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Diagnostic Virologique
Diagnostic Virologique
BOUBRIT
DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
I. Diagnostic direct :
1) Les Prélèvements :
1. Choix des prélèvements :
Très important, se fait en fonction de l’infection.
Se fait à la phase aigüe de l’infection
o Donc les prélèvements doivent être faits dès l’apparition des signes cliniques
L’excrétion du virus n’excède pas 3-6jrs rapidité (+++)
Les prélèvements sont faits au niveau du site de multiplication (point d’entrée) et au niveau des
lésions.
2) Le diagnostic direct :
Différentes techniques de diagnostic direct existent :
a. Isolement du virus :
Culture cellulaire
Œuf embryonné
Animaux
b. Mise en évidence des Ags viraux : Diagnostic rapide
c. Microscopie électronique :Visualisation des virus
d. mise en évidence du génome viral : Techniques de biologie moléculaire.
a) Isolement du virus :
1. Culture cellulaire :
Différents types de cellules en fonction du virus recherché :
Cellules primaires :
Issues directement du tissu d’origine (durée de vie limitée à quelques passages)
Ex : rein du singe, lymphocytes
Cellules secondaires :
Généralement c’est les cellules diploïdes, fibroblastiques humaines embryonnaires.
Durée de vie : max 40 passages
Cellules de lignées continues :
Cellules transformées
Immortalisées
Facile à cultiver
Ex : cellule HELA carcinome du col utérin
Durée de vie illimitée
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Multiplication du virus dans les cellules altération de la morphologie cellulaire
L’ECP est spécifique d’une famille de virus
Il est observé au microscope optique inversé à l’état frais après coloration et après un
temps déterminé pour chaque famille et parfois pour chaque virus (24h à 7jrs)
Immunofluorescence
Séroneutralisation ID du virus
Inhibition de l’hémagglutination
2. Œuf embryonné
Inoculation du prélèvement sur œufs embryonnés de 8, 9 à 11 jours en fonction des virus
Voies d’inoculation :
− V. amniotique
− V. allantoïde
− V. vitelline
− V. intraveineuse
− Membrane chorio-allantoïdienne
Identification : (après récupération du liquide)
− Hémadsorption
− Hémagglutination hématies spécifiques
− Inhibition de l’hémagglutination
− Séro-neutralisation
ex
Rageencéphalite
→
mortelle souris (œil)
Coxsackie A paralysies
→
flasques souris (VIP, V inter cérébrale)
Les voies les plus utilisées : IV, IP, intra cérébrale, intra oculaire
En fonction du virus : on choisit deux systèmes cellulaires
ex : entérovirus inoculés aux souriceaux nouveau-nés
Techniques utilisées :
Immunofluorescence
Immun peroxydase
Latex (agglutination)
Ex :
− Détection des rotavirus / adénovirus dans les selles (latex)
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− Détection des virus respiratoires, au niveau aspiration nasale LB A (IF)
− Détection Agp2V (HIV), Ag HBs (hépatites) ELISA
c) Microscope électronique
Détection de virus entier
Recherche de virus non cultivables (rotavirus, astrovirus)
Techniques utilisée dans le cadre de la recherche et pour les virus non cultivables
Technique pas très sensibles et très couteuse
Ne permet pas la différenciation des virus
3)Séquençage :
(1) Principe :
− Déterminer la succession des nucléotides qui composent une séquence d’ADN
− Utilisation de désoxyribonucléotides marqués
− Séparation des fragments marqués par électrophorèse
− Obtention d’une cartographie
(2) Application :
− Caractériser un nouvel agent pathogène
− Comparer les souches
− Recherches de mutation résistance au traitement
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Il permet de poser un diagnostic sur la base de la recherche d’AC spécifique
Il est basé sur la recherche d’Ac (apparition) surtout dans les primo-infections ou leur
ascension (augmentation du titre) significative, 4 x le titre
Le prélèvement de deux sérums à 15jrs d’intervalle est indispensable
1er sérum=précoce
2ème= 15 jrs plus tard
La recherche d’IgM est témoin d’une infection récente sauf exception (HSV…etc). dans ce
cas un seul sérum est suffisant
Infections néonatales et congénitales (rubéole…)
Primo-infection
A- Réaction de Seroneutralisation :
Elle est basée sur la neutralisation de l’infectivité d’un virus par l’intermédiaire d’un Ac
neutralisant (inhibant l’ECP)
C’est une technique ancienne est souvent de référence, elle se fait sur présence :
D’un système cellulaire sensible au virus
D’une quantité déterminée de virus
Dilutions croissantes de sérum à tester.
Le mélange virus-sérum est inoculé à la culturecellulaire après un temps d’inoculation bien
déterminé, la lecture se fait au microscope inversé à la recherche d’un éventuel ECP
ECP positifRéactionnégative
ECP négatifRéaction positive (entérovirus,poliovirus)
(Il existe un phénomène d’interférence pour le virus de la rubéole)
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C- Inhibition de l’hemagglutination :
Utilisée pour les virus hemagglutinants tel que :
Virus de la Rubéole (hématie de coq)
ADV (hématies de rat ou de singe)
Arthomyxo (hématies de cobaye)
Virus des Oreillons (hématies de poussin)
Virus de la rougeole (hématie de singe)
❀ IHA=technique pour la MEE du complexe immun en inhibant sa fonction d’hemagglutination. (il
faut éliminer de l’échantillonsérique les Ac hétérologues dirigé contre les hématies test(risque de
faux positif)
Tributaires de la qualité du
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prélèvement (Culture) Possibles faux positifs (réactions
croisées) ou de faux négatifs
Risque de contamination ou de (immunodépression)
faux positifs (PCR)