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Bonnes pratiques de l’étude de l’hémoglobine

Article in Annales de biologie clinique · July 2003

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Josiane Bardakdjian-Michau Frederic Galacteros

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 BONNES PRATIQUES
1 DE L ’ETUDE DE
L ’ HEMOGLOBINE

Josiane BARDAKDJIAN-MICHAU
Groupe de travail hémoglobinopathies
Laboratoire de Biochimie Pr GOOSSENS
Dora BACHIR
Centre de la drépanocytose

CHU HENRI MONDOR 94010 CRETEIL

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• Hémoglobinopathies : maladies génétiques
autosomales récessives

• Problème de santé publique largement

répandu dans le monde

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Que sont les hémoglobinopathies ?

A - Mutation sur une des chaînes de globine

B - Défaut de synthèse d'une des chaînes de globine

—> Thalassémies

- Association des 2 types A et B

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Exemples de variants de l'hémoglobine
Codon 6
Hb S GAG GTG β6 glu → val
GLU VAL

Codon 6
Hb C GAG AAG β6 glu → lys
GLU LYS

Codon 121
Hb 0 Arab GAA AAA β121 glu → lys
GLU LYS

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 β thalassémies

- Dues à des mutations surtout ponctuelles

→ abolissent ou diminuent la synthèse de la chaîne β
- Plus de 400 mutations identifiées
- En général, une mutation donnée ne se rencontre
qu'au sein d'une même population
- La sévérité du désordre est fonction du type de la
mutation.

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 Points d'appel hématologiques et
cliniques

- Anémie - Polyglobulie -Dépistage néonatal

- Microcytose - Cyanose

- Hémolyse - « Ethnie », consanguinité

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 Situations d’ urgence

Quantification de l'Hb S chez un patient connu

• Chirurgie • Grossesse et accouchement

• Echange ou programme transfusionnel
- Efficacité
- Alloimmunisation

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 Les techniques du diagnostic

• Isoélectrofocalisation (IEF) Isolab

• Electrophorèse en citrate agar pH = 6 pour
confirmation
• Chromatographie liquide à haute pression
(CLHP : Varian BioRad) pour quantification

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 Diagnostic biologique
1ère étape : Isoélectrofocalisation (IEF) (ISOLAB)
Principe
L'IEF est une technique d'électrophorèse en
gradient de pH sous voltage élevé (pH 6 - 8.)
• L'IEF nécessite une quantité minime de GR
• Méthode très sensible (Présence d'Hb S moins
de 5 %)
• Permet de détecter et de quantifier les Hb
anormales S, C, D...
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 Isoélectrofocalisation en gel d’Agarose
(Isolab)
Aging Band
Bart’s
(9) H A1C
+

_
- Témoin
(11) (8) (7) (5) (4) (3) (2) (1)
D Constant AE AE SS AE AD SS
(10) (6)
Spring
S/β+Thal AC
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Electrophorèse sur acétate
de cellulose à pH alcalin
Hb A2 déterminée par CLHP

A/A 2,2%
A/S 2,8%
A/D 3,5%
A/C
A/E
S/C
S/D Punjab
A/ β Thal 5,9%
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 Electrophorèse en Agarose à pH acide
Paragon (Beckman)
2ème étape : Test de confirmation
Dans ce système, la migration résulte de :
- l'électroendosmose —> flux de liquide vers la cathode
- la liaison à l'agaropectine —> complexe migrant vers
l'anode.
- l'effet de l'acide maléique (anion) qui entre en
compétition avec l'agaropectine pour sa fixation au site
du 2.3-DPG et des autres régions chargées positivement
de l'hémoglobine.
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 ELECTROPHORESE
CITRATE AGAR
AD SS
+
C
S
A
F
_
+

AE AC
DB AC
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3ème étape : Test de confirmation
Test d'ITANO ou test de solubilité de l'Hb S

La déoxy Hb S polymérise et est insoluble dans

une solution déoxygénée de phosphate concentré.
Réduction de l'Hb S par l'action de
l'hydrosulfite de Na+ qui précipite dans une solution
tampon P 2.24 M

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Test de solubilité pour HbS

1- Témoin normal
2- Présence d ’HbS

1 2

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Quantification des fractions d'hémoglobine

Technique de chromatographie liquide

haute performance
CLHP (variant BioRad).
Résine échangeuse de cations.

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Profil CLHP A/S

HbA HbS

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Profil CLHP A/C

HbA HbC

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Syndromes drépanocytaires majeurs
SDM
SDM

S/S S/D Punjab S/βο thalassémie

S/C S/O Arab S/β+ thalassémie

A/S Antilles
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 RESULTATS
(à interpréter en l’absence de transfusion récente)
• Taux d'Hb S normal pour un hétérozygote
Hb S 35 % à 45 %
• Taux d'Hb S > 48 % : anomalie associée
probablement à une β+ thalassémie
• Taux d'Hb S < 35 %: anomalie associée
probablement à une α thalassémie ou une
carence en fer
Dans tous les cas l’étude familiale est nécessaire
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 HbS

HbA

Sβ+ thalassémie

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HbF HbS

SS sous Hydrea

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 Résultats du dosage de l'Hb A2

Taux d'Hb A2 : Normal et microcytose

- α Thalassémie problable
- Synthèse des chaînes de l'hémoglobine
- Etude du gène
- Etude familiale

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 Résultats du dosage de l'Hb A2

Taux d'Hb A2 : > 3,1 % et microcytose

- β thalassémie hétérozygote.
- Etude du gène (DPN ?)
- Etude familiale

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HbA

HbA2

β thalassémie hétérozygote
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 Résultats du dosage de l'Hb A2
Augmentation non génétique de l'Hb A2

Taux d'Hb A2 : > 3,1 % sans microcytose

- Hyperthyroidie non traitée

- Anémies mégaloblastiques

- Patients traités par antiviraux

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 Recommandations
!
- Quantification de l'Hb A2 par densitométrie pas
toujours fiable
- Difficile de conclure une étude de l'hémoglobine sans
données hématologiques (et ethniques).
- Sans les données cliniques, le diagnostic d’ un
homozygote SS peut passer pour un hétérozygote AS.
- Un profil S/F ne permet pas de différencier entre un
S/PHHF, un S/β° thal. et un S/S → étude familiale ou
celle du gène.
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REMERCIEMENTS
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BONNES PRATIQUES DE L ’ETUDE DE

L ’ HEMOGLOBINE

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