Support Immunologie 2023-2024 DR - Chaima Khadhraoui

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Cours 1:Introduction à l’immunologie

Préparé par Dr. Chaima Khadhraoui
Année de formation 2023/2024
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I: Le rôle du système immunitaire
CHAPITRE II: Structure du système immunitaire
CHAPITRE III: les effecteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires
CONCLUSION 1
2
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Objectifs du module
 Comprendre le concept de l'immunité et le rôle du système immunitaire
 Identifier les principaux organes lymphoïdes primaires (la moelle osseuse et le thymus) et
secondaires (les ganglions lymphatiques et la rate) et comprendre leur rôle dans le développement et
la régulation des cellules immunitaires.
 Décrire les différentes molécules et cellules immunitaires et expliquer leurs fonctions spécifiques
dans la réponse immunitaire.
INTRODUCTION
 L'organisme est constamment exposé à une variété de facteurs qui peuvent
potentiellement l'endommage (agent infectieux, composés toxiques, etc.).
Il est capable de résister et combattre ces différents facteurs.
 La propriété qu’a l'organisme à se défendre et à éliminer toutes substances

étrangères s'appelle:
Provient du terme latin « Immunitas »

Immunité qui veut dire « libre de », « exempt de » 2
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Chapitre I: Rôle du systéme immuniatire
Maintenir le bon fonctionnement

de l’organisme (la cohérence des
Immunité cellules et tissus qui le constituent)
C’est l’ensemble des
mécanismes biologiques
Assurer son intégrité en éliminant le

non soi et le soi altéré
Chapitre I: Rôle de systéme immuniatire

Le Soi / le Non Soi
Une capacité de « reconnaissance »
 Les constituants de l'organisme (ce qui lui appartient en propre): « le soi »: toléré.
 Ses propres substances altérées et des substances étrangères « le non soi »: rejeté/ éliminé
 Une cellule tumorale  Un agent infectieux

reconnue étrangère après
sa transformation  un organe étranger (transplantation) 3
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Chapitre I: Rôle de systéme immuniatire
Le système immunitaire(SI)
 L'ensemble des facteurs (effecteurs)

humoraux (molécules solubles) et cellulaires
chargés de protéger l'organisme est désigné
sous le nom du système immunitaire
Chapitre II: Structure du SI
Les organes lymphoïdes

Les organes lymphoïdes périphériques (OLP) ou secondaires
centraux OLC ou primaire:
Le lieu d’initiation de la réponse
Les sites de développement et adaptative (activation des lymphocytes
de maturation des cellules naïfs après avoir rencontré l'antigène
immunitaires spécifique (Ag) et se différencient en
cellules effectrices et initier les
réponses immunitaires)
Cellules immunocompétentes
4
naïves
Cellules effectrices
et cellules mémoires
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I. Les organes lymphoïdes centraux OLC
1. Moelle osseuse (MO)
 Localisée dans les os,contient des cellules
adipeuses et du tissu hématopoïétique (moelle
rouge) dans lequel se trouvent les cellules
hématopoïétiques totipotentes.
 Ces cellules se différencient en progéniteur à
l'origine de toutes les cellules sanguines.
 C’est le lieu de l’hématopoïèse et de la
différenciation et la maturation des LB
Figure: Structure de la moelle osseuse
(https://nutrixeal-info.fr/index/moelle-osseuse/)

I. Les organes lymphoïdes centraux OLC
2. Thymus
 Une glande située dans la partie supérieure du thorax,
juste derrière le sternum et entre les poumons.
 Elle est constituée de deux lobes séparés par une
cloison et entourés d'une capsule.
 chaque lobe est divisé en lobules par des travées
conjonctives qui comprend deux zones: le cortex et la
médulla
5
 Les cellules progénitrice issu de la Mo sont Figure: Structure du thymus
différencié en LT dans le thymus. (https://nutrixeal-info.fr/index/moelle-
osseuse/)
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11
Chapitre II: Structure du Systéme Immunitaire
II. Les Organes Lymphoïdes Secondaires
1. Rate (réagit aux Ag circulant par le sang)

2. Ganglions lymphatiques (GL) ( réagit
aux Ag circulant par la lymphe)
3. Des formations lymphoïdes plus au
moins diffuses associées aux muqueuses
(MALT): les Amygdales, les plaques de
Peyer et les autres MALTS (Ag qui 6
pénètrent par les barrières muqueuses
12
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Chapitre III: les cellules du SI
 Toutes ces cellules sont

d'origine hématopoïétique
issues de cellules souches de la
MO.
 Ils agissent directement par les

molécules de surface soit par
l'intermédiaire des cytokines.
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13
14
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Les granulocytes: Les polynucléaires neutrophiles (PNN)
 Il représente plus de 70% des leucocytes.

 Il possède 3 types de granules
cytoplasmiques.
 Ces granules possèdent plusieurs enzyme et
substances toxiques pour les agents
pathogènes.
 Phagocytes professionnels dans les infections
aiguës par des germes à multiplication
extracellulaire.
15
15

Les granulocytes: polynucléaires éosinophiles (PNE)
 1 à 4% des leucocytes circulants.
 Caractérisé par de grosse granulation éosinophile intracytoplasmique
 Interviennent dans l’immunité antiparasitaire par un mécanisme de cytotoxicité.
 Multiples médiateurs de l’inflammation
 Faible capacité phagocytaire
Eosinophiles
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Les granulocytes: polynucléaires basophiles (PNB)
 Précurseur sanguin des mastocytes

tissulaires représente moins de 0,5 %.
 ils ont des granules cytoplasmiques

contenant des médiateurs de l'inflammation
et sont fonctionnellement similaires aux
mastocytes.
17
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Les granulocytes
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Mastocytes
 Présents dans le tissu conjonctif (peau, muqueuse digestive
et respiratoire).
 La principale cellule impliquée dans l'initiation et
l'amplification de la réaction inflammatoire.
 Leur site cytoplasme est bourré de granulations contenant
des médiateurs chimiques de l'inflammation tels que
l’histamine dont les effets sont:
• Contractions des muscles lisses
• Vasodilatation.
• Attraction des neutrophiles
• Activation de plaquettes.
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Lymphocytes B (LB)
 5 à 15% des lymphocytes circulants
 Caractérisée par le récepteur membranaire
d’Ag BCR et par certaines molécules de
surface: CD79a et CD79b,CD19,CD20,CD22
 Impliquée dans l'immunité à médiation
humorale
 Différenciation en plasmocyte secrétant des
anticorps (Ac) et en LB mémoires
Plasmocytes
21
21

Lymphocytes T (LT)
 Naissent dans la MO (précurseurs: LT immatures) et se développe dans le thymus où il exprime leur
récepteur pour l’Ag (TCR), le complexe CD3. Ils se différencient en deux populations
11
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LT CD4 +/LT helper

 Possède un rôle de régulation de niveau et de la
qualité des réponses immunitaires (RI)
 Initie et amplifie l’activation des autres cellules

du système immunitaire
23
23
LT CD8 +/LT cytotoxiques

 Tc possède des granules de sécrétion
intracytoplasmique contenant des substances
cytolytique.
 Il est capable de lyser (cytotoxicité):
1. les cellules tumorales ou infectés par un micro-
organisme intracellulaire
12
2. les cellules allogéniques (Rejet des allogreffes)
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Natural Killer (NK)
 5 à 30% des lymphocytes du sang
 Marqueur: CD56 pas de marqueurs spécifiques LT
et LB
 Possède des granules intracytoplasmique contenant
des substances lytiques
 Doué d'une cytotoxicité non-spécifique contre les
cellules tumorales et les cellules infectées par des
virus ou par des pathogènes intracellulaires.
25
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Natural Killer (NK) : récepteur KIR
La cellule NK perçoit l’absence

d’une structure normalement
présente sur les cellules de
l’organisme : CMH I
13
26
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Macrophage/Monocytes
 5 % des leucocytes circulants
 Les monocytes sont des grandes cellules mononuclées, migrent dans les tissus où elles se
différencient en macrophages tissulaires
Fonctions:
• Phagocytose et bactéricidie (surtout les
germes en multiplication intracellulaire)
• Présentation de l'antigène aux LT/
• Production de cytokines
• Induction de la RI spécifique
27
27
Cellules dendritiques (DC)
 Très faible nombre dans la circulation

 Infiltre tous les tissus
 Abondante dans les épithéliums muqueux et la peau
 caractérisé par des granules cytoplasmiques sont des
cellules sentinelles.
 Fonction de capture, transport et présentation de
l'antigène au lymphocyte/Phagocytose. 14
28
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Cellules dendritiques (DC)
 Ce sont les principales cellules
présentatrices d’antigènes (CPA), qui
aident à activer la réponse
immunitaire adaptative.
https://tp-svt.pagesperso-orange.fr/inflammation.htm
29
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https://tp-svt.pagesperso-orange.fr/inflammation.htm
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• Multiples types cellulaires

• grande hétérogénéité fonction différente
• interaction cellulaire par l'intermédiaire des
molécules :cytokines et chimiokines
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Classification fonctionnelle des cellules de l’immunité
Cellules phagocytaires
16
32
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Classification fonctionnelle des cellules de l’immunité
Cellules productrices
Cellules cytotoxiques CPA d'anticorps
33
33

Communications cellulaires
Contacts directs entre cellules Contacts indirects
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Les cytokines
• Les cytokines sont des médiateurs
solubles de la communication entre
les cellules de l’organisme
• Les interleukines sont les cytokines

qui servent à la communication entre
cellules immunitaires
35
35
Exercices
Quelle affirmation n’est pas vraie ?

A.Chaque cellule B aura un type différent de récepteur anticorps à sa surface.
B.Chaque cellule B ne possède qu’un seul type de récepteur anticorps qui se lie
à un antigène spécifique.
C.Le récepteur antigène des cellules B (BCR) a une structure similaire à un
anticorps soluble.
D.La cellule B peut se lier à des antigènes extracellulaires et intracellulaires. 18
E.Le récepteur anticorps des cellules B est complémentaire à un antigène.
36
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CONCLUSION
Système immunitaire fonctionnel
Régulation Effecteurs performants

Préservation en permanence de son
Protection de l'intégrité de
équilibre (homéostasie)
l'organisme
Réponse immunitaire La perturbation de ce système est à l’origine de :

adaptée - Maladies auto-immunes (Rupture de la tolérance).
- Allergies et des réactions d’hypersensibilités (RI exagéré)
- l’immunodéficience (RI inefficace).
37
37
Références bibliographiques et webographiques
• M Benhalima (2014). Introduction à l'immunologie (https://bit.ly/3Rp1khb)

• D.lakomy (2017). Structure générale du système immunitaire (https://bit.ly/3PDyt7w)
• Willard-Mack CL. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicol Pathol 2006; 34 : 409–24. Abul K.
Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, (2020), Les bases de l'immunologie fondamentale et clinique, 6 éditions, Elsevier
Masson.
• Kouassi É, Revillard J-P, Fournier M, Ayotte P, Roy R, Brousseau P, Hadji L (2003) Système immunitaire. In : Environnement
et santé publique - Fondements et pratiques, pp.687-698. Gérin M, Gosselin P, Cordier S, Viau C, Quénel P, Dewailly É,
rédacteurs. Edisem / Tec & Doc, Acton Vale / Paris
• https://nutrixeal-info.fr/index/moelle-osseuse/ 19
• https://tp-svt.pagesperso-orange.fr/inflammation.htm
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Cours 2: Réactions immunitaires

Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I: Réponse innée
CHAPITRE II: Réponse adaptative
CONCLUSION
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Objectifs du module
 Expliquer les types de réponses immunitaires innées et adaptatives

 Distinguer entre les réponses immunitaires humorales et cellulaires
 Décrire les différentes étapes d'une réaction inflammatoire.
 Expliquer le concept de mémoire immunitaire
INTRODUCTION
 Tous les êtres vivants sont soumis à des multiples agressions qui peuvent les
détruire ou perturber profondément leur équilibre interne et externe
 Les organismes supérieurs ont développé de multiples moyens de défense
contre les micro-organismes
 Des relations complexes et parfois équilibrées s'instaurent entre les germes
pathogènes et nos propres organismes humains
Réactions Immunitaires
2
(RI)
4
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Chapitre I: Réponse innée
Ligne de défense externe
 Empêche la pénétration des agents infectieux dans l’organisme.

 Elle est constituée de :
• la peau et des muqueuses (barrière physique)
• Les sécrétions (le mucus, la salive, les larmes)
Le risque d'infection survient quand ces barrières sont

lésées ( piqûres morsures, brûlures…)
Immunité non spécifiques /naturelle (innée)
• Existe avant tout contact avec l'agent infectieux (le même mode d'action :
immédiate
• Première ligne de défense (limiter les dégâts).
• Indispensable à l'activation de l'immunité spécifique en lui présentant les
antigènes.
3
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Principales cellules: cellules phagocytaires,

mastocyte, NK, plaquettes.
Principales fonctions:
• Phagocytose et bactéricidie
• cytotoxicité naturelle
• amplification de la réponse inflammatoire,
initiation de la réponse spécifique
Chapitre I:Réponse innée

1. Phagocytose et bactéricidie
La capacité de reconnaître, capter, internaliser et
dégrader des particules inertes ou viables
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Etapes de la phagocytose

2. Cytotoxicité naturelle
 Mécanisme de défense contre les infections virales et parasitaires et les tumeurs.

 La cytotoxicité désigne la capacité de certaines cellules de lyser les micro-organismes ou de
cellules cibles sans internalisation ni phagocytose.
 La cellule cytotoxique vient au contact de la cellule cible et déverse en sa direction le
contenu lytique de ces granules intracytoplasmique qui provoque la lyse osmotique de la
cellule cible et sa mort.
 Les principaux effecteurs cellulaires de la cytotoxicité naturelle sont les NK. 5
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La cytotoxicité spontanée (naturelle) des NK est activée dès lors que les cellules cibles ne
portent pas de molécule de CMH 1 (complémentaire des récepteurs KIR).
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3. Réaction inflammatoire
 Se met en place très rapidement (moins de 24 h après l’infection)
 Fonction principale: le recrutement davantage de cellules phagocytaires et des
molécules effectrice vers le site d'infection.
 Elles font intervenir plusieurs médiateurs solubles qui vont provoquer:
1. Une contraction de muscles lisses

2. Une vasodilatation
3. Une augmentation de la perméabilité capillaire
6
4. Le chimiotactisme des phagocytes et des lymphocytes
vers le site de l'infection
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Les signes Cliniques de

l’inflammation
• Rougeur et chaleur : vasodilatation.
• Gonflement : extravasation de plasma
et de leucocytes.
• Douleur : libération de médiateurs par
les leucocytes au voisinage des
terminaisons nerveuses.
13
13
La réaction inflammatoire est due au Cette reconnaissance entraînent la libération

recrutement de cellules immunitaires capables de médiateurs chimiques responsables de la
de reconnaître la majorité des dilatation des vaisseaux sanguins et de
microorganismes grâce à des récepteurs PRR. l’attraction des cellules immunitaires
Figure: inflammation cutanée

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Cellules sentinelles (récepteur PRR)
Détection
Cellules
dendritiques Mastocytes Macrophages
Médicaments
anti-inflammatoires
Sécrétion des
médiateurs de Histamine TNF,IL Prostaglandine
Recrutement et
Vasodilatation Vasodilatation
l’inflammation sortie des
afflux de plasma fièvre
cellules
immunitaires stimulation de nocicepteurs
8
Inflammation
Douleur + chaleur+ gonflement+ rougeur
16
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Inflammation Douleur + chaleur+ gonflement+ rougeur
Elimination Phagocytose
(MO,PN) Migration des cellules dendritiques
vers les ganglions lymphatiques:
présentation aux lymphocytes des
antigènes associés au CMH
Initiation de la réponse adaptative
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Chapitre II:Réponse adaptative
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Chapitre II: Réponse adaptative
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Cellules présentatrice d’Ag(CPA)
Deux grands types

• Cellules de la lignée myéloïde :
(Macrophage & cellules dendritiques)
• Les Lymphocytes B (LB)
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21

1. Apprêtement peptidique
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Activation des LT CD4+
1. Signal 1:Interaction spécifique

entre le CMHII-peptide d’une CPA
ayant capté un antigène et le TCR
d’un LT CD4+
2. Signal 2: signaux de costimulation
3. Signal 3: secrétion de l’IL-2 par
les LT.
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Rôle des LT helper
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25
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Réponse humorale
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  IgM
  IgG
  IgA
  IgD
  IgE
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IgM
10 sites de fixation
 Forme sécrétée pentamérique à l’antigène
 Secrètée avant les IgG lors d’une réponse
immunitaire : première ligne de défense de
l’immunité adaptative.
 Trop grosses pour passer la barrière placentaire
 L’apparition d’IgM contre un agent infectieux chez
le bébé signe une infection et non un transfert passif
d’anticorps de la mère
29
29
Ig G
• Sécrétées après les IgM
• Immunoglobuline majoritaire dans le sérum (70 à 75% des Ig totales)
• Intra- et extravasculaire
• Passent le placenta et interviennent dans la protection du foetus et du
nouveau-né
• Un enfant né de mère séropositive pour le VIH sera toujours
« séropositif » même s’il n’est pas infecté. 15
30
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 la forme sérique est monomérique
Ig A 

la forme sécrétée est polymérique
Rôle fondamental dans l’immunité muqueuse
 Exerce surtout une fonction neutralisante
31
31
Utilisée dans le
diagnostic des maladies
infectieuses
– IgM+ IgG-
infection aiguë
– IgM+ IgG+
infection subaiguë
– IgM- IgG+
infection ancienne 16
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Réponse cellulaire
 Rôle des LT c : cytotoxicité spécifique
33
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2. Réponse cellulaire
 Rôle des LT c :
cytotoxicité spécifique
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• Mémoire immunitaire
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35

 La notion de spécificité antigénique
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37
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CONCLUSION
1) Immunité naturelle (innée)
 Premiére ligne de défense (limiter les dégâts).
 Présentation des Ag aux lymphocytes auxiliaires CD4
2) Immunité acquise (adaptative ) :

 A médiation humorale (production des Ac)
Défense contre les Ag extracellulaires
Ex: (bactéries, toxines, stade précoce de certaines infections virales)
 A médiation cellulaire (les LT cytotoxiques (LT CD8)

Défense contre les Ag endogènes 19
Ex: (virus, bactéries intracellulaire, cellules cancéreuses)
38
38
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CONCLUSION
Stratégies de système immunitaire
Immunité naturelle
(innée)
Coopération
Immunité adaptative
(acquise)
 Rep cellulaire
Réponses immunitaires  Rep humorale (Ac)
39
39
CONCLUSION
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40
40
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• Christopher Cayzac, Isabelle Diaz, Priscilla Lapalud, Jean-Pierre Vendrell, Christine

Biron Andreani, Jean-François Schved, Géraldine Lavigne-Lissalde . Mécanismes
cellulaires de la réponse immune anti-FVIII chez les patients hémophiles A.
Hématologie. 2010;16(5):372-381. doi:10.1684/hma.2010.0503
• https://www.ifsidijon.info/v2/wp-content/uploads/2017/10/immuno-2016.version-
%C3%A9tudiant.pdf
• https://www.youtube.com/watch?v=0ZXdk8rKZgc
• https://nutrixeal-info.fr/index/phagocytes/
41
41
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Cours 3:
Techniques d’Immunoprécipitation
Préparé par Dr. Chaima khadhraoui
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I : Principe de la réaction Antigène-Anticorps
CHAPITRE II: Méthodes d’immunoprécipitation
CHAPITRE III: Méthodes d’agglutination
CONCLUSION
1
2
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Objectifs du module
 Expliquer les bases de la reconnaissance Ag-Ac et la formation de complexes immuns.

 Comprendre les principes de l'immunoprécipitation.
 Connaitre les techniques d'immunoprécipitation en phase liquide et en gels.
 Comprendre le principe de la réaction de d’agglutination.
 Comprendre l’analyse des résultats d'une immunoprécipitation et d’agglutination.
INTRODUCTION
Les techniques immunologiques sont basées

sur le principe de la réaction antigène-anticorps
(Ac-Ag)
Mise en évidence de la formation d’un

complexe immuns (Ag-Ac) 2
4
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Chapitre I:
Principe de la réaction
Antigène-Anticorps
Chapitre I: Principe de la réaction Antigène-Anticorps

Antigène (Ag) Anticorps (Ac)
Elément introduit dans l’organisme Elément plasmatique appelé

provoquant une réponse immunitaire immunoglobuline (Ig) de nature protéique
réagissant spécifiquement avec un Ag
Le site de reconnaissance: Le site de reconnaissance:

paratope
6
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Épitopes
Virus=Antigène

STRUCTURE D’UNE MOLECULE D’IMMUNOGLOBULINE (Ig)
 Un Ac est une glycoprotéine complexe Paratope

utilisée par le SI pour détecter et (site de liaison à l’Ag
neutraliser les agents pathogènes de
manière spécifique.
 Les Ac sont sécrétés par des cellules Chaine légère

dérivées des lymphocytes B : les
plasmocytes Pont de di-sulfure
4
Chaine lourde
Représentation schématique d’un anticorps
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Les réactions antigène-anticorps sont des réactions très spécifiques.
Notion de spécificité
C'est l'aptitude de l'anticorps à

ne réagir qu'avec l'antigène et
rien qu'avec cet Ag
Le paratope reconnaît un seul épitope.

La reconnaissance: Un anticorps ne peut reconnaitre qu'un antigène particulier ou un
déterminant de celui-ci (épitope).
10
10
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Mise en évidence la formation d’un complexe
immun
BUT • Dosage d’un Ag /Ac : Test quantitative

• Détection d’un Ag/Ag Test qualitative
• Méthodes de précipitation
Signal visible directement • Méthodes d’agglutination
Méthodes (visible à l’oeil nu)
• Marqueur radio-isotypique
Signal visible indirectement • Marqueur enzymatique
(Utilisant un marqueur) • Marqueur fluorescent
11
11
Chapitre II:
Méthodes d’immunoprécipitation
6
12
12
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Chapitre II:Méthodes d’immunoprécipitation

Phénomène de zone : mise en évidence
Expérience de précipitation quantitative
1. Quantités fixe d’Ac dans chaque tube 3. Apparition d’un précipité

2. Ajout des quantités croissantes d’Ag  Augmentant avec la
sous un volume constant quantité ajoutée d’Ag
 Diminuant avec les fortes
concentrations d’Ag ajoutée
13
13

Phénomène de zone : mise en évidence
14
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Courbe de précipitation
15
15

Principe d’immunoprécipitation
Formation de complexes immuns (Ag solubles)

Conditions optimales :
• Antigène multivalent
• Anticorps spécifique
• Rapport de concentration optimum :équivalence
• Conditions physicochimiques adaptées (pH, force ionique …)
8
Formation d’un réseau tridimensionnel
Précipité : insoluble, visible
16
16
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1. Précipitation en milieu liquide
1.1. Immunoturbidumétrie
• Technique quantitative
• La turbidimétrie est l'appréciation de l'intensité du trouble induit par le précipité
• La quantité de complexe Ag-Ac en solution est évaluée en mesurant
l'affaiblissement quantitatif d'un rayon lumineux traversant la cuve de mesure
• Mesure, au spectrophotomètre, de l’absorbance de la lumière par les immuns
complexes (l’atténuation de la lumière)
17
17
Interprétation:
• En choisissant un antisérum (Ac) de spécificité reconnue.

• En construisant une courbe d'étalonnage à l'aide des quantités connues de Ag.
• On peut doser plusieurs protéines de sérum présentant une concentration suffisante
• l'inconvénient de cette méthode: nécessite des quantités importantes d’Ac
spécifiques et d’Ag 9
18
18
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1.2. Immunonéphélémétrie
• Principe: elle est basée sur les

propriétés de déviation (diffraction)
de la lumière d’un rayon laser par les
complexes immuns en milieu liquide.
19
19

Turbidimétrie et néphélométrie
 Méthodes optiques de mesure du complexe Ag-Ac dans le milieu liquide
(ou du trouble) par la mesure de:
• la lumière transmise, par turbidimétrie, dans un spectrophotomètre

• La lumière dispersée, par néphélométrie, grâce à un photodétecteur.
• La concentration est déterminée par une courbe de calibrage.
• Elle dépend de la taille, de la forme, et de quantité des molécules.
10
20
20
29 /0 9 /2 0 2 3
2. Immunoprécipitation en gels
 L’immunoprécipitation en milieu liquide ne permet pas de distinguer (séparer)

plusieurs systèmes précipitants distincts mais évoluant simultanément.
 Pour les distinguer il faut utiliser des Ac monospécifiques (monoclonales)
 L’immunoprécipitation en milieu gel permet une analyse:
• Quantitative (dosage/titrage)
• Qualitative (savoir combien d’Ag comporte l’échantillon à analyser)
21
21

Principe
Les substances gélifiantes sont caractérisées par

l’établissement d’un réseau moléculaire à large maille
Les molécules peuvent circuler dans le gel et sont cependant

freinées (plus leur taille est volumineuse)
Les différents Ag et Ac vont donc diffuser à des vitesses différentes

11
Immunodiffusion
22
22
29 /0 9 /2 0 2 3
2.1. Immunodiffusion simple en tube: technique d’Oudin

2. l’Ag progresse dans le gel par simple diffusion en créant
un gradient de concentration
Ag en solution
Ac en agar
Zone d’équivalence
(Formation de précipité)
le temps d'apparition de
précipités (minutes à
quelques heures)
1. Des tubes sont remplis par un

gel d’agarose (l'antisérum)
23
23

 Ce déplacement est lié à la diffusion de l’Ag
et il correspond à la dissolution de précipité
qui se reforment à l’endroit où un rapport
optimum de [ ] s’établit de nouveau
 La distance de migration de précipité étant

proportionnelle au logarithme de la [Ag]
12
:propriété utilisée pour doser un Ag
24
24
29 /0 9 /2 0 2 3

Formation d’un ou plusieurs zones de
précipitation [Ag] élevée
Deux précipités différents

(2 Ag ayant des PM
La préparation comporte plusieurs différents
systèmes précipitants (Ag-Ac) Gel +antisérum dirigé

contre les deux Ag
25
25

2.2. Immunodiffusion simple radiale: technique de Mancini
 Un gel d’agarose contenant déjà Ac spécifique de l’Ag à doser sur

un support horizontal (une boîte de pétri)
 Des puits sont remplis de concentrations différentes de l’Ag.
 Immunodiffusion de l’Ag dans le gel.
13
26
26
29 /0 9 /2 0 2 3

2.2. Immunodiffusion simple radiale: technique de Mancini
Interprétation
Après 48 heures, les diamètres des anneaux de
précipitation, qui se sont progressivement éloignés du
puits, sont mesurés car proportionnels à la quantité
d'antigène.
27
27

2.2. Immunodiffusion double en plaque: technique d’Ouchterlony
Principe
• Le gel ne contient ni Ag ni Ac
• Les solutions d'Ag et d'Ac sont déposées dans
des puits percés à distance les uns des autres
dans un gel d'agarose.
• Les molécules diffusent dans le gel en fonction
14
de leur masse et forme Un précipité apparaît dans la zone d'équivalence:
Arc de précipité
(pour chaque système d'Ag et d’Ac).
28
28
29 /0 9 /2 0 2 3

2.2. Immunodiffusion double en plaque: technique d’Ouchterlony
Intérêt:
 Apprécier la complexité d'un mélange

antigénique et pour identifier ces
composants.
 Comparer des préparations antigéniques et

d'étudier leur relation vis-à-vis d'un
antisérum donné ou de plusieurs antisérums
vis-à-vis d'un même antigène
29
29
La ligne se prolonge sans chaque ligne de précipitation Deux Ags possèdent des
discontinuité d’un système à un évolue seul et les deux lignes épitopes en communs
autre pour former un trait se croisent:
15
Deux Ags sont identiques Deux Ags sont différents Réaction identité partiel
Réaction d’identité total Réaction non identité
30
30
29 /0 9 /2 0 2 3

3. Immuno- électrophorèses (IEP): IEP de Grabar et Williams
l’IEP est une technique réalisée en milieu gélosé:
1. Séparation électrophorétique des Ag: l’Ag déposé sur le

gel (coté cathode) est soumis à un champ électrique à voltage
constant. Les protéines antigéniques migrent en fonction de
leur taille et de leur charge.
2. Diffusion du sérum: le sérum est déposé sur l’agarose en

gouttière parallèlement à l’axe de migration des Ag
31
31

3. Immuno- électrophorèses (IEP)
 IEP de Grabar et Williams
• Réaction Ag-Ac multiples et formation de précipités multiples aux zones d'équivalences
• révélation des arcs de précipitation
• Interprétation comparative des résultats de sérum étudié par rapport au sérum témoin B
• Renseignements fournis essentiellement qualitatifs
16
32
32
29 /0 9 /2 0 2 3
Limites des réactions de précipitation
 La réaction de précipitation nécessite des Ag et des Ac multivalents.

 Les haptènes doivent être couplés à des molécules porteuses.
 La sensibilité des réactions de précipitation est limitée par la
concentration des d'Ac et d’Ag nécessaires à la formation du
complexe immun et donc du précipité.
33
33
Chapitre II:
Méthodes d’immunoagglutinations
17
34
34
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre III:Réaction d'agglutination

L’addition d’Ac spécifiques à une suspension d'éléments portant les Ag particulaires
correspondants
l'agglutination : Formation de complexes immuns avec des Ag

particulaires (cellulaires) produisant des amas visibles
Ag sur un élément figuré

(cellules, GR, particules,
bactéries
35
35
Réaction d’agglutination sont très sensible

Détection d’Ac à des [ ] inf à 1µg/ml
Le terme agglutinine :les Ac qui agglutinent les Ag particulés :
L’agglutination des hématies: hémagglutination
18
36
36
29 /0 9 /2 0 2 3

 Réaction d’agglutination active /directe/naturelle: Ag naturellement présent à la surface
de la particule porteuse (ex: GR, bactérie)
 Réaction d’agglutination passive/indirecte/conditionnée: Ag soluble est fixé
artificiellement sur un élément figuré (une particule naturelle (ex: GR) ou inerte (ex: latex).
Réaction d’agglutination directe Réaction d’agglutination indirecte
37
37

Test qualitatif: Détermination du groupe sanguin ABO
• Réaction d‘hémagglutination
• Déterminer le type d’Ag porté par les GR d’un individu.
Mettre en contact un sérum Après un temps d'incubation qui permet

19
(contenant l’Ac spécifique) à l’Ag de laisser le temps aux Ac de venir à la
aux GR du patient rencontre des Ag et de s'y fixer.
38
38
29 /0 9 /2 0 2 3

Test qualitatif: Détermination du groupe sanguin ABO
39
39
20
40
40
29 /0 9 /2 0 2 3

Vidéo
41
41
A AB
B 21
O
42
42
29 /0 9 /2 0 2 3

Test antiglobuliniques (les tests de COOMBS)
Une méthode qui permet de détecter les anticorps non agglutinants qui sont soit
 fixée sur l’hématies du malade: test de Coombs direct

 présente dans son sérum: test de Coombs indirect
 Application :
- Recherche d'une incompatibilité photo maternelle dont le système rhésus
- détection des anticorps anti-Rhésus hein les chiffres
43
43

Le test de COOMBS DIRECT
 Détectez les Ac non agglutinants anti érythrocytaires fixés in vivo sur les GR du patient
GR du patients recouverts Réactif de Coombs

AC anti- Agglutination 22
d’Ac non agglutinants
immunoglobuline
44
44
29 /0 9 /2 0 2 3
Le test de COOMBS INDIRECT

GR Sérum du patient GR recouvert d’Ac non
( présence d’Ac non agglutinants
agglutinants)
 Détectez les Ac non agglutinants
anti érythrocytaires donnés dans
un échantillon de sérum.
GR recouvert d’Ac non Réactif de Coombs AC Agglutination

agglutinants anti-immunoglobuline
(invisible à l‘œil nu)
45
45

Réaction
: d’inhibition de l’hémagglutination
 Mesurer la capacité d'un antigène soluble d'inhiber l'agglutination par les anticorps spécifiques des
émaciés recouvertes par le même antigène
Agglutination
Ac anti-Ag en
question GR recouvert d’Ag
Inhibition 23
Echantillon à analyser d’agglutination
(Ag soluble recherché)
46
46
29 /0 9 /2 0 2 3
Conclusion
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
 But : Mise en évidence des antigènes
Mise en évidence des anticorps
Choix de la technique
- Fonction de la concentration de l’antigène ou de l ’anticorps
- Forme de l ’antigène (soluble ou particulaire)
- Localisation de l ’antigène ou de l’anticorps
 Si l’antigène est moléculaire et soluble == complexe Ag-Ac forme un précipité

 Si l’antigène est particulaire ou cellulaire == complexe Ag-Ac forme un agglutinat
47
47
• Anderson DJ, Blobel G. Immunoprecipitation of proteins from cell-free translations. Methods in Enzymology. 1983
;96:111-120. DOI: 10.1016/s0076-6879(83)96012-3. PMID: 6361451.
• Johnson, M.A. 1986. Immunoprecipitation in gels. In Manual of Clinical Laboratory Immunology. (N.R. Rose, H.
Friedman, and J.L. Fahey, eds.p:14-24.Am Soc, Microbiol, Washington,DC.
• Ouchterlony, 0. & Nilsson, L.A. (1973). immunodiffusion and immunoelectrophoresis. In D.M. Weir (Ed.),
Immunology,Vol.1: et hé immunochemestry (Weir DM, Herzeinberg LA et Blackwell CB,Eds.), p:32,1-32.50
Blackwell, Oxwford.
• Erica Spackman, Ioannis Sitaras (2020), Hemagglutination Inhibition Assay, Animal Influenza Virus, 2123: pp 11–
28
• Roselyne L'Italien, Benoît Leblanc, Projetbleu (2008), Immunohématologie,p140

24
• Mohamed Naceur KRIFI (2005),Abrèges illustres d’immunotechnologie, p145-185,
48
48
29 /0 9 /2 0 2 3
Cours 4:
Méthodes de séparation et de transfert
Préparé par Dr. Chaima khadhraoui
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I :Techniques électrophorétiques
CHAPITRE II Immuno-adsorption sur support solide
CONCLUSION
2
29 /0 9 /2 0 2 3
Objectifs du module
Comprendre les Méthodes de séparation et de transfert immunologiques:
Principe des techniques électrophorétiques

1. PAGE
2. SDS PAGE
3. isoelectric focusing
• Principe des techniques d’immuno-adsorption et immunofixation
1. Western-Blotting
2. Dot Blotting
INTRODUCTION
Les méthodes de séparation et de
transfert
L’électrophorèse sur support ou
électrophorèse de zones Immuno-adsorption sur support
solide
PAGE
DOT BLOT
SDS-PAGE
WESTERN BLOT 2
IEF
4
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre I: Techniques électrophorétiques

I. L'électrophorèse
 une technique permettant la séparation de molécules porteuses
de charges électriques comme les AA, les protéines, les acides
nucléiques par migration différentielle sous l'action d'un
champ électrique.
 Obtention après migration d’une séparation en zones distinctes

(bandes) des molécules chargées
 La migration dépend de la charge de la molécule, sa taille et

du support (gel, papier…)

L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones
 Les molécules à séparer sont déposées sur un support
dont chaque extrémité est en contact avec une solution
tampon.
 Dans chaque solution tampon se trouve une électrode.
 Les électrodes sont reliées à un générateur de courant
 Lorsque le générateur envoie du courant, les
molécules chargées se déplacent sur le support en 3
direction de l’électrode de signe opposé à leur charge.
6
29 /0 9 /2 0 2 3
 Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette
 Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+)
 Les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode (−).

• Electrophorèse selon le type de montage
Gels avec pores de dimensions
moléculaires de taille variable:
1. Polyacrylamide: petite taille des pores

2. Agarose: grande taille des pores
 La taille des pores varie aussi avec la [ ]

des gels Plus la concentration , plus la
taille 4
8
29 /0 9 /2 0 2 3
Montage horizontal Montage verticale

1. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
10
10
29 /0 9 /2 0 2 3

1.1. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
• Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec
la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant.
• En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
11
11

1.2. SDS-PAGE:
SDS
Un détergent anionique fort

(une longue chaîne hydrocarbonée hydrophobe 6
+ une extrémité chargée négativement)
12
12
29 /0 9 /2 0 2 3
Dénaturation des
protéines
Empêche son repliement confère à la protéine

(Les structures secondaire une charge nette
et tertiaires détruites) négative
13

Séparation par une électrophorèse
sur gel de polyacrylamide
Seul le PM des protéines sera le facteur de leur séparation
14
14
29 /0 9 /2 0 2 3
La séparation des protéines

Les protéines ayant un poids moléculaire
s’effectue uniquement en
plus faible migreront plus rapidement
fonction de leurs tailles
15
15

Révélation: Fixation et coloration des protéines
• Séparation des protéines uniquement en

fonction du facteur TAILLE
• Évaluation des masses moléculaires des

protéines séparées 8
16
16
29 /0 9 /2 0 2 3

Exemple de Gel coloré au bleu de COOMASSIE ( standard: dernier puit) et courbe d’étalonnage pour
calcul des PM
17
17
Chapitre I:Techniques électrophorétiques

1.3. Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing)
Principe
• Création d'un gradient de pH sur un gel de polyacrylamide à l'aide d'ampholines,

séparation selon le pHi.
• Les protéines vont se focaliser à des distances différentes correspondant à leur point
isoélectrique (pHi).
• Excellente résolution et détermination du pHi par comparaison avec protéines de pHi
9
connu.
18
18
29 /0 9 /2 0 2 3

Un gel en gradient de pH est nécessaire: le pH varie d'acide à basique d'un
gradient à un autre dans le gel.
En raison de la charge
électrique associée au gel:
la protéine se déplace jusqu'au point dans le gel où

la charge du gel est identique à celle de la protéine
et où la charge totale est nulle appelée point
isoélectrique
19
19
Le point isoélectrique (Pi= pHi)
le point auquel la charge de la

molécule est nulle du fait que la
quantité de charges positives et de
charges négatives dans la molécule
10
est identique.
20
20
29 /0 9 /2 0 2 3
 Cette méthode est donc utilisée

pour séparer les protéines en
fonction de leur charge/pi, ainsi
que pour déterminer le point
isoélectrique (Pi) d'une protéine
cible.
21
21
Chapitre II:Immuno-adsorption sur support solide
La détection spécifique des Ag peut se faire par des Ac spécifiques après immobilisation
préalable des antigènes sur certaines membranes qui ont la propriété de les absorber non
spécifiquement et irréversiblement tout en conservant la réactivité immunochimique
DOT-BLOT WESTER-BLOT
11
22
22
29 /0 9 /2 0 2 3
Dot blot
• L’immunoprécipitation sur support solide

• Une microgoutte de la solution contenant l'antigène protéique a identifié et déposée sur
une membrane fixante,nitrocellulose ou nylon
• On dépose ensuite à la surface de la membrane une solution contenant l'anticorps
spécifique marqué à la peroxydase
• Après lavage la peroxydase, mis en évidence par un réactif spécifique permis d'utiliser
terminer par coloration la présence de l’Ag recherché
23
23
12
24
24
29 /0 9 /2 0 2 3

Western blotting =Immunotransfert
But: analyser des protéines individuelles dans un mélange protéique (ex: un lysat de cellules).
• Le gel de polyacrylamide est le gel le plus couramment utilisé pour le Western blotting.
• Les Ac sont conjugués à des marqueurs (fluorescents / radioactifs/ enzymes) pour
provoquer une réaction suite à l'ajout d'un réactif, entraînant une coloration ou une émission
de lumière qui favorise la détection
Avantage :
• la séparation du mélange protéique par taille, charge
• détecter plusieurs cibles, contrairement au test ELISA
25
25

Western blot
1. Dénaturation par SDS des protéines 3. Transfert des protéines sur membrane 5. Révélation 13
2. Séparation des ≠ Ag par SDS PAGE 4. Détection par Ac primaire immunologique
5. Détection de l’Ac primaire par un Ac
secondaire couplé
26
26
29 /0 9 /2 0 2 3

2. Transfert électrophorètique 3. Blockage de la
Des Proteines du gel vers
membrane (lait)
une membrane NC
1. Séparation des
échantillons protéiques
sur PAGE
6.Incuber la membrane avec

le substrat chemiluminescent 4. Incuber la membrane
5. Incuber la membrane avec AC primaire
de l’enzyme et exposition du film avec AC secondaire
conjugué à une enzyme
27
27

Transfert des bandes de protéines vers une membrane porteuse, par un même
système d'électrophorèse sur un support (nylon, nitrocellulose)
14
Obtention des bandes
homogènes de protéines.
28
28
29 /0 9 /2 0 2 3
La membrane est mise au

contact du gel et un courant
électrique est appliqué afin
que les protéines migrent du
gel à la membrane
29
29
15
30
30
29 /0 9 /2 0 2 3

Applications du Western Blot
31
31
Applications du Western Blot Exemple (clinique): détection d'Ac anti-HIV

Protéines HIV
C’est la méthode de référence utilisée dans la

confirmation: Patient A: négatif
• De l'infection par le VIH en cas de test ELISA Patient B: indéterminé

positif, Patient C: positif
• De la maladie de Lyme et de l'encéphalopathie

spongiforme bovine (maladie de la vache folle). 16
patients
32
32
29 /0 9 /2 0 2 3
CONCLUSION
 L'électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans un but
analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Elle n'est donc
pas adaptée à la séparation des lipides
 Avantages:
- L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.

- La séparation est fine.
33
33
CONCLUSION
 Les méthodes d'électrophorèse de protéines sur gel décrites peuvent également

être combinées pour séparer les protéines. Le choix de la méthode dépend des
exigences spécifiques de l'expérience.
 La détection spécifique des Ag peut se faire par des Ac spécifiques après

immobilisation. Immunofixation (immunoadsorption) qui consiste à identifier
certaines protéines préalablement séparées par électrophorèse à l’aide des Ac
17
34
34
29 /0 9 /2 0 2 3
• Johnson MA (1982). Immunofixation electrophoresis. Clin. Chem.28,1797-1800.

• BASLI Abdelkader, Procédés de Séparation des Biomolécules, Université Abderrahmane Mira, Bejaia
Faculté de Sciences de la Nature et de la Vie, Département de Biologie Physico-chimie.
• Millipore (1990). Protein Blotting Protocols For immobilon-P Transfer Mqembrane. Millipore,
Bedford,Mass.
• Pierre Kamoun, Appareils et méthodes en biochimie. Editeur : Flammarion, Médecine-Sciences, Paris,
1987. 373p.
• https://www.youtube.com/watch?v=J86IgcQMWYE&t=477s
• https://biologyreader.com/dot-blot-technique.html
• http://www.perrin33.com/biochanalys/electroph/ief-2D_1.php
35
35
18
29 /0 9 /2 0 2 3
Intitulé du cours:
Immunodosages utilisant un réactif marqué
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I: Chapitre I: le schéma réactionnel (Compétion et capture)
CHAPITRE II: Radio-immuno-essai (RIA)
CHAPITRE III: Fluorescense-immuno-essai
CHAPITRE IV: Enzyme-immuno-essai
CHAPITRE V: Dot-Blot-immuno-essai
CHAPITRES VI: Chimiluminicense-immuno-essai

1
CHAPITRES VII: Elispot
CONCLUSION
2
29 /0 9 /2 0 2 3
Objectifs du module
1. Connaitre les divers marqueurs utilisables dans les tests immunologiques

2. Connaitre la différence entre méthodes par capture et compétition
3. Décrire le principe et l’utilité des méthodes utilisant un réactif marqué:
• Radio-immuno-essai (RIA)
• Enzyme-immuno-essai (EIA)
• Fluorescense-immuno-essai (FIA)
• Chimiluminicense-immuno-essai
• Dot-Blot-immuno-essai
• Elispot
INTRODUCTION
Immunoanalyse Mettre en évidence la présence d’une réaction Ag-Ac
Dans des zones de faible [réactifs]
Aucun phénomène Marquage de l’un des partenaires de la réaction

directement observable
Le principe de ces tests est pratiquement le

même quel que soit le marqueur utilisé
2
Par une substance susceptible d'émettre un signal

identifiable par l'œil ou par un appareil spécialisé
4
29 /0 9 /2 0 2 3
INTRODUCTION
Réactions Antigène-Anticorps utilisant un réactif « Ag* ou Ac * »
Immunomarquage
associé à un Marqueur (Traceur) détectable permettant de révéler
la liaison Ag–Ac spécifique
 Le marquage ne doit pas modifier la spécificité de la réaction Ag-Ac ( le marquage

se fait en dehors des régions de complémentarité).
 Les marqueurs augmentent la sensibilité d'une immuno-analyse et permettent de

déceler des quantités plus faibles de cible que les méthodes qui ne les utilisent pas.
INTRODUCTION
Type de marqueurs
• Isotype radioactif: émission d'un rayonnement

• Fluorochrome: émission d'une fluorescence
• Réactif oxydant: émission d’une luminescence d’origine chimique
• Enzyme : catalyse de la formation d'un produit coloré
On appelle un anticorps marqué ou un antigène marqué 3
Un conjugué
6
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre I: le schéma réactionnel (Compétion et capture)

Méthode par compétition: Dosage d’un Ag
Une courbe d’étalonnage est
Ag marqué
construite
Contact Lavage Révélation
Ag à doser
(existant dans
l’échantillon) Marqueur lié L’intensité du signal est
Ac fixé
sur une phase solide inversement proportionnelle à
la [ Ag à doser]
Ag* marqué entre en compétition pour la
liaison au niveau des Ac spf fixé.

Méthodes par double capture (en sandwich):
Dosage d’un Ag
Ac marqué lié
Contact Révélation
Ag à doser
(existant dans
l’échantillon) L’intensité du signal est
Ac fixé 4
proportionnelle à la [ Ag à
sur une phase solide • L’Ag à doser se lie aux Ac fixés doser]
• Le complexe formé est révélé par un
deuxiéme Ac marqué
8
29 /0 9 /2 0 2 3

Méthodes par simple capture (en sandwich):
Dosage d’un Ag
Ac marqué lié
Contact Révélation
Ag à doser
(existant dans
l’échantillon)
Ac fixé L’intensité du signal est
sur une phase solide • L’Ag à doser se lie aux Ac fixé proportionnelle à la [ Ag à doser]
• Le complexe formé est révélé par un
deuxième Ac marqué

Méthodes par simple capture (hybride):
Dosage d’un Ag
Mesure de signal
Phase liquide: signal

Contact est proportionnelle à la
[Ag] à dosé
Ag à doser
(existant dans
l’échantillon)
Ac marqué
(en exée) phase solide: signal
5
est inversement
Ag fixée sur phase
proportionnelle à la
solide
[Ag] à dosé
10
10 Ag fixé
29 /0 9 /2 0 2 3
11
11
Chapitre II:Radio immuno Assay

1. Radio immuno Assay (RIA)
Ex: RIST (Radio Immuno-Sorbent Test)
Pa compétition, méthode inversement proportionnelle
12
12
29 /0 9 /2 0 2 3

Révélation et lecture
13
13
Chapitre II:Radio immuno essay

1. Immuno Radio Metric Assay (IRMA)
Ex: RAST (Radio Allergo-Sorbent Test)
Technique en sandwich , méthode 7
directement proportionnelle
14
14
29 /0 9 /2 0 2 3

Expl: Le test de Farr
 C’est une technique de dosage radio-immunologique : utilisée pour la
détection des Ac anti-ADN.
 Elle utilise de l’ADN double brin marqué par un radio-isotope.
 Elle se déroule en 4 étapes :
1. Incubation du sérum du patient avec l’ADN double brin marqué.
2. Séparation des complexes immuns par précipitation et centrifugation.
3. Elimination de l’ADN double brin marqué non lié à un anticorps.
4. Mesure de la radioactivité (proportionnalité entre la radioactivité
mesurée et la quantité d’anticorps présents dans le sérum)
15
15
Compteur gamma
16
16
29 /0 9 /2 0 2 3
17
17
Chapitre III: Fluorescense-immuno-essai

Méthodes d’immunofluoresence
1. Principe: Ac est couplé à un fluorochrome qui est excité par une lumière UV. IL va émettre une
lumière fluorescente ( verte ou rouge …) visualisée au microscope à UV.
2. Phénomène de fluorescence
 Un fluorophore absorbe la lumière d’une certaine longueur

d’onde (excitation).
 Il passe à un état excité.
 Pour revenir à l’état fondamental, émettent une lumière d’une

9
longueur d’onde différente de celle absorbée ( longueur d’onde
d’émission) (λ émise >λ absorbée).
18
18
29 /0 9 /2 0 2 3

Méthodes d’immunofluoresence
3. Principaux fluorochromes utilisés :
Fluorochrome
 L’isothiocyanate de fluorescéine (ou FITC) :
• Le plus fréquemment utilisé.
• Absorbe la lumière bleue à λ absorbée = 480nm
• Emet une fluorescence verte à λ émise =517nm. Ag
 L’isothiocyanate de rhodamine : Site de

• Absorbe à λ absorbée =550nm et émet à λ reconnaissance
émise =580nm (rouge orangé).
19
19
Immunofluorescence Directe (IFD)

Immunofluorescence Indirecte (IFI)
10
20
20
29 /0 9 /2 0 2 3
La lecture est réalisée au

microscope à fluorescence
équipé d’une source de
lumière UV:
Microscope à fluorescence
21
21

Les systèmes optiques de détection de fluorescence
 Une source de lumière :est équipé d’un jeu de filtres
correspondant au fluorochrome utilisé.
Oculaire
Un filtre
 Un filtre d'excitation permettant la sélection de la d'émission
longueur d’onde absorbées par le fluorochrome utilisé Un filtre
d'excitation
un miroir
 Un miroir dichroïque réfléchissant les radiations dichroïque
absorbables vers l'échantillon .
Une source
Objectif de lumière
 Un filtre d'émission ne laissant passer par transmission Echantillon
11
que les radiations émises par le fluorochrome.
22
22
29 /0 9 /2 0 2 3

IF
VRS
Ag pp65 CMV
23
23
Chapitre IV: Enzyme immuno essai

ELISA: enzyme-linked-immunosorbent-assay
 .La révélation repose sur la mesure de la densité

 Réalisées dans des plaques de micro-titration optique du produit généré à l’aide d’un
dont le matériau permet la fixation des spectrophotomètre ( lecteur de plaques ELISA). 12
protéines (Ag ou Ac)
 La détermination de concentration est assurée par
l’utilisation d’une courbe d’étalonnage.
24
24
29 /0 9 /2 0 2 3

Les variantes méthodologiques des techniques ELISA
 Bonne sensibilité, spécificité
 Plusieurs variantes méthodologiques:
25
25
Méthode directe
1 - Habillage (coating) avec l’antigène

2 - Anticorps primaire marqué
4 - Révélation enzymatique
13
26
26
29 /0 9 /2 0 2 3

Méthode indirecte
1 - Habillage (coating) avec l’antigène

2 - Anticorps primaire
3 - Anticorps secondaire marqué
La DO est directement
proportionnelle à la quantité
• Utilisée pour la recherche des Ac. d’Ac mesuré
• Peut-être quantitative ou qualitative.
27
27

Méthode :Exemple dosage d’Ac
 Agent bloquant est ajouté (saturation)

 Ajout du sérum à tester ( Ac à doser) Ac Présent Ac Absent
 Lavage
 Ajout du conjugué (Ac détecteur ) ENZ ENZ
ENZ
 Lavage ENZ
ENZ
ENZ
ENZ ENZ
 Ajout du Substrat
14
Plaque: surface solide qui contient:

Ag ciblé pour Ac à doser ajouté aux puits
28
28
29 /0 9 /2 0 2 3
Méthode « sandwich »
1 - Habillage (coating) avec

un anticorps
2 – Solution contenant l’Ag
anti-Ac
3 - Anticorps anti-Ag marqué

Plaque de microtitration Détail d’un puits
DO est directement proportionnel à la quantité d’Ac mesuré
29
29
Un conjugué
• Un conjugué est un anticorps couplé
à une protéine (Ac secondaire) ;Ac
de révélation
• Conjugué classique: anticorps

couplé à une enzyme
15
30
30
29 /0 9 /2 0 2 3
Systéme de révelation :en fonction du substrat, le produit de la réaction est

mesuré par spectrophotométrie
31
31

Supports de sérologie virale
Techniques Manuelles Techniques Automatisées
16
Puits colorés = sérums positifs pour la
réaction ELISA. Lecture des DO par
spectrophotométrie
32
32
29 /0 9 /2 0 2 3
Interprétation des résultats
• Les puits qui sont positifs (développant une

coloration suite à l’hydrolyse du substrat par
l’enzyme) pourraient contenir les IgG anti-
viral recherchés.
• Les résultats sont calculés automatiquement

par spectrophotomètre et leurs interprétations
sont imprimés systématiquement sur la feuille
du résultat.
33
33
Essai pour Ac contre virus X

Dilutions
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Standard 3.8 1.9 0.8 0.4 0.2 0.1 0.04 0.03
Patient 1 2.5 1.2 0.6 0.3 0.15 0.07 0.03 0.03
Patient 2 0.1 0.05 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
Patient 3 3.6 3.0 1.6 0.8 0.4 0.2 0.1 0.05
Témoin nég. 0.12 0.06 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
Plaque d’ELISA Lectures d’absorbances

Conclusions:
17
Patient 1 & 3 sont séropositifs
Patients 2 est séronégatif
34
34
29 /0 9 /2 0 2 3

Application d’une réaction ELISA – Très sensible
Technique la plus courante – Quantitatif
– Rapide
Les techniques ELISA sont très utilisées en :
Dosage des protéines
la ß2m, drogues, hormones (insuline, glucagon…), médicaments, enzymes (énolase, lipase…), les
facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE…
Diagnostic sérologique
parasitaire, bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella, Salmonelle, Treponema…),
virologique (HIV, rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpès, grippe…), Maladies auto-immunes :
recherche et dosage des Ac anti-ADN, anti-histones …
35
35
Chapitre V: Dot-Blot-immuno-essai
 L'immunodot (dot-blot), est une technique dérivée du western-blot dans laquelle les Ags, sont
directement déposés sur des bandelettes de nitrocellulose. (pas d’électrophorése).
 Il s’agit d’une technique immunoenzymatique

de type indirect.
 Utilisée pour la détection d’Ac.
 Un résultat positif se présente sous forme d’un

cercle ou trait coloré. 18
36
36
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre VI: Chimiluminicense-immuno-essai

Principe : La chimiluminescence, ou chimioluminescence, c’est la production de la
lumière à la suite d'une réaction chimique. Elle se caractérise seulement par un spectre
d’émission. L’émission de la lumière commence directement après le début de la réaction
chimique
L’émission lumineuse provient d’une

molécule transformée par une
enzyme spécifique utilisée comme
marqueur (Peroxydase de raifort
(HRP)
Analyseur d'immunoanalyse par

chimiluminescence
37
37
Chapitre VII: Elispot

Le dosage immunospot lié à une enzyme (ELISpot) : Variante de la technique
ELISA utilisée pour la détection des cellules productrices de cytokines.
1. Le puits de la plaque est couvert d’Ac anti-cytokine recherchée dans lequel sont
cultivées les cellules du patient.
2. Les cytokines produites seront captées par les Ac présents dans le puits dans
l’endroit de leur production.
3. On continue les étapes de l’ELISA sandwich habituelle.
4. Le résultat positif se traduit par l’apparition de spots colorés dont chacun
19
correspond à une cellule productrice.
38
38
29 /0 9 /2 0 2 3

Protocole de la technique ELISPOT
Cellules du patient 6h à une
stimulée par Ag étudiée nuit Cytokines
39
39

Amplification du signal des techniques immuno-enzymatiques Système
streptavidine/biotine
Une forte
affinité à
Streptavidine
20
Ac de révélation : Ac couplé à la biotine-

enzyme couplée à la streptavidine
40
40
29 /0 9 /2 0 2 3
CONCLUSION
Les techniques immunologiques
Identification /dosage d’un Ag Mise en évidence /dosage d’un Ac
• Cellules • Sérologies infectieuses

• Agent infectieux • Maladies auto-immunes
• Protéines • Allergies
• Hormones
• transplantation
• médicament
41
CONCLUSION
Les techniques immunologiques
Avec marquage
Sans marquage
Radio-immunologique
Immunoprécipitation (en milieu liquide)
Immunofluorescence
Immunoprécipitation (en milieu gélifié)
Immuno-enzymatique
21
Agglutination
Chimiluminescence
42
42
29 /0 9 /2 0 2 3
• Reen DJ. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 1994;32:461-6. doi: 10.1385/0-
89603-268-X:461. PMID: 7951745.
• Plested JS, Coull PA, Gidney MA. ELISA. Methods Mol Med. 2003;71:243-61. doi: 10.1385/1-59259-321-
6:243. PMID: 12374024.
• Gan SD, Patel KR. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 2013
Sep;133(9):e12. doi: 10.1038/jid.2013.287. PMID: 23949770.
• "Immunofluorescence in Clinical Immunology: A Primer and Atlas" par Harold R. Hagopian.
• "Radioimmunoassay and Related Techniques: Methodological Progress and Clinical Applications"
édité par W. Körner.
• Handbook of ELISPOT: Methods and Protocols" édité par Alexander E. Kalyuzhny.
• https://slideplayer.fr/slide/16211267/
• https://www.youtube.com/watch?v=jeWBGIJsCo8
43
43
22
29 /0 9 /2 0 2 3
Cours 6:
Techniques immunohistochimiques
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I: La préparation de l'échantillon
CHAPITRE II: Immunohistochimie

CHAPITRE III: Immunofluorescence
1
CONCLUSION
2
29 /0 9 /2 0 2 3
Objectifs du module
• Acquérir les bases nécessaires et connaitre les principes fondamentaux des

techniques utilisées en IHC.
• Connaître les différentes étapes techniques qui vont permettre l'analyse en IHC
• Décrire le principe et l’utilité d’immunofluorescence indirecte sur cellules et
coupes tissulaires
INTRODUCTION
L’immunohistochimie
 C’est la combinaison de l’immunologie et de l’histochimie.
 Buts essentiels :
1. Détection spécifique de protéines sur matériel
cytologique ou sur coupes tissulaires.
2. Localiser et estimer le niveau d'expression de
protéines d'intérêt sur un matériel cytologique ou des
2
coupes tissulaires.
4
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre I: La préparation de l'échantillon

Types de prélèvements tissulaires
Biopsie Pièces opératoires

Matériel de résection à la curette (endomètre, vessie,
La biopsie consiste à prélever un fragment prostate) ou de pièce d’exérèse segmentaire ou totale,
de tissu sur un être vivant d’une tumeur ou d’un organe

I. La préparation de l'échantillon
1. Fixation:. Intérêts de la fixation :
 indispensable pour conserver la morphologie cellulaire

 Immobilisation des constituants tissulaires/cellulaires
 Prévient l’autolyse cellulaire.
 Prévient de la putréfaction bactérienne post-mortem
Réalisée immédiatement et tout au plus dans un délai d’une heure
La durée de la fixation  6 heures pour une biopsie

3
(dépend de la taille du  24 heures pour une pièce opératoire.
prélèvement)  Au moins de 48 h (limiter la dégradation des acides nucléiques
6
29 /0 9 /2 0 2 3

1. Fixation:.
Nature du fixateur
Formol 10 % tamponné à pH= 7.2

Il s'agit d'un produit toxique (allergisant, cancérigène)
nécessitant des mesures de protection lors de son utilisation
: port de gants, lunettes, surblouses par les personnels
médicaux et paramédicaux, et systèmes d'aspiration des
vapeurs dans les laboratoires.

1. Fixation.
Paramètres de la fixation
 Le volume du fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce.
 Le récipient doit être de taille suffisamment grande pour prévenir les déformations
des pièces opératoires volumineuses ;
 Avant fixation, les organes creux (tube digestif, vésicule biliaire, utérus) doivent
être ouverts et si nécessaire lavés de leur contenu afin de prévenir l'autolyse des
muqueuses ; les organes pleins volumineux (foie, rate) doivent être coupés en
4
tranches pour faciliter la pénétration rapide et homogène du fixateur.
8
29 /0 9 /2 0 2 3

2. Inclusion en paraffine
 Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en plastique

 Ces traitements permettent aux tissus de passer d’une

forme semi-liquide à une forme solide homogène
suffisamment dure pour permettre la réalisation des coupes
fines du tissu tout en préservant sa morphologie.
 Les biopsies incluses dans la paraffine sont enfin refroidies

et stockées à température ambiante. 5
10
10
29 /0 9 /2 0 2 3

3. Coupe au microtome et étalement sur lames
 Les blocs inclus en paraffine sont découpés avec un

microtome en coupes d'une épaisseur de 4 à 5 μm.
 Plusieurs motifs de coupe tissulaire sont étalés sur
lames.
 Les lames sont alors séchées afin d'assurer une
bonne adhésion à la lame des tissus avant
coloration.
 Passage dans bains de toluène, d’alcool et d’eau
(déparaffinage, réhydratation
11
11

12
12
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre II: Immunohistochimie
1. Principe
Le complexe Ag-Ac est visualisé au
microscope par un fluorochrome ou
un complexe enzymatique coloré.
Les Ag recherchés
• membranaires
• cytoplasmiques Si Ag recherché est présent
nucléaires dans le prélèvement, il est
• protéines de la matrice reconnu par l’Ac
extracellulaire. (appliqué sur la coupe dans
une solution aqueuse)
13
13
Démasquage Blocage de la
Déparaffinage
des Ag peroxydase endogène
Mettre les lames dans l’eau

la destruction des ponts de
oxygénée (H2O2) pour inhiber
méthylène inter et
les enzymes de la membrane
intramoléculaires induits par
(peroxydase endogène) qui sont
le formol pendant la fixation
libérés et font une réaction
positive avec l’anticorps
7
14
14
29 /0 9 /2 0 2 3

Démasquage Blocage de la
Déparaffinage
des Ag peroxydase endogène
15
15
Microscope à fluorescence
Visualisation au (marquage par un
microscope optique fluorochrome)
un complexe 8
enzymatique coloré.
16
16
29 /0 9 /2 0 2 3

L'analyse de l'immunomarquage
 Qualitative : définir le % de cellules positives
et quelle est la localisation cellulaire du
marquage (membranaire, cytoplasmique ou
nucléaire).
 Semi-quantitative: en prenant en compte le

comptage des structures ou cellules
immunomarquées par unité de surface ou
champ microscopique.
17
17
18
18
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre III: Immunofluorescence

Immunofluorescence sur frottis ou sur coupe
IFD Antigènes viraux IFI
Fixer directement l’Ac
marqué sur la Anticorps spécifiques
préparation Non marqués
antigénique étudiée. Mettre en évidence de l’Ag
Anticorps secondaires
Après lavage la lecture est effectuée marqués à la fluoresceïne
au microscope à fluorescence
19

Protocoles
10
20
20
29 /0 9 /2 0 2 3

Antigènes viraux
IFD Applications IFI
 Identifier un germe.
 Analyser dans une biopsie tissulaire les  Recherche d’Ac anti-microorganisme:
dépôts d’immunoglobulines et de  Sérodiagnostique de la toxoplasmose
complément.  La recherche d’Ac anti-Tréponema pallidum
 Le phénotypage des populations  Diagnostic et dépistage des maladies auto-
lymphocytaires B et T. immunes
21

Recherche et titration des auto-Ac
 Détecter les auto-Ac

 Facilité d’exécution.
11
 -Bonne sensibilité
 -Détection de plusieurs Ac à la fois.
 Semi-quantitative
22
22
29 /0 9 /2 0 2 3
Recherche des Ac anti nucléaires caractéristique de lupus érythématheux

disséminé( maladie auto-immune systématique):
 Le sérum du patient est testé sur des groupes de 4 micromètres de rein de souris riches en
cellules nucléées ou sur des étalements de lignées cellulaires en culture dont la membrane a
été perméabilisée.
 Les lames sont lavées puis incubées avec un anti-immunoglobulines humaines marqué à la
fluorescéine.
 La présence d'anticorps anti-ADN dans le sérum du patient permet la fixation des anticorps
marqués et illumine les noyaux avec un aspect particulier très homogène.
23
23
12
24
24
29 /0 9 /2 0 2 3
CONCLUSION
IMMUNO-FLUORESCENCE IMMUNO-HISTOCHIMIE
 Faible coût et technique facile et rapide  Apprécier la morphologie des lésions

 Ne permet pas la conservation des lames  Permet la conservation des lames
 Peu informative sur la morphologie
25
25
CONCLUSION
L'immunohistochimie est très largement utilisée avec de multiples indications parmi

lesquelles :
1. Intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en

évidence d'antigènes de différenciation cellulaire ou identification de certains agents
infectieux
2. Intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération
cellulaire, ou de produits d'oncogènes
3. Intérêt thérapeutique : mise en évidence de cibles thérapeutiques, telles que les

récepteurs nucléaires aux estrogènes et la protéine Her2 dans les cancers du sein. 13
26
26
29 /0 9 /2 0 2 3
• Immunofluorescence in Clinical Immunology: A Primer and Atlas" par Harold R. Hagopian.

• Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Essential Methods" par C. D. P. Warner.
• Taylor, C. R., & Levenson, R. M. (2006). "Quantification of immunohistochemistry—issues concerning
methods, utility and semiquantitative assessment II." Histopathology, 49(4), 411-424.
• Ramos-Vara, J. A., et al. (2013)."Immunohistochemical evaluation of heat-induced epitope retrieval and
protease-induced epitope retrieval for the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissues." Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 25(3), 362-
368.
• https://celluloyd.tumblr.com/image/163960029808
• https://celluloyd.tumblr.com/post/164074470363/coupe-dun-tissu-inclus-en-paraffine-ce-quon
• https://www.youtube.com/watch?v=KnMdSgd5mts
27
27
14
29 /0 9 /2 0 2 3
Cours 7:
Techniques d’immuno-phénotypisation
Préparée par Dr. Chaima Khadhraoui
Plan du cours
OBJECTIFS DU MODULE
INTRODUCTION
CHAPITRE I: Principe et intérêt de la CMF
CHAPITRE II: composition d’un cytométre
CHAPITRE III: Analyse et présentation des données
CHAPITRE IV : Applications de la CMF
1
CONCLUSION
2
29 /0 9 /2 0 2 3
Objectifs du module
• Comprendre le principe et l’intérêt de la cytométrie en flux (CMF)

• Connaitre la composition d’un cytométre
• Savoir analyser les cellules en cytométrie et la présentation des données
• Savoir les applications de la CMF en pratique clinique
INTRODUCTION
La cytométrie en flux (CMF): une méthode d’analyse qui permet, à grande vitesse
(plusieurs milliers d’événements par seconde), de caractériser et compter des cellules
(ou des particules) en suspension dans un flux liquidien en passant devant une lumière laser.
Adapté aux cellules en suspension:

l'analyse de liquide biologique L’analyse de tissus cellulaires
• Sang est possible, préalablement
• Lavage broncho-alvéolaire dissociés pour être mis
• Liquide céphalo-rachidien secondairement en suspension
2
• aspiration médullaire
4
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre I: Principe et intérêt de la CMF
• Les cellules en suspension dans un flux liquidien

passent une à une dans un faisceau laser.
• La lumière du laser va exciter des fluorochromes
préalablement couplés à des anticorps monoclonaux
capables de reconnaître et fixer certaines protéines
• Un système de filtre optique et de photomultiplicateur
va permettre de collecter la lumière propre à chaque
https://bicel.univ-lille.fr/cytometrie-en-flux fluorochrome et de la quantifier.
La diffusion physique de la lumière émise par

la source lumineuse est dépendante de la taille
et de la granularité cellulaire:
• La diffusion dans l’axe de la source

lumineuse (forward scatter, FSC) renseigne
sur la taille.
3
• La diffusion à 90°C (side scatter, SSC)
https://bicel.univ-lille.fr/cytometrie-en-flux renseigne sur la granularité ou structure.
6
29 /0 9 /2 0 2 3
La CMF permet de mesurer individuellement et simultanément plusieurs paramètres

sur chaque cellule au sein d’une population hétérogène.
Expression de molecules de Detection après

La taille et la granularité surface (CD, cluster of perméabilisation des molecules
differention) intracellulaires.
Détectés grâce à la diffusion de Révélée par un fluorochrome couplé à un anticorps

la lumière monoclonal dirigé contre le CD d’intérêt.

Etude multiparamétrique en utilisant
 plusieurs fluorophores émettant à différentes longueurs d'onde (différentes PM)

 plusieurs sources lumineuses (Red laser (HeNe) 633 nm, Argon laser :488nm)
Un laser à 488 nm active
• La fluorescéine (FITC, émission à 520 nm), couplée

à un anticorps identifiant un récepteur membranaire.
• la phycoérythrine (PE, émission à 580 nm) couplée à

4
un anticorps identifiant une intégrine.
8
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre II: Composition d’un cytométre
Un cytométre est une combinaison

de 3 différents systèmes:
1. Système fluidique
2. Système optique
3. Système électronique

1. Système fluidique: une veine liquide sous
pression (liquide de gaine) qui aura pour
effet d’aligner et espacer les cellules et les
amener au niveau du laser
2. Système optique: Rayons laser et différents
filtres qui permettent de sélectionner les
longueurs d'onde appropriées
3. Système électronique:
• PMT capte la lumière émise (LE)
• Digitaliseur transforme la LE en signal électrique
puis en signal numérique 5
• Ordinateur: gère et entrepose les données
10
10
29 /0 9 /2 0 2 3
Laser
FSC
Miroirs
dichroïques PMT
SSC
PMT
FL2
Filtres
FL1 PMT
11
11
Chapitre III:Analyse et présentation des données

Les paramètres FSC/SSC
Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse
 Forward Scatter (FSC): la lumière diffractée est
collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est
relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule)
 Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à
90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la
granularité de la cellule. ( = granulométrie de la
cellule)
12
12
29 /0 9 /2 0 2 3

Analyses de la fluorescence/ Immunophénotypage
Exemple: Identification des sous-populations lymphocytaires T
13
13

Exemple : molecules de surface (CD, cluster of differention)
http://www.cri-net.com/ckfinder/userfiles/files/formation/fichesImmuno/Chap_2.pdf
14
14
29 /0 9 /2 0 2 3
Chapitre IV:Application
Indications cliniques
 Compte cellulaire :
Nombre de cellules par unité de volume. Par exemple : la numération des
lymphocytes CD4+ pour le suivi des patients VIH+ ;
 Détection de la présence anormale d’un CD dans une population cellulaire

(typage des leucémies / lymphomes, applications en oncohématologie)
 Tests fonctionnels ex vivo :

Expression d’une molécule de surface après activation (test d’activation des
basophiles pour allergie au curare), quantification intracellulaire de cytokines après
activation (déficits immunitaires)
15
15
Résultat attendu
d’un sujet sein (sur
sang périphérique)
16
16
29 /0 9 /2 0 2 3
Dysfonction lymphocytaire T au cours du sepsis : rôle des lymphocytes T
régulateurs CD4+ CD25+ CD127 faible
17
17
Exemple représentatif d’un test fonctionnel :
Détection de molécules intracellulaires:

production de TNF dans les monocytes en
réponse à une stimulation par du
lipopolysaccharide (LPS
18
18
29 /0 9 /2 0 2 3
Laser
Tri cellulaire: Veine liquide

d’entraînement
C’est la séparation physique de cellules
ou de particules d’intérêt à partir d’une
population hétérogène.
- +
Tube de
collecte
Non sélectionnées
19
19
CONCLUSION
 La Cytométrie en flux est une technologie qui nous permet de

mesurer simultanément de multiples caractéristiques physiques
d’une cellule.
 Le cytomètre enregistre le comportement de la cellule quand celle-ci

passe devant le laser en mesurant:
1- La diffusion de la lumière incidente

10
2- L’émission de la fluorescence
20
20
29 /0 9 /2 0 2 3
CONCLUSION
 Les renseignements transmis par le cytomètre à propos des cellules :
1- Sa taille relative (FSC)
2- Sa granularité relative (SSC)
3- L’intensité de la fluorescence émise (Fl)
 C'est une technique rapide qui permet une caractérisation:

1. Individuelle de chaque cellule
2. Quantitative ( intérêt statistique)
3. Qualitative et multiparamétrique ( morphologie de la cellule et phénotypage)
21
21
• L. Zafrani · G. Monneret, Comprendre la cytométrie en flux Méd. Intensive Réa (2017) 26:517-
522
• Monneret G, Venet F, (2016) Sepsis-induced immune alterations monitoring by flow cytometry
as a promising tool for individualized therapy. Cytometry B Clin Cytom 90: 376–386
• Venet F, Chung CS, Kherouf H, Geeraert A, Malcus C, Poitevin F, Bohé J, Lepape A, Ayala
A, Monneret G, (2009) Increased circulating regulatory T cells (CD4(+)CD25 (+)CD127 (-))
contribute to lymphocyte anergy in septic shock patients. Intensive Care Med 35: 678–686
• http://www.crinet.com/ckfinder/userfiles/files/formation/fichesImmuno/Chap_2.pdf
• https://bicel.univ-lille.fr/cytometrie-en-flux 11
22
22

Support Immunologie 2023-2024 DR - Chaima Khadhraoui

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Cours 1:Introduction à l’immunologie

Année de formation 2023/2024

 Comprendre le concept de l'immunité et le rôle du système immunitaire

 La propriété qu’a l'organisme à se défendre et à éliminer toutes substances

Provient du terme latin « Immunitas »

Chapitre I: Rôle du systéme immuniatire

Maintenir le bon fonctionnement

Assurer son intégrité en éliminant le

Chapitre I: Rôle de systéme immuniatire

 Une cellule tumorale  Un agent infectieux

Chapitre I: Rôle de systéme immuniatire

 L'ensemble des facteurs (effecteurs)

Chapitre II: Structure du SI

Les organes lymphoïdes

Chapitre II: Structure du SI

Chapitre II: Structure du SI

Chapitre II: Structure du SI

Chapitre II: Structure du Systéme Immunitaire

II. Les Organes Lymphoïdes Secondaires

1. Rate (réagit aux Ag circulant par le sang)

Chapitre III: les cellules du SI

 Toutes ces cellules sont

 Ils agissent directement par les

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

 Il représente plus de 70% des leucocytes.

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Les granulocytes: polynucléaires basophiles (PNB)

 Précurseur sanguin des mastocytes

 ils ont des granules cytoplasmiques

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

LT CD4 +/LT helper

 Initie et amplifie l’activation des autres cellules

Chapitre III: les cellules du SI

LT CD8 +/LT cytotoxiques

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

La cellule NK perçoit l’absence

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Cellules dendritiques (DC)

 Très faible nombre dans la circulation

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

• Multiples types cellulaires

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Chapitre III: les cellules du SI

Contacts directs entre cellules Contacts indirects

Chapitre III: les cellules du SI

• Les interleukines sont les cytokines

Quelle affirmation n’est pas vraie ?

Régulation Effecteurs performants

Réponse immunitaire La perturbation de ce système est à l’origine de :

Références bibliographiques et webographiques