombreuses astuces
de blindage sont utilisées contre les capacités parasites.
Elles ne font pas l’objet de cet article. Il convient
cependant de souligner que la fabrication de la
microélectrode (choix du verre, revêtement
supplémentaire de la surface extérieure avec un
matériau isolant …) est également importante pour
l'optimisation de la qualité des enregistrements. Dans
un dispositif soigné, les mesures peuvent être
effectuées avec une résolution temporelle de l'ordre de
0,1 ms. Pour plus de détails, nous renvoyons le lecteur
à l'excellente revue de Sigworth [2], [3]. Dans cette
revue, les circuits électriques permettant de compenser
la capacité de la membrane et la résistance d'accès sont
également décrits en détail.
4. Les limitations de la technique du point de vue
de la longueur d'impulsion et de la chute réelle
de tension transmembranaire. Extraction de
relations courant-tension à partir des données
de patch-clamp.
Les principaux avantages de la configuration cellule
entière de la technique de patch-clamp en tant qu’outil
de recherche sur l'électroporation ont déjà été discutés
au paragraphe 2. Comme l’ensemble de la membrane
cellulaire «voit» la même tension, la réponse en
courant d'une cellule reflète directement les propriétés
de la membrane à la fois dans l’état électroporé et dans
l'état non-électroporé. À cet égard, la technique offre
des possibilités exceptionnelles pour étudier les
propriétés des membranes, non seulement pour des
tensions de membrane physiologiques, mais aussi pour
des tensions dites extrêmes, supra-physiologiques (par
physiologique on entend la gamme de tensions
membranaires générées par le transport membranaire
électrogène à l’état naturel). Cependant, certaines
limites et certains pièges de la technique doivent être
pris en compte pour arriver à une interprétation valable
des données lorsque le patch-clamp est employé dans
la recherche sur l’électroporation.
Il est évident que le patch clamp est un outil de
recherche unique, qui peut aider à optimiser les
paramètres d'impulsions pour les applications de
routine. Cependant, dans la mesure où il s’agit d’une
technique dite ‘cellule unique’ (une seule cellule est
étudiée à la fois), elle n'est pas directement adaptée à
des fins appliquées.
Deuxièmement, il doit être souligné que la tension
établie dans la micropipette (avec l'aide de la
technologie de l'amplificateur, voir ci-dessus) n'est pas
identique à la chute de tension réelle sur la membrane
de la cellule. Au contraire, les deux valeurs peuvent
différer considérablement. La configuration cellule
entière permet d'accéder à travers une «faible
résistance» à l'intérieur de la cellule (faible par rapport
à la résistance d’un morceau de membrane qui
boucherait la pipette), mais cela ne signifie pas que
cette résistance (que l’on appelle résistance d'accès, Rs)
est négligeable. Elle se situe généralement dans la
gamme du MΩ. La résistance d'accès est associée à la
pointe de la pipette, ou plus exactement à la très fine
section entre l’embout de la pipette et l’intérieur de la
cellule. Elle façonne l'impulsion de champ réelle à
laquelle la membrane est soumise à deux égards: elle
définit l'évolution temporelle de la charge de la
membrane (et à son tour, le front de montée de
l'impulsion de champ), et elle impose l'amplitude de la
chute de tension qui dévie la tension sur la membrane
de la tension de consigne imposée par l’amplificateur.
Lorsque la différence de tension imposée par
l'amplificateur entre la microélectrode et l'électrode de
référence dans le bain est modifiée (ce qui implique
qu’une nouvelle tension stable est établie sur les
électrodes en environ 20-50 µs pour un amplificateur
classique), la tension de la membrane va évoluer avec
un retard considérable. Pour comprendre cette réponse
tardive, il convient de rappeler que la membrane se
comporte, d’un point de vue électrique, comme un
condensateur et une résistance en parallèle (cf. l’article
de Poignard et Silve dans ce numéro; voir aussi le
circuit équivalent Figure 6).
Figure 6 : Circuit analogique décrivant la configuration
cellule entière de la technique de patch-clamp (Rm =
résistance de la membrane, Cm = capacité de la membrane,
Rs = résistance d'accès associé à la jonction entre le cytosol
et la pipette). D’après Wegner et al. 2013, avec de légères
modifications.
La réponse en courant à un échelon de tension, à partir
d’une amplitude de courant initial I0, peut être décrite
par une fonction exponentielle (équation 1).
(1)
La constante de temps  s’exprime selon l’équation 2:
(2)
est la capacité de la membrane. Pour des raisons
évidentes, la résistance RS ne peut pas être inférieure à
la résistance de la pointe de pipette sans cellule une
fois descendue dans la bain, mais elle peut être
beaucoup plus élevée (jusqu'à 2 fois supérieure) du fait
des débris de membrane ou organites cellulaires qui
s'accumulent tout au bout de la pointe du
microcapillaire. En supposant que RS soit environ de
10 MΩ, et en considérant une capacité membranaire
CM typique de 12 pF, la constante de temps est
d’environ 0.12 ms. La charge complète de la membrane
est obtenue après un temps de cinq fois la constante de
temps, soit environ au bout de 0,6 ms. En considérant
une ‘marge de sécurité’ supplémentaire, nous pouvons
en conclure que l’état d'équilibre sur la membrane est
établi après environ 1 ms. Cela implique que la
configuration cellule-entière’ n'est pas adaptée à l'étude
des effets des impulsions sub-ms. Il s'agit d'une
limitation sérieuse dans la mesure où les impulsions
ultrarapides (dans le régime de la nanoseconde) sont
devenues de plus en plus populaires ces dernières
années, en particulier pour les applications médicales,
puisqu'elles évitent les élévations en température du
matériel biologique. Heureusement, des preuves
s'accumulent, indiquant la similitude des effets au
niveau moléculaire des impulsions de champ allant de
la ns à la ms. Nous pouvons donc nous attendre à ce
que les résultats des expériences de patch-clamp
demeurent pertinents pour étudier les effets des
impulsions de champ sans condition sur la durée
d'impulsion.
La tension sur la membrane peut être calculée en
utilisant la loi de Kirchoff sur la base du circuit
analogique de la Figure 6. Dans la mesure où la
résistance RS est en série avec la résistance de la
membrane, l’ensemble agit comme un diviseur de
tension. La fraction de la tension imposée par
l’amplificateur ( ) qui est réellement appliquée
sur la membrane ( ) dépend du rapport des deux
résistances RS et RM comme indiqué dans l’équation 3.
(3)
Au cours d'une expérience, la résistance RS peut être
considérée comme à peu près constante. En revanche,
ceci n'est pas vrai pour RM. Dans une membrane non
électroporée, lorsque la tension reste physiologique
(quelques mV ou dizaines de mV), la résistance RM est
assez élevée. Sa valeur est au moins 10 fois celle de la
résistance d'accès, et par conséquent, VM diffère peu de
Vclamp. Toutefois, lorsque la membrane est polarisée au
delà d'une certaine différence de potentiel seuil, la
conductance membranaire augmente fortement (jusqu’à
un facteur 100). C’est le phénomène d’électroporation.
Dans ces conditions, seulement environ 50 % de la
tension de commande chute réellement sur la
membrane plasmique. Une expérience typique sur un
protoplaste de tabac (protoplaste = une cellule de
plante, après l'élimination de la paroi cellulaire, couche
supplémentaire qui entoure la membrane chez les
plantes) est représentée sur la Figure 7. Après avoir
établi la configuration cellule entière, la cellule est
soumise à un train d'impulsions de 10 ms couvrant une
large plage de tension. Des impulsions de tension
positives et négatives ont été appliquées
alternativement. L’amplitude des premières impulsions
est de +/- 1000 mV. L'amplitude est ensuite réduite de
40 mV par impulsion. La polarité est alternée entre
deux impulsions successives. Entre chaque impulsion,
on maintient sur la cellule une tension de -80 mV
pendant 20 s. Deux réponses caractéristiques sont
représentées sur la figure 5a. Lorsque la tension de la
membrane n’est pas suffisamment intense pour induire
la formation de pores, on observe un pic de courant
capacitif suivi par une décroissance exponentielle. Le
courant diminue à un niveau faible qui ne diffère que
très légèrement du niveau du courant pré-impulsion.
Au contraire, lorsque la membrane est électroporée, la
réponse en courant est bi-phasique. Suite au pic
capacitif, le courant ne revient pas au niveau initial. Il
passe par un minimum avant d’augmenter à nouveau.
Cette deuxième phase correspond à l’ouverture et
l'activation de pores dans la membrane. En reportant le
niveau de courant à la fin de l'impulsion en fonction de
la tension, on peut extraire la relation courant-tension
de la cellule. Ceci est représenté sur la Figure 7B. La
tension considérée est la tension de consigne
imposée par l'amplificateur. Cependant, comme
souligné plus haut, la chute de tension sur Rs doit être
soustraite de pour arriver à une valeur réelle de
la tension sur la membrane. Rs est directement
accessible grâce à l’amplitude I0 du courant au sommet
du pic capacitif, après avoir imposé un saut de tension
ΔV. En ce point, la tension de consigne est uniquement
aux bornes de RS. La valeur exacte de I0 est accessible
par ajustement de la décharge capacitive par une
fonction exponentielle (équation 1). Avec RS= I0/ΔV,
nous obtenons l'expression de la différence de tension
transmembranaire :
(4)
La nouvelle relation courant-tension utilisant les
valeurs calculées de VM est représentée dans la
Figure 7C. Ce graphique représente les propriétés des
membranes plus convenablement que le graphique de
la Figure 7B, mais les deux graphiques indiquent les
mêmes tendances. Les courbes courant-tension des
cellules ont une forme de type ‘varistor’. La
conductance est très faible dans la gamme de tension
intermédiaire autour de zéro. Au-delà de certains seuils
positifs et négatifs, la conductance de pente (dI/dV)
augmente très fortement, indiquant la formation de
pores induite par le champ électrique [4].

Figure 7 : Relations courant-tension d' un protoplaste de tabac exposé à un train d' impulsions de 10 ms dans la configuration
cellule entière de la technique de patch-clamp (voir schéma de principe avec les concentrations en mM du principal électrolyte ( K-
gluconate) dans la pipette et dans le bain). 'A' montre deux impulsions de tension superposées (traces pointillées) et les réponses
respectives en courant (traces pleines). Lorsque l’on fait passer la membrane d'une ddp de maintien de 0 mV à une ddp de 100 mV
(trace du courant le plus faible), un pic capacitif de courant transitoire est induit. Le courant en régime stationnaire est seulement
légèrement supérieur au niveau du courant à 0 mV. Lorsque l’on revient au potentiel de maintien, un pic de courant est induit dans
la direction opposée. Lorsque la membrane est chargée à 560 mV, on observe qu’au cours de la décharge capacitive, le courant
passe par un minimum relatif et augmente à nouveau en raison de la formation de pores. Sur le graph B, les courants enregistrés à
la fin d'une séquence d'impulsions de tension comme indiqué par les flèches sur le graph A ont été tracés en fonction de la tension
de consigne. Sur le graph C, le courant a été retracé en fonction de la tension transmembranaire calculée avec l’équation 4, en
tenant compte de la chute de tension sur la résistance d'accès. L'impact de cette correction est visible sur les écarts de conductances
de pente et de tensions de seuil qui sont indiquées sur la figure (notez que la graduation de l'axe de tension est différente sur les
graphs B et C).
Le patch-clamp est une technique unique parmi toutes
celles permettant d’étudier l’électroporation car
l'amplificateur permet d’imposer une différence de
potentiel sur la membrane bien supérieure au seuil
d’électroporation. Elle permet également d'étudier les
propriétés de la membrane en régime quasi-
stationnaire (à condition que VM soit estimée de la
manière décrite ci-dessus). Dans les protoplastes de
tabac, les propriétés initiales de la membrane sont
entièrement restaurées au cours des quelques secondes
précédant l’impulsion suivante. Ce type
d'électroporation est qualifié de ‘transitoire’. Dans les
cellules de mammifères, une perméabilisation qui
perdure plusieurs minutes après l'impulsion est
observée. Ce type de perméabilisation est appelée
'électroporation persistante'.
L’évolution de la tension sur la membrane au cours du
temps peut être estimée à partir de la forme et de
l'amplitude de l'impulsion de consigne, comme indiqué
en détail ci-dessus. Ce modèle est fondé sur la loi de
Kirchhoff, et suppose des hypothèses simplificatrices
qui parfois ne reflètent pas la situation «réelle»
expérimentale. L'hypothèse implicite la plus critique
est de considérer que la résistance du seal n'est pas
affectée par une impulsion et reste si élevée que l’on
peut la négliger dans le circuit équivalent, en ignorant
les courants de fuite qui ne traversent pas la cellule.
Cependant, une autre interprétation des données est
possible, au moins en théorie. Une augmentation
soudaine de la conductance pourrait être induite par
une rupture de l'étanchéité (réversible), et donc une
diminution importante de la résistance de seal - dans ce
cas, nous serions en train d’étudier un artefact
expérimental au lieu d’étudier les propriétés des
membranes électroporées. La seule façon de valider
notre modèle (et de s’assurer que nous n’avons pas
affaire à des artefacts) consiste à mesurer la différence
de potentiel transmembranaire de façon directe lors
d'une expérience de patch-clamp. Ceci est possible
grâce aux molécules fluorescentes sensibles au voltage
qui peuvent s'intercaler dans le feuillet externe de la
membrane. Lorsque cette molécule est excitée par une
longueur d'onde donnée, l'intensité de la lumière
fluorescente émise est modifiée par le gradient de
tension à travers la membrane (voir aussi article de
Poignard et Silve dans ce numéro et [5]). Afin de tester
notre hypothèse, des expériences dans la configuration
cellule entière ont été répétées sur des cellules dont la
membrane contient la molécule Annine-6. La Figure 8
montre une courbe de l'intensité de fluorescence et de
la tension sur la membrane VM en fonction de la
tension de consigne Vclamp pour une cellule. On
remarque que les deux courbes présentent exactement
les mêmes tendances, y compris la saturation
caractéristique des tensions au-delà du potentiel de
seuil de formation de pores et la redistribution de la
tension entre RM et RS. Ce résultat confirme la validité
de notre interprétation des données, et constitue une
preuve à l’encontre de la simple rupture du seal (pour
plus de détails, voir [5]).
Figure 8 : Le calcul de la tension de la membrane sur le
principe de l'effet diviseur de tension peut être vérifié en
marquant la membrane d’un protoplaste avec un colorant
sensible à la tension (Annine-6). Les données pour une
cellule représentative, étudiée dans la configuration cellule
entière sont représentées. L'électrolyte principal des
solutions de la pipette et du bain est KCl (schéma). La
fluorescence relative mesurée à 475 nm (symbole plein) et la
tension de membrane calculée (symbole ouvert) sont tracées
en fonction de la tension de consigne. On remarque une
correspondance parfaite des deux courbes, ce qui confirme la
procédure de correction de tension. Les encarts montrent le
signal de fluorescence enregistré pour cette cellule à des
tensions de consigne extrêmes. Illustration obtenue à partir
de Wegner et al. 2013, avec permission.
Pourquoi la connaissance précise du seuil de tension de
formation de pores (qui peut différer selon les types
cellulaires et le milieu de culture utilisé) est elle utile?
Elle peut être utilisée pour calculer l'intensité de champ
minimale qui doit être appliquée avec des électrodes
externes pour induire la formation de pores au niveau
des pôles de la cellule. Ceci est important pour
l'optimisation de la technique du point de vue
énergétique en vue des applications industrielles.
5. Sélectivité aux ions des membranes cellulaires
exposées à des champs électriques pulsés: Un
peu de théorie
Les relations courant-tension obtenues dans la
configuration cellule entière peuvent être utilisées pour
déduire la ddp seuil qui induit la formation de pores
ainsi que nous l’avons décrit ci-dessus. Ce n’est pas
cependant la seule information pertinente pratique que
nous pouvons obtenir à l'aide de cette technique. Un
avantage du patch-clamp est qu'il permet d'exposer la
membrane à des solutions de composition connue à la
fois du côté extracellulaire (dans le bain) et du côté
intracellulaire (dans la pipette). Habituellement, le
cytosol est un cocktail contenant - entre autres choses -
divers ions à des concentrations inconnues qui peuvent
être même variables dans le temps. Toutefois, en
condition cellule-entière, la composition du milieu à
l'intérieur de la cellule peut être contrôlée (dans les
limites de précision), étant donné que les
concentrations d'ions à l'intérieur de la cellule vont
s'équilibrer par diffusion avec le milieu de la pipette en
raison de son volume relativement important. Le milieu
ionique extérieur de la cellule est également sous
contrôle expérimental. Ainsi, les gradients ioniques
peuvent être imposés artificiellement sur la membrane
et les ions peuvent être échangés de façon systématique
dans des expériences successives. C'est une condition
requise si l’on souhaite étudier la sélectivité ionique de
la membrane, c'est-à-dire la perméabilité relative de la
membrane à différentes espèces d'ions. Avant d'aborder
les aspects expérimentaux, voici un peu de théorie sur
la perméabilité des ions à travers les membranes.
Le point de départ de toutes les descriptions
quantitatives de transport d'ions à travers des pores est
l'équation de Nernst-Planck (équation 5). Elle définit le
flux d'ions généré d’une part par le gradient de
concentration à travers la membrane ( ) et
d’autre part par l’action d’un gradient de potentiel
électrique à travers le pore ( ). Le flux des ions i
contient ainsi deux composantes, une composante de
diffusion et une composante électrophorétique.
(5)
R, T et F sont respectivement la constante des gaz
parfaits, la température absolue en Kelvin et la
constante de Faraday. z est la valence de l'ion. Cette
équation repose sur l'hypothèse qu’il n’y a pas
d’interaction des ions entre eux, et que les interactions
des ions avec la paroi des pores sont négligeables. Les
milieux intracellulaire et extracellulaire sont en contact
au centre du pore. Lorsque le flux d’ions (et, par
conséquent, le flux de courant) à travers le pore est égal
à zéro, la différence de potentiel électrique à travers le
pore, s’exprime en résolvant l’équation 5. On la note
et on la désigne par abus de langage par
l’expression "potentiel à courant nul" ou "potentiel
d'inversion" (voir partie expérimentale ci-après). Par
exemple, pour une solution contenant un ion positif et
un ion négatif, tous deux monovalents, dont les
concentrations sont différentes de part et d'autre de la
membrane (Co et Ci respectivement), on obtient
l’équation 6 :
(6)
D- et D+ sont respectivement les coefficients de
diffusion des cations et des anions. Dans ce cas, Erev,
correspond à ce qu'on appelle le «potentiel de jonction
liquide» qui est généré entre les deux solutions.
Toutefois, les données expérimentales sur Erev
s'écartent considérablement des potentiels de jonction
liquide calculés avec une telle approche. Ceci indique
que les hypothèses sous jacentes sont une trop grande
simplification de la situation «réelle». Une approche
différente de l'intégration de l'équation de Nernst-
Planck fut proposée par Goldman et les prix Nobel
Hodgkin et Katz (équation de Goldman-Hodgkin-Katz,
ou l'équation GHK). Pour un courant net nul, nous
obtenons l’équation 7 (dans le cas des cations
monovalents seulement).
(7)
Px est la perméabilité de la membrane à l’ion X. Les
conditions aux limites de cette intégration de l'équation
de Nernst-Planck supposent que les ions se déplacent
indépendamment les uns des autres. Par ailleurs, cette
équation suppose que le gradient de champ à travers la
membrane est linéaire, c'est à dire dV/dx = VM/d, d
étant l'épaisseur de la membrane. Cette équation est
très populaire pour le calcul (relatif) des perméabilités
des ions présents dans la solution de la pipette et dans
le bain. Elle fournit une description générale du
transport des ions à travers les membranes sans qu'il
soit nécessaire de faire des hypothèses sur les
propriétés moléculaires de la voie de passage (présence
de pores dans la membrane avec une géométrie
donnée). Ce dernier point est certainement un avantage
important. Cependant, il faut garder à l’esprit que les
perméabilités Px calculées avec cette équation ne sont
valables que dans le cadre de la théorie GHK, et donc
sous ses hypothèses simplificatrices.
Le fait que la théorie GHK ne prenne pas en compte les
propriétés particulières des pores de la membrane peut
également être considéré comme un inconvénient, dans
la mesure où la création de pores est souvent supposée
comme étant la base de l’électroporation. Une
description plus précise de l'électro-diffusion est
possible grâce à l'équation de Poisson-Nernst-Planck
(PNP). Il s'agit d'une extension de l’équation de NP
classique qui prend en compte la contribution des
charges mobiles (ions) au potentiel en définissant
Φmobile, un potentiel électrostatique dépendant de la
position. Ceci est décrit par l'équation de Poisson
(équation 8):
(8)
avec ε la constante diélectrique (locale) et étant la
densité de charge de l'ion i. Cette approche permet de
tenir compte des interactions mutuelles des ions dans
un pore. Habituellement, le cadre PNP est appliqué à
l'aide d'une approche numérique 3D (par exemple, une
modélisation par éléments finis). Des versions encore
plus sophistiquées intègrent les charges fixes sur les
parois des pores (à condition que leur existence et leur
emplacement soient connus). Pour une description plus
détaillée de la théorie PNP, le lecteur est renvoyé à
l’article de revue de Coalson et Kournikova [6].
La validité de la théorie PNP a été questionnée à
plusieurs reprises pour un problème de base qui revient
régulièrement dans la biologie à l’échelle moléculaire:
dans quelle mesure un traitement macroscopique d'un
problème (comme la théorie PNP) peut il être transféré
à l'échelle nanométrique? Il a été avancé que l'équation
de Poisson ne s'applique pas au transport des ions à
travers des nanopores, et des alternatives ont été
proposées (par exemple la simulation de dynamique
moléculaire qui utilise le mouvement brownien). Les
détails sur ce débat scientifique sont au-delà de la
portée de cet article.
6. Sélectivité aux ions des membranes cellulaires
exposées à des champs électriques pulsés: partie
expérimentale
L'importance du ‘potentiel d'inversion à courant nul’
( ) pour l’évaluation de la perméabilité de la
membrane aux ions a été soulignée dans le paragraphe
précédent. Comment cette valeur peut-elle être
déterminée expérimentalement de façon fiable et
reproductible? Quand nous voulons déterminer
pour les pores générés par des champs électriques à
partir des relations courant-tension (voir ci-dessus),
nous faisons face à un problème technique de base: les
pores n’apparaissent que pour des tensions très
fortement positives ou négatives, et ils disparaissent
rapidement (en quelques ms) dès que la tension est
abaissée dans la gamme de tensions intermédiaires où
l’on peut détecter le potentiel à courant nul. Un moyen
doit donc être trouvé pour mesurer les relations
courant-tension des pores ouverts sur toute la gamme
de tension. La solution consiste à balayer toute la
gamme de tension de façon continue dans le temps à
une vitesse rapide (on appelle ce protocole, ‘rampe de
tension’). Avant la rampe, une préimpulsion est
appliquée, soit en dessous du seuil de formation de
pores pour enregistrer les courants de bases, soit au-
delà du seuil pour ouvrir les pores de la membrane. Le
potentiel d'inversion des pores correspond alors aux
potentiels d'intersection des courbes tension-courant
obtenus avec les deux protocoles de rampe appliqués
l’un après l’autre. Cependant, un traitement des
données est nécessaire pour éviter les artefacts. Tout
d'abord, la réponse à une rampe de tension (Iramp) est
constituée de deux composantes, une capacitive (Icap) et
une résistive (Ires) (Eq. 9). Seule cette dernière
composante est pertinente pour la mesure du potentiel
d'inversion.
(9)
Si la tension sur la membrane évolue à vitesse
constante, ce qui est le cas en première approximation
dans le protocole (on peut s’écarter un peu de cette
condition dans le cas électroporé, voir plus loin), I cap
est une constante qui peut être calculée grâce à
l’équation 10 :
(10)
Il peut être soustrait de la réponse globale afin
d’obtenir Ires (équation 11).
(11)
Comme souligné au début de l’article, la variation de la
tension de consigne Vclamp au cours de la rampe n'est
pas identique à la variation réelle de la tension sur la
membrane. L’effet diviseur de tension doit être corrigé
comme indiqué dans l’équation 4. Une fois que le
profil de variation de la tension de la membrane avec le
temps est connu, la pente autour du potentiel
d'inversion peut être obtenue par approximation
linéaire. Ceci conduit à l’obtention des relations
courant-tension (courbe IV) présentées sur la Figure 9.
Les graphes obtenus avant et après (pendant)
l’électroporation sont superposés afin de déterminer la
tension d’intersection.
La pente de la courbe IV obtenue pour l'état électroporé
est bien plus élevée que celle du contrôle. C’est ce qui
est attendu si un certain nombre de pores est toujours
présent, même à des tensions physiologiques qui
habituellement n’engendrent pas la formation de pores.
On peut noter que la forme de la courbe IV dans l’état
électroporé résulte à la fois de la fermeture progressive
des pores et de la dépendance de la conductance des
pores ouverts vis-à-vis de la tension. L’interprétation
de cette courbe est par conséquent difficile. On notera
en outre que le potentiel d'inversion n’est pas nul quand
un gradient d'électrolyte est imposé, ce qui indique la
sélectivité des pores. Des études approfondies à l'aide
de divers cations et anions ont démontré, que les pores
sont davantage cation sélectifs et qu’ils transportent
assez mal les anions, probablement en raison de la
présence de charges négatives à l'entrée des pores. Pour
plus de détails, voir les publications récentes sur le
sujet [4], [5]. De telles mesures de sélectivité sont
importantes d'un point de vue pratique, car elles nous
indiquent quels ions peuvent pénétrer facilement dans
les cellules via les pores. De plus, elles permettent
d’aboutir à une estimation de la taille des pores.
Figure 9: Expérience de rampe de tension pour mesurer le potentiel d'inversion du courant passant à travers les pores de la
membrane induits par le champ électrique. Le principal électrolyte dans les solutions de pipette et de bain est le K-gluconate (voir
schéma). Une rampe de tension allant de -100 à +100 mV (membrane non électroporé) puis une allant de -600 à 600 mV (membrane
électroporée) ont été appliquées successivement à vitesse de balayage constante (40 mV/ms). Avant chaque rampe, la membrane est
maintenue pendant 10 ms à -100 et -600 mV respectivement. Les traces supérieures sont les tensions. Les lignes pointillées indiquent
la tension de consigne et les lignes continues la tension transmembranaire (elles sont identiques pour la membrane non électroporée
mais diffèrent dans le cas de la membrane électroporée). Sous les traces de tension, les réponses en courant sont représentées. Pour
la membrane non électroporée, la contribution du courant capacitif Icap induit par la rampe de tension est indiqué par un ombrage
gris. Les réponses en courant autour de zéro mV, après correction de Icap, sont tracées en fonction de VM dans le graphique inférieur
(les traces grises et noires correspondent à la membrane non-électroporée respectivement électroporée). L'intersection des deux
courbes correspond au potentiel d'inversion des pores de la membrane ( ici -27 mV ).

7. Conductance de la membrane en fonction de la ce paramètre qui est également utilisé pour la

tension membranaire: conductance de pente et description mathématique de la formation de pores. La
conductance de corde conductance de corde Gcorde est définie comme suit:

Au paragraphe 4, nous avons vu que la conductance de

pente (slope conductance) peut être obtenue à partir de
la courbe IV de type varistor de la membrane cellulaire.
La conductance de pente est désignée par
l’équation 11 :
(11)
augmente de façon spectaculaire lorsque la
tension sur la membrane dépasse la tension de seuil.
Cependant a peu de signification biologique. Si
l’on souhaite déterminer comment la formation des
pores évolue avec la tension, la conductance de corde
(chord conductance) est le paramètre pertinent. C’est
(12)
Ainsi, la conductance de corde correspondant à la pente
d'une ligne droite reliant chaque point de la courbe
avec le potentiel d’inversion d’un pore.
augmente avec la différence de potentiel membranaire,
mais de façon moins brutale que la conductance de
pente (figure 8). reflète la fraction de la
membrane à l'état électroporé. Elle traduit deux
phénomènes superposés: la formation de nouveaux
pores, ainsi que l'expansion de pores existants.
 8. Références:

[1] The Axon guide to Electrophysiology and

Figure 10: Représentation de la conductance de corde
(Gcorde) calculée pour un protoplaste de tabac à partir d'une
courbe courant-tension semblable à celle de la figure 6, en
utilisant l'équation 12. On observe que la pente de la courbe
augmente fortement lorsque la membrane est polarisée au-
delà du potentiel de seuil (flèches). Les données peuvent être
décrites par des droites. Le principal électrolyte dans les
solutions de pipette et de bain est le K-gluconate (schéma).
8. Conclusion et perspectives
L’objectif de cet article était d’introduire une méthode
expérimentale bien établie, la technique de patch-
clamp. Jusqu’à aujourd’hui, cette technique n’a été
utilisée que sporadiquement dans les études
d'électroporation. Il a été montré que cette technique
pouvait être un outil précieux pour étudier les
propriétés des membranes à des tensions extrêmes non
physiologiques, à condition que les pièges et les limites
de la technique soient maitrisés et pris en compte. Son
potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée
n'a pas encore été pleinement exploité, mais nos
connaissances et notre expérience dans ce domaine
sont en pleine expansion.
Biophysics Laboratory Techniques, 3rd ed.
[2] F. J. Sigworth, H. Affolter, and E. Neher, “Design
of the EPC-9, a computer-controlled patch-clamp
amplifier. 2. Software,” J. Neurosci. Methods, vol.
56, no. 2, pp. 203–215, Feb. 1995.
[3] F. J. SIGWorth, “Design of the EPC-9, a
computer-controlled patch-clamp amplifier. 1.
Hardware,” J. Neurosci. Methods, vol. 56, no. 2,
Feb. 1995.
[4] L. H. Wegner, B. Flickinger, C. Eing, T.
Berghöfer, P. Hohenberger, W. Frey, and P. Nick,
“A patch clamp study on the electro-
permeabilization of higher plant cells: Supra-
physiological voltages induce a high-conductance,
K+ selective state of the plasma membrane,”
Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr., vol.
1808, no. 6, pp. 1728–1736, Jun. 2011.
[5] L. H. Wegner, “Cation selectivity of the plasma
membrane of tobacco protoplasts in the
electroporated state,” Biochim. Biophys. Acta,
vol. 1828, no. 8, pp. 1973–1981, Aug. 2013.
[6] R. D. Coalson and M. G. Kurnikova, “Poisson-
Nernst-Planck theory approach to the calculation
of current through biological ion channels,” IEEE
Trans. Nanobioscience, vol. 4, no. 1, pp. 81–93,
Mar. 2005.
[7] Electrophysiologie moléculaire. Tome 1, la
technique du patch clamp - Michel Joffre.

D'un point de vue technique, pour que cette approche

soit encore plus puissante, une amélioration de la
résolution temporelle est nécessaire. Jusqu'à présent,
nous ne pouvions appliquer que des impulsions
millisecondes, mais il est important de continuer les
développements pour pouvoir appliquer des impulsions
plus courtes (de l’ordre de la microseconde ou même
de la nanoseconde). En effet, la tendance est aux
impulsions courtes dans de nombreuses applications de
la technique d'électroporation, et davantage de données
expérimentales sur les mécanismes des bases de
l’électroporation sont requises d'urgence, avec une
résolution temporelle plus élevée.